摘要gydF4y2Ba
脑和心脏的电活动取决于起搏器离子通道(HCN)有节奏地产生动作电位，其活动受cAMP结合的调节gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．先前的工作已经发现了cAMP结合中积极和消极协同作用的证据gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，但这种批量测量受到参数分辨率的限制。使用单分子技术消除这种模糊性的努力受到了阻碍，因为无法直接监测个体配体分子与膜受体在生理浓度下的结合。在这里，我们使用纳米光子零模波导克服了这些挑战gydF4y2Ba4gydF4y2Ba直接解析单个配体与多聚体HCN1和HCN2离子通道的结合动力学。我们发现，当孔关闭时，cAMP独立地与所有四个亚基结合，尽管随后在每个位点发生构象异构到翻转状态。结合和异构化的不同动态可能是每种亚型对cAMP生理反应不同的基础gydF4y2Ba5gydF4y2Ba并为配体诱导的翻转态模型提供直接验证gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba．这种观察多聚体蛋白在生理相关浓度下的逐步结合的方法，可以直接探测其他完整膜蛋白和受体在单分子分辨率下的结合变构。gydF4y2Ba
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开启P2X受体的激活门控gydF4y2Ba
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用细胞衍生的纳米囊泡进行单分子成像，揭示了环核苷酸门控离子通道的早期结合动力学gydF4y2Ba
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参考文献gydF4y2Ba
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确认gydF4y2Ba
本研究由美国国立卫生研究院资助b.c (NS-116850, NS-101723和NS-081293)， D.S.W. (T32奖学金GM007507)和美国国家科学基金会资助R.H.G. (ch -1856518)。我们感谢K. A. Knapper和C. H. Vollbrecht在威斯康辛纳米技术中心对盖玻璃清洗的帮助;M. P. Goldschen-Ohm和M. Smith的有益讨论;C. Lingle和L. Anson对手稿的反馈;以及M. Jackson促成了这次合作。zmw是在橡树岭国家实验室的纳米材料科学中心制造的，该实验室是美国能源部科学用户设施办公室。gydF4y2Ba
作者信息gydF4y2Ba
作者及隶属关系gydF4y2Ba
贡献gydF4y2Ba
D.S.W, S.C, R.H.G.和B.C.构思并设计了这些研究;五、电生理学实验;S.C.进行分子生物学和蛋白质纯化;D.S.W.和R.Z.进行了单分子实验;D.S.W.分析了单分子数据。D.S.W.在S.T.R.监督下制造zmw;D.S.W, S.C, R.H.G.和B.C.根据其他人的意见撰写了手稿。gydF4y2Ba
相应的作者gydF4y2Ba
道德声明gydF4y2Ba
相互竞争的利益gydF4y2Ba
作者声明没有利益竞争。gydF4y2Ba
额外的信息gydF4y2Ba
同行评审信息gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba感谢匿名审稿人对本工作的同行评审所作的贡献。同行评审报告是可用的。gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba
扩展的数据图形和表格gydF4y2Ba
扩展数据图1 HCN1SM和HCN2SM的表征。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， HCN1SM(左)和HCN2SM(右)具有代表性的电生理记录(上)与电压协议。收集−130 mV的尾电流(箭头)，并用于生成激活曲线。gydF4y2BabgydF4y2Ba， HCN1SM(左)和HCN2SM(右)在不存在或存在内部cAMP饱和浓度(500 μM)时的归一化活化曲线，符合Boltzmann拟合(红色)。数据点为均值±s.e.m. (gydF4y2BangydF4y2Ba= 5个补丁)。VgydF4y2Ba1／2gydF4y2BaHCN1SM无cAMP时为-71.2±0.4 mV，有cAMP时为- 69.1±0.5 mV。VgydF4y2Ba1／2gydF4y2BaHCN2SM无cAMP时为-105.2±0.6 mV，有cAMP时为- 84.6±0.5 mV)。gydF4y2BacgydF4y2Ba， HCN1SM(灰色)和HCN2SM(橙色虚线)的尺寸排除色谱(SEC)剖面。三角形表示用于单分子测量的峰值分数(0.3 ml)。gydF4y2BadgydF4y2Ba通过TIRFM光漂白egfp标记的HCN2SM四聚体的荧光与时间轨迹示例。gydF4y2BaegydF4y2Ba，四聚体复合体的光漂白步骤分布覆盖了零截断二项分布(红色)的最大似然估计，其概率为(gydF4y2BaPgydF4y2Ba)，观察eGFP (HCN1:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.65, 95% ci [0.63, 0.67]，gydF4y2BangydF4y2Ba= 752;HCN1:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.67, 95% ci [0.65, 0.69]，gydF4y2BangydF4y2Ba= 588)。gydF4y2Ba
扩展数据图2 zmw中的非特异性绑定。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，采用512 × 512像素EMCCD和100×物镜的单分子成像装置上ZMW阵列的亮场图像。每个白点(每个视场约1600个)是一个ZMW。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba， egfp标记的HCN2SM与ZMWs特异性结合的试验(gydF4y2BabgydF4y2Ba)和fcAMP (gydF4y2BacgydF4y2Ba)到zmw中的HCN2SM。为gydF4y2BabgydF4y2Ba而且gydF4y2BacgydF4y2Ba，所有显示的图像均为前10帧(1秒)的平均值，并减去背景以便可视化。亮度和对比度为清晰度进行了调整。gydF4y2BadgydF4y2Ba，具有代表性的随机选择的空(无HCN)和钝化ZMWs的荧光轨迹与1000 nM fcAMP与DISC(黑色)相匹配。前50帧(灰色)从分析中删除。gydF4y2Ba
扩展数据图3 zmw中fcAMP与HCN1SM的绑定。gydF4y2Ba
fcAMP (100 nM至900 nM)在ZMWs中与HCN1SM结合的典型荧光轨迹，以100 ms分辨率成像。前50帧(灰色)从分析中删除。gydF4y2Ba
扩展数据图4 zmw中fcAMP与HCN2SM的绑定。gydF4y2Ba
fcAMP (100 nM至1500 nM)在ZMWs中与HCN2SM结合的典型荧光轨迹，以100 ms分辨率成像的理想拟合(黑色)。前50帧(灰色)从分析中删除。gydF4y2Ba
扩展数据图5所有状态占用分布。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba， HCN1SM的归一化状态占用分布(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)及HCN2SM (gydF4y2BabgydF4y2Ba)在所有记录的fcAMP浓度中。每幅图表示分子总数(gydF4y2BangydF4y2Ba)和数据点(即帧，gydF4y2Ba米gydF4y2Ba)纳入分析。gydF4y2BaPgydF4y2Ba是考虑四个结合位点的优化二项分布的成功率。所有获得的和预期的状态占用值在补充表中gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
图6 HCN1SM的隔离b1事件。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，不同fcAMP浓度下HCN1SM的隔离b1事件的停留时间分布覆盖单指数(蓝色虚线)和双指数(红色)分布的最大似然估计(补充表)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．对于插入，误差条是二项分布的误差(方法)。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba，在所有ZMW阵列上叠加的512 × 512像素视场中识别的单分子坐标。彩色条表示平均停留时间(gydF4y2BabgydF4y2Ba)和荧光(gydF4y2BacgydF4y2Ba)为每个分子(gydF4y2BangydF4y2Ba)．gydF4y2BadgydF4y2Ba，每个隔离b1事件的荧光强度和停留时间的相关性(gydF4y2Ba米gydF4y2Ba),gydF4y2BargydF4y2Ba为Pearson相关系数。数据被归档以便可视化。gydF4y2Ba
扩展数据图7 HCN2SM的隔离b1事件。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，不同fcAMP浓度下HCN2SM的隔离b1事件的停留时间分布覆盖单指数(蓝色虚线)和双指数(红色)分布的最大似然估计(补充表)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．对于插入，误差条是二项分布的误差(方法)。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba，在所有ZMW阵列上叠加的512 × 512像素视场中识别的单分子坐标。彩色条表示平均停留时间(gydF4y2BabgydF4y2Ba)和荧光(gydF4y2BacgydF4y2Ba)为每个分子(gydF4y2BangydF4y2Ba)．gydF4y2BadgydF4y2Ba，每个隔离b1事件的荧光强度和停留时间的相关性(gydF4y2Ba米gydF4y2Ba),gydF4y2BargydF4y2Ba为Pearson相关系数。数据被归档以便可视化。gydF4y2Ba
扩展数据图8隔离b1事件不表现出静态异构性。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba， HCN1SM的平均隔离- b1停留时间(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)及HCN2SM (gydF4y2BaegydF4y2Ba)为每个分子在100 nM fcAMP。异常值(钻石)由三个比例的中位数绝对偏差确定。数据以指数分布的平均值±标准差表示。蓝色虚线表示所有分子的平均B1停留时间(HCN1SM:gydF4y2BangydF4y2Ba= 176;HCN2SM:gydF4y2BangydF4y2Ba= 77)。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba，每个HCN1SM的平均隔离- b1停留时间直方图(gydF4y2BabgydF4y2Ba)及HCN2SM (gydF4y2BafgydF4y2Ba)分子。gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba， HCN1SM的分离- b1停留时间单指数拟合(τ)的参数(gydF4y2BacgydF4y2Ba)及HCN2SM (gydF4y2BaggydF4y2Ba)．gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba，双指数拟合的参数(τgydF4y2Ba1gydF4y2Ba,τgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,一个gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)到HCN1SM的分离- b1停留时间(gydF4y2BadgydF4y2Ba)及HCN2SM (gydF4y2BahgydF4y2Ba)．为gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba，纵坐标对应于得到的参数(τ， τgydF4y2Ba1gydF4y2Ba,τgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,一个gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，误差条为95%置信区间。所有参数均使用最大似然估计对所有数据中的所有隔离b1事件进行计算(HCN1SM:gydF4y2BangydF4y2Ba= 8229;HCN2SM:gydF4y2BangydF4y2Ba= 2,676)或inlier (HCN1SM:gydF4y2BangydF4y2Ba= 7816;HCN2SM:gydF4y2BangydF4y2Ba= 2,575)组，如横坐标所示。gydF4y2Ba
扩展数据图9 HCN1SM停留时间分布。gydF4y2Ba
HCN1SM在所有fcAMP浓度下所有配位态的停留时间分布与图中优化速率的期望重叠。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba．gydF4y2Ba
扩展数据图10 HCN2SM停留时间分布。gydF4y2Ba
HCN2SM在所有fcAMP浓度下所有配位态的停留时间分布与图中优化速率的期望重叠。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba．gydF4y2Ba
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怀特，d.s.，乔杜里，S，伊迪库达，V。gydF4y2Baet al。gydF4y2BacAMP与封闭的起搏器离子通道的结合是非合作的。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba595gydF4y2Ba， 606-610(2021)。https://doi.org/10.1038/s41586-021-03686-xgydF4y2Ba
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开启P2X受体的激活门控gydF4y2Ba
Purinergic信号gydF4y2Ba（2022）gydF4y2Ba
用细胞衍生的纳米囊泡进行单分子成像，揭示了环核苷酸门控离子通道的早期结合动力学gydF4y2Ba
自然通讯gydF4y2Ba(2021)gydF4y2Ba
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