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BRCA1-BARD1核小体识别和泛素化机制gydF4y2Ba

自然gydF4y2Ba体积gydF4y2Ba596gydF4y2Ba，gydF4y2Ba页面gydF4y2Ba438 - 443 (gydF4y2Ba2021gydF4y2Ba）gydF4y2Ba引用本文gydF4y2Ba

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一个gydF4y2Ba作者修正gydF4y2Ba本文于2021年8月17日发表gydF4y2Ba

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摘要gydF4y2Ba

BRCA1-BARD1肿瘤抑制因子是通过同源重组修复DNA双链断裂所必需的E3泛素连接酶gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。BRCA1-BARD1复合体定位于DNA复制后受损的染色质上，并催化组蛋白H2A和其他细胞靶点的泛素化gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba。BRCA1-BARD1双链断裂招募和靶标识别的分子基础尚不清楚。在这里，我们使用冷冻电镜显示BARD1中的锚蛋白重复结构域和串联BRCT结构域采用紧密折叠，并结合核小体组蛋白、DNA和附着在H2A氨基末端K13或K15上的单素，这两个信号已知是双链断裂的特异性信号gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba。我们进一步展示了RING域gydF4y2Ba17gydF4y2Ba在BRCA1-BARD1基因中，一个E2泛素偶联酶以动态的构象定位在核小体的顶端，启动泛素转移到H2A和变体H2AX的柔性羧基末端。我们的研究揭示了H2A N端BRCA1-BARD1对单泛素的识别阻断了多泛素链的形成，并协同促进了H2A C端泛素化的调控串音。这些发现阐明了BRCA1-BARD1染色质募集和泛素化特异性的机制，突出了BARD1在这两个过程中的关键功能，并解释了BRCA1-BARD1如何通过对抗复制后染色质中的DNA修复蛋白53BP1来促进同源重组gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba。这些数据为评估BARD1变异提供了一个结构框架，并有助于识别驱动癌症发展的突变。gydF4y2Ba

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图1:BRCA1基因的低温电镜结构gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-UbcH5c-nucleosome复杂。gydF4y2Ba
图2:在H2A K13和K15位点泛素化核小体复合物中BARD1 (ARD-BRCT)的低温电镜结构。gydF4y2Ba
图3:在H2A K13和K15位点泛素化的核小体上结合的BARD1在低温电镜结构中的分子内和分子间界面。gydF4y2Ba
图4:BRCA1-BARD1对H2A N端泛素化NCP的多价识别促进了H2A C端泛素化NCP。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

原子坐标和电磁图已在加入代码下存入蛋白质数据库gydF4y2Ba7 lyagydF4y2Ba(NCP),gydF4y2Ba7 lybgydF4y2Ba(BRCA1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-UbcH5c-NCP)和gydF4y2Ba7 lycgydF4y2Ba(BARD1 ncp (ARD-BRCT)gydF4y2BaH2AK13ubK15ubgydF4y2Ba)，并在相应的加入码下存入电子显微镜数据库gydF4y2Baemd - 23590gydF4y2Ba，gydF4y2Baemd - 23591gydF4y2Ba和gydF4y2Baemd - 23592gydF4y2Ba。原始凝胶和斑点在补充图中提供。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。本研究的试剂可根据要求从通讯作者处获得。gydF4y2Ba

改变历史gydF4y2Ba

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    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

下载参考gydF4y2Ba

致谢gydF4y2Ba

我们感谢太平洋西北低温电子显微镜中心(PNCC)的H. Scott, J. Myers和N. Meyer的低温电子显微镜筛查和数据收集，并感谢H. Scott在整个项目中提供的宝贵建议;我们感谢A. sundborg - lunna, p . l .。Chiu和A. Alam提供仪器访问和在其他低温电镜项目上的合作;感谢谢伦伯格先生慷慨地提供仪器，感谢布拉甘蒂尼先生分享未发表的研究成果。本研究由美国国立卫生研究院(NIH)拨款R01 CA132878、R01 GM116829和R35 GM136262给通用公司支持。卵巢癌研究联盟Liz Tilberis奖给m.v.b;爱德华·c·肯德尔生物化学奖学金;以及梅奥诊所癌症中心和生物医学发现中心的鹰奖学金，以D.Z.冷冻电镜筛查和数据收集由NIH拨款U24GM129547支持，在俄勒冈健康与科学大学(OHSU)的PNCC进行，并通过EMSL (grid.436923.9)访问，EMSL是由生物与环境研究办公室赞助的能源部科学用户设施办公室。gydF4y2Ba

作者信息gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

  1. 这些作者贡献均等:胡琦、Maria Victoria Botuyan、赵德标gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

  1. 美国明尼苏达州罗彻斯特市梅奥诊所生物化学与分子生物学系gydF4y2Ba

    胡琦，Maria Victoria Botuyan，赵德标，崔高峰，Elie Mer & Georges MergydF4y2Ba

  2. 美国明尼苏达州罗彻斯特市梅奥诊所癌症生物学系gydF4y2Ba

    乔治MergydF4y2Ba

作者gydF4y2Ba
  1. 气胡gydF4y2Ba
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  2. 玛丽亚·维多利亚·博图扬gydF4y2Ba
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  3. Debiao赵gydF4y2Ba
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    您也可以在gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  4. 崔高峰gydF4y2Ba
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    您也可以在gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  5. Elie MergydF4y2Ba
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  6. 乔治MergydF4y2Ba
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贡献gydF4y2Ba

通用公司构思并监督了这项工作。通用、Q.H、M.V.B.和D.Z.设计了这些实验。q.h测定了低温电镜结构。G.C.和q.h进行了核磁共振波谱实验。m.v.b克隆了不同的结构。m。v。b。d。z。q。h。和e。m。制作并纯化了所有的样本。M.V.B, Q.H, D.Z.和E.M.进行了功能分析。通用在M.V.B.和Q.H的主要贡献下完成了这份手稿，并得到了所有作者的参与。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba乔治MergydF4y2Ba。gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明没有利益竞争。gydF4y2Ba

额外的信息gydF4y2Ba

同行评审信息gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba感谢Daniel Durocher和其他匿名审稿人对这项工作的同行评审所做的贡献。同行评审报告是可用的。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

扩展的数据图形和表格gydF4y2Ba

图1 BRCA1介导核小体组蛋白H2A和H2AX位点特异性泛素化gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba和UbcH5c。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba左:BRCA1催化核小体H2A泛素化的时间过程gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-UbcH5c在25°C下用核磁共振光谱探测。信号强度的变化gydF4y2Ba1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba15gydF4y2BaNCP港口的N异核单量子相干(HSQC)光谱gydF4y2Ba15gydF4y2Ba监测n标记的H2A-H2B。右:叠加gydF4y2Ba1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba15gydF4y2Ba泛素化反应开始前和开始后1000 min的N HSQC光谱。来自残余标签残基的信号用黑色标记。gydF4y2BabgydF4y2Ba左:考马斯氏染色凝胶显示野生型(WT) NCP和NCP的泛素化，如所示，在H2A中携带双点和三点突变，使用BRCA1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba和UbcH5c。被单酚化的赖氨酸残基用红色表示。右:NCP泛素化的定量gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个独立实验。条形图显示每个数据点的平均值和标准差。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用双样本、双尾Student计算值gydF4y2BatgydF4y2Ba以及;gydF4y2Ba*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,gydF4y2Ba**gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01,gydF4y2Ba* * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001, NS表示不显著。确切的gydF4y2BaPgydF4y2Ba值在补充表中提供gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。凝胶源数据参见补充图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba。gydF4y2BacgydF4y2BaBRCA1中H2A、H2AX和UbcH5c波动构象采样的构象空间模拟估计gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba- ubch5c结合型NCP(见gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba）.该图显示了H2A(残基118-129)和H2AX(残基118-142)的c端尾部可到达的泛素化空间。红色虚线表示UbcH5c活性位点半胱氨酸C85的巯基与允许泛素转移的受体赖氨酸ε-氨基之间的距离为3-5 Å。这条线下面的青色阴影区域显示了可被泛素化的组蛋白残基。负距离表示C85的硫原子与H2A或H2AX的α-碳之间的距离足够短，如果相应的受体残基是赖氨酸，则可以实现泛素化。只有H2A残基123-129和H2AX残基123-142满足这个条件。其中三个残基是H2A (K125, K127和K129)和H2AX (K127, K133和K134)中的赖氨酸。在这些计算中考虑了UbcH5c的构象变异性。gydF4y2BadgydF4y2Ba左:H2A和H2AX c端尾部氨基酸序列比对和BRCA1催化核小体H2AX泛素化的时间过程gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-UbcH5c在25°C下用核磁共振光谱探测。信号强度的变化gydF4y2Ba1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba15gydF4y2BaNCP港口的HSQC光谱gydF4y2Ba15gydF4y2Ba监测n标记的H2AX-H2B。右:叠加gydF4y2Ba1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba15gydF4y2Ba泛素化反应开始前和开始后1000 min的N HSQC光谱。来自残余标签残基的信号用黑色标记。gydF4y2BaegydF4y2Ba左图:comasese染色凝胶显示了H2AX中携带WT、双点和三点突变的ncp的泛素化，使用BRCA1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba和UbcH5c。被单酚化的赖氨酸残基用红色表示。右:NCP泛素化的定量gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个独立实验。条形图显示每个数据点的平均值和标准差。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用双样本、双尾Student计算值gydF4y2BatgydF4y2Ba以及;gydF4y2Ba*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,gydF4y2Ba**gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01,gydF4y2Ba* * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001, NS表示不显著。确切的gydF4y2BaPgydF4y2Ba值在补充表中提供gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。凝胶源数据参见补充图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

图2 BRCA1的低温电镜数据处理gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-UbcH5c-nucleosome复杂。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，低温电镜图像处理各阶段流程图。在Titan Krios 300 kV显微镜上收集了5490张显微照片，并进行了光束诱导运动校正。使用cryoSPARC (v2.14)和RELION 3.0进行数据处理。BRCA1的重建gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba选择分辨率最高的-UbcH5c-NCP建立原子模型。Cryo-EM密度重建的载脂蛋白NCP(颗粒没有检测到BRCA1的密度gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-UbcH5c)也进行了研究，并以蓝色箭头表示。在建立三维模型后，所有NCP主链原子在载脂蛋白和复合物状态之间的rm.s.d.为0.29 Å，不包括在两种密度中未检测到的组蛋白尾部。gydF4y2BabgydF4y2BaBRCA1的多体细化及构象动力学分析gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-UbcH5c-NCP使用RELION 3.1。用六个主分量来描述对应于BRCA1的三个刚体之间的运动gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2BaUbcH5c和NCP，每个刚体的两个极端构象以灰色和蓝色显示。BRCA1的刚体运动gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2BaUbcH5c和BRCA1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-UbcH5c整体分别用橙色、红色和黑色曲线箭头表示。gydF4y2Ba

图3验证BRCA1基因的电镜数据和样品低温电镜密度gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-UbcH5c-nucleosome复杂。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，重建BRCA1的cryo-EM密度图显示局部分辨率分布gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-UbcH5c-nucleosome复杂。gydF4y2BabgydF4y2Ba，上:最终重建所用粒子使用RELION 3.0生成的欧拉角分布。每个条都有一个高度和颜色，表示在一个确定的方向上粒子的数量(从蓝色增加到红色)。底部:使用cryoSPARC (v2.14)生成的粒子角分布热图。gydF4y2BacgydF4y2Ba，金标准傅里叶壳相关(GSFSC)曲线，用于cryoSPARC (v2.14)的最终细化。非均匀细化导致3.28 Å分辨率映射。gydF4y2BadgydF4y2Ba在3DFSC服务器上使用三维傅里叶壳相关(3DFSC)算法量化方向分辨率各向异性gydF4y2Ba65gydF4y2Ba。gydF4y2BaegydF4y2Ba，模型计算密度与使用PHENIX生成的最终cryo-EM密度图之间的傅里叶壳相关(FSC)曲线。显示fsc0.5的分辨率。gydF4y2BafgydF4y2Ba，该复合体核小体成分(组蛋白和DNA)的冷冻电镜密度图的代表性区域。gydF4y2BaggydF4y2BaBRCA1基因冷冻电镜密度图的代表性区域gydF4y2BaRgydF4y2Ba, BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba和UbcH5c接口。BRCA1的四螺旋束gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba在左侧高亮显示。gydF4y2BahgydF4y2Ba，涉及BRCA1的界面的cryo-EM密度图的代表性区域gydF4y2BaRgydF4y2Ba和BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba与核小体的相互作用。从左边开始的第一个和第二个表示突出了BRCA1gydF4y2BaRgydF4y2Ba与核小体酸性贴片和BARD1相互作用gydF4y2BaRgydF4y2Ba分别与H2B相互作用。gydF4y2Ba

图4 BRCA1中基于结构的突变的影响gydF4y2BaRgydF4y2Ba, BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba以及核小体组蛋白H2A和H2B与H2A的泛素结合。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba上图:使用UbcH5c和BRCA1进行NCP泛素化时程检测的代表性考马斯氏染色凝胶gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba，野生型(WT)，并伴有BRCA1突变gydF4y2BaRgydF4y2Ba。下图:NCP泛素化的定量gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个独立实验。条形图显示每个数据点的平均值和标准差。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用双样本、双尾Student计算值gydF4y2BatgydF4y2Ba以及;gydF4y2Ba*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,gydF4y2Ba**gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01,gydF4y2Ba* * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001, NS表示不显著。确切的gydF4y2BaPgydF4y2Ba值在补充表中提供gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。凝胶源数据参见补充图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。gydF4y2BabgydF4y2Ba左图:具有代表性的考马斯氏染色凝胶，用于WT的泛素化实验，并通过WT BRCA1指示H2A突变体ncpgydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba和UbcH5c。右:NCP泛素化的定量gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个独立实验。条形图显示每个数据点的平均值和标准差。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用双样本、双尾Student计算值gydF4y2BatgydF4y2Ba以及;gydF4y2Ba*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,gydF4y2Ba**gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01,gydF4y2Ba* * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001, NS表示不显著。确切的gydF4y2BaPgydF4y2Ba值在补充表中提供gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。凝胶源数据参见补充图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。gydF4y2BacgydF4y2Ba，类似于gydF4y2BabgydF4y2Ba但使用了WT，并在NCP中显示了H2B突变。确切的gydF4y2BaPgydF4y2Ba值在补充表中提供gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。凝胶源数据参见补充图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。gydF4y2BadgydF4y2Ba上图:使用UbcH5c和BRCA1进行NCP泛素化时程检测的代表性考马斯氏染色凝胶gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba在BARD1中显示突变gydF4y2BaRgydF4y2Ba。用WT BRCA1进行泛素化实验gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba显示在gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba。下图:NCP泛素化的定量gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个独立实验。条形图显示每个数据点的平均值和标准差。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用双样本、双尾Student计算值gydF4y2BatgydF4y2Ba以及;gydF4y2Ba*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,gydF4y2Ba**gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01,gydF4y2Ba* * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001, NS表示不显著。确切的gydF4y2BaPgydF4y2Ba值在补充表中提供gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。凝胶源数据参见补充图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。gydF4y2BaegydF4y2Ba，叠加gydF4y2Ba1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba15gydF4y2BaWT BRCA1的HSQC核磁共振谱gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba与BRCA1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba藏有BARD1gydF4y2BaRgydF4y2BaP89A或W91A突变。乳腺癌易感基因1gydF4y2BaRgydF4y2Ba和BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba有化学位移变化的信号分别用BC和BD前缀标记。光谱显示突变蛋白折叠良好。W91A突变体的化学位移变化映射到突变位点附近的空间残基，可归因于环电流效应的改变。这些受影响的残基在BRCA1的核磁共振结构上呈红色和青色gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba。显示了W91在核磁共振系综中的多个侧链构象。gydF4y2Ba

图5 BRCA1基因的结构与功能比较gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-UbcH5c和RING1BgydF4y2BaRgydF4y2Babmi1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-UbcH5c与BRCA1的核小体和动力学相关gydF4y2BaRgydF4y2Ba-UbcH5c交互。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba上图:荧光极化核小体结合曲线，显示BRCA1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba和BRCA1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-UbcH5c与NCP结合的亲和力相似，但低于RING1B的亲和力gydF4y2BaRgydF4y2Babmi1gydF4y2BaRgydF4y2Ba为全国大会党。数据为每个数据点的平均值和标准差(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个独立实验)。gydF4y2BaKgydF4y2BadgydF4y2Ba指示值。下图为RING1B的控件绑定曲线gydF4y2BaRgydF4y2Babmi1gydF4y2BaRgydF4y2Ba两种盐浓度下-NCP的相互作用。虽然我们的实验是用50 mM NaCl完成的，但之前发表的探测RING1B的实验gydF4y2BaRgydF4y2Babmi1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-NCP相互作用在100 mM NaCl下进行。较高的RING1BgydF4y2BaRgydF4y2Babmi1gydF4y2BaRgydF4y2Ba大会党gydF4y2BaKgydF4y2BadgydF4y2Ba我们在100 mM NaCl下得到的结果与已发表的数据相似gydF4y2Ba34gydF4y2Ba。gydF4y2BabgydF4y2BaBRCA1三维结构的表面表示gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-UbcH5c-NCP和RING1BgydF4y2BaRgydF4y2Babmi1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-UbcH5c-NCP与NCP的相同取向并列显示，以突出UbcH5c相对于NCP在两个配合物中的完全不同的定位。gydF4y2BacgydF4y2Ba左图:用UbcH5c和BRCA1进行NCP泛素化检测的代表性考马斯氏染色凝胶gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba或RING1BgydF4y2BaRgydF4y2Babmi1gydF4y2BaRgydF4y2Ba使用野生型(WT)蛋白和指定的UbcH5c和BRCA1gydF4y2BaRgydF4y2Ba突变体。右:NCP泛素化的定量gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个独立实验。条形图显示每个数据点的平均值和标准差。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用双样本、双尾Student计算值gydF4y2BatgydF4y2Ba以及;gydF4y2Ba*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,gydF4y2Ba**gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01,gydF4y2Ba* * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001, NS表示不显著。确切的gydF4y2BaPgydF4y2Ba值在补充表中提供gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。凝胶源数据参见补充图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba。gydF4y2BadgydF4y2Ba，顶部:覆盖的gydF4y2Ba1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba15gydF4y2BaBRCA1的核磁共振HSQC谱gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-UbcH5c(红色)，BRCA1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba(青色)和UbcH5c(金色)突出了BRCA1附近的12个残基(黑色标签)gydF4y2BaRgydF4y2Ba-UbcH5c界面，在BRCA1形成后，由于交换展宽，其核磁共振信号消失或变得非常弱gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-UbcH5c复合物，与微秒到毫秒时间尺度上的运动一致。其他七个UbcH5c残基的信号(蓝色标签)，远离BRCA1的界面gydF4y2BaRgydF4y2Ba，也会因为变构效应而交换变宽，就像前面提到的其他UbcH5c和相关配合物一样gydF4y2Ba53gydF4y2Ba，gydF4y2Ba78gydF4y2Ba。下:BRCA1的表面表示gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-UbcH5c复杂。由于BRCA1形成后交换展宽，核磁共振信号消失的区域gydF4y2BaRgydF4y2Ba-BARD1gydF4y2BaRgydF4y2Ba-UbcH5c复合物以黄色突出显示。UbcH5c的活性位点C85用红色表示。gydF4y2Ba

图6显示在H2A、K13和K15位点泛素化核小体的BARD1 (ARD-BRCT)复合物的低温电镜图像处理的各阶段流程图。gydF4y2Ba

在Titan Krios 300 kV显微镜上共收集了5051张显微照片，并进行了光束诱导运动校正。数据处理使用cryoSPARC (v2.15)完成。选择分辨率最高的重构模型构建原子模型。gydF4y2Ba

图7在H2A K13和K15位点泛素化核小体复合物中BARD1 (ARD-BRCT)的EM数据验证。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba与含h2ak13ubk15ub的新型冠状病毒结合的BARD1 (ARD-BRCT)在重构的低温电镜密度图上显示了局部分辨率分布。gydF4y2BabgydF4y2Ba，上:最终重建所用粒子使用RELION 3.0生成的欧拉角分布。每个条都有一个高度和颜色，表示在一个确定的方向上粒子的数量(从蓝色增加到红色)。底部:使用cryoSPARC (v2.15)生成的粒子角分布热图。gydF4y2BacgydF4y2Ba，金标准傅里叶壳相关(GSFSC)曲线，用于cryoSPARC (v2.14)的最终细化。不统一的细化导致2.94 Å分辨率映射。gydF4y2BadgydF4y2Ba在3DFSC服务器上使用三维傅里叶壳相关(3DFSC)算法量化方向分辨率各向异性gydF4y2Ba65gydF4y2Ba。gydF4y2BaegydF4y2Ba，模型计算密度与使用PHENIX生成的最终cryo-EM密度图之间的傅里叶壳相关(FSC)曲线。显示fsc0.5的分辨率。gydF4y2Ba

图8 BARD1 (ARD-BRCT)-泛素化核小体复合物的低温电镜样本密度。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，该复合物不同组分(组蛋白、DNA、BARD1-ARD、BARD1-BRCT和泛素)的低温电镜密度图的代表性区域。gydF4y2BabgydF4y2Ba， cryo-EM密度图的代表性区域，突出了全球界面。gydF4y2BacgydF4y2Bacryo-EM密度图的代表性区域，突出了复合物中各种界面的细节。gydF4y2Ba

图9 BARD1的泛素化核小体结合特性(ARD-BRCT)和k63介导的多泛素链形成的相关抑制。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba上图:加入荧光标记的H2AK13ubK15ub-bearing NCP的BARD1 (ARD- brct)、野生型(WT)和ARD结构域突变的荧光极化结合曲线。GST作为对照，因为BARD1 (ARD-BRCT)被GST标记。数据为每个数据点的平均值和标准差(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个独立实验)。gydF4y2BaKgydF4y2BadgydF4y2Ba指示值。ND，不确定。下图:与上图相似，但具有串联BRCT结构域的指示突变。gydF4y2BabgydF4y2Ba左:与H2AK13ubK15ub-bearing NCP复合物中BARD1 (ARD-BRCT)结构中泛素异肽键附近的低温电镜密度。密度中只检测到一种与BARD1和NCP表面相互作用的泛素分子(即结合泛素)。异肽键区的密度较弱且模糊，这与结合的泛素与H2AK13或H2AK15结合是相容的，提示H2AK13ub和H2AK15ub之间存在结合交换。第二个泛素分子缺乏密度可能是由于未结合状态下的柔韧性。右图:RNF168、UbcH5c和UBA1对BARD1 (ARD-BRCT)-H2A-H2B融合(标记为融合)的泛素化反应，显示用于冷冻电镜纯化的样品中有两个泛素分子附着在H2A上(K13和K15)。所示数据具有代表性gydF4y2BangydF4y2Ba= 5个独立实验。凝胶源数据参见补充图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。gydF4y2BacgydF4y2Ba图中，与H2A K13和K15位点泛素化的NCP结合的BARD1 (ARD-BRCT)结构中BARD1 brct -泛素(左)和h2b -泛素(右)界面的cro - em密度。泛素K63、E64与BARD1接触，泛素I44、G47、H68、V70与H2B接触。gydF4y2BadgydF4y2BaBARD1串联BRCT结构域中推定的磷酸结合位点的位置。预测的磷酸结合残基S575、G576、L618和K619用红色突出显示。gydF4y2BaegydF4y2Ba左图:NCP中mms2 - ubc13催化的H2AK13ubK15ub的多泛素链延伸被添加越来越多的gst标记BARD1 (ARD-BRCT)(最多16倍摩尔过量)所抑制。泛素化效率计算为特定western blot (WB) lane中泛素化产物的总强度与具有不受抑制的MMS2-Ubc13活性的lane的比值。数据为每个数据点的平均值和标准差gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个独立实验。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用双样本、双尾Student计算值gydF4y2BatgydF4y2Ba以及;gydF4y2Ba*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,gydF4y2Ba**gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01,gydF4y2Ba* * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001, NS表示不显著。确切的gydF4y2BaPgydF4y2Ba值在补充表中提供gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。右:代表性的WB图像显示GST标记的BARD1 (ARD-BRCT)抑制NCP中mms2 - ubc13催化的H2AK13ubK15ub多泛素链延伸，而GST没有抑制。非泛素化的NCP作为对照底物，仅被MMS2-Ubc13显示出游离泛素链延伸，不受BARD1 (ARD-BRCT)的抑制。所有带ATP的通道都显示MMS2-Ubc13形成了带有额外链延伸的二泛素，这表明BARD1或GST不抑制MMS2-Ubc13。凝胶源数据参见补充图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

图10 BARD1错义变体与泛素化核小体复合物在BARD1 (ARD-BRCT)三维结构中位于区域间和分子间界面附近。gydF4y2Ba

在癌症患者中发现错义变体的BARD1 (ARD-BRCT)残基侧链在BARD1 (ARD-BRCT)-泛素化NCP的3D结构上被突出显示。只有位于域间和分子间界面附近的变异才会在每个界面上以不同的颜色显示。当氨基酸直接参与BARD1 (ARD-BRCT)泛素化NCP结构的结构域间或分子间相互作用时，它们就会被标记。这些变异是从美国国立卫生研究院的ClinVar数据库中获得的gydF4y2Ba79gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

扩展数据表1 Cryo-EM数据收集、细化和验证统计gydF4y2Ba
全尺寸表gydF4y2Ba

补充信息gydF4y2Ba

补充信息gydF4y2Ba

本文件包含补充文本、补充图1-7和补充表1-2。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

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视频1gydF4y2Ba

brca1 - bard1 - ubch5c -核小体复合体的三维变异分析。gydF4y2Ba

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brca1 - bard1 - ubch5c -核小体复合物的多体分析。gydF4y2Ba

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胡强，波图彦，M.V，赵，D。gydF4y2Baet al。gydF4y2BaBRCA1-BARD1核小体识别和泛素化机制。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba596gydF4y2Ba， 438-443(2021)。https://doi.org/10.1038/s41586-021-03716-8gydF4y2Ba

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