RecA通过降维搜索找到同源DNAgydF4y2Ba

为了研究活细菌中的同源重组机制，我们创建了一个诱导DSB系统，包括(1)一个诱导Cas9核酸酶，在特定的染色体位置(“切割位点”)产生DSB，(2)一个荧光体gydF4y2Ba帕尔斯gydF4y2Ba/ mCherry-ParB系统(以下简称ParB)来可视化染色体断裂位置，以及(3)sos反应gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba报告者选择进行DSB修复的细胞(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Ba、扩展数据图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。我们使用了微流体母机的变种gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba这允许短暂的Cas9核酸酶诱导(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

DSB形成后，RecBCD进行末端处理，去除断口附近的ParB标记gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba，并通过激活sos响应报告器(图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。Cas9脉冲在染色体切割位点的细胞中诱导特定的dsb，在诱导后不久，伴随着sos激活细胞比例的增加(图。gydF4y2Ba1 c, dgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。在没有切割位点的细胞中表达Cas9或表达催化死亡的Cas9 (dCas9)不会诱导SOS反应(图2)。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)。SOS反应的激活依赖于同源重组，在缺失的细胞中不存在gydF4y2BarecAgydF4y2Ba或gydF4y2BarecBgydF4y2Ba基因(扩展数据图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)。由于dsb而丢失的ParB焦点在野生型细胞中被恢复和分离，但在缺乏关键重组成分的细胞中却没有(扩展数据图)。gydF4y2Ba2 c fgydF4y2Ba)。这些结果表明，诱导的dsb可以通过同源重组得到修复。修复是非常稳健的:95.5%(468个中有447个)保留了未裂解模板的细胞修复了DSB，随后分裂。在没有修复模板的细胞中，修复功能受损，因为在4小时的实验中，没有一个细胞在切割部位的所有副本上分裂(gydF4y2BangydF4y2Ba= 27个细胞，3次实验)。gydF4y2Ba

接下来，我们重点研究了修复过程中切口位点的动态变化。通常，在DSB后，未切割的位点首先易位到细胞中部，然后分裂成两个病灶，随后分离(图2)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)。当我们沿着细胞长度绘制ParB焦点的位置与相对于DSB事件的时间的关系时，这种模式是可见的。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)。然后，我们测量了单个细胞的修复时间，即ParB焦点丢失和再现之间的时间(图2)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)。我们将分析限制在DSB之前有两个分离的ParB病灶的细胞。我们发现DSB在15.2±5.0 min内修复。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)。这些结果在重复之间是一致的(扩展数据图。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)，特别是当I-SceI代替Cas9诱导断裂时(扩展数据图。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)，或将ParB标记替换为gydF4y2Ba不全gydF4y2Ba由MalI - venus蛋白结合的阵列(称为“MalI”)(扩展数据图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。当DSB的一侧是ParB，另一侧是MalI时，两端同时处理，并遵循相同的动力学(扩展数据图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。考虑到修复时间只是生成时间的一小部分(这里是35±10分钟)，我们测试了它是否对适应度有负面影响。单次DSB将分裂延迟至55±10 min;然而，这种延迟在接下来的几代中被更快的分裂所补偿。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)。在接受DSB修复的细胞中，生长速率暂时降低了4%。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

ParB病灶的丢失阻碍了对切割位点位点的观察。因此，为了可视化断裂点的动态，我们使用了一组在RecBCD未处理的距离上集成的MalI标记gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba}(距离被切割的位置为- 25kb或+ 170kb)gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)。两个MalI标记中的任何一个成像显示，在DSB后，两个姐妹位点都移动到细胞中部，在那里它们共定位(图2)。gydF4y2Ba2, cgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba4 a, cgydF4y2Ba)。姐妹MalI标记的运动是对称的，不像先前报道的动态，在DSB后，分裂的姐妹位点移动得更远gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba}．为了测试姐妹位点的共定位是特异性的还是由染色体的整体排列引起的，我们使用了一个整合在染色体另一侧的远端MalI标记(gydF4y2BaygaYgydF4y2Ba)。遥远的gydF4y2BaygaYgydF4y2Ba标记在修复过程中保持其典型位置(图;gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)，排除了同源重组修复诱导整个染色体配对的模型。相反，它似乎共定位是特定的裂切部位及其同源性。由于姐妹位点在通过搜索定位之前与其他染色体位点没有区别，我们得出结论，姐妹位点的共定位意味着完成同源性搜索(扩展数据图)。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)。−25 kb标记的共定位时间为9.1±3.3 min。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)，因此同源搜索速度比此更快。gydF4y2Ba

同源性搜索由组装在单链DNA (ssDNA)上的RecA细丝介导。gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba}荧光RecA融合形成的结构之前已经成像gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}．我们使用与野生型结合的RecA黄色荧光蛋白(YFP)融合来观察DSB修复过程中的RecA活性gydF4y2BarecAgydF4y2Ba，一个结构被发现是完全活跃的(图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba5 b, ggydF4y2Ba)。一个类似的结构之前已经被证明具有完全的功能gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba但还没有被用来描述遥远的修复事件。gydF4y2Ba

诱导dsb导致gydF4y2BarecBgydF4y2Ba在DSB位点依赖于RecA结构的形成(图;gydF4y2Ba3gydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba)。这些结构出现时间为35±98 s(扩展数据图;gydF4y2Ba5 hgydF4y2Ba)，并在6.6±5.2 min后拆解(扩展数据图;gydF4y2Ba5我gydF4y2Ba)在修复完成之前，由ParB病灶分离定义。SOS响应由组装在ssDNA上的RecA灯丝激活gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba}．我们预测，如果结构是RecA-ssDNA细丝，它们的寿命将与SOS响应的强度相关。事实确实如此(皮尔逊的gydF4y2BargydF4y2Ba= 0.36,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 3 × 10gydF4y2Ba^{−12gydF4y2Ba}扩展数据图gydF4y2Ba5 d, egydF4y2Ba)，我们确信该结构为RecA-ssDNA丝状结构。gydF4y2Ba

RecA结构在几十秒的时间尺度上是高度动态的(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。平均寿命为8.8±3.0 min。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)，在这段时间内，它们表现出两种形式:在DSB处的初始点(存在2.6±1.4 min)，强度增加(扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，提示在ssDNA上加载RecA;以及从初始点挤出并延伸到整个电池的灯丝(存在6.2±2.8分钟)。gydF4y2Ba

据报道，在细菌DSB修复过程中，RecA形成束状结构gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba．为了测试我们是否可以观察到这种结构，我们使用激发发射耗竭超分辨率显微镜(STED)对标记有ALFA表位的RecA进行成像gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba．单独的RecA-ALFA在DSB修复中完全起作用(扩展数据图。gydF4y2Ba5 b, ggydF4y2Ba)。进行DSB修复的细胞免疫染色显示，RecA形成薄的丝状结构(图。gydF4y2Ba3 f、hgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)，它们与细胞膜无关，相反，它们出现在细胞的中心区域(图。gydF4y2Ba3 i, jgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba6罪犯gydF4y2Ba，补充视频gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)。用成像系统的点扩散函数(PFS)对观测到的60±13 nm半最大全宽(FWHM)进行反褶积，得到丝宽为37.5±23.5 nm(图5)。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba6 e, fgydF4y2Ba)。正如预期的那样，鉴于RecA-YFP结构在活细胞中的高流动性，固定细胞表现出各种各样的构象，包括复杂的、纠结的线或横跨细胞长度的单一的、缠绕的细丝(图2)。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba)。值得注意的是，当免疫染色RecA-YFP的串联结构时，我们观察到相同类型的结构。gydF4y2Ba6克gydF4y2Ba)，或RecA-ALFA, RecA-YFP串联结构(扩展数据图。gydF4y2Ba6 h-kgydF4y2Ba)。这些结果表明，同源性搜索是通过薄而灵活的RecA细丝进行的。gydF4y2Ba

与其他依赖同源定向搜索的系统相比，RecA的目标搜索速度更快gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba需要一个不同的定量模型。由于大的RecA-ssDNA复合体和染色体位点的扩散速度都很慢gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba在三维空间中，无法用双分子反应-扩散来解释gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba．我们提出，RecA同源搜索由“降维”机制促进，该机制以两种方式加速了该过程。首先，ATP水解使RecA-ssDNA丝在不到一分钟的时间内穿过细胞，迅速覆盖断端和搜索目标之间的大部分距离，如图所示。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba．第二，延长的纤维与许多不同的序列并行相互作用。这种同时探测在单分子实验的基础上已经被提出过gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba和冷冻电子显微镜结构gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba．我们对模型的补充是认识到在任何gydF4y2BazgydF4y2Ba坐标(即沿着细胞的长轴)，始终有至少一段拉伸的RecA-ssDNA丝同时与双链DNA (dsDNA)片段同源gydF4y2BazgydF4y2Ba位置(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。这使得搜索问题独立于gydF4y2BazgydF4y2Ba协调并将复杂性从三维降低到二维。也就是说，同源配对的时间等于染色体dsDNA片段径向扩散到RecA-ssDNA丝的时间，而不是两个片段在整个细胞中通过3D扩散找到彼此所需的时间。在这种情况下，2D搜索大约比3D搜索快100倍gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba(有关详细描述，请参见gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

在补充信息中，我们推导了同源序列相遇的期望时间的表达式。我们的模型根据目标DNA在类核半径长度尺度上的扩散速率预测搜索将在5分钟内完成gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba．值得注意的是，该模型还预测搜索时间应该与单元长度不变，因为只有径向距离是相关的。这将我们的模型与以前的模型区分开来，例如参考文献中提出的模型。gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba．实验数据证实，细胞的长度对ParB焦点分裂、RecA结构寿命或马里焦点在细胞中部共定位估计的搜索时间有微小的影响(图2)。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)，尽管更大的细胞有更多的DNA需要探索(扩展数据图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

我们提出，拉伸的RecA-ssDNA丝——以一种简单而优雅的方式——将至少一个ssDNA片段定位在其同源姐妹的附近，这样同源dsDNA片段就可以使用快速、近距离搜索找到ssDNA片段。RecA是链交换蛋白家族的原型成员，它存在于所有形式的生命中，并具有共同的机制gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba}．降维机制可能是这些蛋白质的保守性质。拉伸纤维的优势在拉长细胞中是明显的，长RecA结构确实在gydF4y2Ba茎菌属crescentusgydF4y2Ba^11gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba．当DSB修复发生在姐妹模板附近的复制分叉处时，荧光RecA仅在断裂部位形成短暂焦点gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba这表明，在RecA灯丝完全延伸之前，研究可能就会结束。先前的研究表明，I-SceI诱导的dsb修复是通过“束”进行的，“束”是由RecA形成的复杂结构gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba．这些束的特点是中心体厚，流动性低，寿命只有几十分钟，位于类核和内膜之间。我们发现参与DSB修复的RecA细丝与这些束明显不同:它们很薄，动态，仅持续几分钟，并且存在于类核内(图2)。gydF4y2Ba3 h,我gydF4y2Ba)。值得注意的是，根据降维模型，搜索时间不受DNA量增加的影响，只要灯丝的长度与DNA量成比例。因此，这种机制可以在基因组比细菌大的生物体中进行搜索。gydF4y2Ba

紧张施工gydF4y2Ba

在这项工作中使用的菌株是衍生物gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaTB28gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba其中我们恢复了gydF4y2Barph-1gydF4y2Ba突变为野生型并删除gydF4y2Ba马里gydF4y2Ba基因和gydF4y2Ba不全gydF4y2Ba操作符。遗传整合是用lambda红整合完成的gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba，用pCP20质粒去除抗性盒gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba，标记物通过P1噬菌体转导进行组合。gydF4y2Ba

标签mCherry-ParBMt1gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba和MalI-Venus由整合到基因中的本构启动子表达gydF4y2BagtrAgydF4y2Ba轨迹。的gydF4y2Ba不全gydF4y2Ba/MalI标记由12个麦芽糖操作符组成，这些操作符是MalI- venus的结合位点。gydF4y2Ba

DSB盒由两侧的I-SceI识别位点组成gydF4y2Ba虫胶gydF4y2Ba运营商,gydF4y2BaparSMt1gydF4y2Ba站点和三gydF4y2Ba气gydF4y2Ba位于parSMt1和I-SceI识别序列之外的位点(扩展数据图。gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)。Cas9靶点选在距离细胞约100bp的地方gydF4y2BaparSMt1gydF4y2Ba网站。值得注意的是，该结构的设计方式没有gydF4y2Ba气gydF4y2Ba站点之间的DSB站点和gydF4y2BaparSMt1gydF4y2Ba网站。将DSB卡带集成成gydF4y2BacodAgydF4y2Ba轨迹。gydF4y2Ba

RecA-YFP融合基因在内源性基因下游直接表达gydF4y2BarecAgydF4y2Ba通过ref将构造中的mCherry替换为SYFP2。gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba．RecA-ALFA融合体通过引入ALFA c端来实现gydF4y2BarecAgydF4y2Ba无论是野生型还是野生型gydF4y2BarecAgydF4y2Ba轨迹或进入上面提到的串联结构。gydF4y2Ba

本研究中使用的菌株列表可在扩展数据表中找到gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba．gydF4y2Ba

质粒构建gydF4y2Ba

p15a-SceIdeg-amp采用HiFi DNA Assembly (NEB)融合两个PCR片段进行克隆:(1)pSC101SceI_deg_ampgydF4y2Ba^8gydF4y2Ba(2) p15aSceI_deg_Kan片段gydF4y2Ba^8gydF4y2BaJwu037和Jwu038扩增片段。从p15a-SceIdeg-amp模板扩增出的2个PCR片段(1)Jwu088和Jwu090， (2) Jwu085和Jwu091，经Gibson组装克隆得到p15a-dSceIdeg-amp。p15a-Cas9deg-amp由两个片段(1)Jwu273和Jwu274扩增的p15a-SceIdeg-amp片段和(2)Jwu263和Jwu264扩增的pCRED片段(来自Daniel Camsund)组成。采用Gibson组装法克隆了质粒p15a-SceIdeg-amp- sos，分别采用引物Jwu330和Jwu331扩增p15a-SceIdeg-amp片段gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba引物Jwu332和Jwu333。采用Gibson组装法克隆p15a-Cas9deg-amp-SOS质粒，引物Jwu263和Jwu272扩增p15a-wtCas9deg-amp片段，引物Jwu273和Jwu274扩增p15a-SceIdeg-smp-SOS片段。p15a-dCas9deg-amp-SOS采用Gibson组装协议克隆(1)p15a-SceIdeg-amp-SOS扩增片段，引物为Jwu273和Jwu274gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba利用引物Jwu264和Jwu272对菌株EL1605进行测序。pKD13-recA:: alfa - cash - syfp2 -frt-kan-frt采用金门协议克隆(1)片段扩增gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba引物Jwu485和Jwu486，(2)从菌株EL2515中扩增出片段gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(3)引物Jwu489和Jwu490从pKD13-P58-SYFP2-frt-kan-frt中扩增的片段。gydF4y2Ba

psgRNA-CS1被克隆gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba将Jwu267、Jwu184和psgRNA PCR生成的片段钝端结扎获得Top10gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba质粒作为模板(psgRNA是D. Bikard的礼物;添加基因质粒号。114005)，引导RNA (gRNA)序列为ACTGGCTAATGCACCCAGTA。gydF4y2Ba

本研究中使用的引物列表可在扩展数据表中找到gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

高通量DSB成像gydF4y2Ba

生长条件gydF4y2Ba

在微流控实验中，细胞在添加0.4%葡萄糖、0.08% RPMI 1640氨基酸(Sigma-Aldrich R7131)、表面活性剂Pluronic F-109 (Sigma-Aldrich 542342, 21µg ml的M9培养基中37°C生长gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})，当相关卡本西林(40µg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})或卡那霉素(20µg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})。从- 80°C冷冻库中取出的细胞接种添加了足够抗生素的LB培养基，并在37°C下培养过夜。第二天，细胞在M9 0.4%葡萄糖0.08% RPMI培养基中稀释1/250，培养2 h后加载到微流控芯片上。在实验开始前，细胞在微流控芯片中生长至少2小时。Cas9和dCas9的诱导时间为5分钟(扩展数据图中的点计数实验为6分钟)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba) aTc脉冲(20 pg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})。gydF4y2Ba

显微镜gydF4y2Ba

显微镜实验采用Ti2-E(尼康)倒置显微镜，配备CFI Plan Apochromat DM Lambda 100×物镜(尼康)，Sona 4.2B-11 sCMOS相机(Andor)， Spectra III (Lumencor)荧光光源。显微镜由Micro-Manager控制gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba运行内部构建插件。荧光光源由TTL连接的相机触发。使用定制荧光立方体:CFP激发滤波器:BrightLine FF02-438/24 (Semrock)，发射滤波器:BrightLine FF01-494/41 (Semrock)，二向色镜:Di02-R442 (Semrock);YFP激励滤波器:FF01-514/3-25 (Semrock)，发射滤波器:ET550/50M 200362 (Chroma)，二向色镜:Di02-R514 (Semrock);mCherry励磁滤波器:FF01-559/34 (Semrock)，发射滤波器:T590LP 262848 (Chroma)，二向色镜:T585lpxr (Chroma)。用1.5倍中倍镜成像。在插入CFP立方体的情况下拍摄相位对比图像。通常情况下，每分钟采集一张相位对比图像，曝光80 ms, CFP通道每3分钟采集一张，荧光强度设置为5%，曝光40 ms, mCherry通道每分钟采集一张，荧光强度设置为20%，曝光80 ms, YFP通道每分钟采集一张(用于RecA成像)，或每2分钟采集一张(用于MalI实验)，荧光强度设置为40%，曝光100 ms。用于扩展数据图中的点计数实验。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2BamCherry通道每3分钟成像一次gydF4y2BazgydF4y2Ba在每个时间点取间隔300 nm的切片，采用最大强度投影法重建荧光图像。gydF4y2Ba

微流控实验gydF4y2Ba

微流控实验采用前期研制的PDMS母机微流控芯片进行gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba．这种芯片设计允许加载两种不同的应变和自动切换介质。使用OB1 MK3+微流体流量控制器(Elveflow)控制介质压力。在3小时实验开始时脉冲aTc，或在图像采集开始后20分钟脉冲aTc, 4小时实验。gydF4y2Ba

染色体DAPI染色gydF4y2Ba

菌株EL2504和EL1743(与gydF4y2BadnaC2gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba)在LB培养基中过夜生长。第二天，将细胞培养物稀释在5 ml M9中，加入0.4%葡萄糖和0.08% RPMI 1640氨基酸(Sigma-Aldrich R7131)，并在37°C下培养(菌株EL2504)。EL1734菌株在30°C下培养2小时，然后在42°C下培养一个培养基以诱导复制停止。DAPI加入最终浓度为1µg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}含DAPI的细胞在生长温度下孵育30 min。然后将1 ml细胞在4℃、7000转/分(5424 R, Eppendorf)下离心3分钟，再悬于50 μl添加10 mM MgCl的ITDE (Integrated DNA Technologies)冷缓冲液中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．将2 μl浓缩细胞置于琼脂糖垫上成像。成像用功率为12 mW cm的445 nm激光完成gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}曝光时间为220毫秒。采用Nested-Unet神经网络对相位对比图像进行分割gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba他在公司内部接受培训。DAPI图像通过减去细胞外区域的平均像素强度来校正背景。gydF4y2Ba

图像分析gydF4y2Ba

数据分析是用MATLAB (Mathworks)完成的，除了单元格分割是用Python完成的。显微镜数据使用之前开发的自动化分析管道进行处理gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba，经过了几处修改。首先，利用Nested-Unet神经网络对相位对比图像进行分割gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba内部培训，专门为我们的显微镜设置。神经网络使用Pytorch 1.7.1。我们训练了两个网络，一个用于分割细胞，另一个用于在相位对比图像上检测微流体生长通道(扩展数据图)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)。测量不同滤波立方体获取的图像之间的转换矩阵，并对荧光图像进行转换，以校正荧光图像和相位对比度图像之间的像素移位。格拉姆gydF4y2Ba^31gydF4y2Ba工具箱在Matlab中生成部分图。gydF4y2Ba

DSB细胞的选择和分析gydF4y2Ba

接受DSB修复的细胞是在质粒携带的SOS报告细胞CFP信号增加至少4倍的基础上选择的。首先，通过从原始CFP图像中减去一个核大小为20像素的高斯滤波器滤波的图像(使用Matlab函数imgaussfilt)，对CFP图像进行背景校正。我们将分析局限于在分割中没有重大错误、存活至少9分钟并在实验中分裂的细胞。手动修复动力学注释仅在DSB之前包含两个ParB病灶的细胞上进行，并在修复后进行分裂。有>2 ParB病灶的细胞，或诱导DSB不止一次的细胞，被排除在分析之外。在扩展数据图的实验中。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba采用基于径向对称的方法自动检测ParB病灶。使用自定义编写的Matlab代码将斑点位置映射到单元长度上。所有显示样例细胞的图像都来自至少重复两次的实验，除了RecA-YFP和RecA-ALFA的costaining只做了一次(扩展数据图。gydF4y2Ba6 h-kgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

超分辨率STED显微镜gydF4y2Ba

样品制备gydF4y2Ba

表达RecA-ALFA, RecA-YFP或两者的细胞在37℃的M9培养基中培养3小时，培养基中含有葡萄糖(0.4%)，RPMI 1640氨基酸(0.08%)，卡本西林(20µg ml)gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})和卡那霉素(10µg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})。用aTc (0.8 pg ml)诱导Cas9 40 mingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})，然后用甲醛(3.5%)固定细胞10分钟。用100 mM甘氨酸淬灭固定，细胞在PBS中洗涤，然后在70%乙醇中渗透1小时。染色时，细胞在含牛血清白蛋白(1%)的PBS中封闭30分钟，然后用1:200稀释的抗体孵育至少1小时。我们使用偶联Star635P或Star580的骆驼单结构域抗体。用于RecA-ALFA flutag - x2抗alfa (N1502-Ab635P)和RecA-YFP flutag - x4抗gfp (N0304-Ab635P和N0304-Ab580, NanoTag生物技术公司)。在没有表位的情况下，没有检测到抗体结合(扩展数据图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。为了显示类核和膜，分别用Pico488(1:400稀释，Lumiprobe)和尼罗红(5µM)对细胞进行染色。在PBS中清洗三次后，细胞被安装在琼脂糖垫上进行显微镜检查。gydF4y2Ba

2D和3D STED显微镜gydF4y2Ba

使用定制的STED装置进行超分辨率成像gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba．用脉冲二极管激光器对染料进行激发;561 nm (PDL561, Abberior Instruments)， 640 nm (LDH-D-C-640, PicoQuant)和510 nm (LDF-D-C-510, PicoQuant)。使用775 nm激光(KATANA 08 HP, OneFive)作为耗尽光束，利用空间光调制器(LCOS-SLM X10468-02, Hamamatsu Photonics)将其分裂成两束正交偏振光束，分别在焦平面上形成甜甜圈和礼帽形状，实现2D和3D-STED成像。激光束用HC PL APO 100×/1.40 Oil STED White物镜(15506378,Leica Microsystems)聚焦在样品上，并采集荧光信号。在物镜的第一共轭后焦平面测量，561 nm激发激光功率为8-20 μ W, 640 nm激发激光功率为4-10 μ W, 775 nm耗尽激光功率为128 mW，完成成像。gydF4y2Ba

RecA-YFP与RecA-ALFA以逐行扫描方式进行双色STED成像，平均超过4或8行;ParB和RecA-ALFA逐帧记录，第一通道为共焦，第二通道为STED。所有2D图像的像素大小设置为20 nm，像素停留时间为50µs。gydF4y2Ba

逐行扫描方式记录RecA-ALFA和尼罗红的体积双色3D-STED成像，随后在细菌细胞中间记录Pico488的单共焦帧。的体素大小gydF4y2BaxyzgydF4y2Ba体积设置为25 × 25 × 80 nmgydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba}．像素停留时间设置为30或50µs。gydF4y2Ba

使用ImSpector软件(Max-Planck Innovation)和ImageJ对原始图像进行处理和可视化gydF4y2Ba^{33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba}．亮度和对比度对整个图像进行线性调整。计算垂直于结构方向的RecA细丝和RecA束的尺寸，并在原始图像上的两个像素上进行平均。然后用OriginPro2020软件对数据进行高斯函数拟合，从中提取全宽半最大值。为gydF4y2BaxzgydF4y2Ba在ImSpector中实现的Richardson Lucy反褶积算法对图像进行反褶积。在Imaris 9.1 (Bitplane)中使用惠更斯反褶积完成三维体绘制。gydF4y2Ba

显微镜的分辨率是在校准样品上测量的，校准样品由附着在玻璃上的稀疏抗体制成，再加上Star635P染料。提取直线轮廓，并用洛伦兹函数进行拟合gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba，其中宽度(gydF4y2BaWgydF4y2Ba)提取为网点大小。gydF4y2Ba

我们估计丝的直径为37.5±23.5 nm，作为观测到的60±13 nm FWHM宽度的反褶积(图2)。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)与成像系统的35±11 nm (FWHM) Lorentzian PFS(扩展数据图;gydF4y2Ba6 fgydF4y2Ba)假设灯丝是一个表面有3纳米荧光团层的圆柱体。gydF4y2Ba

I-SceI实验gydF4y2Ba

对于I-SceI超切酶的实验，将含有p15a-I-SceI质粒的细胞培养在M9最小培养基中，加载在微流控芯片中，然后在37°C的M9培养基中与葡萄糖(0.4%)、RPMI 1640氨基酸补充物(Sigma-Aldrich R7131, 0.05%)、卡本西林(20µg ml)孵育gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})和Pluronic F-108(21µg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})。通过切换到同样含有aTc (20 ng ml)的培养基3分钟诱导dsbgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})和IPTG (1 mM)，然后3分钟至中仅IPTG。然后对细胞进行成像，同时在初始培养基中修复和恢复。gydF4y2Ba

连续稀释镀法gydF4y2Ba

细菌培养物从冷冻库中取出，在洛杉矶的盘子上划线，在37°C下培养一夜。第二天，用隔夜培养皿中的单个菌落接种5 ml LB培养基，在37℃下培养6 h。接着，在LB中连续稀释10倍，每稀释4 μl分别镀于LA板或含1 μg ml的LA板上gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}萘啶酸。在37°C下孵育过夜。gydF4y2Ba

用扩展的RecA细丝搜索模型gydF4y2Ba

同源搜索将被视为一个扩散限制反应，具有同源序列到达反应半径的运输时间和序列相遇后的探测时间。与获取同源序列的时间相比，正确序列的探测时间可以忽略不计，但需要探测的大量不正确句子会减慢整体反应。gydF4y2Ba

为了量化这些情况，我们从很少的近似开始。假设RecA-ssDNA细丝是圆柱形核体中心的细杆，从一个极点延伸到另一个极点gydF4y2BazgydF4y2Ba而同源dsDNA序列在类核的随机位置上盘绕。同源序列找到彼此的相关时间是盘绕起来的dsDNA片段径向扩散到细胞中心的棒的时间。在我们的模型中，核心的认识是，在哪个位置并不重要gydF4y2BazgydF4y2Ba-坐标它到达杆子。这将搜索问题从3D转换为2D，因为我们可以从dsDNA片段的角度来描述搜索过程，该dsDNA片段与恰好位于的ssDNA序列同源gydF4y2BazgydF4y2Ba-杆最先到达的位置。gydF4y2Ba

考虑这种情况的等效方法是考虑许多独立搜索器(即染色体dsDNA片段)的第一个绑定事件，每个可以绑定到许多目标中的一个(即reca结合的ssDNA片段)，与一个可以绑定所有目标的搜索器具有相同的速率。总结合速率为gydF4y2Ba\ (r ={\总和}_{我}{r} _{我}\)gydF4y2Ba，其中gydF4y2BargydF4y2Ba_我gydF4y2Ba是模板段收费吗gydF4y2Ba我\ \ ()gydF4y2Ba找到它的同源ssDNA片段。如果我们写出at的依赖关系gydF4y2BazgydF4y2Ba协调,gydF4y2Ba\ ({z} _ {j} \)gydF4y2Ba时，灯丝到达时，总速率可表示为gydF4y2Ba\ (r ={\总和}_ {j}{\总和}_{我}{r} _{我}({z} _ {j}) p ({z} _ {j}) \)gydF4y2Ba，其中gydF4y2Baz \ (p ({} _ {j}) \)gydF4y2Ba到达灯丝位置的概率是多少gydF4y2Ba\ ({z} _ {j} \)gydF4y2Ba而且gydF4y2Bar \ ({} _ {} ({z} _ {j}) \)gydF4y2Ba是分段的条件费率吗gydF4y2Ba我\ \ ()gydF4y2Ba考虑到灯丝达到gydF4y2Ba\ ({z} _ {j} \)gydF4y2Ba．在这里，除非模板片段与特定的ssDNA匹配，否则结合率为零gydF4y2BazgydF4y2Ba-position，即，gydF4y2Bar \ ({} _ {} ({z} _ {\ ne我})= 0 \)gydF4y2Ba这意味着gydF4y2Ba\ (r ={\总和}_{我}{r} _{我}({z} _{我})\)gydF4y2Baz \ (p({} _{我})\)gydF4y2Ba，即总结合率与单个dsDNA片段的结合率相同，该片段可以在灯丝的任何位置结合，与gydF4y2BazgydF4y2Ba位置，并且每个位置都是同源的。gydF4y2Ba

搜索时间预测gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba

对于染色体dsDNA片段从类核中的随机径向位置扩散到其中心的纤丝所需要的时间的一阶近似，我们可以使用扩散限制速率来达到圆柱体中心的棒gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba长度为2gydF4y2BalgydF4y2Ba，也就是说，gydF4y2BakgydF4y2Ba= 2π(2gydF4y2BalgydF4y2Ba）gydF4y2BaDgydF4y2Ba/ ln (gydF4y2BaR / RgydF4y2Ba)，其中gydF4y2BargydF4y2Ba反应棒的反应半径，假设在核苷酸的量级(1nm)，和gydF4y2BaRgydF4y2Ba是类核半径。搜索dsDNA片段的浓度为gydF4y2BacgydF4y2Ba= 1 /gydF4y2BaVgydF4y2Ba= 1 / (2gydF4y2BalgydF4y2BaπgydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)，其中gydF4y2BaVgydF4y2Ba是类核体积。因此到达杆的平均时间为gydF4y2BaTgydF4y2Ba=gydF4y2BaVgydF4y2Ba/gydF4y2BakgydF4y2Ba=gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Baln (gydF4y2BaRgydF4y2Ba/gydF4y2BargydF4y2Ba) / 2gydF4y2BaDgydF4y2Ba．核半径gydF4y2BaRgydF4y2Ba≈200 nm，反应半径约为gydF4y2BargydF4y2Ba≈1nm，虽然确切的值是无关紧要的，因为只有它的对数进入时间。复杂的参数是扩散速率常数gydF4y2BaDgydF4y2Ba，因为DNA位点的运动是次扩散的gydF4y2BaDgydF4y2Ba因此在长长度尺度上比短长度尺度上要低。然而，该过程将受到相应的长距离运动的限制gydF4y2BaRgydF4y2Ba．在长度尺度上gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba的gydF4y2BaRgydF4y2Ba= 200nm，gydF4y2BaDgydF4y2Ba_RgydF4y2Ba≈0.0007 μmgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．搜索过程的关联步骤是这样的gydF4y2BaTgydF4y2Ba≈(0.2 μm)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba× ln(200 nm/1 nm)/0.0007 μmgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}= 300秒= 5分钟。如果我们考虑RecA灯丝也在分钟的时间尺度上移动，这只会进一步加快搜索速度。gydF4y2Ba

探测时间gydF4y2Ba

然而，由于RecA细丝还需要探测所有其他的dsDNA片段，因此它不能一直被用于结合。如果同源序列只需要测量到的搜索时间的一半(约10分钟)，那么对其他序列的探测还有5分钟的时间。这足以探测所有序列吗?如果dsDNA被探测gydF4y2BangydF4y2Ba-bp长的片段，在RecA纤维中2 kb长的ssDNA的每一个等长片段平均每2000 /一次gydF4y2BangydF4y2Ba染色体的片段。细胞中dsDNA有9.6 Mb(每个基因组4.8 Mb ×每个细胞约2个基因组)，对应9.6 × 10gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba/gydF4y2BangydF4y2Ba探测部分。反过来，这意味着RecA灯丝中的每个ssDNA片段都需要测试(9.6 × 10gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba/gydF4y2BangydF4y2Ba) / (2000 /gydF4y2BangydF4y2Ba) = 4,800个dsDNA片段。每次测试的平均时间不能超过300 s/ 4800≈63 ms，考虑到Cas9-sgRNA执行类似任务平均需要30 ms，这应该是足够的时间gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

ATP结合和水解gydF4y2Ba

ATP-RecA对ssDNA具有较高的亲和力gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba并在结合后的结果是一个拉伸和刚性的灯丝与持久的长度gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba大约900纳米。ATP水解降低了RecA对ssDNA的亲和力，是快速丢弃不匹配序列所必需的gydF4y2Ba^{17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba}．因此，需要ATP周转来拉伸细胞内环境中的纤维，否则它将陷入部分同源。gydF4y2Ba

替代模型gydF4y2Ba

如何获得足够接近的序列以探测同源性的替代模型可以有许多其他形式。gydF4y2Ba

最简单的比较是考虑扩散速率对应dsDNA片段的粒子和反应半径对应的非扩散片段的扩散限制双分子反应gydF4y2BargydF4y2Ba(约1nm)在核碘的任何位置。这里，扩散限制反应的速率是gydF4y2BakgydF4y2Ba= 4πgydF4y2Ba理查德·道金斯gydF4y2Ba_lgydF4y2Ba，其中gydF4y2BaDgydF4y2Ba_lgydF4y2Ba就是扩散gydF4y2Ba^{38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba}细胞长度尺度上的速率，而段的浓度与上面相同(gydF4y2BacgydF4y2Ba= 1 /gydF4y2BaVgydF4y2Ba= 1 / (2gydF4y2BalgydF4y2BaπgydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba))。结果是gydF4y2BaTgydF4y2Ba=gydF4y2BaVgydF4y2Ba/gydF4y2BakgydF4y2Ba=gydF4y2BaLRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba/ 2gydF4y2Ba理查德·道金斯gydF4y2Ba_lgydF4y2Ba．这应该与gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Baln (gydF4y2BaRgydF4y2Ba/gydF4y2BargydF4y2Ba) / 2gydF4y2BaDgydF4y2Ba_RgydF4y2Ba在二维情况下。重要的是，在类核半径长度尺度上的扩散速率，gydF4y2BaDgydF4y2Ba_RgydF4y2Ba，是一个数量级gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba快于;gydF4y2Ba_lgydF4y2Ba．比率为(gydF4y2BalgydF4y2Ba/gydF4y2Ba理查德·道金斯gydF4y2Ba_lgydF4y2Ba) / (ln (gydF4y2BaRgydF4y2Ba/gydF4y2BargydF4y2Ba）/gydF4y2BaDgydF4y2Ba_RgydF4y2Ba)≈1750，考虑gydF4y2BalgydF4y2Ba= 1µm，gydF4y2BaRgydF4y2Ba= 300 nm，gydF4y2BargydF4y2Ba= 1 nm和gydF4y2BaDgydF4y2Ba_RgydF4y2Ba/gydF4y2BaDgydF4y2Ba_lgydF4y2Ba≈10。的实际值gydF4y2BargydF4y2Ba在这种情况下更重要，因为重新绑定事件的数量比在2D情况下更重要。gydF4y2Ba

建立二维模型的中间步骤是将原始模型并行化，并将同源dsDNA分成片段，这些片段可以并行和独立地在RecA细丝中搜索它们各自的同源性。例如，如果我们将1750个碱基长的灯丝分成10段，速度将增加175倍，与2D模型相比，剩余的差异为(gydF4y2BaDgydF4y2Ba_RgydF4y2Ba/gydF4y2BaDgydF4y2Ba_lgydF4y2Ba)−倍的短期和远程扩散的差异。gydF4y2Ba

最后一个模型是认为同源DNA是静态的，只有RecA细丝的运动类似于针织针在纱线球中的运动。这种情况不是直接量化的，因为我们不知道在细胞中不同长度尺度上的RecA细丝有多刚性。它似乎在100纳米的长度尺度上是灵活的，但探测相互作用必须发生在1纳米尺度上，因此我们不知道灯丝探索基因组的速度有多快。它可以清楚地同时探测多个DNA片段gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba但是，当细丝移动到基因组的其他部分时，用细丝的一部分探测序列会造成复杂的限制。可能需要详细的模拟来预测这类模型的预期搜索时间。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba