ecDNA中心驱动协同分子间癌基因表达gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba， WGS跟踪DNA FISH探针位置。对于COLO320-DM和PC3, 1.5 MbgydF4y2BaMYCgydF4y2BaFISH探针(图。gydF4y2Ba1 a, bgydF4y2Ba)，大小为100kbgydF4y2BaMYCgydF4y2BaFISH探针(图。gydF4y2Ba1 d-fgydF4y2Ba)，或使用1.5 Mb 8号染色体FISH探针。商业探针用于SNU16和HK359细胞。gydF4y2BabgydF4y2Ba，具有代表性的DNA FISH图像，使用染色体和1.5 MbgydF4y2BaMYCgydF4y2Ba非ecdna扩增的HCC1569探针显示染色体位点预期的成对信号。gydF4y2BacgydF4y2Ba，个体col320 - dm细胞ecDNA自相关聚类gydF4y2BaggydF4y2Ba（gydF4y2BargydF4y2Ba)．gydF4y2BadgydF4y2Ba，代表性的FISH图像显示ecDNA在原发性成神经细胞瘤肿瘤中聚集(患者11和17)。gydF4y2BaegydF4y2Ba，利用自相关技术对所有3例患者的单个原发肿瘤细胞进行ecDNA聚类gydF4y2BaggydF4y2Ba（gydF4y2BargydF4y2Ba)．gydF4y2BafgydF4y2Ba，比较gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba根据WGS (n=7个基因组箱与DNA FISH探针重叠)、中期FISH (n=82个细胞)和间期FISH (n=47个细胞)计算COLO320-DM中的拷贝数。用双面Wilcoxon检验确定p值。gydF4y2BaggydF4y2Ba，新生的代表形象gydF4y2BaMYCgydF4y2BaPC3细胞中新生RNA(内含子)和总RNA(外显子)FISH探针重叠的RNA FISH(独立重复两次)。gydF4y2BahgydF4y2Ba，结合DNA FISH的代表图像gydF4y2BaMYCgydF4y2BaecDNA (100kb探针)和带有新生的染色体DNAgydF4y2BaMYCgydF4y2Bacol320 - dm细胞中的RNA FISH(独立重复4次)。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba通过新生RNA FISH归一化到DNA拷贝数来测量转录概率，通过FISH将单例ecdna与col320 - dm枢纽中发现的ecdna进行比较(方框中线，中位数;方框限制，上下四分位数;盒须，1.5倍四分位范围)。为了控制少量ecdna转录概率中的噪声，我们根据hub大小分组随机重新采样RNA FISH数据并计算转录概率。小提琴图表示每个ecDNA枢纽基于枢纽大小匹配采样的转录概率。用双面Wilcoxon检验确定p值。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，基于TetO阵列敲入和tetra - egfp标记的ecDNA成像(左)。TetO-eGFP col320 - dm细胞中TetO-eGFP信号在时间过程中指定时间点的代表性图像(右;独立重复两次)。gydF4y2BabgydF4y2Ba， ecDNA-TetO COLO320-DM细胞中的GFP信号。在活细胞中tetra -eGFP和单体tetra -eGFP(A206K)标记的ecDNA中心似乎比固定细胞的DNA FISH研究中更小，这可能是因为TetO阵列没有集成在所有ecDNA分子中，并且在DNA FISH和eGFP二聚过程中存在变性引起的潜在差异。gydF4y2BacgydF4y2Ba， ecDNA中心直径，单位为微米(方框中线，中位数;方框限制，上下四分位数;盒须，1.5倍四分位范围)。tet -eGFP标记的中心比单体tet -eGFP(A206K)标记的中心略小，这可能是由于eGFP二聚化效应(方法)。用双面Wilcoxon检验确定p值。gydF4y2BadgydF4y2Ba，每个细胞的ecDNA中心数。直线表示中位数。用双面Wilcoxon检验确定p值。gydF4y2BaegydF4y2Ba在chr8-chromosomal-TetO (chr8:116,860,000-118,680,000，左)和ecDNA-TetO (TetO-eGFP COLO320-DM，右)col320 - dm细胞中的TetO-eGFP信号。gydF4y2BafgydF4y2Ba， chr8- chromosome - teto和ecDNA-TetO病灶的荧光强度。gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba，每个病灶推测的ecDNA拷贝数(g;N =病灶数/细胞)，每个细胞(h;n =细胞数)用于ecDNA-TetO标记细胞，基于相对于chr8-染色体- teto焦点的总和荧光强度。直线表示中位数。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，未集成TetO阵列的亲本COLO320-DM中tetra - gfp信号的代表图像，显示最小的tetra - gfp焦点。gydF4y2BajgydF4y2Ba， ecDNA (TetO-eGFP)和BRD4 (HaloTag)焦点的平均荧光强度横跨最大ecDNA (TetO-eGFP)信号中心的一条线。数据为n=5个ecDNA病灶的平均值±标准差。gydF4y2BakgydF4y2Ba，无TetO阵列集成覆盖BRD4-HaloTag信号的COLO320-DM细胞tetra - egfp信号代表图像。虚线为核边界。我们在没有TetO阵列整合的COLO320-DM细胞亚群中注意到细胞质tetra - egfp信号，但它没有与BRD4-HaloTag共定位。gydF4y2BalgydF4y2Ba，gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba用RT-qPCR检测亲本COLO320-DM细胞和BRD4-HaloTag COLO320-DM细胞经DMSO或500 nM JQ1处理6小时的RNA，显示相似水平gydF4y2BaMYCgydF4y2BaBRD4表位标记后对JQ1抑制的转录和敏感性。3个生物重复之间的数据为平均值±标准差。gydF4y2BaPgydF4y2Ba由双面学生决定的值gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，具有代表性的中期FISH图像和示意图显示了COLO320-DM中的ecDNA和COLO320-HSR中的染色体HSRs(在COLO320-DM中独立重复两次，在COLO320-HSR中不重复)。gydF4y2BabgydF4y2Ba， BRD4级ChIP-seq信号。ecDNA或HSR扩增的峰值被高亮显示，并用最近的基因标记。gydF4y2BacgydF4y2Ba、ATAC-seq、BRD4 ChIP-seq、H3K27ac ChIP-seq和扩增MYC位点的WGS。gydF4y2BadgydF4y2Ba，经DMSO或500 nM JQ1处理6小时后，个体COLO320-DM细胞间期FISH成像的ecDNA位置数量(包括>1 ecDNA的ecDNA中心和单个ecDNA)。N =每个条件量化的细胞数。用双面Wilcoxon检验确定p值。gydF4y2BaegydF4y2Ba，在DMSO或500 nM JQ1处理6小时后，col320 - dm的间期FISH成像中每个ecDNA位置都有ecDNA拷贝(框中线，中位;方框限制，上下四分位数;盒须，1.5倍四分位范围)。N =每种条件下定量的ecDNA位点数。用双面Wilcoxon检验确定p值。gydF4y2BafgydF4y2Ba，在指定时间点用DMSO或500 nM JQ1处理后tetra - egfp标记的ecDNA的代表性实时图像(上;独立重复两次)和ecDNA中心放大图(底部)。gydF4y2BaggydF4y2Ba，经DMSO、500 nM JQ1或1% 1,6-己二醇处理6小时的COLO320-DM细胞中DNA/RNA组合FISH的代表图像。gydF4y2BahgydF4y2Ba，gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba用DMSO、1% 1,6-己二醇或100µg/mL α -amanitin处理6 h后，用双DNA/RNA FISH测量转录概率(方框中线，中位数;方框限制，上下四分位数;箱形须，1.5倍四分位范围;N =单元格数)。用双面Wilcoxon检验确定p值。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，用1% 1,6-己二醇或100µg/mL α -amanitin处理6 h, col320 - dm间期MYC ecDNA的代表性DNA FISH图像。gydF4y2BajgydF4y2Ba， ecDNA在间期细胞中的自相关聚类gydF4y2BaggydF4y2Ba（gydF4y2BargydF4y2Ba)，用DMSO、1% 1,6-己二醇或100µg/mL α -amanitin处理6小时。数据为均值±标准差(每个条件定量n = 10个细胞)。gydF4y2BakgydF4y2Ba， DMSO或500 nM JQ1处理细胞6 h后，所有BRD4峰上的平均BRD4 ChIP-seq信号和热图。gydF4y2BalgydF4y2Ba，用不同浓度的JQ1处理48小时后，通过ATP水平(CellTiterGlo)测定细胞活力。3个生物重复之间的数据为平均值±标准差。gydF4y2BaPgydF4y2Ba由双面学生决定的值gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，不同JQ1浓度处理72 h后细胞增殖。3个生物重复之间的数据为平均值±标准差。gydF4y2BangydF4y2Ba，不同JQ1浓度在72小时内处理后的细胞倍增时间(上)或正常化至dmso处理后的细胞(下)。3个生物重复之间的数据为平均值±标准差。gydF4y2BaPgydF4y2Ba由双面学生决定的值gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BaogydF4y2Ba，gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba用指示抑制剂处理6小时后，RT-qPCR检测RNA(上;每个点代表一个生物复制，DMSO和JQ1治疗n=6，所有其他药物治疗n=3)。数据为平均值±标准差。gydF4y2BaPgydF4y2Ba由双面学生决定的值gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。抑制剂组，蛋白靶点，作用意义gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba转录，以及对ecDNA和HSR转录影响的比较(下)。gydF4y2BapgydF4y2Ba，gydF4y2Ba问gydF4y2Ba，代表性DNA FISH图像(gydF4y2BapgydF4y2Ba)和自相关聚类gydF4y2BaggydF4y2Ba（gydF4y2BargydF4y2Ba) （gydF4y2Ba问gydF4y2Ba)gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba用DMSO或500 nM MS645处理col320 - dm中的ecdna 6小时。数据为均值±SEM。半径= 0处双面Wilcoxon检验确定的p值。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，结构变体(SV)视图的AmpliconArchitect (AA)重建的gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba结肠320- dm细胞中的扩增子。gydF4y2BabgydF4y2Ba， col320 - dm细胞的纳米孔测序(左)和读取长度的分布。gydF4y2BacgydF4y2Ba通过WGS和纳米孔测序检测到col320 - dm的连接。gydF4y2BadgydF4y2Ba，用于光学映射和统计的分子长度。gydF4y2BaegydF4y2Ba，整合WGS、光学作图和体外ecDNA消化后重建COLO320-DM ecDNA。标记起始染色体和对应坐标(hg19)。三条内环形轨道(浅棕色、石板色和棕色);引导A, B和C)表示使用三种不同的sgrna及其预期大小作为Cas9裂解结果的预期片段。引导序列见补充表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(PFGE_guide_A-C)。gydF4y2BafgydF4y2Ba，体外Cas9酶切col320 - dm ecDNA，然后用PFGE酶切(左)。碎片大小的确定基于gydF4y2Bah . wingeigydF4y2Ba而且gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba梯子。未裁剪的凝胶图像见补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．中间面板显示的短读测序gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba所有分离片段的ecDNA扩增子，按片段大小排序。右图显示了通过光学映射重建的预期片段大小的一致性，以及通过体外Cas9消化观察到的片段大小(不一致的片段圈出)。每次sgRNA消化在一个独立的实验中进行。gydF4y2BaggydF4y2Ba，显示共定位的中期FISH图像gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba，gydF4y2BaPCAT1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba确切地gydF4y2Ba正如光学绘图和体外消化预测的那样。N = 20个细胞，1270个ecdna定量gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba/gydF4y2BaPCAT1gydF4y2BaDNA FISH和n = 15个细胞和678个ecdnagydF4y2BaMYCgydF4y2Ba/gydF4y2Ba确切地gydF4y2BaDNA FISH来自一个实验。gydF4y2BahgydF4y2Ba，通过RT-qPCR检测col320 - dm细胞中稳定表达dCas9-KRAB和指示sgRNAs的指示转录本的RNA表达(n=2个生物重复)。规范gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba引物MYC_exon1_fw和MYC_exon2_rv扩增;融合gydF4y2BaPVT1-MYCgydF4y2BaPVT1_exon1_fw和MYC_exon2_rv扩增;用total_MYC_exon2_fw和total_MYC_exon2_rv扩增total MYC。引物序列见补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba导序见补充表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，连接处的对齐读数gydF4y2BaPVT1-MYCgydF4y2Ba断点。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba联合单细胞RNA和ATAC-seq同时检测基因表达和染色质可及性，并识别与之相关的调控元件gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba表达式。gydF4y2BabgydF4y2Ba，独特的ATAC-seq片段和RNA特征的细胞通过过滤器(都是log2转换)。gydF4y2BacgydF4y2Ba，之间的相关性gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba可及性评分和归一化RNA表达。gydF4y2BadgydF4y2Ba，来自RNA或ATAC-seq数据的UMAP(左)。对数标准化和缩放gydF4y2BaMYCgydF4y2BaRNA表达(右上)和gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba可达性评分(右下)在ATAC-seq UMAP上可视化，显示细胞水平的异质性gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba含ecdna的COLO320-DM中的RNA-seq和ATAC-seq信号。gydF4y2BaegydF4y2Ba的基因表达评分(用Seurat在R中计算)gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba-上调基因(基因集M6506，分子特征库;MSigDB)gydF4y2BaMYCgydF4y2BaRNA分位数箱。水平线标记中间值。图中显示了所有单个细胞的总体方差(上图)。由双侧f检验确定p值。gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba顶部和底部箱子的表达水平(左)。标准化ATAC-seq覆盖显示(右)。gydF4y2BaggydF4y2Ba，与col320 - hsr中的染色体HSRs相比，col320 - dm ecdna上识别的可变元素数量(左)。ecDNA上有45个唯一的可变元件。ecDNA上的所有可变元素显示在右侧(y轴显示-log10(FDR)，圆点大小表示log2倍变化。的相对位置突出显示并命名了五个最重要的变量元素gydF4y2BaMYCgydF4y2BaTSS(负，5 ';积极的,3 ')。gydF4y2BahgydF4y2Ba，估计之间的相关性gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba复制数字和规范化的log2转换gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba所有个体细胞的表达均表现出与表达增加相关的高水平拷贝数变异性，特别是COLO320-DM。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba估计,gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba所有细胞箱的扩增子拷贝数gydF4y2BaMYCgydF4y2BaRNA表达。gydF4y2BajgydF4y2Ba中确定的五个最显著变量元素的ATAC-seq覆盖率的放大图gydF4y2BaggydF4y2Ba(由虚线框标记)。gydF4y2BakgydF4y2Ba，高单元和低单元箱中TSS富集的相似分布，表明变量元素可达性的差异并不是数据质量差异的人为因素。gydF4y2BalgydF4y2Ba，平均拷贝数回归，对数归一化，缩放ATAC-seq覆盖差异峰值相对均值gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba橙色为每个细胞箱的RNA(对数归一化，平均中心，缩放)。来自相同扩增子区间的相同数量的随机非微分峰，以灰色显示。误差带显示线性模型的95%置信区间。gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，的累积概率gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba单细胞ATAC-seq数据和DNA FISH数据的扩增子拷贝数分布(以平均为中心，按比例分布)，表明单细胞ATAC-seq数据的拷贝数估计反映了DNA FISH测量的ecDNA拷贝数的异质性。由Kolmogorov-Smirnov检验确定的p值(1000次自举模拟)。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，从上到下:COLO320-DM H3K27ac HiChIP接触图(kr归一化读计数，10kb分辨率)，重构的COLO320-DM扩增子，H3K27ac ChIP-seq信号，BRD4 ChIP-seq信号，WGS覆盖，交互剖面gydF4y2BaPVT1gydF4y2Ba(上，深粉色)和gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba(底部，淡粉色)10 kb分辨率的启动子，FitHiChIP循环如下所示，调整后的p值着色。通过scATAC识别的活性元件和重叠的H3K27ac HiChIP触点，根据到MYC起始位点的基因组距离命名:−1132E，−1087E，−679E，−655E，−401E，−328E，−85E。gydF4y2BabgydF4y2Ba10 kb分辨率下COLO320-DM H3K27ac HiChIP矩阵归一化方法的比较。HiChIP信号对不同的归一化方法具有鲁棒性。gydF4y2BacgydF4y2Ba，质粒NanoLuc荧光素酶信号的定量gydF4y2BaPVT1pgydF4y2Ba-，gydF4y2BaminpgydF4y2Ba,或gydF4y2BaMYCpgydF4y2Ba驱动NanoLuc报告表达式。通过将NanoLuc读数归一化到Firefly读数来计算荧光素酶信号。条形图显示平均值±SEM。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用双面Student 's计算gydF4y2BatgydF4y2Ba-test (n=3个生物重复)。gydF4y2BadgydF4y2Ba，在pvt1p -报告者和minp-报告者转染的细胞中，小提琴图显示NanoLuc报告RNA的平均荧光强度和信号大小。p值采用双面Wilcoxon检验计算。gydF4y2BaegydF4y2Ba，原理图gydF4y2BaPVT1gydF4y2Ba启动子驱动的荧光素酶报告质粒gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba增强剂。的细节gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-enhancer在Methods中。gydF4y2BafgydF4y2Ba，柱状图显示PVT1p、MYCp或本构TKp驱动的荧光素酶信号，无论有无顺式增强子(均值±SEM)。所有的值都归一化为相应的仅启动子结构，不含顺式增强子。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用双面Student 's计算gydF4y2BatgydF4y2Ba-test (n=3个生物重复)。gydF4y2BaggydF4y2Ba，点阵图显示jq1处理的荧光素酶信号(萤火虫标准化NanoLuc信号)在dmso处理的COLO320-DM和COLO320-HSR细胞中，在转染PVT1p或带有或不带有顺式增强子的MYCp质粒后的倍数变化。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用双面Student 's计算gydF4y2BatgydF4y2Ba-test (n=3个生物重复)。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，具有代表性的DNA FISH图像显示染色体外单阳性gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba而且gydF4y2BaFGFR2gydF4y2Ba放大(左上和中上)和双阳性gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba而且gydF4y2BaFGFR2gydF4y2Ba在亲本SNU16细胞(右上)的中期扩散放大(右上)。N = 42个细胞和8222个ecdna。具有代表性的DNA FISH图像显示明显的染色体外gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba而且gydF4y2BaFGFR2gydF4y2Basn16 - dcas9 - krab细胞中期扩散的扩增(下)。N = 29个细胞和3893个ecdna。gydF4y2BabgydF4y2Ba，在AmpliconArchitect中显示支持每个断点的连接读取数量的排序图。断点的颜色是基于它们是否跨越来自同一扩增子的区域(gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba/gydF4y2BaFGFR2gydF4y2Ba)或来自两个不同扩增子的区域。gydF4y2BacgydF4y2Ba亲本SNU16细胞系(左)和SNU16- dcas9 - krab细胞系(右)在10kb分辨率下经KR归一化的HiChIP接触矩阵。亲代细胞的接触基质含有增加的区域gydF4y2Ba顺式gydF4y2Bachr8和chr10之间的接触频率如所示，而相比之下，SNU16-dCas9-KRAB细胞的chr8和chr10之间的接触频率大大降低。中描述的chr8和chr10之间的低频结构重排重叠的区域灶相互作用增加gydF4y2BabgydF4y2Ba用方框表示。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba， CRISPRi实验在SNU16-dCas9-KRAB细胞中扰动候选增强子。单导rna (sgRNAs)被设计用于靶向候选增强子gydF4y2BaFGFR2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba基于染色质可及性的ecdna。gydF4y2BabgydF4y2Ba，聚合CRISPRi抑制假定增强子的实验工作流程。通过单细胞克隆获得稳定的SNU16-dCas9-KRAB细胞。用抗生素筛选的慢病毒sgRNAs库转导细胞，并用flowFISH评估癌基因RNA。通过基于癌基因表达的荧光激活细胞分选(FACS)将细胞分为6个箱。对每个箱子中的细胞进行sgrna定量。gydF4y2BacgydF4y2Ba， FACS门控策略。gydF4y2BadgydF4y2Ba，与针对任何一种增强子的CRISPRi库的未排序细胞相比，每个候选增强子元素的sgRNAs的变化为Log2倍gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba或gydF4y2BaFGFR2gydF4y2Baecdna，其次是基于表达水平的细胞排序gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba或gydF4y2BaFGFR2gydF4y2Ba．每个点代表针对一个候选元素的20个sgrna的平均log2倍变化。与相同池中阴性对照sgRNA分布相比，与癌基因表达负相关的元素用红色标记。gydF4y2BaegydF4y2Ba， Bar图显示了CRISPRi抑制候选增强子元素的重要性，如图所示。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba(上)。重要的在gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba而在gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba增强子的颜色如所示。SNU16-dCas9-KRAB H3K27ac HiChIP 1D信号轨迹和相互作用配置文件gydF4y2BaFGFR2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba启动子在10kb分辨率gydF4y2Ba独联体gydF4y2BaFitHiChIP循环如下所示。中的交互概要文件gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba用紫色和in表示gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba用橙色表示。gydF4y2BafgydF4y2Ba，针对MYC TSS的单个sgrna的Spearman相关性gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba而且gydF4y2BaFGFR2gydF4y2Ba表达式。使用低尾t检验比较目标sgrna与阴性对照sgrna (negcontrols)的P值显示。每个点代表一个独立的sgRNA。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，上:中期扩散的双色DNA FISH，用于定量共定位的频率gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba基因和分子间增强子如图所示。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba．以上随机共定位将表明融合事件。下图:代表性DNA FISH图像。DNA FISH探针靶向以下hg19基因组坐标:E1, chr10:122,635,712-122,782,544 (RP11-95I16;N = 11单元格);E2, chr10:122,973,293-123,129,601 (RP11-57H2;N = 12 cell);E3/E4/E5, chr10:123,300,005-123,474,433 (RP11-1024G22;N = 10个cell)。gydF4y2BabgydF4y2Ba，上:不同和共定位的FISH信号数。为了估计随机共定位，使用匹配数量的信号生成100个模拟图像，并将平均模拟频率与观测到的共定位进行比较。通过双侧t检验(Bonferroni-adjusted)确定P值。底部:明显高于随机概率的共定位信号数量。超过模拟随机分布的共定位是所有FISH图像中超过随机均值的共定位分子之和，其中总共定位高于随机均值加上95%置信区间(每张FISH图像100个模拟图像)。gydF4y2BacgydF4y2BaCas9体外消化gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba在SNU16-dCas9-KRAB中含有- ecDNA，然后是PFGE(一个独立的实验)。碎片大小的确定基于gydF4y2Bah . wingeigydF4y2Ba而且gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba梯子。未裁剪的凝胶图像见补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2BaMYCgydF4y2BaCDS指南对应《补充表》中的指南BgydF4y2Ba2gydF4y2Ba．gydF4y2BadgydF4y2Ba，分离增强子DNA序列的富集gydF4y2BaMYCgydF4y2Baecdna带gydF4y2BacgydF4y2Ba基于5kb窗口中标准化读取的背景(从未消化的基因组DNA在相应大小范围内的单独PFGE通道中分离的DNA)。每个点代表来自不同凝胶带的DNA。红色表示折叠变化大于4。gydF4y2BaegydF4y2Ba，测序轨迹为凝胶纯化gydF4y2BaMYCgydF4y2BaecDNA显示富集gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba扩增子和耗竭gydF4y2BaFGFR2gydF4y2Ba含有增强子E1-E5的扩增子。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，从上到下:四种不同扩增子的长读重建;基因组图谱，以长reads为基础的结构变异体>为10kb大小，>为20支持reads，红色边表示;短读全基因组测序的拷贝数变异和覆盖范围，所选基因的位置。gydF4y2BabgydF4y2Ba的代表性DNA FISH图像gydF4y2BaMYCNgydF4y2Ba间期TR14细胞中的ecDNA(上)和ecDNA聚类与相同细胞中DAPI对照的自相关评估gydF4y2BaggydF4y2Ba（gydF4y2BargydF4y2Ba)(底部)。数据为平均值±SEM (n = 14个单元)。gydF4y2BacgydF4y2Ba，自定义重构TR14扩增子Hi-C图。的gydF4y2BaMYCNgydF4y2Ba/gydF4y2Ba到gydF4y2Ba扩增子和gydF4y2BaMYCNgydF4y2BaecDNA共享序列，这阻止了在这些区域进行明确的短读映射，并显示为白色区域。gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba之间的相互作用出现局部升高gydF4y2BaMYCNgydF4y2BaecDNA和gydF4y2BaODC1gydF4y2Ba扩增子(由箭头指示)。gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba- - -gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-接触频率为所示颜色。gydF4y2BadgydF4y2Ba，对连接扩增子的长读测序识别的结构变异的读取支持。不同扩增子之间只有一个结构变异(gydF4y2BaMYCNgydF4y2Ba而且gydF4y2BaMDM2gydF4y2BaAmplicons)被鉴定为3个支持reads。gydF4y2BaegydF4y2Ba，连接扩增子结构变异的变异等位基因频率。gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba增强子之间的交互模式gydF4y2BaMYCNgydF4y2Ba扩增子片段(垂直)和一个gydF4y2BaODC1gydF4y2Ba扩增子片段(水平)。短读WGS覆盖(灰色)，H3K27ac ChIP-seq轨迹显示输入的平均折叠变化(黄色)，Hi-C接触图显示(kr归一化计数在5kb箱)。gydF4y2BaggydF4y2Ba，从上到下:三个扩增子重建，富增强子的虚拟4C相互作用谱gydF4y2BaHPCAL1gydF4y2Ba轨迹在gydF4y2BaODC1gydF4y2Ba带有其他扩增子位点的扩增子(红色)，以及H3K27ac ChIP-seq(输入的折叠变化;黄色)。gydF4y2BahgydF4y2Ba，gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba不同扩增子之间的相互作用(kr归一化计数为5kb bin)取决于相互作用位点的H3K27ac信号(左;盒子中心线，中间;方框限制，上下四分位数;盒须，1.5倍四分位范围)。gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba相互作用(kr归一化计数在5kb箱)由扩增子对(右)分开。H3K27ac高与低表示在5kb的箱子中至少比输入的平均富集3倍。N = 114,636对H3K27ac Low + Low, N = 11,990对H3K27ac High + Low, N = 296对H3K27ac High + High。gydF4y2Ba