SARS-CoV-2ο变异复制人类支气管和肺体外gydF4y2Ba

COVID-19的出现在2019年12月以来,病原体SARS-CoV-2继续人类的进化,产生变异的逐步增加人类之间传播能力。世界卫生组织(世卫组织)分类几个血统变异的关注(挥发性)的透射率高,潜在的免疫逃避,不寻常的流行病学特性,对诊断和治疗或不良影响gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba。这些挥发性有机化合物的仪器包括α、β、γ、δ和ο病毒血统。gydF4y2Ba

第一个病毒变异出现在2020年2月携带D614G在S蛋白质和氨基酸替换迅速成为占据主导地位的全球病毒变种。在主要显示复制更快气道上皮细胞和鼻腔的实验感染仓鼠,解释其在人类更大的传播能力gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba。阿尔法血统,这是首次报道在英国在2020年9月,有13个突变(S)的蛋白质,和N501Y P681H突变的蛋白质导致其传递率增加gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba}。删除在峰值位置60 - 70蛋白导致损失的检测gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba目标在某些基因诊断测试(用逆转录聚合酶链反应(rt - PCR)),称为gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba基因目标失败gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba。β家族在南非首次检测到2020年8月,包含10 S蛋白的突变,突变N501Y K417N增强病毒传播而E484K导致免疫逃避gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba}。三角洲血统是首次发现在马哈拉施特拉邦,印度2020年10月,有多个氨基酸替换在S protein-including L452R E484Q,增强血管紧张素转换酶2 (ACE2)绑定,传输和免疫逃避gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba}。ο变种被发现在博茨瓦纳和南非在2021年11月,被指定为VOC的同月。它有37个氨基酸替换在S蛋白,15在受体结合域。因此,它是可能的,病毒会显著影响表型的传播,摆脱以前的免疫力或两者兼而有之。截至2021年12月14日,ο变种被发现在全球76个国家gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba。疾病严重程度的差异之间的变异更微妙。适度增加疾病严重程度已经报道了δVOC,较高的住院与αVOCgydF4y2Ba^{12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba}。广泛的峰值蛋白质的氨基酸替换买卖gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba遗传性可能会产生重大的影响,疾病严重程度和免疫逃避来自感染和疫苗诱导的血清中和抗体和治疗性单克隆抗体。然而,有限的信息在生物或病毒学这变异的特征。ο复制ACE2依赖、它有一个相当大的能够逃避过去感染引发的中和抗体或免疫接种gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

SARS-CoV-2的表型变异的相关性与流行病学实验也说明了体外观察D614G突变。同基因的野生型(WT)病毒改造携带飙升D614G替换了增强的人类肺上皮细胞和病毒复制主人体气道组织通过增加传染性和病毒粒子的稳定gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba。仓鼠感染这种病毒产生高传染性滴定度在鼻腔冲洗和气管,但不是在肺部,支持临床证据显示,突变提高患者的上呼吸道病毒载量COVID-19和可能增加传播。然而,研究使用生理相关实验模型研究的表型ο变体相比先前SARS-CoV-2缺乏的变体。gydF4y2Ba

我们以前使用体外外植体文化人类支气管和肺实质的研究病毒复制的能力和禽流感病毒的细胞趋向性gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba},即gydF4y2Ba^{18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba}和SARS-CoV-2 (ref。gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba)。这提供了一个合适的平台,快速的复制概要文件和取向比较ο变体与他人,并提供洞察这种变体的流行病学观察。我们最初的病毒复制动力学相比WT SARS-CoV-2 D614G变体和挥发性有机化合物的仪器在体外α和β血统外植体文化的人类支气管和肺。在后续的实验中,我们比较了病毒复制概要文件与三角洲和B.1.1.529 WT /ο血统。我们也调查了病毒的细胞趋向性使用免疫组织化学和WT的依赖相比,三角洲和ο变体在跨膜丝氨酸蛋白酶2 (TMPRSS2)和组织蛋白酶的复制。gydF4y2Ba

我们第一次复制WT动力学相比,D614Gα和β菌株,分离从旅行回来后或在香港社区体外培养的人类支气管和肺组织培养感染剂量滴定传染性病毒使用50% (TCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba)滴定。唯一显著差异观察到的是一个更高的复制人类支气管β变体的72小时post-inferction (hpi);之间没有显著差异指出病毒在24和48(图的快乐指数。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。当WT,三角洲和ο变体相比,ο变异复制滴定度要明显高于WT或δ在24和48 hpi-a差异大于70倍(图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。在72居民,三角洲和ο病毒复制远远超过人类支气管WT应变,但是没有三角洲和ο病毒之间的显著差异。这些实验在33°C时,病毒滴定度类似在37°C为每个病毒(数据未显示)。在体外培养的人类肺组织,唯一的显著差异观察是减少复制ο与WT应变在24相比,48和72居民(无花果。gydF4y2Ba1 c, dgydF4y2Ba)。这些发现在支气管和肺组织被证实在曲线下的面积(AUC)分析总病毒的滴定度在24 - 72居民(无花果。gydF4y2Ba1 e, fgydF4y2Ba)。个人捐赠的病毒滴定度数据集比较WT,三角洲和ο扩展数据图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。同样的观察一致的趋势为每个单独的捐献者。类似的趋势之间的观察gydF4y2BaORF1bgydF4y2Ba基因量化和TCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba结果的更高层次的病毒基因检测在支气管感染ο变体与WT和δ菌株相比,虽然更多的病毒基因复制测量在肺组织中感染了WT应变与三角洲和ο变体(扩展数据图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

每个病毒变体的取向在支气管和肺可视化通过免疫组织化学染色SARS-CoV-2核蛋白(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。病毒变异似乎没有在支气管细胞取向不同体外组织被感染。买卖,有证据显示广泛的病毒感染后纤毛上皮,酒杯和俱乐部细胞,感染的WT,观察α,β,δ和ο病毒免疫荧光染色的基础上(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。透射电子显微镜还显示买卖的存在病毒颗粒在细胞质包围的囊泡,以及表面附着在纤毛细胞的微绒毛(扩展数据图。gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba)。病毒变异似乎没有在肺组织细胞取向不同(图gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)。在肺组织免疫组织化学染色显示阳性染色,与纺锤状1型pneumocytes抗原阳性细胞形态相似。在肺组织中感染了买卖,有减少染色强度的病毒抗原识别(扩展数据图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。相比之下,更多的细胞对病毒抗原阳性染色观察在支气管上皮细胞感染ο相比其他变体和WT病毒。gydF4y2Ba

ACE2和跨膜丝氨酸蛋白酶2 (TMPRSS2)导致SARS-CoV-2进入细胞。后者劈开的S2域(S2′),使病毒进入细胞通过细胞融合在细胞膜外,不同于病毒入口通过内吞作用的途径gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba。ACE2表达在细胞表面存在短期和长期的形式,以简短的形式缺乏域结合SARS-CoV-2飙升gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba。我们表明,有更高的长期和短ACE2表达人类支气管肺部与(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。免疫组织化学染色显示清晰的证据更广泛ACE2染色相比,支气管肺部(无花果。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba和gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)。我们下一个调查gydF4y2BaTMPRSS2gydF4y2Ba表达式,发现明显的高表达gydF4y2BaTMPRSS2gydF4y2Ba信使rna在肺部支气管而(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

我们调查了WT、三角洲和TMPRSS2ο病毒复制的依赖。我们的病毒复制动力学WT相比,三角洲和ο菌株州立E6和州立E6-TMPRSS2 (E6 / T2)细胞。虽然病毒滴定度在24 hpi在E6 / T2高细胞WT和δ,不同的大小是100 - 1000倍的δ,3 - 100倍ο和WT(图10倍左右。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)。病毒滴定度在24 - 48 hpi的AUC水平证实这些发现(图。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)。ο复制到较低的滴定度与WT和δ菌株在24 hpi E6 / T2细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),这也是他们的AUC水平(图所示。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)。我们下一维罗E6 / T2感染细胞与WT,三角洲和ο菌株在camostat甲磺酸(丝氨酸蛋白酶的抑制剂,包括TMPRSS2)gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba或E64d(组织蛋白酶抑制剂)gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba。维罗E6的可行性/ T2细胞治疗后80%以上camostat甲磺酸浓度高达300µM或E64d浓度120µM(扩展数据图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。尽管WT和ο感染部分减少camostat甲磺酸,δ抑制剂(图更敏感。gydF4y2Ba4 f, ggydF4y2Ba)。相比之下,虽然WT和三角洲感染被E64d部分抑制,ο感染更大幅减少约5%的控制(无花果。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)。的综合治疗camostat甲磺酸和E64d完全封锁了所有三种病毒的感染(无花果。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)。这表明,与δ,ο可能更依赖于进入细胞内吞作用的途径。gydF4y2Ba

英国的初步流行病学数据显示,家庭传播的风险与买卖的3.2倍(95%置信区间2.0 - -5.0)高于与δ,进而与WT相比是高传染性病毒的病毒。ο繁殖数量(gydF4y2BaRgydF4y2Ba)3.7 (ref。gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba)。一直不清楚这个增加传输效率是由突变引发的免疫逃避抗体种群中授予之前的感染或接种疫苗,由内在病毒因素或两者的结合。越来越清楚的是,高中和抗体滴定度前感染或免疫引起的由ο明显受损gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。我们的研究结果表明,ο变体已经大幅增加(超过70倍)和复制能力明显高于人类支气管与WT和三角洲病毒在24 hpi的程度这个更快的复制支气管可能导致遗传性尚不清楚,但高传染性病毒负荷进行航空公司可能导致增加大量的传染性病毒释放,而呼吸或说,因此加强传播通过空中航线。还有最近的报告表明ο与三角洲和WT相比增加了病毒复制病毒在体外鼻上皮分化的人类文化gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba。检测到传染性SARS-CoV-2总之气溶胶粒子在空气中通过COVID-19患者呼出gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba。背后的机械原因增加支气管的复制能力仍有待阐明。ο变体有37个氨基酸替换的蛋白质,15在受体结合域gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba。感染οACE2依赖gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba和绑定ο高峰的峰值ACE2相比还是增强WT的病毒gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba。我们发现有更广泛的ACE2表达人类支气管和肺部相比,这或许可以解释增强复制SARS-CoV-2支气管。买卖也有氨基酸替换的核衣壳蛋白(R203K和G204R)与增强的病毒复制gydF4y2Ba^{29日gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

流行病学研究表明三角洲变体是传播大大超过α变体gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba,这本身就是传播比早期的病毒株gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}。因此,我们的数据表明三角洲的变种病毒传染性病毒的滴定度高于WT与流行病学观察支气管也兼容。已经表明,假病毒感染ACE2表达δ飙升更有能力gydF4y2Ba^低gydF4y2Ba人类支气管上皮细胞相比以前的变体gydF4y2Ba^{31日gydF4y2Ba}。此外,δ的突起蛋白裂解占主导地位的国家,这可能促进其复制人类呼吸道的效率gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba。P681R增强furin-cleavage序列的乳沟,这有助于增强健身δ/α在Calu-3竞争分析和人工气道上皮细胞体外模型gydF4y2Ba^{33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

我们的数据表明ο变异的病毒复制能力较低的肺与支气管特别感兴趣。这种差异也证实了免疫组织化学研究表明减少病毒感染细胞体外肺外植体在人类文化。生物因素的差异比较复制能力支气管和肺的买卖和δ变异仍有待检验。这些观察结果可能表明ο临床严重程度减少了,但这样的解释需要合格因为COVID-19的疾病严重程度不仅取决于病毒的复制也提供先天免疫反应。最近的流行病学研究从南非和英国表明ο造成住院与三角洲相比较少gydF4y2Ba^{35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}。因此,从体外研究结果文化和谐最近流行病学评估关于传播和疾病严重程度。gydF4y2Ba

我们发现ο感染较少依赖TMPRSS2活动但更敏感组织蛋白酶抑制剂与三角洲相比表明,买卖可以进入细胞主要通过内吞作用的通路,wheras三角洲优先通过融合进入细胞在细胞表面。采用一个无处不在的内吞作用的通路可能扩大ο感染的细胞谱系,使ο感染细胞与ACE2表达无论TMPRSS2的存在。单细胞测序结果表明,细胞的co-expression ACE2在上呼吸道和组织蛋白酶更丰富的比细胞co-express ACE2 TMPRSS2,这或许可以解释在支气管ο复制能力的增加gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba。我们发现ο优先通过endosomal途径进入细胞而三角洲更依赖于细胞表面融合和报告是一致的肺泡上皮细胞和鼻上皮细胞gydF4y2Ba^{24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}。治疗TMPRSS2抑制剂的使用可能是有限的效益管理的临床感染ο变体。尽管有单细胞研究TMPRSS2的分布在细胞培养中,数据的分布受到抗体固定组织的敏感性和特异性。gydF4y2Ba

本研究的限制之一是,从每个家族只有一个病毒株进行了测试。此外,所有六个病毒变异没有并行测试在同样的实验中,但这是很难开展后勤组织可用的有限测试6病毒复制。gydF4y2Ba

总之,我们的研究结果显示,ο更快的效率和增强病毒复制人类支气管与前面的血统相比,表明它有一个内在的能力增强的传输。ο低复制能力的人类肺部疾病严重程度较低而三角洲兼容。这两个观测结果都和流行病学数据一致。即使疾病严重程度适度降低,买卖的非常有效的传播能力将构成重大威胁全球公共卫生和医疗保健系统。调查通过接种疫苗预防感染ο助推器和急需治疗选项。gydF4y2Ba

SARS-CoV-2隔离gydF4y2Ba

维罗E6细胞(写明ATCC)被用于病毒分离和WT病毒的传播,维罗E6-TMPRSS2 D614G应变和α变体,过表达细胞(m .武田提供的)gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba是用于β,δ和ο变体。两个细胞系的边后卫在DMEM培养为10%。最初的临床样本收集证实SARS-CoV-2感染患者从2020年1月至2021年11月在香港(扩展的数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba如前所述)和孤立gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba。病毒鼻咽癌的临床样本中分离的咽喉拭子从病人感染SARS-CoV-2病毒传输介质。维罗E6-TMPRSS2 (E6 / T2)细胞在1×10播种gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba24-well板细胞注射50µl样本和超过2%的边后卫DMEM培养基为1毫升1 h在37°C。PBS的细胞被洗一次,每天补充新鲜培养基,观察细胞病变效应(CPE)。文化上层清液收集在CPE达到50%左右,被定义为P1。病毒进一步传播E6 / T2细胞。病毒股票整除和存储冻结在−80°C。整除TCID滴定gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba在各自的细胞系。支原体是免费使用的所有的细胞系。实验进行了一个生物安全三级(BSL-3)设施,公共卫生学院的路医学院,香港大学。知情同意是获得所有的参与者和机构审查委员会批准了(IRB)香港大学和医院管理局(香港西)(IRB没有批准。威斯康辛大学20 - 862和uw20 - 863)。gydF4y2Ba

体外文化和人类呼吸道的感染gydF4y2Ba

新鲜non-tumour支气管(gydF4y2BangydF4y2Ba= 12)和肺(gydF4y2BangydF4y2Ba= 12)组织获得51 - 78岁的病人择期手术在玛丽医院外科部从5月到2021年12月,被作为常规临床护理的一部分,但顺差常规诊断需求如前所述gydF4y2Ba^{39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba}。扩展的数据表中列出的捐赠信息gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。病毒感染过程进行如前所述gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba。总之,同样大小的块人类支气管和肺组织病毒感染了每一个在5×10gydF4y2Ba^5gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba每毫升1 h在37°C。每个组织片段被三次培养基去除残余病毒培养液,充满新鲜的媒介和孵化在37°C表示。Mock-infected组织作为消极的控制。培养基被移除的整除表示时间和储存在−80°C到滴定。传染性病毒滴定度文化上层清液被TCID化验gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba维罗E6-TMPRSS2州立E6或细胞,分别根据细胞用于病毒隔离和通道。受感染的组织固定在10%福尔马林处理和疣状72居民。支气管组织也被浸泡在福尔马林溶液,然后处理透射电子显微镜如前所述gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

由TCID病毒滴定gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba分析gydF4y2Ba

一个支流96 -维罗E6-TMPRSS2 Vero-E6或细胞组织培养板制备病毒滴定(TCID前的一天gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba)分析。细胞被洗一次PBS和补充DMEM (Gibco)与2%胎牛血清和100 U ml (Gibco)补充gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}青霉素和100µg毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}链霉素(Gibco)。连续稀释的病毒上清液,从0.5日志7日志,进行和每个病毒稀释添加到盘子一式四份。每天的盘子观察细胞病变效应。病毒的终点稀释导致50%的接种CPE井使用Karber估计方法gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba。AUC计算从病毒滴定度表示在不同的时间点gydF4y2BaygydF4y2Ba轴。gydF4y2Ba

石蜡包埋组织的免疫组织化学染色gydF4y2Ba

人类呼吸道组织(肺和支气管)与10%福尔马林固定在一夜之间在4°C和固定组织嵌入在石蜡块。免疫组织化学,4µm切片部分微波为抗原15分钟检索。内源性过氧化物酶活动停止了淬火组织部分3%的HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba20分钟。幻灯片被屏蔽10%正常马血清在室温和孵化主要抗体(anti-SARS-CoV-2核蛋白(NP) (40143 - t62,嘉汉生物)或ACE2 (ab108252长形式;简式、ab15348 Abcam))在室温下90分钟紧随其后的是辣根peroxidase-conjugated anti-rabbit抗体(向量实验室)。部分是使用束射功率管底物开发工具包(向量实验室)。的细胞核和迈耶的苏木精复染色。gydF4y2Ba

描述SARS-CoV-2-infected细胞,double-antibody免疫荧光染色对SARS-CoV-2 NP和不同细胞标记。组织部分首先沾SARS-CoV-2 NP抗体类似于如上所述除了SARS-CoV-2 NP抗体孵育后,部分与碱性孵化phosphatase-conjugated anti-rabbit或anti-mouse抗体(向量实验室)和使用向量红(VR)基质开发工具包(向量实验室)。部分被微波,孵化SCGB1A1 / CC10 (Protein-Tech),乙酰化α-tubulin (Santa Cruz)、MUC5AC(热费希尔),在室温下90分钟山羊反rabbit-AF488或山羊反mouse-AF488紧随其后。细胞核是复染色与DAPI(蓝色)。部分是使用Eclipse Ti-S尼康显微镜成像。gydF4y2Ba

量化的免疫组织化学gydF4y2Ba

免疫组织化学染色样本分析使用ImageJ斐济(v.2.1.0)如前所述gydF4y2Ba^{43gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba}。总之,每个原始包含IHC (RGB)图像分成地方性政党更有利图像和Nova-red (SARS-CoV-2 NP)彩色图像被选为SARS-CoV-2 NP的量化表达式。Nova-red (SARS-CoV-2 NP)彩色信号量化后调整阈值,这是所有的图片设置为相同的值。结果给出了频率的表达式和计算积极染色面积的百分比除以总图像面积肺组织或支气管上皮细胞区域的组织。gydF4y2Ba

RT-qPCRgydF4y2Ba

提取病毒RNA在文化上层清液使用QIAamp病毒RNA迷你包(试剂盒)。RNA被使用随机个六reverse-transcribed引物与PrimeScript RT试剂盒(豆类)。目标基因的mRNA表达检测使用相应的引物(扩展的数据表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba7)使用ABI ViiA实时PCR系统(应用生物系统公司)。所有的程序进行根据制造商的指示。病毒基因和基因表达谱的细胞溶解产物是量化和标准化β-actin如前所述gydF4y2Ba^{45gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba,gydF4y2Ba47gydF4y2Ba,gydF4y2Ba48gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

复制的SARS-CoV-2 Vero-E6 Vero-E6-TMPRSS2细胞和药物治疗gydF4y2Ba

Vero-E6和Vero-E6-TMPRSS2 48-well盘子被感染细胞的莫伊SARS-CoV-2 0.01病毒复制动力学。病毒滴定度文化上层清液使用TCID (1 - hpi)测定gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba试验(见上图)。评估TMPRSS2抑制剂和组织蛋白酶抑制剂的影响,Vero-E6-TMPRSS2细胞被感染的莫伊SARS-CoV-2 0.01。Camostat甲磺酸(Sigma-Aldrich)或E64d (Sigma-Aldrich) 30µM添加1 h之前,期间和之后的感染。车辆被用作消极的控制。病毒复制被SARS-CoV-2的量化评估gydF4y2BaORF1bgydF4y2Ba拷贝数在文化上层清液用qPCR 24 hpi (ref。gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

量化的细胞生存能力gydF4y2Ba

药物治疗后细胞的可行性Vero-E6-TMPRSS2评估使用细胞计数工具包8 (WST-8 / CCK8) (Abcam)。总之,细胞生长至70% confluency 48-well板块中孵化24小时没有或存在各种浓度(0.41 -300µM) camostat甲磺酸和E64d -120µM (1.88)。接下来,培养基是吸气和PBS洗一次,孵化与CCK8工作方案(CCK8:中等,1:10)37°C, 5%的公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba2 h。随后,光密度值在450纳米测量使用一个多平台的读者(BMG FLUOstar最佳状态)。细胞生存能力表示为一个百分比的控制细胞。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

文化与人类体外实验进行独立,用6种不同的捐赠者。结果显示在数字几何平均数±南达科他州。AUC计算通过整合传染性病毒滴定度在24 - 72 hpi在体外支气管或肺组织或在24 - 48 hpi在细胞系。不同的日志gydF4y2Ba_10gydF4y2Ba改变病毒滴定度和定量病毒RNAgydF4y2BaORF1bgydF4y2Ba和病毒之间随着时间的推移使用双向方差分析比较图基紧随其后的使用GraphPad棱镜v.9.1.2多重比较检验。比较的AUC和定量病毒RNAgydF4y2BaORF1bgydF4y2Ba病毒之间的单向方差分析计算图基的多重比较测试紧随其后。差异被认为是重要的gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

进一步研究信息设计是可用的gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba与本文有关。gydF4y2Ba