主要

艺术是高度有效地抑制病毒复制,防止疾病进展。然而,hiv - 1感染CD4坚持感染+T细胞,从而构成长期潜伏前病毒的宿主1。因此,当艺术是中断,病毒反弹后4周内发生在大多数人4。到目前为止,试图改变潜在的hiv - 1病毒水库诱发自由缓解人类显示有限的成功5,6。

然而,对人性化的小鼠和猴的研究显示,单克隆抗体管理可以抑制hiv - 1或simian-human免疫缺陷病毒(SHIV)感染多年治疗终止后,表明抗体可能疗法旨在实现hiv - 1的缓解作用7,8,9。抗体可能这样做,因为他们可以直接消除病原体,有可能清除病毒和感染细胞,并产生免疫复合物,能增强适应性免疫2。

管理anti-HIV-1广泛中和抗体(bnab)对人类是安全的,有效的防止感染,降低病毒血症和维护antibody-sensitive病毒的病毒抑制持续很短的时间没有艺术3,10,11,12,13,14,15。因此,有人建议,广泛中和抗体可能作为兼职教授艺术,或作为一个独立的维持治疗,旨在引起长期自由hiv - 1缓解3。我们评估的有效性重复bNAb联合治疗长期维护的病毒抑制以及它的影响的大小和构成潜在的病毒水库在艾滋病毒携带者。

研究安全、耐受性和抗病毒活性的组合两个广泛而强大的anti-HIV-1抗体,3 bnc117和10 - 107416,17在艺术的存在与否,我们进行了第一阶段b,非盲、随机临床试验的两个治疗组的慢性感染艾滋病毒携带者(无花果。1)。这项研究的主要目标是评估重复抗体注入维持病毒抑制的影响没有艺术,以评估对储层的影响大小当抗体有单独或在抑制的艺术,并评估安全的七个抗体注入超过五个月。

图1:研究设计和3 bnc117和10 - 1074的药物动力学。
图1

一个研究设计。钻石代表leukapheresis的时间点。红色和蓝色三角形代表3 bnc117和10 - 1074注资,分别。周,一周。b水平的3 bnc117(红色)和10 - 1074(蓝色)血清中(n= 23参与者),由TZM-bl化验18。数据意味着南达科他州±。红色和蓝色三角形表明3 bnc117和10 - 1074注资,分别。意思是半衰期(t1/2每个bNAb表示在天的)。

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研究合格标准包括正在进行的艺术和病毒抑制血浆hiv - 1 RNA水平的不到50份每毫升至少12个月(有一个短暂的不到500拷贝/毫升允许),在筛选不到20拷贝/毫升,CD4细胞+T细胞计数超过500细胞/μl(补充表1)。个人的方案包含非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs)切换到一个整合酶inhibitor-based方案(dolutegravir加泰诺福韦disoproxil延胡索酸酯和emtricitabine)四个星期之前,由于艺术由于NNRTIs长半衰期。26日参加研究的参与者没有筛查bNAb敏感性的前病毒的水库(扩展数据图。1,扩展数据表1补充表1)。额外十个人在随着时间的推移抑制艺术随访并行重复献血的观察性研究和储层评估,同时保持抑制艺术(艺术就组;扩展的数据图。1,扩展数据表1 b补充表2)。自诊断的平均时间为11.5年,平均时间不间断抑制艺术在治疗组8.5年和16.5和15年,分别在艺术就集团(P分别为= 0.18和0.04;扩展的数据图。1 b, c,扩展数据表1 a, b补充表1,2)。

治疗组的参与者收到7注入30毫克公斤−1每个抗体在20周2(注入1 - 3)和四周的间隔(注入4 - 7)(图。1)。十八26登记的参与者被随机分配到组1和8被随机分配到组2(扩展数据图。1补充表1)。参与者在第1组被要求停止他们的艺术2天前3后bnc117和10 - 1074注资,而参与集团仍在艺术2中断后的抗逆转录病毒药物前26周(无花果。1)。病毒载量和CD4+T细胞计数分析治疗期间每周监测中断直到38周,每两周的周38到48周后随访,每4到8周后艺术重启(见方法)。

所有参与者共有48周的随访时间的报名(第0天)。Leukapheresis了大约两个星期前和后26周的第一抗体注入个人保持病毒载量低于20拷贝/毫升至少26周。

重复的抗体注入20周通常是安全的和耐受。百分之八十八(79 90)的不良事件报道的1级严重性- 28%(25 90)被认为是至少可能相关抗体和1级的严重性。两个参与者感染丙型肝炎病毒(HCV)在后续的研究和经验丰富的瞬态肝转氨酶升高三年级,和艺术是重新启动。没有严重不良事件报告(补充表3)。

平均CD4+T细胞计数是729(范围483 - 1192)和660(范围284 - 1083)细胞每μl第一抗体注入时,反弹,分别(扩展数据图。1 d补充表4,5)。没有明显的改变激活CD4细胞表达的标记+或CD8+T细胞之间的初始和26周的时间点(扩展数据图。2 a - c)。参与者5108(组1)经历了绝对CD4下降30%以上+从基线T细胞数(0天)在18周尽管保持察觉血浆hiv - 1 RNA。每个协议,他没有收到本周20抗体注入,建议恢复艺术。然而,这个参与者选择了艺术将持续到病毒反弹,发生在24周,当他的CD4细胞+T细胞是640个细胞/μl(补充表4)。在组1和2,艺术的重启后病毒反弹导致控制hiv - 1 RNA病毒血症的不到50份每毫升8和6周后,分别为(补充表4,5)。我们得出这样的结论:重复注入3 bnc117和10 - 1074都是安全的,同时。

药物动力学

血清浓度的3 bnc117和10 - 1074测量使用bNAb-specific pseudovirus中和试验18。3 bnc117和10 - 1074的平均半衰期分别为14.9和20.3,分别为(P= 0.001;无花果。1 b,扩展数据图。3补充表4,5)。没有显著差异抗体半衰期在没有(组1)或存在(组2)艺术(扩展数据图。3 b, c),获得的半衰期是类似在以往临床试验期间一个剂量的抗体后抑制的艺术或三个剂量的抗体在中断(扩展数据图。3 d和参考文献。11,12,13)。我们得出这样的结论:药代动力学资料3 bnc117和10 - 1074是独立的并发抗逆转录病毒药物在抑制病毒和不改变多个政府在20周。

病毒抑制

十三17(76%)可评价的第1组参与者保持病毒抑制艺术至少20周后停药。16组1的参与者没有re-initiate艺术反弹之前,重复组合与病毒相关抗体治疗抑制至少7周反弹的平均时间为28.5周(无花果。2补充表4,5)。人收到七bNAb输液维持病毒抑制21与平均时间超过48周反弹的32周或12周后最后bNAb输液。虽然整体反弹时间明显长于人收到只有三个注入相同的抗体12(无花果。2 b(左)log-rank Mantel-CoxP= 0.03),反弹后注入相似(图2 b,log-rank Mantel-CoxP= 0.47)。组1的两个参与者(5106和5120)完成研究随访48周没有出现反弹。参与者5106年失访1年之后,参与者5120仍然是病毒抑制后2年没有检测到的抗逆转录病毒药物。值得注意的是,参与者5106是杂合的人类白细胞抗原(HLA) B57,这与增强艾滋病毒控制相关联19。

图2:病毒学和药代动力学跟踪个人的参与者。
图2

一个、血浆hiv - 1 RNA水平(黑线;左y设在)和bNAb血清浓度(3 bnc117,红色;10 - 1074,蓝色;正确的y设在)第1组参与者保持病毒抑制(n= 13)或恢复艺术(n= 4)剂量期间以及组2 (n= 6)参与者。红色和蓝色三角形表明3 bnc117和10 - 1074注资,分别。灰色阴影区域表示时间的艺术。hiv - 1 RNA的检测下限是每毫升20册。星号表示参与者与协议偏差分析治疗中断。参与者5115周31日前恢复艺术但没有实现完全的病毒抑制由于不遵守日程安排。参与5128年恢复艺术在48周,取得完整的病毒抑制在研究一个额外的52周的访问。b,kaplan meier情节总结艺术在中断(左)或病毒反弹后抗体注入所有组1(右)参与者接收7注入(n= 16,绿线)。蓝色的点线表示一群人收到的三个注入抗体组合12(n= 15参与者)。的y设在表明参与者的比例保持病毒抑制。的x设在表示数周后开始分析治疗中断(ATI)(左)和周后的数量持续输注(右)。参与者5122被排除在分析由于COVID-19相关艺术的重启。参与者5104显示两个病毒的< 500拷贝/毫升,随后反弹前持续控制在33周的病毒血症。c,kaplan meier总结的病毒反弹时间组1(绿线)和组2(绿色的点线)参与者,分别。灰色阴影区域表示时间在艺术为第二组参与者。5216年参与者决定反对艺术中断,被排除在分析之外。Log-rank (Mantel-Cox)测试是用来确定统计学意义b,c。

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组2中的参与者保持病毒抑制中间的7周(周4 - 9日)在艺术停止13周(范围10 - 15周)后bNAb注入(无花果。2摄氏度)。没有统计上的显著差异,病毒反弹后艺术中断1组和2组参与者之间(图2摄氏度,log-rank Mantel-CoxP= 0.69)。

的平均血清浓度3 bnc117和10 - 1074反弹的时候人20周后仍抑制μg 3.5和28.3毫升−1,分别。与前一个报告一致12,这些参与者经历了病毒反弹后的血清浓度3 bnc117下降大约10μg毫升以下−1,导致一段时间的10 - 1074单药治疗。我们得出这样的结论:重复注入两个anti-HIV-1 bNAb能保持病毒抑制比之前报道的时间更长,只要bNAb水平继续治疗。类似的结果在一个平行的安慰剂对照临床观察trial-sponsored国家过敏症和传染病研究所的美国国立卫生研究院(NIAID / NIH)——的艾滋病毒感染者开始艺术在感染的早期阶段获得八相同剂量的抗体组合在24周内没有艺术20.。

基线和反弹抗体的敏感性

研究参与者事先为筛查前病毒的储层敏感性3 bnc117或10 - 1074。检查病毒单克隆抗体的潜在影响对时间敏感性测试病毒反弹,我们进行事后分析水库和血浆病毒反弹。信封(env)序列得到等离子体的病毒反弹或从水库limiting-dilution PCR和Q4PCR21(见方法)。我们分析了env序列已知的10 - 1074电阻突变(方法),再分为敏感或耐药。序列的预测阻力是不可能3 bnc117,和副产物化验也有限的在这方面由于有限数量的病毒和差距和反弹病毒产物12,22,23。样本还分析了抗10 - 1074和3 bnc117 PhenoSense单克隆抗体测定(Labcorp-Monogram生物科学)与一个探索性的敏感度阈值(无花果。3补充表6)。

图3:事后灵敏度分析储层和等离子反弹影响病毒和病毒反弹的时间。
图3

潜在的储层(左)和血浆病毒反弹从参与组1(右)(n= 16)表型和遗传型的分析为10 - 1074和3 bnc117阻力,分别(方法)。是基于序列分析env序列恢复limiting-dilution PCR在基线或Q4PCR各时间点测试。中间面板描述病毒反弹时间升序排序。PhenoSense单克隆抗体测定antibody-sensitive (IC90年< 1μg毫升−1)和防病毒(IC90年> 1μg毫升−1与绿色和红色方块)进行描述,分别。序列分析antibody-sensitive防(缺乏耐药病毒)或(识别一个或多个耐药病毒)病毒是绿色和红色方块中描述,分别。中出现的数字方块代表序列的数量分析。参与者样本的结果或序列可以获得用灰色表示。参与者保持病毒抑制没有经历反弹显示一个蓝色的正方形。没有样品分析与白色正方形表示。

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序列分析16组1的参与者10 - 1074电阻突变是由limiting-dilutionenv聚合酶链反应(n由Q4PCR = 360), (n= 1096)。尽管10 - 1074电阻突变没有发现在更为有限envPCR样本,Q4PCR发现四个人(25%)和潜在的病毒(图10 - 1074的抵抗力。3补充表7)。时间在个人艺术中断后反弹窝藏10 - 1074耐前病毒是短但不统计不同敏感同行(P= 0.54、25.5与30周;扩展的数据图。4)。相比之下,limiting-dilutionenvPCR在等离子体病毒反弹后出现一段时间的10 - 1074单药治疗显示10 - 1074目标站点的突变,但两组参与者反弹(图1。3补充表7)。

水库的PhenoSense化验没有产生结果病毒组1 38%的参与者(图。3补充表6)。结果可供十组1的参与者。平均时间反弹并没有统计学上不同的参与者与敏感,单或double-resistant水库病毒(单向方差分析(方差分析)P= 0.89,扩展数据图。4 b)。如果个人的样本没有产生的结果在这个试验和耐水库病毒被排除在参与,然后14的16组1(无花果参与者会被排除在外。2一个,3补充表6)。因此,在这个小数据集,这两个基因型和表型敏感性分析无法预测临床结果和时间病毒反弹。放大失败,测序深度,结果之间的差异和病毒反弹,截止值定义糟糕的敏感,我们无法可靠地定义序列,导致3 bnc117阻力限制现有水库的适用性筛选化验。额外的效用分析这些化验将需要更大的数据集和分析的前瞻性和回顾性研究。

潜在的储层

检查的影响长期bNAb疗法潜在的水库,我们对样品进行了Q4PCR获得约2 - 4周之前和24或26周之后第一个抗体注入21,24(bNAb治疗组、补充表1和8)。此外,我们在分析储层平行组10个参与者仍在抑制艺术没有收到配对抗体注入中间间隔的时间点32周(范围24-58周)之间的基线和随访(艺术就组;无花果。4补充表2,8)。

图4:水库量化和组成。
图4

一个、完整的频率和缺陷每10前病毒的基因组6CD4+T细胞(日志规范化)由Q4PCR治疗前和治疗后(26周)bNAb疗法与参与者一直在艺术至少7年(顶部,圆圈)和基线和随访(24-58周)艺术就(底、广场)组,分别。所有参与者与水库测量包括配对(bNAb疗法至少7年的艺术n= 12,艺术n= 10)。开放符号代表降低检测极限的一半(定义为完整的前病毒的频率假设一个完整的前病毒的基因组分析细胞的总数没有目标识别)。绿色和红色单杠描绘的意思是美国南达科他州±完整的和有缺陷的前病毒的频率,分别。b,纵向相对的变化表示的前病毒的亚型bNAb疗法至少7年艺术(上)和艺术就(底部)组,分别。描述是完整的和有缺陷的前病毒的亚型的分数相对于总前病毒从每个参与者在指定的时间点。前病毒的亚型:完好无损;SV、结构变化;米格,缺少内部基因;LTR LTR缺陷;默沙东公司,主要的拼接捐赠者突变;和NF,非功能性。参与者都至少有一个完整的前病毒的基因组恢复显示(bNAb疗法至少7年的艺术n= 11,艺术n= 9)。单杠中位数和四分位范围。c前病毒的频率相对变化(表示每个数据集的底部)治疗前(T1)、治疗后时间点(T2)完好无损(绿色)和缺陷(红色)前病毒的频率在bNAb疗法(圈)和艺术就(广场)组,分别。单杠表明中值变化。开放与十字架代表个人之外的数据点y设在范围(相对变化TSC−127 = 0.09)。P值显示图表的顶部,并使用双尾成对学生的测定t以及在一个和双尾Wilcoxon配对符号秩检验b,c。

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总的来说,我们恢复和分析6074缺陷(bNAb疗法n= 3866,艺术n= 2208)和841年完整的前病毒的(bNAb疗法n= 542,艺术n= 299)序列(扩展数据图。5补充表8)。五个不同类别的缺陷前病毒记录:(1)结构变化;(2)缺少内部的基因;(3)长末端重复(LTR)缺陷;(4)主要拼接捐赠者突变;(5)非功能性(见方法)。与以前的工作协议,最丰富的类别有缺陷的前病毒被那些失踪的内部基因由于内部删除不同的大小(扩展数据图。5和参考文献。21,25)。系统发育分析表明,试验参与者进行临床流行病学感染不同的病毒(扩展数据图。6)。两个参与者(5108和5112)感染non-clade B亚型G和A1,分别。中位数时间为参与者窝藏non-clade病毒反弹是短乙型流感病毒,但差异没有达到统计学意义(P= 0.30,17周与30周;扩展的数据图。4摄氏度)。此外,时间反弹并未直接与完整的大小前病毒的水库(扩展数据图。4 d)。

水库半衰期似乎增加艺术治疗的七年后26和个人在我们群接受bNAb治疗有更短的平均时间不间断的艺术比那些没有接受抗体治疗(扩展数据图。1 c)。控制这个潜在的混杂变量,我们省略了所有那些被抑制的艺术不到七年从我们最初的储层分析。

正如所料,在总体上没有变化的绝对数量缺陷前病毒在水库在观察期间在积极治疗或平行艺术就组25,26,27,28(无花果。4得了,扩展数据图。5 b, c补充表8)。此外,也没有重大变化的相对表现五个不同类别的活动中有缺陷的前病毒疗法或平行的艺术就集团(无花果。4 b,扩展数据图。5 b, c补充表8)。

在有缺陷的前病毒相比,有一个温和但却意义重大的变化在两个完整的绝对数量和相对表示antibody-treated队列前病毒(P= 0.04,P= 0.03分别bNAb疗法至少7年艺术;无花果。4 a、b)。积极治疗组,平均减少46%的完整水库超过6个月接近但没有达到统计学意义(P= 0.06;无花果。4摄氏度)。将需要额外的时间点计算半衰期水库的个体接受免疫疗法。

进一步压力测试结果我们进行了两个额外的分析:(1)所有参与者不管时间在艺术;(2)所有参与者+所有志愿者(n= 4)从并行NIH / NIAID-sponsored临床试验有一个可衡量的水库和维护病毒抑制在缺乏艺术在收到八个相同剂量的抗体组合在24周内53(扩展数据图。7得了补充表1,8)。在任何情况下都不有缺陷的水库有显著变化。相比之下,当所有的人在我们的群体中,有一个下降的相对比例(P= 0.01),绝对数字(P= 0.06)和相对数字(P= 0.07)完整的前病毒(扩展数据图。7 a、c)。当额外的志愿者从NIH / NIAID也包括相对比例(P= 0.002),绝对数字(P= 0.01)和相对数字(P= 0.05)完整的前病毒也降低(扩展数据图。7 b, c)。

值得注意的是,非功能性的相对表现和主要拼接捐赠者突变缺陷proviruses-near-full长度艾滋病毒基因组不同于完整的前病毒的基因组的一个核苷酸substitution-does不会改变显著抗体治疗后的组织进行了分析。因此,长距离PCR扩增效率无法解释观察到的变化的完整的前病毒的宿主bNAb疗法组(图。4 b,扩展数据图。7 a、b)。

确定完整的前病毒的水库中的观察到的变化依赖于分析治疗中断,我们执行一个单独的分析标本参与者谁治疗期间被打断bNAb剂量(扩展数据图。8 a, b, d)和第二组参与者仍在艺术(扩展数据图。8 c, d)。

亚组分析的参与者进行分析治疗中断(ATI) (ATI + bNAb组1和ATI + bNAb组1 +参与者从并行NIH / NIAID-sponsored临床试验(NIH pt。);扩展的数据图。8 a, d和扩展数据图。8 b, d分别显示相同的绝对和相对方向和大小的变化前病毒的景观总体分析(ATI + bNAb组1,绝对数值P= 0.17,相对组成P= 0.04,相对变化P= 0.13,平均减少23%;ATI + bNAb组1 + NIH pt,绝对数值P= 0.03,相对组成P= 0.01,相对变化P= 0.14,平均减少36%;扩展的数据图。8 a, b, d)。

类似水库的受试者中被观察到的变化仍在艺术上抗体注入(艺术+ bNAb组2),但有限的样本大小没有达到统计学意义(n= 6,绝对数量P= 0.24,相对组成P= 0.25,相对变化P= 0.44,平均减少23%,扩展数据图。8 c, d)。我们得出结论,完好无损的大小和构成潜在的储层变化间隔6个月个人维持镇压,同时接受重复剂量的anti-HIV-1 bnab。

基于储层分析允许完整的前病毒的明确识别,但由于相对稀缺的完整的前病毒潜伏水库,分析不可避免地依赖于小数字和需要额外的确认。

开放研究的结果在慢性感染参与者和并行安慰剂对照临床试验在原发感染人发起的艺术53证明抗体能保持抑制hiv - 1的时间太长。的抗体针对重叠组合抗原表位在这方面显得至关重要,因为单一疗法期间抗体耐药性的出现11,13。在76%(17)的13日数量有限的个人检查,其中大多数是hiv - 1感染支系B, 3 bnc117 + 10 - 1074抗体组合保持抑制缺乏事先的敏感性。抗体疗法的进一步实施的一个关键挑战是,可用不包括100%的hiv - 1菌株组合。此外,抗体的敏感性测试仍然不佳,部分原因是储层的深度很难获得充分代表性样本。虽然这些尚未公布,谨慎选择剂量方案,以避免时间的抗体单药治疗,密切监测和教育与病毒相关的参与者关于风险反弹期间艺术中断研究是至关重要的29日。尽管这些当前的挑战,长效抗体可能成为一个可行的治疗选择结合长效艺术来实现更高的利率的持续病毒抑制的艾滋病毒感染者群体中面临挑战与日常的方案。

hiv - 1储层是由非常大量的缺陷和完整的前病毒整合到各种基因的位置30.,31日,32。复活的完整的前病毒ART-suppressed个人谁治疗已经中断导致反弹病毒血症在大多数人两到四周后,即使长时间艺术的时期4。据估计,三到四个数量级的降低储层规模需要改变动力学反弹33。bNAb疗法似乎加速完整水库衰变,但正如预期的那样,改变储层规模的大小不足以推迟六个月后反弹。

几种方法关注完整的前病毒已经被用来描述储层的特征,包括定量34和定性35病毒产物化验,全身PCR附近36,37、完整的前病毒的聚合酶链反应27,38(IPDA)和Q4PCR21。虽然完整的绝对数量前病毒检测到这些方法各不相同39水库,他们都报告相同的完整的前病毒的半衰期为4到5年25,26,27,40,41。有缺陷的前病毒,一到两个数量级比完整的前病毒更丰富,有一个更长的半衰期比完整的前病毒26,28,37,42。之间的差异的大小和半衰期的完整和有缺陷的水库是重要的干预措施,旨在改变完整水库是衡量方法,可以明确区分这两个隔间。

测序研究表明,完整的水库在很大程度上是由扩展CD4的克隆+T细胞。个体克隆的大小是动态的和完整的水库衰变,它变得更多的克隆和不那么复杂25,31日,35,40。类似于其他T细胞,潜伏provirus-containing CD4+在反应抗原T细胞进行克隆扩张,包括慢性病毒感染如巨细胞病毒抗原43,44。克隆扩张需要细胞激活和NF-κB表达式,也有可能重新激活潜在的前病毒45。虽然高层hiv - 1表达导致细胞死亡46体外实验显示,只有一小部分划分潜在的细胞死亡后复活37,47,48。后生存这样做一些暂时性的表达hiv - 1包膜蛋白或peptide-major组织相容性复合体复合物在细胞表面bNAb潜在目标9,49,50或CD8+T细胞间隙9,50在临床前研究,记录bNAb-treated SHIV-infected猕猴8,9。

我们的数据表明,anti-HIV-1抗体能保持抑制,可能加速水库衰变的速率。抗体疗法可能会改变储层动力学通过限制克隆扩张,针对细胞分裂直接或通过增强CD8表达病毒蛋白质+T细胞免疫力。如果这些机制负责抗体介导的储层的变化,他们也可能发生在艺术治疗。更大规模的研究需要更长的时间来确定精确的半衰期的完整水库在抗体治疗和抗体标准的艺术是否会影响水库半衰期和有助于战略旨在长期hiv - 1缓解。

方法

研究设计

我们进行了阶段1 b、非盲、随机临床试验的两个治疗组的慢性感染hiv - 1感染者(http://www.clinicaltrials。政府;NCT03526848)。研究参与者被录取顺序根据合格标准和随机分配到两组1或组2在3:1的比例。计划的样本大小是40名学员;然而,由于COVID-19流行,早就停止了招生与26个参与者,与18加入组1和8组2。参与者收到七注入3 bnc117和10 - 1074静脉注射的剂量30毫克/公斤体重的抗体,在周0,2,4,8、12、16和20除非病毒发生反弹。病毒反弹被定义为> 200拷贝/毫升血浆hiv - 1 RNA水平在两个连续测量。组1停止艺术2天后第一抗体注入,而第二组仍在艺术中断药物第一抗体注入后26周。治疗中断期间的研究中,艺术是恢复是否有确认> CD4下降30%+或确诊CD4 T细胞计数+T细胞计数减少< 350细胞/μl从基线(0)天。等离子体通过研究hiv - 1病毒RNA水平监控每周星期38和病毒学标准为艺术重启适应不同阶段的随访期内:(A)部分0到每周26日连续2血浆hiv - 1 RNA水平> 200拷贝/毫升每周测量,(乙方)26至38周,持续(> 4周)hiv - 1 RNA水平> 1000拷贝/毫升每周测量;和(C)部分38至48周,连续2血浆hiv - 1 RNA水平> 1000拷贝/毫升测量每隔一周。其他艺术重新启动标准包括怀孕和症状与急性感染症状一致。研究参与者被随访48周后第一个输液。重复的研究假设是,政府注资3 bnc117和10 - 1074在缺乏艺术将安全和耐受性良好,维持病毒抑制艾滋病毒携带者在ATI和干扰HIV - 1水库。研究的主要终点是:(1)病毒反弹的速度12周后艺术中断(第12周组1,和周38组2);(2)时间返回的病毒血症(第一次血浆hiv - 1 RNA水平> 200拷贝/毫升2连续测量)后艺术中断;(3)的前病毒的hiv - 1 7抗体注入前后储层;和(4)率和不良事件和严重不良事件的严重性。之前所有的参与者提供书面知情同意参与这项研究,研究符合良好的临床实践。 The protocol was approved by the US Food and Drug Administration and the Rockefeller University and Mass General Brigham Human Research Institutional Review Boards (IRBs).

研究参与者

研究参与者被招募在洛克菲勒大学医院,纽约,美国马萨诸塞州综合医院,波士顿,美国。合格参与者18 - 65岁的成年人,HIV-1-infected,艺术与血浆hiv - 1 RNA水平< 50拷贝/毫升的至少12个月(> 50但病毒信号之一< 500拷贝/毫升在此期间被允许),血浆hiv - 1 RNA水平< 20册每毫升筛选访问,或确诊CD4报道+T细胞计数的最低点> 200每μl和当前的CD4细胞+T细胞数>每μl 500细胞。参与者在一个艺术疗法,包括NNRTI转向一个整合酶inhibitor-based方案(dolutegravir加泰诺福韦disoproxil延胡索酸酯和emtricitabine)前至少4周治疗中断由于NNRTIs的半衰期延长。排除标准包括病史抵抗两个或两个以上类别的抗逆转录病毒药物治疗,之前anti-HIV-1单克隆抗体疗法,同时乙肝或丙肝感染,临床相关的物理发现,医疗条件或实验室异常和怀孕或哺乳期。病毒反弹时间被定义为两个连续的病毒载量的第一> 200拷贝/毫升除了参与者5104经历过两次病毒光点(两个病毒载量的< 500拷贝/毫升)随后跟着抑制病毒血症与持续反弹之前在33周的病毒血症。

由于COVID-19大流行,一个参与者在组1(5122米)重新启动艺术虽然没有经历过病毒反弹和参与组2(5216)决定不分析治疗中断完成后的7个抗体注入。参与者5126米第一抗体注入后被撤回,因为他的NNRTI-based艺术疗法不不经意间切换根据协议,他被发现有615拷贝/毫升的病毒载量基线(天0)。此外,两个参与者(5207和5219)选择退出COVID-19-related和其他个人原因的研究。

外周血单核细胞(PBMC)样本的七个研究参与者在一个平行的NIH / NIAID-sponsored临床试验获得3 bnc117结合艺术中断期间10 - 1074 (http://www.clinicaltrials.gov;NCT03571204)包括储层评估(snel et al .,提交的手稿)。这个试验包括参与者发起的艺术在90天内被诊断出患有急性或早期艾滋病毒感染。报名参加者停止艺术第一抗体注入后3天,总共收到了8 3 bnc117和10 - 1074注资超过24周。储层评估进行基线和24周。4参与者选择进行分析,因为他们有可衡量的水库和维持病毒抑制而接收的所有8注入3 bnc117和10 - 1074(30毫克/千克体重的每个抗体)在24周。另一个参与者保持病毒抑制在24周没有可衡量的水库Q4PCR和被排除在分析之外。协议的机构审查委员会批准国家过敏症和传染病研究所,国立卫生研究院(snel et al .,提交的手稿)。

十附加个人抑制相似的艺术和基线临床特点是随着时间的推移在平行观测协议重复献血和储层评估,同时保持抑制艺术(艺术就组;扩展的数据图。1)。临床数据收集和管理进行了使用iMedRIS虹膜的软件11.02版。

研究过程

3 bnc117和10 - 1074人准备根据洛克菲勒大学药学和MGH药房管理标准操作程序和静脉注射的剂量30毫克公斤−1。单克隆抗体静脉输液管理的顺序,每个抗体超过60分钟。研究参与者被观察到洛克菲勒大学医院或马萨诸塞总医院1 h后抗体注入。

参与者返回每周(A和B部分部分)和双周刊(C)部分后续访问ATI期间安全评估,其中包括体格检查和临床实验室的测量参数如血液学、化学反应、尿液和怀孕测试(女性)。病毒载量监测每周(周1 - 38)或每两周(38 - 48)周基础和CD4细胞+T细胞计数分析期间监测每1 - 2周治疗中断和艺术重启后2 - 4周。每个研究访问期间,参与者被建议使用屏障保护的重要性,从艺术和艺术重启后直到病毒载量检测不到降低艾滋病毒传播的风险性伴侣。两个参与者获得丙肝病毒研究随访期间(一个又一个可能的性传播艺术已经恢复,但病毒抑制与药物使用前在ATI)(补充表3)。协议被修改为细菌包括每月测试性传播感染而参与者还是艺术,直到病毒抑制后重启。研究人员评估和分级根据艾滋病部门的不良事件(多)表为成人和儿童不良事件的严重程度分级2.1版(2017年7月)和确定因果关系。

Leukapheresis洛克菲勒大学医院执行或在马萨诸塞州总医院星期−2和26周。收集血液样本之前,多次之后3 bnc117和10 - 1074注资。收集样本处理在4 h,血清和血浆样本存储在−80°C。PBMCs被密度梯度离心法分离。PBMCs的绝对数量是决定使用一个自动细胞计数(Vi-Cell XR;贝克曼库尔特)或手动,细胞冻存胎牛血清+ 10% DMSO之前存储在液态氮。

血浆hiv - 1 RNA水平

hiv - 1 RNA水平测量等离子体筛选的时候,周−2天0(注入之前),每周在ATI,每两周每八周后病毒发生反弹。hiv - 1 RNA水平测定使用罗氏COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan hiv - 1试验(2.0版本)或罗氏COBAS hiv - 1定量核酸测试(COBAS 6800),量化hiv - 1 RNA在2×10的范围11×107拷贝/毫升。这些化验进行LabCorp或在当地实验室麻省综合医院。

CD4+T细胞

CD4+T细胞计数测定临床流式细胞术测定在LabCorp执行或在当地实验室麻省综合医院。

3 bnc117和10 - 1074测量血清水平

血清浓度的活性3 bnc117和10 - 1074测定前和结束时每10 - 1074注入,每4周ATI期间,每隔4到8周后随访期间艺术重启,和病毒反弹的时候验证luciferase-based TZM-bl细胞中和试验(如前所述)18。总之,血清样本测试使用主要1:20稀释5倍滴定法对hiv - 1 Env假病毒Q842系列。d12和X2088_c9, which are highly sensitive to neutralization by 3BNC117 and 10-1074, respectively, while fully resistant against the other administered antibody. In the case of the post-infusion time points of 10-1074, instances where the serum inhibitory dose (ID50对X2088_c9 > 100000)滴定度,血清样本也测试不太敏感的菌株,Du422。同样,在和时间点的情况下3 bnc117,例子血清ID50针对Q842滴定度。d12were >100,000, serum samples were also tested against a less sensitive strain, Q461.e2 (Supplementary Tables4和5)。生成标准曲线、3 bnc117和10 - 1074临床药物产品包含在每一个试验设置使用一个主μg 10毫升的浓度−15倍滴定系列。血清浓度的3 bnc117和10 - 1074为每个样本计算如下:血清ID50滴定度(稀释)×3 bnc117 IC50或10 - 1074集成电路50滴定度(μg毫升−1)= 3的血清浓度bnc117或10 - 1074(μg毫升−1)。Env假病毒生产使用ART-resistant骨干向量减少背景抑制活性的抗逆转录病毒药物如果存在血清样本(SG3ΔEnv / K101P.Q148H.Y181C;m . s .海员未公开的数据)。准型病毒包膜蛋白的小鼠白血病病毒(MLV)作为一种消极的控制。血清抗体浓度计算使用ID80年滴定度和单克隆抗体IC80年如果非特异性针对MLV检测活动。检测的下限0.007µg毫升−1和0.005µg毫升−1分别为3 bnc117和10 - 1074。所有化验项目标准实验室进行的会议。

抗逆转录病毒药物筛选

血浆样本筛查的抗逆转录病毒药物(替诺福韦(TFV) emtricitabine (FTC),拉米夫定(3 tc) abacavir (ABC)、齐多夫定(ZDV)、奈韦拉平(一步法),amprenavir (APV) atazanavir (ATV),内(DRV) etravirine (ETR) elvitegravir (EVG),依法韦伦(EFV), lopinavir (LPV),例如(RTV), raltegravir(轮胎式龙门吊)dolutegravir(壳体),maraviroc (MVC)和rilpivirine(以下))的北卡罗莱纳大学艾滋病研究中心临床药理学和分析化学的核心。结果报告为“峰值”或“没有峰”。没有结果对应于峰值non-detectable抗逆转录病毒浓度ng > 1毫升的样品−1FTC, TFV 3 tc, ABC, ZDV和一步法,或者> 10 ng毫升−1APV、ATV DRV, ETR EVG, EFV, LPV, RTV轮胎式龙门吊,壳体,MVC和以下。样本的参与者继续维持病毒抑制> 12周(组1)或> 12周从去年剂量(组2)大约每12周进行一次,直到病毒反弹。额外的样品从参与5120年收集了大约24个月后艺术中断也是考验。

表型特征和表面染色

冷冻PBMCs解冻,用PBS。细胞然后surface-stained 30分钟在黑暗中与可行性试剂在4°C (BD地平线上可以解决的可行性污点;BD生物科学)和13-colour鸡尾酒含表面抗体的单克隆抗体CD19(克隆SJ25C1,稀释1/250),CD20(1/100)克隆2 h7,稀释,CD66b(克隆G10F5,稀释1/250),CD14(克隆M5E2,稀释1/150),CD3(克隆SK7,稀释1/100),CD4(克隆OKT4,稀释1/200),CD8(克隆RPA-T8,稀释1/500)、CD38(克隆HIT2,稀释1/250)、CD69(克隆FN50,稀释1/500)、CD71(克隆M-A712,稀释1/100)、CD25(1/300)克隆2 a3,稀释,CD152(克隆BNI3,稀释1/250),CD279(克隆EH12.1,稀释1/500),TIGIT(741182年克隆,稀释1/500),CD223(克隆t47 - 530,稀释1/250)和CD336(克隆7 d3,稀释1/500)。标签后,细胞被洗和含有2%多聚甲醛固定在PBS和存储在4°C流式细胞术在24 h收购。

流式细胞术分析

所有事件(∼每样1200000 - 1800000事件)收集在BD FACSymphony A5细胞分析仪(BD生物科学)。为进一步分析淋巴细胞是封闭的,如扩展数据图所示。2使用FlowJo版本9.9.6 (BD生物科学)。

PhenoSense单克隆抗体测定

PhenoSense单克隆抗体测定(Labcorp-Monogram生物科学)是一个表型细胞传染性试验能力评估案例- - -用的易感性假病毒颗粒的轴承等离子体或PMBC-derived hiv - 1信封蛋白质anti-envelope单克隆抗体。全身的信封序列的数量,扩大从血浆HIV RNA来自viremic个人或细胞相关艾滋病病毒DNA aviremic个人,被克隆到一个信封表达载体。信封表达载体人口和艾滋病毒基因组记者向量,与cotransfected到生产商env取而代之的是荧光素酶细胞生成案例- - -用荧光素酶报告假病毒颗粒。Pseudovirions然后进行中和敏感度3 bnc117或10 - 1074体外细胞试验。

临床中和截止值灵敏度尚未建立PhenoSense单克隆抗体测定。在这项研究中,以下探索性值被用来定义单克隆抗体的敏感性:集成电路90年< 1µg毫升−1每分,最高抑制=或> 98%。

单基因组扩增的水库env基因

基因组DNA (gDNA)使用Puregene孤立的细胞和组织工具包(试剂盒,商品目录号。158388)根据制造商的指示。使用Nanodrop DNA浓度测量。hiv - 1信封从gDNA放大单基因组扩增(SGA)。实现一个泊松分布,其中≤30%的油井产量PCR产物,gDNA端点在384 -孔板稀释。执行第一轮PCR在94°C 2分钟;15秒94°C, 58.5°C 30年代,3分钟×35和68°C;和68°C,持续15分钟。1微升的PCR产品从第一轮第二轮嵌套PCR被用作模板PCR在94°C 2分钟;15秒94°C, 61°C 30年代,3分钟×45和68°C; and 68 °C for 15 min. PCR2 products were checked using 1% 96-well E-Gels (Invitrogen). Bands with the expected size of the HIV-1 envelope were subjected to library preparation and sequencing using the Illumina Miseq platform (Control Software v3.1.0.13). All PCRs were performed using Platinum Taq Polymerase. Primers used in the first round were envB5out 5′–TAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAG–3′ and envB3out 5′–TTGCTACTTGTGATTGCTCCATGT–3′. In cases where there was no amplification in the first round, 3′ half-genome primers were used instead (B3F3 5′-TGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATAC-3′ and R3B6R 5′-TGAAGCACTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGC-3′). The second-round nested primers used were envB5in 5′–TTAGGCATCTCCzTATGGCAGGAAGAAG–3′ and envB3in 5′–GTCTCGAGATACTGCTCCCACCC–3′.

Q4PCR

Q4PCR如前所述21,39。总之,基因组DNA CD4总量从100万年到500万年+T细胞是孤立使用Gentra工具包(试剂盒)或phenol-chloroform Puregene细胞,DNA浓度测量使用量子位高灵敏度工具包(热费希尔科学)。其次,外部PCR (NFL1)进行基因组DNA单副本稀释使用外PCR引物BLOuterF (5′-AAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG-3′)和BLOuterR37(5′-TGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGTC-3′)。未稀释的1-µl整除NFL1 PCR产品受到Q4PCR反应使用的结合四个primer-probe集这一目标基因组保守地区hiv - 1。每个primer-probe集由一对正向和反向引物和荧光标记内部水解探测器如前所述21如下:PS, 5′-TCTCTCGACGCAGGACTC-3′;相反,5′-TCTAGCCTCCGCTAGTCAAA-3′;调查,5′- / Cy5 / TTTGGCGTA /道/ CTCACCAGTCGCC-3′/ IAbRQSp(集成DNA技术);env, 5′-AGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGC-3′;相反,5′-GTCTGGCCTGTACCGTCAGC-3′;调查,5′-维克/ CCTTGGGTTCTTGGGA-3′/ MGB(热费希尔科学);呕吐,5′-ATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGA-3′;相反,5′- TGCTTGATGTCCCCCCACT-3′;探针5′- / 6-FAM / CCACCCC AC /禅AAGATTTAAACACCATGCTAA-3′/ IABkFQ(集成DNA技术);和波尔,5′gca CTTTAAATTTTCCCATTAGTCCTA-3′; reverse, 5′-CAAATTTCTACTAATGCTTTTATTTTTTC-3′; probe, 5′-/NED/AAGCCAGGAATGGA-TGGCC-3′/ MGB (Thermo Fisher Scientific). Each Q4PCR reaction was performed in a 10-µl total reaction volume containing 5 µl TaqMan universal PCR master mix containing Rox (catalogue no. 4304437; Applied Biosystems), 1 µl diluted genomic DNA, nuclease-free water, and the following primer and probe concentrations: PS, 675 nM forward and reverse primers with 187.5 nM PS internal probe; env, 90 nM forward and reverse primers with 25 nM env internal probe; gag, 337.5 nM forward and reverse primers with 93.75 nM gag internal probe; and pol, 675 nM forward and reverse primers with 187.5 nM pol internal probe. Quantitative PCR (qPCR) conditions were 94 °C for 10 min, 40 cycles of 94 °C for 15 s, and 60 °C for 60 s. All qPCRs were performed in a 384-well plate format using the Applied Biosystem QuantStudio 6 or 7 Flex real-time PCR system. qPCR data analysis was performed as previously described212.4.3使用ThermoFisher设计与分析软件。一般来说,样本显示反应的两个或两个以上的四个qPCR探针被选为一个嵌套PCR (NFL2)除了参与者5108人样本的反应性与一个或多个NFL2四qPCR探针被选中。这种集中的方法检测子集的有缺陷的前病毒阳性的至少2 4寡核苷酸探针进而导致有缺陷的前病毒的绝对数量的低估。NFL2反应进行稀释1-µl整除的NFL1 PCR产物。反应进行20-µl反应体积使用铂Taq高保真聚合酶(热费希尔科学)和PCR引物275 f37(5′-ACAGGGACCTGAAAGCGAAAG-3′)和280 r (5′-CTAGTTACCAGAGTCACACAACAGACG-3′)的浓度800海里。图书馆准备和测序进行如前所述21。取样时间点没有恢复完整的序列测定下限检测统计分析。检测极限计算一半的前病毒的频率假设一个完整序列的采样输入最高的细胞。

单基因组扩增的血浆病毒反弹env基因

测序的hiv - 1等离子反弹env基因如前所述12,51。

hiv - 1基因重建

HIV - 1基因重建使用我们的内部管道,有缺陷的和完整的艾滋病毒基因组汇编(DIHIVA),管道装配的原始测序读到带注释的艾滋病毒基因组,在数小时内能够重建成千上万的基因组。首先,它消除了PCR扩增并执行使用clumpify纠错。从BBtools包v38.72 sh (http://sourceforge.net/projects/bbmap)。之后,质量控制检查由削减大量的包v0.6.4 (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore)削减Illumina公司适配器和低质量的基础。管道还使用bbduk。sh从BBtools包去除污染物可能读取使用洛斯阿拉莫斯HIV艾滋病毒序列数据库(https://www.hiv.lanl.gov)是一个积极的控制。一个k-mer-based汇编、黑桃v3.13.052用于组装hiv - 1序列。最长的重叠群装配通过爆炸HXB2 hiv - 1序列对齐设置正确的取向和转让注释。序列与双峰,区域指示的存在两个或两个以上的病毒样本(截止共识身份的任何残留< 70%),或样本数量有限的读取(≤500测序读)从下游分析省略。最后,重建的序列被归类为完整的或有缺陷的前病毒。我们将有缺陷的前病毒的序列分成五个子类:(1)非功能性,即完成,但是与一个或多个完整的基因组早期停止在至少一个密码子编码的基因;(2)主要拼接捐赠者突变突变,即完成,完整的,与突变在坐标系基因组5′剪接供体1 (D1);(3)缺少内部基因,截断前病毒,拥有大量内部删除跨越一个或多个9艾滋病毒编码的基因;(4)结构性变化,包含indels基因组,复制或倒置;(5)LTR缺陷,失踪的3′LTR或基因组5′LTR和PSI地区

事后10 - 1074模型灵敏度测试

重建env序列分析的计算预测10 - 1074逃避突变53。的env序列被列为敏感时遵守以下所有氨基酸规则(使用HXB2编号):332:N;333:非P;334年:S、T;325:D N或T和330:H或y模型的性能进行了测试与10 - 1074中和面板,包括557株(n10 = 371 - 1074 (IC敏感50= 2.0µg毫升−1),n10 = 186 (IC - 1074的抵抗力50≥2.0µg毫升−1))。预测的393株敏感,366被证明是真实的敏感和27是假的敏感。预测的164株耐耐159被证明是正确的和5是假的耐药导致敏感性为99%,特异性为85%。

系统发育分析

核苷酸排列的env序列翻译一致使用MAFFT v7.487 BLOSUM62下成本矩阵。最大似然生成系统发育树被从这些比对PhyML v3.1使用一般倒流(GTR)模型1000。

统计分析

病毒反弹的艺术中断后12周组1、组2计算。差异时间艺术中断后病毒反弹,去年抗体注入组1和更短的抗体之间的联合治疗的研究12确定使用kaplan meier曲线比较和log-rank (Mantel-Cox)测试。差异时间病毒反弹1组和2组之间也决定。自诊断和时间的差异之间的不间断艺术bNAb疗法和艺术就组决定使用双尾Mann-Whitney紫外线测试。时间的差异与表型耐药病毒反弹参与者之间,部分病毒耐药或敏感水库决心用单向方差分析图基多重比较检验。差异日志归一化频率的完整和有缺陷的前病毒的基因组每106CD4+T细胞测定使用成对的学生的t以及。前病毒的频率相对变化确定使用双尾Wilcoxon配对符号秩bNAb疗法和艺术就组内测试匹配比较。药代动力学参数估计通过执行non-compartmental分析使用凤凰WinNonlin构建8.3 (Certara),使用所有可用的药代动力学数据的时间点开始后10 - 1074的最后注入TZM-bl化验。这些和其他所有统计测试表明手稿和图传说进行使用GraphPad Prism 9.1。

数据显示

在2021年Adobe Illustrator数据安排。

报告总结

进一步研究信息设计是可用的自然研究报告摘要与本文有关。