FcγR-mediated SARS-CoV-2感染单核细胞激活炎症gydF4y2Ba

SARS-CoV-2导致严重COVID-19,急性呼吸窘迫可以进步multiorgan衰竭和死亡在老年人和并发症患者gydF4y2Ba^1克ydF4y2Ba。增加慢性炎症是与衰老有关(inflammaging)和并发症严重疾病有关gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba和严重的疾病与炎症的迹象gydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba}。当髓细胞侵入性感染,感觉他们激活inflammasomes声音一个先天免疫报警gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba。Inflammasome激活需要过程和发布(il - 1)的家庭因子,最强有力的炎症介质gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba。然而,肿瘤坏死因子受体激活NF-κB总科和T辅助17 (TgydF4y2Ba_HgydF4y2Ba17)细胞细胞因子也会导致严重的炎症。当inflammasomes意义感染,他们招募ASC适配器和组装成大型招募和激活caspase-1复合物,进而过程il - 1 pro-cytokines和造孔gasdermin D (GSDMD)破坏细胞膜,导致细胞死亡和细胞因子释放gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba。Pyroptotic细胞膜破裂释放细胞因子,趋化因子和其他alarmins招募免疫细胞感染的网站。LDH释放pyroptosis来说是特殊的和其他形式的坏死细胞死亡gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba和LDH升高是一个最好的严重COVID-19相关gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

正如inflammasome激活是一个重要的炎症介质gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba,我们检查了病人的血液感染SARS-CoV-2 inflammasome激活和pyroptosis。刚从19分离出单核细胞健康的捐赠者个人(HDs)和22 COVID-19患者在急诊科对造血的细胞标记染色;小的可以解决的染料(僵尸黄色)与受损的等离子体膜,进入细胞;膜联蛋白V,程序性细胞死亡(图的一项指标。gydF4y2Ba1 a, bgydF4y2Ba,扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和补充表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)。膜联蛋白VgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba僵尸gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba凋亡细胞没有增加任何分组人口样本COVID-19患者。然而,大约6%的患者单核细胞平均COVID-19拿起僵尸染料,膜损伤的标志与pyroptosis一致。患者的淋巴细胞在样本子集COVID-19显示pyroptosis增加。单核细胞流式细胞仪分析表明有一个古典单核细胞(CD14的频率降低gydF4y2Ba^高gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba)在15个患者COVID-19与13 HDs相比,而中间单核细胞(CD14gydF4y2Ba^高gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)显著增加,但没有改变(CD14在非经典的子集gydF4y2Ba^低gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。许多中间(大约60%)和非经典的(约40%),但没有一个更丰富的古典,单核细胞有了SARS-CoV-2病毒核衣壳(N)染色时(无花果。gydF4y2Ba1 d, egydF4y2Ba)。只有单核细胞,表达CD16-an锁定的重要中介phagocytosis-took病毒,anti-spike RBD免疫球蛋白等离子滴定度测定患者血浆样品中64 COVID-19获得在演讲在急诊室,20 HDs和5患者COVID-19-like症状但SARS-CoV-2 PCR -(以后,non-COVID-19病人)(图。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)。大多数COVID-19患者,但不是HDs或non-COVID-19控制,anti-spike RBD免疫球蛋白升高,这表明他们已经感染了大约一个星期gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba。血浆样本COVID-19患者不同疾病比较结果和HDs pyroptosis-specific标记(GSDMD、IL-1βIL-1RA,地震和LDH活性)(图gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba),炎症标记物不特定pyroptosis(炎性细胞因子il - 6、TNF和IL-17/17A;生长因子IL-7和g - csf;和趋化因子CCL7 CXCL9和CXCL10)和干扰素(IFNβ和IFNγ)。符合公布的数据gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba},并非所有的炎症标记都是特定于pyroptosis显著升高患者的血浆COVID-19 (IL-17/17A除外)和干扰素没有检测到高于基线(数据未显示)。pyroptosis标记都显著升高患者的血浆COVID-19与HDs相比。虽然在COVID-19患者样本,明显高于血浆IL-1β很低,这并不奇怪,因为它是快速清除,通常不是发现即使在pyroptosis-mediated疾病患者。然而,它的对手IL-1RA,用作代理gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba在样本大大增加COVID-19患者。注意,il - 1细胞因子和pyroptosis强有力地激活其他炎症标志物升高gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

确定pyroptosis生物标志物与COVID-19疾病严重程度、患者血浆从10 HDs和60 COVID-19 GSDMD分析,LDH, IL-1RA和地震在演讲和天住院病人(图3和7。gydF4y2Ba1 hgydF4y2Ba和补充表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba)。患者分为轻微、中等和严重疾病使用MGH COVID敏锐度gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba。等离子GSDMD、LDH、IL-1RA和地震都高的样本严重疾病患者和患有轻微或中度的疾病相比,但GSDMD不显著的增加。总的来说,这些结果表明持续pyroptosis COVID-19血液中更加突出的严重疾病。gydF4y2Ba

这些数据表明,患者单核细胞COVID-19可能死于pyroptosis和释放炎性细胞因子导致糟糕的结果。没有多少人知道病毒如何与27个潜在的人类交互规范inflammasome传感器gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba。的NLRP3 inflammasome,检测KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba射流产生的各种刺激,可以激活特定的病毒蛋白gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}。三个SARS-CoV-2 proteins-Orf3a Orf8和信封(E)——被认为是“viroporins”(离子通道),可能激活KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba为冠状流出,如前所述gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba。Orf3和Orf8编码只有人类冠状病毒致病性。有趣的是,蝙蝠,是冠的自然宿主和SARS-CoV-2有抑制NLRP3应对多种病毒,包括MERS-CoV,这或许可以解释这些感染,尽管高病毒载量的宽容gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba。检查是否患者单核细胞COVID-19接受pyroptosis,刚刚独立,丰富了HDs的单核细胞,患者COVID-19复杂疾病的严重性(补充表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)和non-COVID-19患者使用成像流式细胞术分析常见的表达和细胞内分布inflammasome适配器ASC,激活caspase-1(使用fluorochrome-labelled抑制剂还存在的试验(FLICA))和GSDMD。激活规范inflammasomes形式大micrometre-sized inflammasome-ASC-caspase-1斑点gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba。从COVID-19患者约4%的单核细胞,单核细胞的1% non-COVID-19病人,但没有从HDs单核细胞,有caspase-1和ASC斑点(图。gydF4y2Ba2 a - cgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba)。这些结果表明,其它原因造成的呼吸窘迫激活单核inflammasomes,但是激活更广泛SARS-CoV-2感染。大多数细胞的ASC斑点(大约80%)患者COVID-19也与caspase-1斑点(无花果。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

COVID-19单核细胞与ASC斑点显示膨胀等离子体膜,GSDMD再分配从细胞质到细胞膜puncta和僵尸染料吸收,符合GSDMD孔隙的形成和pyroptosis,但细胞没有ASC斑点没有(图。gydF4y2Ba2 e, fgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2 b, egydF4y2Ba)。大多数僵尸gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞已经ASC斑点(62±9%),表明大多数COVID-19单核细胞死亡是由于inflammasome激活。然而,只有28±5%的细胞ASC斑点了僵尸染料。这种差异可能是因为细胞膜透化作用后延迟ASC激活和垂死的细胞损坏膜迅速从血液中删除。免疫印迹的单核细胞溶解产物的HDs和COVID-19患者探索全身GSDMD (GSDMD-FL)及其c端片段(GSDMD-CT)和管家蛋白,β-actin和COX-IV(无花果。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba)。pyroptosis期间,裂解GSDMD肌动蛋白释放和肌动蛋白细胞骨架分解,而膜结合蛋白,如COX-IV,大多保留gydF4y2Ba^{3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}。GSDMD-FL中检测出所有的高清样本,但在只有1 3 COVID-19患者样本。GSDMD-CT COVID-19患者中检测出单核细胞和积极控制(有限合伙人+ nigericin-treated高清单核细胞)。虽然COX-IV所有的样本中,检测出,全身β-actin没有检测到在一个COVID-19样本,但β-actin碎片被发现在所有的样本COVID-19和nigericin-activated HD患者单核细胞。因此,接受pyroptosis COVID-19患者单核细胞。gydF4y2Ba

识别激活inflammasome,单核细胞的HDs和COVID-19患者co-stained ASC和三个规范inflammasomes (NLRP3, AIM2(由胞质DNA激活)和pyrin(激活细菌毒素))gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2 d, h-jgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2氟gydF4y2Ba)。在COVID-19患者单核细胞,ASC斑点与NLRP3和AIM2,但没有pyrin斑点。AIM2激活是意想不到的,虽然AIM2激活RNA病毒在极少数情况下的机制还不清楚gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba。AIM2可能感觉主持人线粒体DNA线粒体膜pyroptosis期间损坏gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba。几乎所有ASC-speck-positive单核细胞与NLRP3 AIM2斑点(图。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba),ASC, NLRP3 AIM2与(无花果。gydF4y2Ba2 jgydF4y2Ba)。我们没有期望找到多个inflammasome刺激位于相同的单元中,尽管colocalization两个截然不同的inflammasomes已被报道gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba。共焦显微镜证实ASC, caspase-1, NLRP3 AIM2 colocalization inflammasomes选择性地在COVID-19单核细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)。这些数据显示inflammasome斑点和GSDMD膜定位和乳沟,一起死亡的检测膜联蛋白VgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba僵尸gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba单核细胞和血浆GSDMD和il - 1细胞因子(无花果。gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba),表明COVID-19 pyroptosis单核细胞死亡。gydF4y2Ba

我们下一个检查激活inflammasomes COVID-19单核细胞。作为inflammasomes侵入性感染,单核细胞感染可能是触发。一些报告表明单核细胞gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}和巨噬细胞可以被SARS-CoV-2感染,我们发现核衣壳在病人单核细胞(图。gydF4y2Ba1 d, egydF4y2Ba)。然而,单核细胞不表达ACE2,病毒受体gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba。事实上,ACE2几乎未被发现或通过流式细胞术和定量PCR检测逆转录(RT-qPCR)患者单核细胞分析COVID-19和HDs(扩展数据图。gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba)。单核细胞的HDs和患者COVID-19 CD147表达了类似的水平(也称为遗传性和EMMPRIN),据报道,绑定到SARS-CoV-2峰值蛋白质,促进病毒吸收,虽然这一发现是有争议的gydF4y2Ba^{23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba}(扩展数据图。gydF4y2Ba3 c, dgydF4y2Ba)。单核细胞表达三个Fcγreceptors-CD64 (FcγRI)和CD32 (FcγRII),这是表示在大多数血液单核细胞,和CD16 (FcγRIIIa),表示在一小部分血液单核细胞(HDs)在10%左右gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba}——在COVID-19增加gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba。这些受体可以识别antibody-opsonized病毒粒子通过锁定吞噬作用以及调节吸收gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba。Anti-SARS-CoV-2高峰在SARS-CoV-2感染早期检测到抗体,当患者出现炎症的症状gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba}在我们的队列(图。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)。检查是否COVID-19患者单核细胞的感染,我们co-stained单核细胞的HDs和COVID-19患者核衣壳(N)(图gydF4y2Ba3模拟gydF4y2Ba)或双链RNA(极)(anti-J2抗体)(无花果。gydF4y2Ba3情况gydF4y2Ba)和ASC。N染色表明病毒内部化,但是J2染色显示活跃的感染gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba。单核细胞的HDs N没有污点,dsRNA或ASC。大约10%的患者单核细胞从COVID-19彩色N或dsRNA(无花果。gydF4y2Ba3 b, fgydF4y2Ba)和N的95%左右gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba单核细胞也J2积极,表示病毒复制。几乎所有被感染的细胞显示ASC斑点(无花果。gydF4y2Ba3 c、ggydF4y2Ba(图)和所有ASC-speck-positive细胞被感染。gydF4y2Ba3 d hgydF4y2Ba)。因此,SARS-CoV-2激活单核细胞感染inflammasomes pyroptosis。gydF4y2Ba

呼吸道感染是主要的网站,我们下一个评估是否在尸检肺巨噬细胞感染SARS-CoV-2 inflammasomes和活跃。固定与SARS-CoV-2感染肺幻灯片从五个人(补充表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)和三个未受感染的个人经历了创伤co-stained CD14, ASC, N和DAPI(无花果gydF4y2Ba3 i (kgydF4y2Ba)。COVID-19患者的肺部CD14的15.1±2.9%gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba细胞CD14的8.3±4.2%gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞染色为N, N却没有发现在那些经历过创伤(图的影响gydF4y2Ba3 i (kgydF4y2Ba)。正如所料,钙粘蛋白gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba上皮和CD31gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba内皮细胞CD14gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba细胞染色N(无花果gydF4y2Ba3 kgydF4y2Ba)。然而,只在CD14 ASC斑点检测gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba,但不是在CD14gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCOVID-19肺细胞,表明tissue-resident巨噬细胞激活ASC-containing inflammasomes,但感染肺上皮和内皮细胞不。大多数CD14gydF4y2Ba^+gydF4y2BaNgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞已经ASC斑点(无花果。gydF4y2Ba3 jgydF4y2Ba)。ASC斑点并没有控制尸体解剖。CD14的四分之一gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba肺细胞ASC斑点,尽管只有大约8% N是积极的,这表明危险分子模式,从感染或其他损坏肺细胞,释放可能激活inflammasomes感染的巨噬细胞无毒性。gydF4y2Ba

确认可以感染单核细胞,单核细胞的HDs感染了一个工程感染性克隆(icSARS-CoV-2-mNG)编码霓虹绿色(NG)荧光病毒复制的记者gydF4y2Ba^{31日gydF4y2Ba}。单核细胞,启动与否与有限合伙人,被感染(1)感染复数与记者病毒preincubated IgG1同形像控制抗体(mAb114) anti-spike单克隆抗体(non-neutralizing (C1A-H12)或中和(C1A-B12))gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba或混合等离子体(heat-inactivated与否)从HDs或COVID-19患者。抗体和等离子体也出现在文化。48 h后,单核细胞进行分析为N, dsRNA, ASC成像流式细胞术(无花果。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。没有有限合伙人,anti-spike抗体或COVID-19汇集血浆,HDs的单核细胞或复制病毒,但是感染显著增加的anti-spike单克隆抗体或从COVID-19患者血浆。Antibody-neutralizing活动和等离子体heat-inactivation并不影响感染(扩展数据图。gydF4y2Ba4 a egydF4y2Ba),建议补充没有涉及。IgG-depletion COVID-19近废除病毒感染患者的血浆,评估NG荧光,但IgA损耗没有影响感染(图。gydF4y2Ba4 e, j, kgydF4y2Ba)。这些结果表明,病毒感染是由由anti-spike调理的抗体。尽管如此,N - J2 - NG-positive单核细胞被发现在低水平感染后的高清单核细胞与病毒preincubated同形像控制单克隆抗体或高清等离子,暗示可能低效anti-SARS-Cov-2-antibody-independent单核细胞的感染。体外最高的感染率是3%左右的高清单核细胞进行预处理与病人血浆LPS和孵化。N和J2染色相比,具有低背景未感染样本的0.1%左右;更少的细胞NG荧光(大约一半的),没有背景NG荧光。更多的J2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba或者NgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba感染率最高的细胞样本(LPS处理和病人血浆或anti-spike抗体)也NG荧光,表明病毒复制(扩展数据图。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)。NG可能比N或dsRNA发现少,因为它是表示在病毒生命周期和/或检测更加困难。ASC斑点刚刚发现的高清单核细胞无毒性,但增加SARS-CoV-2感染(无花果。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)。ASC-speck-positive细胞增加当SARS-CoV-2 preincubated anti-spike抗体和更当preincubated病人血浆。高清单核细胞感染荧光分子克隆是类似于感染的华盛顿(WA)应变或δ变体临床孤立,但正如预期的那样,分子克隆效率会降低感染A549-ACE2细胞与佤邦应变或更多的传染性三角洲变体(扩展数据图。gydF4y2Ba4 f, ggydF4y2Ba)。高清单核细胞感染对所有三种病毒的相似性表明单核细胞病毒可能ACE2-independent条目。gydF4y2Ba

提出的评估疾病严重程度或抗体是否接种疫苗增加单核细胞病毒吸收,LPS-activated单核细胞被感染的汇集血浆从感染捐助者、mRNA疫苗接受者或COVID-19患者轻微或严重的疾病。重要的是,未受感染的HD和接种后等离子体并没有促进病毒吸收或复制,尽管等离子anti-RBD免疫球蛋白高约两个高清的疫苗接受者(6.5±1.1µg毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})比COVID-19患者(3.6±0.5µg毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})(图。gydF4y2Ba4 f, ggydF4y2Ba)。然而,汇集血浆从non-COVID-19病人感染轻微增加,但增加不显著,表明可能效率低下的病毒吸收一些non-COVID等离子体组件。疾病严重程度并不影响感染患者的血浆COVID-19作为混合的轻微和/或严重血浆同样容易感染。gydF4y2Ba

严重急性患者COVID-19增加抗病毒免疫球蛋白的Fc afucosylated地区和绑定CD16更好gydF4y2Ba^{33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba}。测试afucosylation是否影响高清单核细胞感染,高清单核细胞感染病毒preincubated纯化免疫球蛋白与汇集血浆从HDs或COVID-19患者或从患者COVID-19相对较低(约8%)或高(大约30%)afucosylation(每个2例)比较(图gydF4y2Ba4 h,我gydF4y2Ba)。正如所料,纯化高清等离子体免疫球蛋白g没有导致N染色或NG荧光,而患者免疫球蛋白g从汇集血浆COVID-19。低afucosylated免疫球蛋白高清相比没有显著增加感染免疫球蛋白,但更高度afucosylated COVID-19温和免疫球蛋白,但值得注意的是,增加NgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞。然而,NG荧光没有显著增加后增加低收入或high-afucosylated从患者免疫球蛋白COVID-19高清免疫球蛋白g相比,也许是因为这比N染色试验不太敏感。纯化免疫球蛋白增强高清单核细胞感染不到病人血浆(比较图。gydF4y2Ba4 l, mgydF4y2Ba无花果。gydF4y2Ba4 f, ggydF4y2Ba),这表明一个Ig-independent等离子体组件可能促进感染。gydF4y2Ba

识别病毒受体在单核细胞,纯化高清单核细胞病毒感染了记者的COVID-19患者的血浆或不枯竭的免疫球蛋白或阻止潜在的单核细胞受体抗体的存在——ACE2, CD147和三个单核FcγRs CD16, CD32 CD64(无花果。gydF4y2Ba4 j, kgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5 a、bgydF4y2Ba)。阻塞CD16 CD64或免疫球蛋白损耗强烈抑制感染,而阻止其他受体没有显著的影响。anti-CD16和anti-CD64阻止抗体也不抑制病毒吸收超过抑制性抗体。因此,SARS-CoV-2感染单核细胞主要是由CD16和/或CD64的调理的病毒。gydF4y2Ba

CD16也表达了对中性粒细胞和细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞,这可能是感染类似的锁定机制。我们没有观察到细胞死亡增加患者淋巴细胞(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),因此没有进一步研究它们。然而,中性粒细胞有助于SARS-CoV-2免疫病理和炎症gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba。以确定是否感染,中性粒细胞高清中性粒细胞和单核细胞被感染并排在COVID-19等离子(扩展数据图。gydF4y2Ba5 b, cgydF4y2Ba)。感染高清中性粒细胞单核细胞感染相比很低(约0.2%和近3%在单核细胞)和不显著增加以上背景。评估体内中性粒细胞是否感染,体内的中性粒细胞感染样本的频率COVID-19患者疾病严重程度和HDs是由N染色评估选择消极,新鲜血液中性粒细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)。感染没有检测到COVID-19患者的中性粒细胞。gydF4y2Ba

极和NG检测强烈建议单核细胞复制SARS-CoV-2。进一步确认病毒复制和评估是否ACE2吸收介导,高清单核细胞被感染的患者血浆从COVID-19和抗病毒药物remdesivir病毒依赖RNA的RNA聚合酶的抑制剂,和camostat甲磺酸,TMPRSS2抑制剂,质数的蛋白质为ACE2-mediated条目gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4 l, mgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5比gydF4y2Ba)。单核细胞感染,评估N或NG积极性,被camostat未受影响,但显著和同样被Ig损耗或remdesivir确认锁定条目和病毒复制。缺乏抑制camostat anti-ACE2抗体表明,ACE2不大可能是病毒的主要受体进入单核细胞,但并不排除一个小角色在单核细胞感染或感染的ACE2扮演更积极的角色gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba巨噬细胞。在病毒复制的早期,一系列的正链subgenomic rna (sgRNAs)转录序列与一个共同的领导人专门表示病毒复制gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba。RT-qPCR被用来检测SARS-CoV-2基因组rna (gRNAs)和sgRNAs使用引物瞄准的N1区域gydF4y2BaNgydF4y2Ba基因序列和共享领导和3′UTR sgRNAs序列,分别。gRNA和sgRNA只发现在SARS-CoV-2-infected高清单核细胞(图。gydF4y2Ba4 n, ogydF4y2Ba)。最丰富的放大sgRNA片段的大小在琼脂糖凝胶迁移gydF4y2BaNgydF4y2BasgRNA(1560核苷酸),其身份被测序证实。gydF4y2Ba

尽管多个化验显示单核细胞开始病毒复制,我们下一个评估是否感染单核细胞产生感染病毒。患者血浆中检测到传染性SARS-CoV-2 COVID-19只有化验尤其敏感,和我们没有检测到传染性病毒空斑实验九COVID-19患者血浆样本中。虽然感染高清单核细胞文化上层清液形成的斑块在维洛细胞文化上层清液收集后立即感染(可能检测输入病毒),没有发现感染病毒时文化上层清液收集在感染后48 h(无花果。gydF4y2Ba4 pgydF4y2Ba)。相比之下,斑块很容易检测到在文化上层清液从被感染的维洛细胞在感染后48 h。因此,没有产生单核细胞感染传染性病毒。gydF4y2Ba

这里我们展示antibody-opsonized SARS-CoV-2感染和复制在血液单核细胞和肺巨噬细胞。大约10%的患者单核细胞和8%的肺巨噬细胞COVID-19 SARS-CoV-2-infected。我们发现单核细胞感染和之间的一一对应inflammasome caspase-1激活和pyroptosis。多数患者血液中单核细胞死亡COVID-19激活inflammasomes,表明pyroptosis单核细胞死亡。这是一个很大的数,考虑到死亡细胞迅速消除体内。也许奇怪,单核细胞感染和细胞死亡并没有被广泛认可。然而,这可能是由于(1)许多COVID-19研究使用解冻,冷冻细胞、冻融和垂死的细胞做不下去;(2)调查是否循环单核细胞死亡在已发表的研究缺乏;(3)一些研究人员一直在寻找单核细胞感染因为单核细胞不表达ACE2。一些先前的研究显示患者的血浆il - 1细胞因子增加COVID-19,体外SARS-CoV-2进入骨髓细胞或NLRP3 inflammasome caspase-1激活COVID-19患者的血细胞gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba}。但是,没有先前的研究显示,SARS-CoV-2感染的抗体介导单核细胞,单核细胞受体,表明病毒复制不产生传染性病毒,鉴定单核细胞感染的原因inflammasome激活或显示pyroptosis的证据。然而,先前的研究表明,两个monocyte-derived可以失败地感染巨噬细胞gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba。与我们的研究结果相比,monocyte-derived巨噬细胞弱ACE2表达及其感染可能是由ACE2,体外感染没有anti-spike被anti-ACE2gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

FcγR-mediated吸收antibody-coated病毒进入单核细胞是一把双刃剑。Pyroptosis迅速发生,可能中止前病毒感染传染性病毒粒子完全组装。单核细胞/巨噬细胞感染病毒的死胡同删除病毒粒子的细胞外环境,阻止他们生产传染性后代和阻止他们传播。Pyroptosis感染单核细胞/巨噬细胞也听起来一个强有力的免疫报警招募和激活先天和适应性免疫细胞感染网站动员免疫防御。相比之下,炎症介质释放pyroptotic单核细胞和巨噬细胞可以导致细胞因子风暴。临床恶化的同时,这可能不是一个巧合暂时SARS-CoV-2检测的抗体反应gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba}。事实上,最近的一些研究表明,较高的抗体滴定度与疾病严重程度gydF4y2Ba^{29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

Pyroptotic髓细胞的主要原因可能是严重的炎症导致急性肺损伤的后遗症,multiorgan损伤、血管渗漏和呼吸窘迫严重疾病患者。特别是严重COVID-19患者增加了等离子体生物标志物的pyroptosis轻度或中度COVID-19患者。然而,无论是抗体滴定度还是被感染的比例ASC-speck-positive单核细胞在演讲与严重疾病有关,也许因为少量的样本。更大的群组研究中需要更好地评估的相对重要性单核细胞/巨噬细胞pyroptosis严重COVID-19发病机理。大量感染单核细胞和巨噬细胞,事实上,四分之一的肺巨噬细胞激活inflammasomes,和骨髓细胞il - 1的主要来源和其他炎性细胞因子可能,单核细胞/巨噬细胞感染和严重COVID-19 inflammasome激活是重要的发病机制。尽管中性粒细胞可能感染,感染的新孤立COVID-19中性粒细胞或vitro-infected高清中性粒细胞没有检测到。因此,中性粒细胞感染可能不是发病机制的主要因素,虽然嗜中性粒细胞激活GSDMD-dependent NETosis(细胞死亡过程包括中性粒细胞胞外陷阱(网))或其他特征的中性粒细胞的激活可能是重要的司机。这将是值得研究的潜在来源的其他感染细胞炎症,和理解方面的单核细胞/巨噬细胞激活增强感染。gydF4y2Ba

四倍lung-resident巨噬细胞有激活inflammasomes被感染。还需要进一步的研究来确定哪些刺激炎症感染的巨噬细胞无毒性,但alarmins发布的肺组织损伤可能是罪魁祸首。尽管inflammasome激活检测几乎在每一个感染单核细胞和巨噬细胞,肺上皮细胞中发现。为什么肺上皮细胞抵抗inflammasome激活需要进一步研究。值得研究的感染是否会激活inflammasome-independent pyroptosis其他gasdermins non-myeloid细胞在肺部。NLRP3和AIM2 inflammasomes承认细胞膜损伤和胞质DNA,分别形成于SARS-CoV-2-infected单核细胞。进一步的工作是要去了解这些inflammasomes SARS-CoV-2激活,激活是否局限于致命的冠状病毒,以及其他inflammasomes是否激活,如NLRP1和NLRP6 dsRNA感gydF4y2Ba^{40gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

在这项研究中,阻止抗体两FcγRs CD16 CD64,抑制单核细胞的感染。CD64单核细胞表达,其中占主导地位的古典亚型不是感染,而CD16更有选择地表达,和所有受感染的病人单核细胞CD16是积极的。这意味着CD16可能是主要的Fc受体介导病毒进入单核细胞。阻断感染anti-CD64抗体可能是间接的,因为CD64 CD16使用相同的信号适配器和在细胞表面。gydF4y2Ba

在pyroptosis等离子体生物标志物的诊断,包括IL-1RA、地震、LDH和GSDMD增加患者严重disease-suggesting,他们可能有助于预测预后和谁将受益于immune-modulating疗法。再利用fda批准的药物,抑制炎性细胞因子或GSDMD价值评估,但到目前为止,控制临床试验评价抑制炎症因子(anti-IL-1β(canakinumab) anti-IL-1RA (anakinra) anti-IL-6和anti-IL-6R)显示在最好的保护不力,这可能是由于非最优时间或因为任何细胞因子只有一个许多炎症介质。两种GSDMD fda批准的抑制剂,戒酒硫(戒酒硫)gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba和富马酸二甲酯(tecfidera)gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba目前正在评估在临床研究(NCT04485130 NCT04594343和NCT04381936)。在脓毒症小鼠模型,重叠特性有严重COVID-19疾病,这些药物强烈提高生存和降低血浆il - 6和TNF。gydF4y2Ba

我们的研究结果,表明在单核细胞感染和inflammasome活化调理的抗体,表明抗体可能导致有害的免疫反应与严重疾病有关gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba。FcγR-mediated单核细胞感染的感染抗体介入增强的一个例子。尽管如此,大量证据表明疫苗中和抗体预防感染和提高突破感染的临床结果,表明anti-spike抗体是大有益处。血浆从接种疫苗的个体并没有促进单核细胞感染,表明抗体介入增强并不是一个问题对接种疫苗。然而,治疗管理anti-spike中和单克隆抗体只改善临床结果如果早,住院治疗gydF4y2Ba^{45gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba}人,恢复期的血清没有表现出临床益处gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba。因此,它值得考虑一些抗体是否保护和有害的影响gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba。抗体明显有利于阻断感染ACE2-expressing肺癌和呼吸道上皮细胞,病毒复制生产完成的传染性的后代。然而,抗体属性影响Fc-receptor-mediated细胞吸收,吞噬作用、细胞毒性和补体的激活会影响疾病的发病机理gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

的早期发展afucosylated anti-spike抗体促进肺泡巨噬细胞炎症和与COVID-19严重程度相关gydF4y2Ba^{33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba}。Afucosylated抗体增加与包膜病毒急性感染时像SARS-CoV-2 COVID-19疫苗接种后但不丰富gydF4y2Ba^49gydF4y2Ba或其他类型的抗原暴露gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba。免疫球蛋白分离COVID-19患者更高比例的显著afucosylated抗体,但弱,增加体外单核细胞感染但从患者免疫球蛋白afucosylated抗体没有少。致病性的增加afucosylated抗体可能继发感染抗体介入和下游inflammasome激活单核细胞和巨噬细胞。然而,我们的研究结果对afucosylation是初步的,还需要更多的工作来让这个协会。描述如何抗体特性,比如afucosylation, sialylation恒定区和选择,改变anti-spike抗体的保护和有害的功能不仅是重要的对于理解SARS-CoV-2发病机理,也为选择最好的准备康复的病人血浆和单克隆抗体治疗和/或预防严重疾病。gydF4y2Ba

人类参与者gydF4y2Ba

新鲜PBMCs和等离子体群gydF4y2Ba

这项研究是调查审查委员会批准的波士顿儿童医院和马萨诸塞州总医院(MGH),和所有的登记患者签署知情同意。共有73名患者18岁或以上的临床症状暗示COVID-19感染当时注册的演示MGH急诊科(ED)从2020年7月9日到2021年10月15日。一个10毫升EDTA血液样本被送往波士顿儿童医院和2 h内收集处理。样本COVID-19患者所有RT-qPCR验证SARS-CoV-2感染,血液了。患者提出的ED COVID-19-like症状,但PCR阴性,被用作non-COVID-19样本。患者SARS-CoV-2接种在演讲之前被排除在研究之外。人口统计学和临床数据的摘要提供了补充表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba。高清样本处理和分析与病人样本。参与者被登记从2020年7月9日到2021年1月10日在波士顿儿童医院(BCH) IRB-approved豁免的知情同意。接种疫苗HDs (gydF4y2BangydF4y2Ba= 6),接受两剂Pfizer-BioNtech mRNA疫苗,为3周后第二剂量和血浆汇集来评估它是否促进单核细胞的感染。gydF4y2Ba

冷冻血浆组gydF4y2Ba

共有60名患者18岁或以上的临床症状暗示COVID-19感染进入MGH ED从15 2020年3月至2020年4月15日IRB-approved豁免的知情同意。登记病人至少有下列之一:(1)呼吸急促,每分钟呼吸次数≥22;(2)血氧饱和度,在室内空气的情况下,≤92%;(3)要求补充氧气;和(4)正压通风。10毫升EDTA管得到的初始临床抽血ED (gydF4y2BangydF4y2Ba= 60)。血也获得了在天3 (gydF4y2BangydF4y2Ba= 42)和7 (gydF4y2BangydF4y2Ba= 35)如果病人入院的日期。临床课程报名或者直到出院后随访28天如果后28天。SARS-CoV-2-confirmed患者(通过RT-qPCR)被分配一个最大灵敏度分数(A1-A5) (A1,死亡;A2,需要机械通气;A3,住院需要补充氧气;A4住院,但不需要补充氧气;和A5、排放和不需要住院治疗)gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba。患者分组的基础上最糟糕的敏度得分超过28天,分为三组进行比较(A1和A2、严重疾病;A3,温和的疾病;A4和A5,轻微的疾病)。在A4只有1例;大部分的轻度患者因此代表那些立即出院ED,因此只有第0天样品。人口统计学和临床数据的摘要提供了每个结果组补充表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

肺组织样本gydF4y2Ba

五个人死于肺癌样本COVID-19(补充表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)和三人死于创伤,没有肺部疾病是从MGH获得的。该研究机构审查委员会批准MGH IRB 2020 p001147。知情同意是获得研究参与者的亲戚。肺组织标本解剖后24小时内,并立即获得formalin-fixed和嵌入在石蜡。gydF4y2Ba

试剂和抗体gydF4y2Ba

试剂的列表和抗体及其来源提供了补充表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

等离子体,PBMC,中性粒细胞和单核细胞隔离gydF4y2Ba

样本处理BSL-2 +设备中使用推荐的安全预防措施。血管在2000转离心10分钟分离血浆和血细胞。等离子体是否收集在一个新的管和孵化1% Triton x - 100对1 h在整除和冻结在冰−80°C。血细胞在PBS和分层resuspended聚蔗糖密度离心。PBMCs收集从界面和受到血红细胞溶菌作用(如果有必要)和红细胞溶解缓冲Hybri-Max 5分钟在冰上,其次是与RPMI淬火介质penicillin-streptomycin补充的边后卫为10%和1%。PBMCs洗一次RPMI和一个分数染色流式细胞术,而其余细胞用于单核细胞净化负选择使用RosetteSep人类单核细胞浓缩鸡尾酒。中性粒细胞COVID-19患者隔离的全血immunomagnetic负选择使用人类嗜中性粒细胞EasySep直接隔离鸡尾酒,根据制造商的指示。高清单核细胞体外感染和CD14纯化从PBMCs积极的选择gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba磁珠。的红血细胞颗粒聚蔗糖密度离心被用来分离中性粒细胞从高清的样品一样。中性粒细胞被低渗裂解红细胞颗粒分开。gydF4y2Ba

细胞系gydF4y2Ba

的THP-1单核细胞的细胞系和州立E6细胞从写明ATCC获得。overexpressing A549细胞和HEK293T细胞gydF4y2BaACE2gydF4y2Ba得到从MassCPR变体在雷根研究所正是从存储库。gydF4y2BaACE2gydF4y2Ba表达式由RT-qPCR验证,anti-ACE2流式细胞术。所有细胞检测支原体污染。gydF4y2Ba

多路复用luminex、免疫测定和LDH活性测定gydF4y2Ba

IL-5 IL-1RA、2、il - 4, il - 6, IL-7, il - 10、il - 12, IL-13, IL-17,地震,IL-21, IL-23, CCL3, CCL7, CCL9, CXCL10, g - csf, TNF, IFNβIFNγ测定血浆样品中使用自定义Luminex化验(研发系统)根据制造商的指示。4.2样本数据是使用Luminex xPONENT MAGPIX分析仪在波士顿大学的核心实验室分析仪器和分析Milliplex分析师v5。IL-1β的血浆水平都是使用简单的丛墨盒埃拉(ProteinSimple) BCH根据制造商的指示。所有的样本稀释1:3稀释缓冲和ProteinSimple Ella自动化的分析性能进行了免疫分析平台(Bio-Techne)。样本获得使用简单丛跑步v.3.7.2.0软件和使用简单的丛Explorer 3.7.2.0分析。GSDMD测定同一样品使用人类GSDMD酶联免疫试剂盒(MyBiosource)根据制造商的指示和LDH活性测定使用CytoTox 96非放射性细胞毒性试验(Promega)。后者化验的结果分析了使用Biotek协同2分析仪;GSDMD吸光度测量在450 nm和LDH吸光度测量在490海里。吸光度水平量化,根据标准曲线线性回归。gydF4y2Ba

Anti-spike RBD ELISAgydF4y2Ba

酶联免疫吸附试验(ELISA) anti-spike RBD工具包(BioLegend)是用来量化抗原免疫球蛋白在等离子体从HDs non-COVID-19病人和COVID-19患者。ELISA进行根据制造商的指示。Anti-spike RBD吸光度测量在450 nm和570 nm和量化,根据标准曲线线性回归。gydF4y2Ba

细胞内染色成像流式细胞术和共焦显微镜gydF4y2Ba

固定单核细胞permeabilized 0.1% Triton x - 100 10分钟,洗两次与PBS + 3%的边后卫。单核细胞被封锁与PBS 30分钟+ 5%的边后卫,洗两次,然后沾非结合的主要抗体ASC(1∶老鼠或兔子),NLRP3(1∶山羊),AIM2(1∶鼠标),GSDMD(1∶鼠标),pyrin(1∶兔子),dsRNA (J2、鼠标)(1:50 0)或SARS-CoV-2核衣壳蛋白(1:50 0,兔子)2 h,紧随其后的是三个洗PBS + 3%的边后卫。细胞被沾染了二级抗体(驴anti-mouse,兔子和山羊共轭和Alexa萤石488年,546年或647年,1:1,000)1 h的边后卫在PBS + 3%,紧随其后的是三个洗。未经处理的THP-1细胞,THP-1细胞治疗与LPS + nigericin或转染保利(dA: dT)使用Lipofectamine 2000和HEK293T细胞(负控制)沾anti-NLRP3 anti-AIM2抗体,抗体验证。gydF4y2Ba

显微镜分析,细胞被固定,然后用DAPI染色(1:1,000)10分钟,洗了三次,玻璃上cytospun幻灯片(VWR)和密封使用聚乙烯醇和1.5毫米盖玻片(VWR)。共焦图像获得使用蔡司LSM 800系统与405 nm、488 nm、561 nm和633 nm激光(排放过滤器、465 nm、509 nm、561 nm和668 nm)和一个×40或63×1.4 NA油浸物镜。图像使用禅宗黑色2.0收购和加工使用禅宗蓝色3.2。gydF4y2Ba

成像流式细胞术,细胞在PBS resuspended + 3%的边后卫进行分析。数据获得使用ImageStream X MKII系统×60放大(Amnis),激发v。2采集软件和分析使用想法v.6.2 (Amnis)。基于区域/长宽比单核细胞是封闭的。ASC, NLRP3 AIM2 pyrin斑点是封闭的和量化的基础上荧光团强度/最大像素。gydF4y2Ba

流式细胞术gydF4y2Ba

PBMCs洗,染色的可行性与僵尸黄色PBS(1:200) 15分钟在冰上。细胞用PBS,离心机,然后沾anti-annexin V PE(1:200)抗体1×膜联蛋白缓冲15分钟在冰上。洗后用1×膜联蛋白V缓冲区,细胞被封锁的10分钟anti-CD32(1:10 0)在PBS + 3%的边后卫,然后彩色15分钟在冰鸡尾酒抗体识别淋巴细胞和骨髓细胞的子集(所有1:200除了CD19 BV650, CD123 PerCP-Cy5.5和CD56 APC-Cy7, 1:10 0)。纯化单核细胞和一个A549细胞株overexpressinggydF4y2BaACE2gydF4y2Ba用anti-CD32被封锁,然后沾主要抗体ACE2(1:10 0) 15分钟在冰上。二次抗体AF488抗体与anti-CD14 co-incubated PE-Cy7(1:200)和anti-CD147 APC(1:10 0)抗体。最后洗后,细胞resuspended 2% PFA和保持在4°C到流式细胞术分析。vitro-infected单核细胞的固定和permeabilized 0.1% Triton x - 100,然后用PBS + 5%的边后卫阻塞。细胞被沾主要抗体dsRNA (J2、鼠标)(1:50 0),然后用二次抗体染色(驴anti-mouse共轭Alexa萤石647在1:50 0)和anti-CD14 PE-Cy7抗体。细胞获得使用流式细胞仪第二章或使用FACSDiva LSR II v7采集软件,和数据分析使用FlowJo v.10.7.1。gydF4y2Ba

FLICA化验gydF4y2Ba

刚分离单核细胞被清洗和resuspended RPMI 10%的边后卫FLICA衬底(BioRad FAM-FLICA Caspase-1工具包)和培养1 h在37°C。1×凋亡细胞被洗两次(从设备)和固定的缓冲区1×固定剂(装备)。细胞被保持在4°C,直到进一步的染色和分析。gydF4y2Ba

免疫印迹分析gydF4y2Ba

溶菌产物的纯度从HDs和COVID-19患者单核细胞,前者不治疗或16 h ng在37°C和100毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}有限合伙人和20µM nigericin,解决在12% sds - page凝胶,转移到硝化纤维膜和涂抹探测GSDMD使用(Abcam ab210070)主要兔单克隆抗体和二级anti-rabbit免疫球蛋白。膜也涂抹β-actin和COX-IV。gydF4y2Ba

免疫荧光分析肺样本gydF4y2Ba

Formalin-fixed和石蜡包埋的肺实质样本染色SARS-CoV-2 N, ASC和CD14、免疫荧光分析在徕卡键RX自动化染色平台使用徕卡生物系统完善检测设备(莱卡)。SARS抗体的核衣壳(罗福斯)和柠檬酸抗原检索和标记Alexa萤石488 Tyramide(生活)。细胞CD14柠檬酸剥离后,抗体(信号)是594年孵化并标记出Alexa萤石Tyramide(生活)。EDTA剥离后,染色为ASC (Santa Cruz)分析了使用抗体标记Alexa萤石647 Tyramide(生活)。EDTA剥离anti-CD31之前执行或anti-E-cadherin染色标记Alexa萤石555 Tyramide(生活)。样本与DAPI复染色。幻灯片使用Aperio Versa数字病理扫描仪进行扫描(莱卡)和分析使用Aperio透视仪v.12.4.3(莱卡)。幻灯片也分析了共焦显微镜如上所述。gydF4y2Ba

体外SARS-CoV-2感染gydF4y2Ba

icSARS-CoV-2-mNG (SARS-CoV-2表达的分子克隆霓虹绿色荧光蛋白(NG))是一个礼物从s p . A.E.G.勇和世界参考中心的新兴病毒和虫媒病毒)gydF4y2Ba^{31日gydF4y2Ba}。NG融合蛋白的表达只在病毒复制。非典CoV-2 US-WA1/2020祖先(WA)变体是来自贝资源。B.1.617.1 /δ变体分离获得MassCPR变种库。总之,拉根BSL3变种被隔离在通过救援Vero-E6细胞主要临床标本。随后病毒股票的全基因组测序确认没有额外的突变病毒期间出现扩张。高清单核细胞和中性粒细胞从apheresis纯化leukoreduction项圈在布莱根妇女医院收集。一夜之间,单核细胞被孵化与介质或100 ng毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}有限合伙人,然后感染icSARS-CoV-2-mNG, SARS-CoV-2 (WA)和非典CoV-2 B.1.617.1 /δ(感染复数(MOI) = 1) BSL-3设施。莫伊A549-ACE2细胞感染0.01被用作控制。病毒培养液处理10µg毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}抗体(同形像控制mAb114 anti-spike C1A-H12,或anti-spike C1A-B12),或5%汇集血浆(heat-inactivated与否;从HDs Ig-depleted与否,表示)(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3),患者COVID-19复杂疾病的严重程度(gydF4y2BangydF4y2Ba= 12(总),gydF4y2BangydF4y2Ba= 4(轻微),gydF4y2BangydF4y2Ba= 4(温和的),gydF4y2BangydF4y2Ba= 4(严重))或接种HDs (gydF4y2BangydF4y2Ba= 6)感染SARS-CoV-2之前30分钟在室温下。对待病毒(100µl)添加到单核细胞(2×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞每)48-well盘子。感染细胞在37°C下5%孵化有限公司gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}柔和震动每10分钟1 h,之后文化成交增加到500µl RPMI补充5% heat-inactivated正常AB人类血清和10µg毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}上述抗体,或5%汇集血浆从HDs或COVID-19患者。文化被孵化在37°C下5%的股份有限公司gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}48 h,在这段时间里,这些细胞被收集和固定的20分钟4% PFA然后染色。gydF4y2Ba

患者免疫球蛋白的混合等离子体COVID-19耗尽了蛋白质A / G琼脂糖肽M琼脂糖树脂和IgA耗尽。控制样本孵化与琼脂糖树脂没有耦合的蛋白质。C1A-B12和C1A-H12 SARS-CoV-2 spike-targeting人类单克隆抗体,产生了如前所述gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba。为阻断实验,细胞被孵化µg 10毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}单克隆抗体、anti-CD16 anti-CD32(克隆IV.3(无花果。gydF4y2Ba4 jgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),克隆6 c4(无花果。gydF4y2Ba4 kgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5 b, cgydF4y2Ba))、anti-CD64 anti-ACE2 anti-CD147 30分钟,在病毒感染。抗病毒药物治疗,单核细胞在37°C下5%孵化有限公司gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}1 h和10µM remdesivir (gs - 5734)或camostat甲磺酸之前感染。找到一个合适的remdesivir浓度,连续稀释10至80µM进行分析。比较等离子体从患者获得不同的疾病严重程度,等离子体在MGH敏度的基础上,汇聚起来,得分(A1-A5),如上所述。gydF4y2Ba

测试免疫球蛋白g afucosylation的作用,免疫球蛋白纯化COVID-19患者的血清样本是由质谱分析定义的百分比afucosylation如前所述gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba。低afucosylated样本,由t . Wang包含8.4±0.7% afucosylated免疫球蛋白和高afucosylated样本,30.1±1.5% afucosylated免疫球蛋白。免疫球蛋白也净化池等离子体从HDs和COVID-19患者使用瓜凝胶免疫球蛋白旋转净化设备(热费希尔科学)根据制造商的指示。病毒是preincubatedµg 10毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}纯化的免疫球蛋白和感染了如上所述。gydF4y2Ba

RT-qPCRgydF4y2Ba

RNA是使用试剂盒提取试剂(从单核细胞表达载体)COVID-19患者从感染或感染的高清单核细胞(刺激有限合伙人(100 ng毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}16 h)),然后使用高容量reverse-transcribed cDNA逆转录工具包(应用生物系统公司)。随机引物被用来产生互补脱氧核糖核酸检测细胞rna (gydF4y2BaACE2gydF4y2Ba,gydF4y2BaBSGgydF4y2Ba和gydF4y2BaACTBgydF4y2Ba)和SARS-CoV-2-specific引物被用来生成互补脱氧核糖核酸检测到病毒基因组rna (N1的地区gydF4y2BaNgydF4y2Ba基因)gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba。互补脱氧核糖核酸是由RT-qPCR分析使用SsoFast EvaGreen Supermix (BioRad)(30年代在95°C;40周期3 s在95°C和3 s在54°C) CFX96触摸实时PCR检测系统(BioRad)使用它管理器v.1.6采集/分析软件。执行检测SARS-CoV-2 sgRNA, RT-qPCR用一对引物5′的正向引物退火领袖病毒基因组区域和反向引物3′UTR退火。使用的循环条件(30年代在95°C;然后40周期30年代在95°C, 30年代60°C和90年代在72°C),全身gRNA没有放大,但小sgRNA段(< 3 kb)可能会被放大gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba51gydF4y2Ba,gydF4y2Ba52gydF4y2Ba}。对于每一个样本,CgydF4y2Ba_tgydF4y2Ba值被规范化gydF4y2BaACTBgydF4y2BaCgydF4y2Ba_tgydF4y2Ba价值。引物序列提供了补充表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。sgRNA qPCR产品也1%琼脂糖凝胶电泳,分析了与溴化乙锭染色和可视化Chemidoc成像仪(BioRad)。大约1600个核苷酸乐队是切除和测序证实它的起源SARS-CoV-2 sgRNA编码gydF4y2BaNgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

斑块化验gydF4y2Ba

维罗E6细胞被播种在24-well层板1天前感染。感染病毒的样本文化上层清液在DMEM连续稀释。板块与DPBS洗一次,然后感染100µl稀释样本和37°C下5%孵化有限公司gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}每15分钟1 h和摇摆。1 h后,培养液的删除和覆盖1%甲基纤维素(Sigma-Aldrich)完成MEM (Gibco)应用于每个。板块在37°C,直到孵化斑块在积极控制井可观测。可视化斑块,覆盖了,细胞单层是固定的4% PFA和结晶紫染色。斑块被量化计算每毫升微升的病毒滴定度。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

使用GraphPad棱镜v.9.0执行统计分析。正态分布的数据之前使用达和皮尔森正常测试评估应用统计方法。分布被认为是正常的如果gydF4y2BaPgydF4y2Ba≤0.05。参数或非参数(Mann-WhitneygydF4y2BaUgydF4y2Ba以及)双尾未配对gydF4y2BatgydF4y2Ba测试被用来比较两个未配对组。多集团对比分析了用单向方差分析Sidak或图基多重比较测试,或非参数和邓恩测试后克鲁斯卡尔-沃利斯。多个组比较使用双向方差分析和其他Sidak或图基多重比较测试。意味着从住院病人血浆值与COVID-19每天由多个未配对严重性组之间比较gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。等离子体水平的相关性是由简单线性回归和皮尔逊相关系数。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

进一步研究信息设计是可用的gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba与本文有关。gydF4y2Ba