过氧化物酶体泛素连接酶复合物形成逆转录易位通道gydF4y2Ba

过氧化物酶体是存在于大多数真核细胞中的膜界细胞器。它们参与必要的细胞代谢，特别是脂肪酸的氧化和活性氧的破坏。大多数过氧化物酶体代谢酶存在于腔内，但在细胞质中合成并输入细胞器gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba}．过氧化物酶体的重要性在其生物发生的人类遗传疾病中被突出，如齐薇格综合征gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

大多数管腔过氧化物酶体蛋白含有一个c端靶向信号(PTS1)，该信号由Ser-Lys-Leu序列或其变体组成gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba}．PTS1信号在细胞质中被受体Pex5识别(在一些真菌中它的副产物Pex9)，它与过氧化物酶体上的一个对接复合物结合，随后将货物运送到腔内。Pex5是否伴随货物进入腔内gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba或者整合到膜中成为易位通道的一部分gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba是有争议的，但至少有一部分似乎穿过了膜。为了开始一个新的导入周期，Pex5必须最终返回细胞质。这种循环需要在N端附近的保守Cys上对Pex5进行单泛素化，并由六聚体双环atp酶提取，其中包括交替的Pex1和Pex6亚基gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba．受体如何重新出现在细胞质中，使单泛素化和反转录易位跨膜尚不清楚。gydF4y2Ba

其他管腔蛋白的导入依赖于PTS2信号，Pex7识别的n端序列和真菌中的其他受体包括Pex18, Pex20和Pex21(参考文献)。gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba})．这些受体与Pex5相似，因为它们也在保守的n端Cys上单泛素化，并通过Pex1-Pex6 atp酶返回细胞质。当Pex5或其他受体的正常循环被阻断时，例如，通过失活Pex1-Pex6 atp酶，受体转而在Lys残基上多泛化，随后被蛋白酶体降解。这种替代途径被称为“缺乏循环的受体积累和降解(RADAR)”。gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

受体的单泛素化和多泛素化都由保守的膜包埋泛素连接酶(E3)复合物催化，由Pex2, Pex10和Pex12组成(参考文献)。gydF4y2Ba^{5克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba})．在酵母中，单泛素化也需要泛素偶联(E2)酶Pex4及其膜锚定激活剂Pex22;在高等生物中，这些酶可能被更混杂的E2酶所取代gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba．多泛素化需要E2酶Ubc4或其同源物gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba．Pex2, Pex10和Pex12都有无名指结构域gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba，是许多泛素连接酶的标志。然而，三个无名指蛋白的参与是独特的，关于它们在单泛素化和多泛素化中的作用存在矛盾的数据gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba}．目前还不清楚连接酶复合物是否只催化受体的泛素化或也促进它们的逆转录易位，类似于泛素连接酶如何介导错误折叠的蛋白质从内质网(ER)到细胞质降解(ERAD)的逆转录易位。gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

为了阐明过氧化物酶体连接酶复合物的功能，我们使用来自嗜热真菌的Pex2, Pex10和Pex12测定了其冷冻电子显微镜(cro - em)结构gydF4y2BaThermothelomyces酸奶gydF4y2Ba，与中相应蛋白高度同源gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba和高级生物(扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．这三种蛋白在gydF4y2Ba毕赤酵母属pastorisgydF4y2Ba并通过亲和层析和凝胶过滤在洗涤剂中纯化洋地黄苷。它们形成了大约150 kDa的稳定的1:1:1的络合物gydF4y2Ba（gydF4y2Ba无花果。gydF4y2Ba1 a, bgydF4y2Ba)．用同源物得到了相似的配合物gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba或gydF4y2Ba毛壳菌属thermophilumgydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．为了增加颗粒的大小并便于定向它们进行低温电镜分析，我们使用噬菌体显示诱变来生成针对病毒的fabgydF4y2Bat .酸奶gydF4y2Ba连接酶复合物被重组成纳米圆盘。其中一种fab与纳米盘和洋地黄苷中的连接酶复合物强烈结合(图2)。gydF4y2Ba1 a, bgydF4y2Ba)，可能形成一个从表面突出的环(图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．在3.1 Å总分辨率下测定了洋地黄苷中Pex2-Pex10-Pex12-Fab配合物的冷冻电镜结构(扩展数据图)。gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba及扩展数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．密度图(图;gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)可以为蛋白质的所有部分建立模型(图;gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)，除了一些在其他物种中不可见且不保守的循环(扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．Fab结合到由Pex12细胞质环形成的腔中(图12)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

这三个Pex蛋白与它们的跨膜片段形成一个通道，与它们的环指结构域形成一个细胞质塔(图。gydF4y2Ba1 c, dgydF4y2Ba)．每个蛋白质都有5个跨膜片段，由于它们的亲水性，大部分在预测中被遗漏了gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba．这三个蛋白质的序列不相关，但它们的五个跨膜片段中的四个形成了重叠的结构(扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，表明有共同的祖先。无名指塔由膜近端RF2和RF10结构域以及更远端的RF12结构域组成(图2)。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)．RF12通过一个中心连接段与Pex12的膜嵌入结构域连接，该中心连接段穿过RF2和RF10之间的接口，包含几个保守的Pro残基(扩展数据图)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

膜嵌入结构呈三角形gydF4y2Ba（gydF4y2Ba无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．Pex10和Pex12的5个跨膜段形成紧密的螺旋束，而Pex2的最后一个跨膜段(跨膜段5 (TM5))从TM1分离到TM4。Pex2在膜内与Pex10和Pex12广泛结合，同时利用TM5和TM1-4(图1)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)，而它的无名指与其他无名指结构域的相互作用很弱。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)，并且在用隔离域进行的凝胶过滤实验中不与它们结合(扩展数据图。gydF4y2Ba5 b, cgydF4y2Ba)．相反，Pex10和Pex12在膜内不相互作用(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，并仅通过无名指域进行关联。RF10和RF12有广泛的接口(大约450 ÅgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)，由几个保守的疏水残基介导(图。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，并且隔离域在凝胶过滤实验中相互作用(扩展数据图。gydF4y2Ba5 d, egydF4y2Ba)．该结构表明，只有这三种蛋白质的组装才能形成稳定的复合物。致病点突变映射到跨膜片段，特别是Pex10和Pex12的簇，以及三个无名指结构域(扩展数据图)。gydF4y2Ba6 a、bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

Pex蛋白的跨膜段形成一个具有开放孔的通道(图2)。gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba)．一个短管状的Pex2环位于孔隙旁边，但在密度图中不可见(由虚线表示)。因为这一段只包含5个小氨基酸，它不太可能堵塞孔，留下直径约10 Å的开口。孔周围的一些残基是亲水且保守的(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4 b, cgydF4y2Ba)．在Pex2和Pex12的最后跨膜段之间的膜内可见一个意义不明的亲水腔。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)．为了测试开放的孔隙是否为过氧化物酶体输入受体的再循环提供了易位路径，并因此对整个蛋白质输入到过氧化物酶体至关重要，我们在孔隙周围的位置引入了大块的残基(图2)。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)及评估进口gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba细胞。蛋白质导入检测测量色氨酸转化为绿色色素(原脱氧紫紫素(PDV))通过工程酶级联，其中最后一个酶(VioE)被一个附加的PTS1信号发送到过氧化物酶体，因此只能参与级联时，其导入受到损害gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba．与通过孔的受体易位一致，当孔的大小因体积较大的残基数量的增加而减小时，蛋白质的输入逐渐被抑制。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5克gydF4y2Ba)．因此，循环受体可能从过氧化物酶体管腔进入催化环指，而不是从膜的侧面进入，这与横向通道门的缺乏一致，并且有证据表明，受体Pex5在返回细胞质之前进入过氧化物酶体管腔gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba．RF2位于孔的正上方，这表明循环受体将其n端插入孔中，因此RF2可以在其保守的Cys上催化单泛素化。另外两个无名指距离更远，无法被位于孔内的多肽到达，因为通路被连接Pex10的最后一个跨膜段与其无名指结构域的环路阻塞(图2)。gydF4y2Ba3 a, egydF4y2Ba)．然而，这个插头可能是灵活的，它的序列保守性很差(扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．事实上，蛋白质的导入并不是必需的(扩展数据图。gydF4y2Ba5 hgydF4y2Ba)，而在高等生物中，它似乎更短或没有。gydF4y2Ba

连接酶通道的壁由单层跨膜片段组成，并包含被磷脂和固醇分子堵塞的小孔，磷脂的亲水头群面向通道内部(扩展数据图)。gydF4y2Ba6 c, dgydF4y2Ba)．大约10 Å直径的孔可以解释为什么过氧化物酶体膜可以渗透小于约800 Da的分子gydF4y2Ba^{19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba}．其他能被小分子渗透的膜只有线粒体、叶绿体和细菌的外膜。gydF4y2Ba

结构表明RF10是一个典型的无名指，有两个ZngydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}由Cys和His残基配位的原子和两个保守环被预测与e2 -泛素缀合物(E2-Ub)相互作用gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba，一个回路包含残基L288和另一个R324(称为关键残基)gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba)(无花果。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．相比之下，RF2和RF12都不是典型的无名指。虽然RF2有两个环(L1和L2)有望与E2酶相互作用，但它们不包含在其他无名指中看到的保守氨基酸。RF2也缺乏关键位点残基。RF12与标准无名指的偏差更大。它只含有5个而不是7个保守的Cys残基，并且缺少第二个ZngydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}原子，如图所示的冷冻- em结构(图;gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)的晶体结构gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba我们在1.5 Å分辨率下确定的同源物(扩展数据图。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba及扩展数据表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．因此，RF12预计不会与E2酶相互作用。gydF4y2Ba

无名指结构域的结构特征与使用分离的无名指和E2酶Ubc4的体外多素化测定结果一致。RF10有一些低活性，而RF2和RF12都是不活跃的(图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba、4车道和扩展数据图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．RF12是RF10的激活剂，它极大地刺激了RF10的多泛素化(图10)。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba这与之前的研究结果一致gydF4y2Ba^5克ydF4y2Ba．预测RF10中取消E2结合(L288A或R324A)或与RF12相互作用(L270A)的突变没有或低活性(11、13和7通道)。RF12刺激RF10活性的机制可以从与RF10 - RF12复合物结构最相似的同型二聚体环指连接酶的比较中推导出来;这种环指二聚体含有结合的E2-UbgydF4y2Ba^{23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}预测Pex12的L398与泛素单螺旋末端相互作用(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7 b, cgydF4y2Ba)．在体外实验中，L398的突变大大降低了RF12的刺激作用(扩展数据图)。gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba)．因此，RF10和RF12可能作为一个单元在多泛素化作用中发挥作用。gydF4y2Ba

为了测试RF10和RF12在过氧化物酶体蛋白输入中的作用，我们将内源性的Pex10或Pex12替换为gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba多泛素化缺陷的无名指突变体。Pex10突变体L270A, L288A, R324A和H303D，以及Pex12突变体L398A，与相应的野生型蛋白一样活跃(图。gydF4y2Ba4 c, dgydF4y2Ba)．即使是Pex10(L288A)和Pex12(L398A)的组合也没有导致导入缺陷(扩展数据图。gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba)．因此，RF10-RF12的多泛素化在过氧化物酶体蛋白导入和正常受体循环中是不可缺少的。据此，人类突变(H310D/Q和R331Q)，相当于gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2BaH303D和R324Q导致相对轻微的疾病表型gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba．相反，预测影响ZngydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}配合物(Pex10中的C301S和Pex12中的C354S)的结合和折叠取消了体内导入(图。gydF4y2Ba4 c, dgydF4y2Ba)．因此，人类无名指蛋白质中的Cys突变会导致严重的齐薇格综合征gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

为了更好地理解rf10 - rf12依赖的多泛素化作用，我们通过定量蛋白质组学方法鉴定了该通路的底物gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba．在表达多泛素化缺陷Pex10突变体R324A的细胞中，过氧化物酶体导入受体Pex5、Pex9和Pex18积累(扩展数据图)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．底物还包括受体对接复合物的组分gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba}，特别是Pex13(扩展数据图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．其他过氧化物酶体蛋白保持不变。这些数据表明，多泛素化途径不仅介导受体的降解(RADAR途径)，而且还维持其他重要因子的稳态，这与报道的几种过氧化物酶体膜蛋白的连接酶依赖性降解一致gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

接下来，我们测试了第三个无名指(即RF2)的作用。设计RF2突变预防ZngydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}结合(C237S)取消了蛋白质导入(图;gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)，但不影响连接酶复合物的组装(扩展数据图。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba)．RF2的L1和L2环(P223A/R224D和D257A)的突变预计会减少与E2酶的相互作用，但没有引起输入缺陷(图2)。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)．然而，当这些突变与多泛素化缺陷的Pex10突变R324A或L288A结合时(它们本身也是良性的)，输入显著减少，尤其是L1突变(图2)。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)．因此，RF2介导的受体单泛素化可能在环突变体中受损，但由pex10pex12介导的多泛素化补偿。gydF4y2Ba

为了进一步测试RF2在单泛素化途径中的作用，我们在中过表达了Pex5突变体gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba含有内源性Pex5的细胞。过度表达的Pex5(C6A)，一种缺乏Cys的突变体，通常由单泛素修饰gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba}，在野生型细胞中只引起轻微的输入缺陷(图。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)．因此，C6A突变体没有阻断内源性Pex5的连接酶通道，即使它不能通过单泛素化途径从孔中提取。相反，孔隙似乎通过多泛素化(即RADAR)途径清除了过表达的突变蛋白。事实上，进口大幅减少(图。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)当C6A突变与排除Pex5多泛化的Lys突变结合时(K18R和K24R)gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba}．K18R/K24R突变本身没有引起输入缺陷(图2)。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)．与RF10 - rf12介导的Pex5多泛素化一致，C6A突变在RF10突变的多泛素化受损细胞(R324A)中表达时，也会引起同样强烈的输入缺陷(图3)。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)．相比之下，当C6A突变体在携带RF2 L1环突变的菌株中表达时，几乎看不到影响(扩展数据图)。gydF4y2Ba8 dgydF4y2Ba)．因此，这些结果表明RF2介导受体循环途径中正常的单泛素化，而RF10-RF12的多泛素化则在循环途径受损时防止连接酶通道的堵塞。与RF2催化单泛素化一致，当Pex5 K18R/K24R突变体在RF2突变株中表达时，输入量减少了约50%(与野生型Pex5相比)。gydF4y2Ba8 dgydF4y2Ba)，而在rf10突变株中未观察到输入缺陷(图10。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)．值得注意的是，我们无法在体外用分离的RF2或全长连接酶复合物证明Pex5的单泛素化，这可能是因为该反应可能需要受体适当插入连接酶孔或其他成分的存在。gydF4y2Ba

我们的结果支持了一个模型，即过氧化物酶体输入受体进入细胞器腔，然后输出回细胞质gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba．在输出过程中，非结构的n端段会从管腔侧插入通道孔，这样保守的Cys残基就可以在RF2和Pex4(或者在高等生物中，另一个E2)的联合作用下被修饰(图2)。gydF4y2Ba4 hgydF4y2Ba)．单泛素化受体随后被Pex1-Pex6 atp酶提取到细胞质中。当受体循环受损时，n端段会横向移动以达到RF10，这一运动需要塞的位移(图2)。gydF4y2Ba4 hgydF4y2Ba)．然后RF10将与RF12和Ubc4(或其同源物)合作，多泛化邻近Lys残基上的受体。多泛素化的受体将被另一个atp酶从连接酶通道中提取，可能是Cdc48(哺乳动物中的p97或VCP)，最后由蛋白酶体降解。这种多泛素化途径也用于降解其他过氧化物酶体膜蛋白。在我们的低温电镜结构中，RF2和RF10与E2酶的相互作用将导致空间位阻冲突(扩展数据图)。gydF4y2Ba7 d, egydF4y2Ba)，表明两只无名指都需要经历构象变化才能变得活跃。由于RF2和RF10与膜埋区通过柔性环连接，这些构象变化不会影响孔隙。gydF4y2Ba

过氧化物酶体受体循环和降解的整体途径类似于根除- l，其中错误折叠的腔内ER蛋白被多跨泛素连接酶反位，多泛素化，然后由Cdc48 atp酶从膜中提取gydF4y2Ba^{17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba}．然而，在erda - l中，Hrd1泛素连接酶和相关的Der1蛋白分别与细胞质腔和腔内腔形成“半通道”;易位发生在薄膜区域，而不是通过水孔gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba．过氧化物酶体反转位子更类似于经典的Sec61/SecY转位子，因为它们都具有多肽易位的水孔gydF4y2Ba^{33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

克隆，质粒构建和菌株gydF4y2Ba

所有结构均使用Gibson汇编克隆。用于连接酶复合物的过表达gydF4y2Bap . pastorisgydF4y2Ba的DNA序列编码gydF4y2Ba嗜热葡萄球菌，酿酒葡萄球菌gydF4y2Ba或gydF4y2Bac . thermophilumgydF4y2Ba采用GeneArt of Life技术合成组分并优化密码子。Pex12含有一个n端SBP标记和一个HRV3C蛋白酶裂解位点，Pex10含有一个c端血凝素(HA)标记，Pex2含有一个c端FLAG标记。所有基因都克隆在pPlCZA- link载体的EcoRI和NotI位点之间，该载体由pPlCZA修饰而成，允许多个基因表达gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba．无名指的表达gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba的DNA序列gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba在载体pGEX6P-1的BamHI和NotI位点之间合成并克隆含有n端谷胱甘肽的基因gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba-转移酶(GST)标记，随后是HRV3C蛋白酶裂解位点。所有结构的变体都是使用Quikchange (Agilent)生成的。gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba野生型菌株UTL7A (MATa, ura3-52, trp1, leu2-3/112)由R. Erdmann (Ruhr-University Bochum)提供。所有单、双敲除菌株均采用标准转化技术和pFA6A-NatMX或KanMX质粒构建。利用pFA6A-HygMX载体在Pex2、Pex10和Pex12的内源位点上进行同源重组，得到了flag标记的Pex2、Pex10和Pex12。对于Pex5过表达，在全长Pex5的C端融合HA标记和6×His标记。该基因位于ATG起始密码子上游约500 bp处，因此Pex5由其内源性启动子表达。该序列被插入到CEN质粒pRS416的多重克隆位点(参考文献)。gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba)．所有的变换gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba细胞采用LiAc-PEG法gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

蛋白表达、纯化及纳米盘重建gydF4y2Ba

的gydF4y2Bap . pastorisgydF4y2Ba野生型菌株SMD1168从Life Technology获得。按照制造商的说明，通过电穿孔进行转换。转化酵母细胞在含zeocin的YPDS (YPD培养基+山梨醇)板上30°C生长3天。选取单个菌落接种起始培养物，在30°C下孵育过夜。然后通过将发酵剂1:100稀释到缓冲的最小甘油(BMG)培养基中接种大培养物。培养物在30°C下孵育约24小时，通过切换到相同体积的缓冲最小甲醇(BMM)培养基诱导蛋白表达。在28°C下孵育约20小时后，在4500℃下离心收集细胞gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。颗粒储存在−80°C，直到进一步使用。gydF4y2Ba

将约100 g的细胞球重悬在100 - 120 ml缓冲液A (25 mM HEPES pH 7.4, 400 mM NaCl)中，补充2 mM苯基甲烷磺酰氟(PMSF)和2 μM pepstatin A。细胞在BioSpec Beadbeater中裂解40分钟，在水冰浴中开/关20秒/60秒。匀浆在10,000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba冲洗20分钟，清除细胞碎片。将上清液在Ti45转子(Beckman)中以44,000转/分的速度在4°C下离心1小时。将球团膜用Dounce匀浆器在缓冲液a中重悬，并通过离心再次球团。将膜重新悬浮在含有1%月桂麦芽糖新戊二醇(LMNG)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒的200-250 ml缓冲液A中，并在4°C下孵育60分钟。不溶性物质在贝克曼Ti45转子中以44,000转/分离心30分钟去除。将上清液转移到新管中，用2 ml高容量链霉亲和素树脂(Thermo Scientific)孵育1小时。用20-30 ml含有0.1%洋地黄苷的缓冲液A (EMD Millipore)清洗树脂，用10-15 ml缓冲液B (25 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 10%甘油和0.1%洋地黄苷)补充2 mM生物素(Sigma)洗脱结合蛋白。该复合物使用100 kda切断Amicon过滤器(Sigma-Millipore)进行浓缩，并在Superose 6 3.2/300 Increase柱(GE Healthcare)上通过尺寸排除色谱进一步纯化，用C缓冲液(25 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl和0.05%地黄皂苷)进行平衡。gydF4y2Ba

为了纳米盘的重建，首先制备了脂质原液。原液中含有1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-各10毫米gydF4y2BalgydF4y2Ba-丝氨酸(DOPS)，制备方法见参考文献。gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba．将洋地黄苷纯化的蛋白质以1:240:5摩尔比的蛋白质:脂质:膜支架蛋白1D1 (MSP1D1)纳入纳米盘。该混合物在4°C下温和搅拌2小时。然后，Bio-Beads (Bio-Rad)在4°C下连续旋转添加过夜。Bio-Beads被移除，重组混合物在12000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba20分钟，去除聚集的蛋白质。将上清液加载到凝胶过滤缓冲液(25 mM HEPES pH 7.4和150 mM NaCl)中的Superose 6 3.2/300增加粒径排除柱(GE Healthcare)上。将含有纳米盘重组连接酶复合物的组分合并浓缩至10 μM左右。这种材料被用来生成fab。gydF4y2Ba

为了组装Fab -连接酶复合物，纯化的连接酶复合物在洋地黄苷中与Fab以1:1.5摩尔比在冰上孵育1小时。将fab -连接酶复合物浓缩并负载在C缓冲液(25 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl和0.05%洋地黄苷)中的Superose 6 3.2/300增加尺寸排除柱(GE Healthcare)上。将峰值组分汇总并浓缩至约7 mg mlgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba用于低温电镜分析。gydF4y2Ba

为了纯化gst标记的无名指结构域，蛋白在gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba应变BL21 (DE3)。细胞裂解液首先在10000度下进行离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下浸泡30分钟，过滤后的上清液应用于谷胱甘肽树脂(GE Healthcare)。用还原性谷胱甘肽洗脱后，将蛋白质浓缩并负载到Superdex 200 3.2/300增加尺寸排除柱(GE Healthcare)上，该柱在凝胶过滤缓冲液(25 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM Tris(2-羧乙基)盐酸磷化氢(TCEP)和5%甘油)中平衡。在−80°C下储存峰值组分直到使用。gydF4y2Ba

为了纯化用于结晶的Pex12环指结构域，与谷胱甘肽树脂结合的GST- 3c - Pex12 RF与pression蛋白酶在4℃下孵育过夜，以分离GST标记。通过的部分被收集并加载到Mono Q离子交换柱(GE Healthcare)。用盐梯度(0-500 mM NaCl和25 mM HEPES pH 7.4)洗脱蛋白，并将峰馏分合并。与Pex12环指结构域相对应的组分被浓缩并应用于HiLoad 16/60 Superdex 75凝胶过滤柱(GE Healthcare)，预平衡在凝胶过滤缓冲液中(25 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP和5%甘油)。将纯化的蛋白质浓缩至6 mg mlgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba，在液氮中速冻，并在−80°C保存。gydF4y2Ba

结晶gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2BaPex12无名指结构域gydF4y2Ba

用悬滴扩散法将0.2 μl蛋白以6 mg ml的浓度混合，得到了Pex12环指结构域gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba100 μl含0.1 M双三丙烷，pH 8.5, 0.2 M氟化钠和20% PEG3350的储液0.2 μl。通过反复添加添加了30%甘油的孔液，逐渐增加滴液中甘油的浓度，可以对晶体进行低温保护。从滴液中取出晶体，用另一滴添加了30%甘油的好溶液擦拭，然后在液氮中快速冷冻。在高级光子源(APS)的24-ID-C光束线处收集100 K的数据。使用HKL2000/3000包对数据进行索引、集成和缩放，分辨率为1.5 Å。gydF4y2Ba

利用噬菌体展示鉴定连接酶复合物特异性fabgydF4y2Ba

的纯化gydF4y2Bat .酸奶gydF4y2Ba如上所述，除了使用化学生物素化的MSP1D1外，连接酶复合物被重组成纳米圆盘。通过用链霉亲和素包被顺磁珠(Promega)捕获纳米圆盘来评估生物素化的效率。对于Fab的选择，使用了先前描述的Fab噬菌体库gydF4y2Ba^39gydF4y2Ba．将含有连接酶复合物和文库的纳米盘稀释到选择缓冲液(20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl和1% BSA)中。如前所述，进行了五轮排序gydF4y2Ba^{40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba}．在第一轮中，使用400 nM的重组连接酶复合物手工进行生物筛选。为了增加筛选压力的严密性，通过逐步降低目标浓度，再半自动地进行4轮筛选:第二轮200 nM，第三轮100 nM，第四轮50 nM，第五轮25 nM。所有回合的噬菌体显示都使用先前描述的协议进行gydF4y2Ba^39gydF4y2Ba．对于除第一轮外的每一轮，都使用前一轮中扩增的噬菌体种群作为输入池。在空MSP1D1纳米圆盘中，2 μM被用作竞争品。gydF4y2Ba

单点噬菌体ELISA验证Fab与重组连接酶复合物的结合gydF4y2Ba

采用单点噬菌体酶联免疫吸附试验(ELISA)验证从第4轮和第5轮噬菌体展示中获得的独特结合物。在芝加哥大学综合癌症中心DNA测序设备上对携带噬菌体的单个菌落进行测序，如前所述，在ELISA前选择独特的克隆并扩增噬菌体gydF4y2Ba^{40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba}．ELISA使用先前描述的方案进行gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

Fab克隆、表达、纯化和验证gydF4y2Ba

基于噬菌体ELISA结果的特异性结合物在芝加哥大学综合癌症中心DNA测序设备进行测序，然后使用In-Fusion克隆试剂盒(Takara)将独特的克隆亚克隆到Fab表达载体RH2.2 (S. Sidhu的捐赠)。DNA测序证实克隆成功。然后像前面描述的那样表达和纯化fabgydF4y2Ba^35gydF4y2Ba．纯化后，用4-20% SDS-PAGE验证Fab样品的纯度，随后在25 mM HEPES pH 7.4和150 mM NaCl中透析过夜。用多点ELISA法测定纯化后Fab的亲缘性gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba在生物素化纳米圆盘中使用连接酶复合物。gydF4y2Ba

Negative-stain EMgydF4y2Ba

连接酶复合物在0.02 mg ml浓度的纳米盘或洋地黄苷中重构gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba应用于发光放电连续碳栅格(电子显微镜科学公司)。吸附1 min后，用滤纸吸除多余样品，立即用4 μl 1.5%新鲜甲酸铀酰溶液洗涤两次，再用4 μl 1.5%甲酸铀酰溶液孵育30 s。然后用滤纸进一步吸干栅格以去除甲酸铀溶液，在室温下风干，并使用配备LaB6灯丝并在120 kV加速电压下操作的Tecnai T12电子显微镜(Thermo Fisher Scientific)进行检查，使用名义放大倍率×52,000，像素大小为2.13 Å。gydF4y2Ba

单颗粒低温电镜样品制备和数据采集gydF4y2Ba

将浓缩样品与MS(PEG)12甲基-PEG- nhs -酯(Thermo Fisher)以1:40摩尔比在冰上孵育2小时，以减少颗粒在网格上的优先取向gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba．然后，将3.0µl PEGylated的样品应用于发光放电的quantifoil网格(1.2/1.3,400目)。在大约100%的湿度下，以12的印迹力对网格进行7秒的印迹，并使用Vitrobot Mark IV仪器(赛默飞世尔科学公司)在液态乙烷中冷冻。gydF4y2Ba

Cryo-EM数据是在一台300kv的泰坦克瑞斯电子显微镜(FEI)上收集的，并在HHMI Janelia农场的Cryo-EM设施中配备了K2 Summit直接电子探测器(Gatan)。能量过滤器的狭缝宽度为20 eV，用于去除非弹性散射电子。所有低温em电影都是在使用SerialEM的超分辨率计数模式下记录的。在超分辨率模式下，×81,000的标称放大倍率对应于1.06 Å和0.53 Å的校准物理像素大小。剂量率为5.28电子ÅgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．总暴露时间为10秒，总剂量为52.8电子ÅgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}分割成50帧(每帧200毫秒)。样品的离焦范围在−1.0和−2.5µm之间。gydF4y2Ba

数据处理gydF4y2Ba

使用MotionCor2程序(参考文献)对9019部剂量分级的超分辨率电影进行了运动校正。gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba)使用2× binning，产生像素大小为1.06 Å。每个图像堆栈的所有帧(总共50帧)的总和按照剂量加权方案计算，并用于除离焦确定外的所有图像处理步骤。程序CtfFind4(参考。gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba)用于估计所有电影帧的总和图像的离焦值。粒子在Relion 3.1中被自动转换。gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba)．经过人工检查和分类，丢弃较差的图像，在Relion 3.1中进行分类。共提取了3,224,513个颗粒，并进行了一轮无参考的2D分类，以去除错误的拾取和明显的垃圾分类。为了加快数据处理过程中的3D分类速度，我们将整个数据集按照收集的顺序分为4批，每批分别进行3D分类。每批中只有一类具有蛋白质特征，并将该类中的颗粒组合进行进一步分类(共1,007,363个颗粒)。利用之前三维分类重建的颗粒集作为初始模型，并在蛋白质和洗涤剂胶束周围建立软掩膜，对该颗粒集进行自动细化。在这一轮细化之后，粒子进行贝叶斯抛光，然后使用包含连接酶复合物和Fab的掩膜进行另一轮自动细化和集中细化。这一步的细化产生了一个3.3 Å映射。使用焦点细化后获得的角度分配，1.8°局部三维分类(2西格玛和gydF4y2BaTgydF4y2Ba= 20)，采用自适应掩模进一步对颗粒进行分类。从一个类别中总共选择了795,444个粒子，并进行了另一轮自动细化。三维分类(T30)不对齐，但使用蒙版，进一步提高地图的质量。在选择了121644个粒子后，最后一轮自动细化，然后使用自适应掩码进行集中细化，得到了位于3.1 Å的地图。使用Resmap v1.1.5计算局部分辨率。gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba)，并在Relion 3.1中执行地图锐化。所有报告的分辨率都基于金标准的细化程序和傅里叶壳层相关= 0.143准则。利用3DFSC服务器计算方向傅里叶壳层相关曲线直方图和球度值gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba．所有软件均由SBGrid支持gydF4y2Ba^49gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

结构模型的建立、细化和分析gydF4y2Ba

所有模型都是在白骨顶建造的gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba并在PHENIX中进行了改进gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba使用3.1 Å锐化密度图。对于Pex2, Pex10和Pex12，每个蛋白的跨膜螺旋都很容易被识别，最初被构建为poly-Ala。然后，我们手动将跨膜螺旋安装到密度中，并使用二级结构预测和大块残基(如Phe, Trp和Arg)作为标记点，在白骨顶中追踪跨膜段的主干和它们之间的连接器。密度图的质量足以为关键残基分配旋转器。在不能分配旋转分子的情况下，侧链在Cβ原子处被截断。使用PHENIX real_space_refine在没有二级结构约束的真实空间中细化模型。PHENIX real_space_refine中的强非晶体对称约束用于固定未细化的域。在目视检查后，使用Phenix和Coot进行了几次手动优化和全局优化的迭代。对于无名指结构域，采用RaptorX软件建立各ring结构域的同源性模型gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba或者Alphafold 2(参考。gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba)．然后，将这些模型拟合到UCSF Chimera的密度图中gydF4y2Ba^54gydF4y2Ba并转移到Coot进行手动模型构建，使用XtalPred服务器的二级结构预测作为附加指南。对于Fab模型的构建，沉积的GgMFSD2A Fab复合物(PDB ID: 7MJS)的Fab部分被用作起始模板，并与Chimera手动对接到低温- em密度中。该模型是通过迭代的自动细化来细化的。由于Fab常数畴的密度较弱，其结构被去除。对于脂类模型，将麦角甾醇或POPC的PDB文件导入白骨顶，作为配体拟合成密度。gydF4y2Ba

Pex12射频晶体数据集采集波长为0.967 Å，其中ZngydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}有很强的异常信号。该信号提供了高质量的异常数据，使SHELXD能够以直接的方式定位锌原子。利用该数据集和重原子位置，用SHARP程序计算了相位概率分布gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba．导出相位的质量允许大多数Pex12 RF模型在Coot中自动或手动完成。用REFMAC进行精制gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

原子模型的可视化是使用UCSF Chimera完成的gydF4y2Ba^54gydF4y2Ba, ChimeraXgydF4y2Ba^57gydF4y2BaPyMOL (PyMOL分子图形系统，2.0版，Schrödinger, LLC.)。gydF4y2Ba

过氧化物酶体蛋白导入试验gydF4y2Ba

紫罗兰素通路(VioA, VioB和VioE-SKL)gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba被整合到gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba在Leu2位点的细胞。简言之，质粒pWCD1401或pWCD1402(参考文献。gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba)用NotI-HF酶切，凝胶提取的11.5 kb片段用于转化。克隆在SD-Leu板上选择。如前所述，使用含有紫罗兰素途径的菌株敲除Pex2、Pex10和Pex12。gydF4y2Ba

为了补充缺乏Pex2、Pex10或Pex12的菌株，从每个基因的内源性位点表达野生型蛋白或突变体的flag标记版本。如上所述，使用载体pFA6A-HygMX进行同源重组引入基因。质粒转化为含有紫罗兰素途径但缺乏PEX基因的细胞，并在SD-Leu培养基上筛选。每种转化的3个菌落在SD-Leu培养皿上，各取1个菌落在30°C、250转/分的YPD培养基中培养过夜。然后将饱和培养物稀释50倍至3 ml新鲜SD-Leu培养基中，培养约60小时。gydF4y2Ba

绿色色素PDV的提取方法如下。将细胞球置于300 μl冰醋酸中重悬，转移至薄壁Eppendorf管中。然后将试管在95°C下孵育15分钟，通过反转混合并再孵育15分钟。细胞碎片首先通过4700转/分离心5分钟去除，然后用Acroprep Advance 0.2 μm滤板(Pall Corporation)过滤上清液。滤液转移到96孔不透明板(Greiner Bio-one)。荧光检测使用microplate reader (Bio-Tek Synergy Neo2)，激发波长和发射波长分别为535 nm和585 nmgydF4y2Ba^19gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

体外多泛素化试验gydF4y2Ba

体外多泛化实验在反应缓冲液(25 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl)中进行gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba50 μM TCEP)。蛋白组分的浓度分别为:0.1 μM Uba1、4 μM Ubc4、0.5 μM GST-RFs和100 μM泛素。混合物中还含有1 μM dylight - maleimide -800标记的cys -泛素。反应由加入5 mM ATP开始，60 min后加入4× SDS样品缓冲液结束。样品采用4-20% SDS-PAGE和800 nm荧光扫描仪(Li-Cor)进行分析。gydF4y2Ba

定量等压标记蛋白质组学gydF4y2Ba

如前所述，用液相色谱-串联质谱对样品进行制备和分析gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba．简而言之，酵母细胞在50 ml YNBG培养基(0.3%酵母浸膏、0.5%蛋白胨、0.67%酵母氮碱含氨基酸和0.5%葡萄糖，pH 6.0)中培养过夜至log期，然后切换到YNBO培养基(0.3%酵母浸膏、0.5%蛋白胨、0.67%酵母氮碱不含氨基酸、0.5%葡萄糖、0.05% Tween40和0.1%油酸，pH 6.0)中再培养18 h，诱导过氧化物酶体增殖。将细胞球重新悬浮在裂解缓冲液(8 M尿素，200 mM EPPS pH 8.5和蛋白酶抑制剂(Pierce))中，然后使用BioSpec Beadbeater裂解5个循环，每个循环30秒，然后60秒。匀浆在2000度下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟以清除细胞碎片和上清液转移到新管。样品用5 mM TCEP还原30分钟，用10 mM碘乙酰胺烷基化30分钟，然后用10 mM DTT淬火15分钟。流线型串联质标标记和液相色谱-质谱都是按照参考文献中描述的方案进行的。gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba．基于定量等压标记的蛋白质组学数据处理使用MSconvert 3.0 (gydF4y2Bahttps://proteowizard.sourceforge.io/tools/msconvert.htmlgydF4y2Ba)和彗星2021.02 rev. 0 (gydF4y2Bahttp://comet-ms.sourceforge.net/gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

免疫印迹gydF4y2Ba

将缺乏Pex2和Pex12并表达来自内源性启动子下的原生位点的flag标记Pex2和Pex12野生型或突变型蛋白的酵母细胞在50 ml YNBG培养基中培养过夜至log期。将细胞转移到YNBO培养基中再培养18 h，诱导过氧化物酶体增殖。如上所述，用玻璃珠裂解细胞，用离心去除细胞碎片。膜组分在45000转/分的超离心下分离60分钟。膜在含1% Triton X-100的裂解缓冲液中均质溶解1小时。用10 μl anti-FLAG M2树脂在4℃下孵育2 h。用含0.1% Triton X-100的裂解缓冲液洗涤三次，用含0.4 mg ml的缓冲液洗脱结合蛋白gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba3×FLAG肽(Sigma)。洗脱蛋白进行SDS-PAGE和免疫印迹。flag标记的Pex2和Pex12用抗flag (F7425, Sigma)抗体以1:3 000稀释检测。作为负载对照，总细胞裂解液用抗sec61 α抗体(自制兔血清)按1:3 000稀释进行免疫印迹。gydF4y2Ba

统计和再现性gydF4y2Ba

所有生化实验都独立进行了至少三次，结果相似。使用GraphPad Prism 9.3.0进行多重比较的单向方差分析，以评估与Pex2、Pex10、Pex12或Pex5突变体导入相比，野生型细胞中过氧化物酶体蛋白导入效率的统计学意义。柱状图如图所示。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba4 c ggydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5 hgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba8 c, dgydF4y2Ba显示三个生物重复的单个数据点，平均值和S.E.M.。NS，不显著;＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.1， **gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05， ****gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001。基于定量等压标记的蛋白质组学实验独立进行了两次，结果相似。结果统计(扩展数据图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)由多个未配对的人执行gydF4y2BatgydF4y2Ba-测试，然后采用两阶段逐步提升的方法(Benjamini, Krieger和Yekutieli，期望错误发现率(gydF4y2Ba问gydF4y2Ba) = 1%)，基于3个生物重复。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba