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生长素转运蛋白中的PIN- formed (PIN - formed)蛋白家族介导生长素的极性转运，在植物生长发育中起着至关重要的作用gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．在这里，我们展示了来自PIN3的冷冻电子显微镜结构gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba载波状态下，与底物吲哚-3-乙酸和抑制剂络合gydF4y2BaNgydF4y2Ba-1-萘酞酸(NPA)。gydF4y2Ba答:芥gydF4y2BaPIN3作为同源二聚体存在，其支架结构域中的跨膜螺旋1、2和7参与了二聚。二聚体PIN3在二聚体界面形成一个大的、联合的面向细胞外的空腔，而每个亚基都采用向内的构象。结构和功能分析以及计算研究揭示了吲哚-3-乙酸和NPA识别的结构基础，阐明了NPA抑制pin介导的生长素转运的分子机制。PIN3结构支持一种升降机式的生长素转运模型，即转运结构域进行上下刚体运动，而二聚化支架结构域保持静态。gydF4y2Ba
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结构坐标和低温电镜密度图已存入蛋白质数据库和电子显微镜数据库，并已登记编号gydF4y2Ba7周内gydF4y2Ba而且gydF4y2Baemd - 32568gydF4y2BaPIN3的gydF4y2Ba7月gydF4y2Ba；gydF4y2Ba7 wkwgydF4y2Ba而且gydF4y2Baemd - 32570gydF4y2BaPIN3的gydF4y2BaNPAgydF4y2Ba；而且gydF4y2Ba7 xxbgydF4y2Ba而且gydF4y2Baemd - 33500gydF4y2BaPIN3的gydF4y2Ba国际宇航科学院gydF4y2Ba．本文分析的其他结构坐标可从蛋白质数据库下载，请按登录号查询gydF4y2Ba4“世界新七大自然奇观”gydF4y2Ba为gydF4y2Bay frederikseniigydF4y2BaASBT;gydF4y2Ba3 zuygydF4y2Ba为gydF4y2Ba脑膜炎奈瑟氏菌gydF4y2BaASBT;gydF4y2Ba7 dswgydF4y2Ba用于人NHE1;gydF4y2Ba5 bz2gydF4y2Ba为gydF4y2Ba栖热菌属酸奶gydF4y2Ba纳帕;而且gydF4y2Ba4 czbgydF4y2Ba为gydF4y2BaMethanocaldococcus jannaschiigydF4y2BaNhaP。支持本研究结果的其他数据载于gydF4y2Ba补充信息gydF4y2Ba．扩展数据图的未裁剪图像。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3, f, kgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba9 dgydF4y2Ba在补充图中提供。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba源数据gydF4y2Ba提供了这篇论文。gydF4y2Ba
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2022年9月21日gydF4y2Ba
对本文的更正已发表:gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/s41586-022-05360-2gydF4y2Ba
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确认gydF4y2Ba
单粒子低温电镜数据采集于湖北大学低温电镜设备、浙江大学低温电镜中心和上海国家蛋白质科学研究所(NFPS)。我们感谢X. Zhang在低温电子显微镜设备接入和数据采集方面的支持，感谢Q. Zhang在荧光成像方面的支持;浙江大学辐射技术平台放射性实验工作人员;以及中国科学院上海高级研究院张江实验室国家蛋白质科学上海基地(NFPS)大规模蛋白质制备系统的工作人员，为ITC数据收集和分析提供技术支持和帮助。本工作由科技部资助(2020YFA0908501、2018YFA0508100 J.G.， 2020YFA0908400 S.W.)，国家自然科学基金(31870724 J.G.， 31741067、31800990杨峰，31900930 S.W.)，中国博士后科学基金(2020M672434 S.W.， 2021M692818 N.S.)，中央高校基本科研业务费专项资金(2021FZZX001-28拨给J.G.)和浙江省自然科学基金(LR19C050002拨给J.G.， LR20C050002拨给杨峰)。杨志刚、杨峰由浙江大学脑科学与脑机集成前沿科学中心资助。杨致远得到阿里云的支持。gydF4y2Ba
作者信息gydF4y2Ba
作者及隶属关系gydF4y2Ba
贡献gydF4y2Ba
j.g.，杨飞和s.w.a构想并监督该项目。刘永生、薛廷廷、薛春春、叶峰、叶永中、程志忠、祁春春、江伟、程永哲进行了样品制备、数据采集和结构测定。n.s.， A.Z.和S.Z.进行生长素外排试验。n.s.， Y.G.和S.J.进行了SPR试验。叶峰，H.W.和杨峰进行了分子动力学模拟。梁建刚、邵世伟、杨峰、沈建中、邵世勇、林明、郑建德等进行了结构数据分析。所有作者都参与了数据分析和稿件准备。gydF4y2Ba
相应的作者gydF4y2Ba
道德声明gydF4y2Ba
相互竞争的利益gydF4y2Ba
作者声明没有利益竞争。gydF4y2Ba
同行评审gydF4y2Ba
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自然gydF4y2Ba感谢Dolf Weijers和其他匿名审稿人对这项工作的同行评审所做的贡献。可以获得同行评审报告。gydF4y2Ba
额外的信息gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba
扩展的数据图形和表格gydF4y2Ba
扩展数据图1序列比对gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba针(AtPIN1-8)。gydF4y2Ba
二级结构分配基于AtPIN3的结构gydF4y2Ba7月gydF4y2Ba．彩色条表示AtPIN3中跨膜螺旋的位置。参与IAA和NPA结合的氨基酸残基用蓝色三角形表示。圆圈表示二聚反应中涉及的关键残基。参与CTD功能的氨基酸残基以橙色圆圈表示。gydF4y2Ba
图2 AtPIN3的IAA转运活性。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， NPA抑制作用的剂量响应曲线gydF4y2Ba3.gydF4y2BaH-IAA输运实验(n = 6个独立实验)。NPA的最大抑制率为~59%。数据以均数±s.e.m表示。gydF4y2BabgydF4y2Ba,gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba在没有或存在50 μ M NPA的情况下，在IAA加载阶段10 min, WT和突变PIN3的H-IAA外排(n = 6个独立实验)。资料以均数±s.e.m.双尾表示gydF4y2BatgydF4y2Ba执行-test。gydF4y2BacgydF4y2BaWestern blot结果显示，所有突变体的表达水平与WT PIN3相当。N = 3个独立实验。gydF4y2BadgydF4y2Ba表达绿色荧光蛋白(GFP)标记的WT PIN3和突变体的细胞的典型荧光(上)和亮场(下)图像。GFP荧光在WT和突变PIN3细胞中检测到，模式相似。N = 3个独立实验。gydF4y2Ba
图3 AtPIN3的结构确定gydF4y2Ba7月gydF4y2Ba, AtPIN3gydF4y2BaNPAgydF4y2Ba，和AtPIN3gydF4y2Ba国际宇航科学院gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BakgydF4y2Ba， AtPIN3的阻垢层析gydF4y2Ba7月gydF4y2Ba, AtPIN3gydF4y2BaNPAgydF4y2Ba，和AtPIN3gydF4y2Ba国际宇航科学院gydF4y2Ba在Superose 6 (GE Healthcare)和SDS-PAGE上分别对最终样本进行分析。N = 3个独立实验。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2BalgydF4y2Ba， AtPIN3图像处理流程图gydF4y2Ba7月gydF4y2Ba, AtPIN3gydF4y2BaNPAgydF4y2Ba，和AtPIN3gydF4y2Ba国际宇航科学院gydF4y2Ba粒子,分别。gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba，gydF4y2Ba米gydF4y2Ba， AtPIN3的密度图gydF4y2Ba7月gydF4y2Ba, AtPIN3gydF4y2BaNPAgydF4y2Ba，和AtPIN3gydF4y2Ba国际宇航科学院gydF4y2Ba由局部分辨率着色。gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，gydF4y2BangydF4y2Ba，最终包含粒子的角分布图gydF4y2BaCgydF4y2Ba2gydF4y2Ba-对称三维重建AtPIN3gydF4y2Ba7月gydF4y2Ba, AtPIN3gydF4y2BaNPAgydF4y2Ba，和AtPIN3gydF4y2Ba国际宇航科学院gydF4y2Ba,分别。gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BajgydF4y2Ba，gydF4y2BaogydF4y2Ba， AtPIN3最终三维重建的金标准傅里叶壳层相关(FSC)曲线gydF4y2Ba7月gydF4y2Ba, AtPIN3gydF4y2BaNPAgydF4y2Ba，和AtPIN3gydF4y2Ba国际宇航科学院gydF4y2Ba，以及FSC曲线，用于map与AtPIN3模型的交叉验证gydF4y2Ba7月gydF4y2Ba, AtPIN3gydF4y2BaNPAgydF4y2Ba，和AtPIN3gydF4y2Ba国际宇航科学院gydF4y2Ba,分别。gydF4y2Ba
图4 AtPIN3结构样图。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，样本定位于AtPIN3的10个跨膜螺旋(TMs)gydF4y2Ba7月gydF4y2Ba．UCSF嵌合体的密度显示为每个TM周围的掩膜，水平为0.0183。地图被低通过滤到3.0 Å，并锐化了−90的B因子ÅgydF4y2Ba2gydF4y2Ba．gydF4y2BabgydF4y2Ba，样本定位于AtPIN3的10个跨膜螺旋(TMs)gydF4y2BaNPAgydF4y2Ba．UCSF嵌合体的密度显示为每个TM周围的掩膜，水平为0.0177。地图被低通过滤到2.62 Å，并以−92 Å的B因子锐化gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．gydF4y2BacgydF4y2Ba，样本定位于AtPIN3的10个跨膜螺旋(TMs)gydF4y2Ba国际宇航科学院gydF4y2Ba．UCSF嵌合体的密度显示为每个TM周围0.022水平的掩膜。地图被低通过滤到2.93 Å，并以−70 Å的B因子锐化gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．gydF4y2BadgydF4y2Ba， AtPIN3中底物结合位点周围的密度gydF4y2Ba7月gydF4y2Ba(左),AtPIN3gydF4y2BaNPAgydF4y2Ba(中)和AtPIN3gydF4y2Ba国际宇航科学院gydF4y2Ba(右)白骨顶在7 σ左右的等高线水平。虚线圈表示AtPIN3图谱中底物结合位点无密度gydF4y2Ba7月gydF4y2Ba．数字表示跨膜螺旋。gydF4y2Ba
图5 AtPIN3的结构比较gydF4y2Ba7月gydF4y2Ba, AtPIN3gydF4y2Ba国际宇航科学院gydF4y2Ba，和AtPIN3gydF4y2BaNPAgydF4y2Ba．gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， AtPIN3的叠加gydF4y2Ba7月gydF4y2Ba和AtPIN3gydF4y2Ba国际宇航科学院gydF4y2Ba亚基A结构在不同的方向。两种结构中377个Cα原子的均方根偏差(r.m.s.d)为0.90 Å。gydF4y2BabgydF4y2Ba， AtPIN3的叠加gydF4y2Ba7月gydF4y2Ba和AtPIN3gydF4y2BaNPAgydF4y2Ba亚基A结构在不同的方向。两种结构中377个Cα原子的均方根误差为0.34 Å。gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba， AtPIN3 TMD中5个TMs的倒置结构重复gydF4y2Ba7月gydF4y2Ba．gydF4y2BacgydF4y2BaTM1-5(蓝色)和TM6-10(青色)的结构在同一方向上一起或单独显示。gydF4y2BadgydF4y2Ba， TM1-5和TM6-10在不同方向的结构叠加。gydF4y2Ba
图6 AtPIN3、SLC9A和SLC10A转运体的结构和拓扑比较gydF4y2Ba
每个传输器的结构显示在侧面(左)和顶部(中)视图中。拓扑图(右)的顶部是细胞外的一面，底部是细胞内的一面。gydF4y2Ba一个gydF4y2BaAtPIN3;gydF4y2BabgydF4y2Ba, ASBTgydF4y2BaYfgydF4y2Ba，gydF4y2Ba鼠疫frederikseniigydF4y2BaAsbt, pdb: 4n7w;gydF4y2BacgydF4y2Ba, ASBTgydF4y2Ba纳米gydF4y2Ba，gydF4y2Ba脑膜炎奈瑟氏菌gydF4y2BaAsbt, pdb: 3zuy;gydF4y2BadgydF4y2Ba， HsNHE1, human NHE1, PDB: 7DSW;gydF4y2BaegydF4y2BaTtNapA,gydF4y2Ba栖热菌属酸奶gydF4y2BaNapA, PDB: 5BZ2;gydF4y2BafgydF4y2BaMjNhaP,gydF4y2BaMethanocaldococcus jannaschiigydF4y2BaNhaP, PDB: 4CZB。gydF4y2Ba
图7 AtPIN3中的配体结合位点。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， AtPIN3的npa结合结构gydF4y2BaNPAgydF4y2Ba(左)牛磺胆酸(TCA)结合结构的ASBTgydF4y2BaYfgydF4y2Ba(中)和AtPIN3的iaa结合结构模型gydF4y2Ba国际宇航科学院gydF4y2Ba(右)。NPA、TCA和IAA分别用青色、绿色和黄色表示。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba， AtPIN3的RMSD (gydF4y2BabgydF4y2Ba)及IAA (gydF4y2BacgydF4y2Ba)在400 ns模拟4个轨迹。gydF4y2BadgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaggydF4y2Ba，从每20 ns模拟提取的4个轨迹(绿色、青色、紫色和橙色)中IAA的结合配置与AtPIN3中模拟的IAA相似gydF4y2Ba国际宇航科学院gydF4y2Ba结构(黄色)。gydF4y2BahgydF4y2Ba， AtPIN3残基与IAA观测距离最短的时间序列。括号中的数字是MD模拟中各自距离的平均值和标准差。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，其中一个轨迹的IAA结合位点的快照，每80 ns拍摄一次，跨度为400 ns。AtPIN3中的IAAgydF4y2Ba国际宇航科学院gydF4y2Ba结构为黄色，MD模拟为绿色;AtPIN3的结构gydF4y2Ba国际宇航科学院gydF4y2Ba是洋红色的，在MD模拟中是粉红色的。gydF4y2Ba
扩展数据图8 IAA或NPA对AtPIN3突变体的SPR分析。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，不同浓度下AtPIN3突变体与IAA或NPA相互作用的SPR结合曲线。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BaKgydF4y2BaDgydF4y2BaAtPIN3与IAA(左)或NPA(右)的曲线符合稳态亲和模型。gydF4y2BacgydF4y2Ba,gydF4y2BaKgydF4y2BaDgydF4y2Ba利用SPR稳态亲和模型计算IAA或NPA与WT和突变AtPIN3结合的值。gydF4y2BadgydF4y2Ba，不同pH条件下WT AtPIN3与IAA相互作用的SPR结合曲线。gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BaKgydF4y2BaDgydF4y2Ba不同pH条件下WT AtPIN3和IAA的曲线符合稳态亲和模型。gydF4y2Ba
图9 AtPIN3和SLC9A转运蛋白以向内构象二聚体组装。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， AtPIN3突变残基的定位gydF4y2Ba7月gydF4y2Ba．gydF4y2BabgydF4y2Ba而且gydF4y2BacgydF4y2Ba，支架结构域二聚体界面突变的AtPIN3的尺寸排除色谱。gydF4y2BadgydF4y2Ba， WT的原生PAGE和两个四倍突变体。N = 3个独立实验。gydF4y2BaegydF4y2Ba,gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba在IAA加载期10 min, WT和突变体AtPIN3 H-IAA外排(n = 6个独立实验)。资料以均数±s.e.m.双尾表示gydF4y2BatgydF4y2Ba执行-test。gydF4y2BafgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba我gydF4y2Ba， AtPIN3的二聚结构gydF4y2Ba7月gydF4y2Ba（gydF4y2BafgydF4y2Ba)， HsNHE1 (gydF4y2BaggydF4y2Ba， PDB: 7DSW)， TtNapA (gydF4y2BahgydF4y2Ba， PDB: 5BZ2)， MjNhaP (gydF4y2Ba我gydF4y2Ba， PDB: 4CZB)细胞外视图(左)，侧视图(中)，切口表面模型(右)。箭头所示为AtPIN3面向细胞内和面向细胞外的空腔。gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充图1gydF4y2Ba
Uncropped图像。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，扩展数据的未裁剪印迹图2c。gydF4y2BabgydF4y2Ba，扩展数据的未裁剪凝胶图3a,f,k。gydF4y2BacgydF4y2Ba，用于扩展数据的未裁剪凝胶图9d。gydF4y2Ba
权利和权限gydF4y2Ba
根据与作者或其他权利持有人签订的出版协议，《自然》杂志或其许可方对本文拥有独家权利;作者对这篇文章接受的手稿版本的自我存档仅受此类出版协议的条款和适用法律的约束。gydF4y2Ba
关于本文gydF4y2Ba
引用本文gydF4y2Ba
苏，N，朱，A，陶，X。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba的结构和机制gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba生长素转运蛋白PIN3。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba609gydF4y2Ba， 616-621(2022)。https://doi.org/10.1038/s41586-022-05142-wgydF4y2Ba
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DOIgydF4y2Ba：gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/s41586-022-05142-wgydF4y2Ba
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n -1-萘酞酸的分子机制，植物生物学和农业的化学工具gydF4y2Ba
分子园艺gydF4y2Ba(2022)gydF4y2Ba
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