PD-1gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba从茎状的CD8 IL-2R激动更好效应器gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞gydF4y2Ba

我们之前的研究表明,白介素2 (IL)治疗与anti-PD-L1加强治疗提高淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒特殊CD8淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在慢性感染T细胞,提高病毒控制gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba。然而,有人担心使用2增强免疫反应,包括对肺内皮细胞和CD4的活动gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD25gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba调节性T (TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}通过绑定CD25)细胞,导致血管渗漏综合征包括肺部水肿和T的优惠扩张gydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞,分别。为了克服这些限制,一个新阶层的β2受体,γ-chain (IL-2Rβγ)偏见受体激动剂是目前正在开发,另外有些针对细胞表面蛋白的过表达在肿瘤或周围基质增强当地肿瘤保留,比如CEA-IL2vgydF4y2Ba^8gydF4y2Ba和FAP-IL2vgydF4y2Ba^{12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

因此我们比较了小鼠的治疗效果FAP-IL2wt (muFAP-IL2wt),使用完整的CD25绑定,和鼠标FAP-IL2v (muFAP-IL2v)结合鼠标anti-PD-L1 (muPD-L1)治疗在慢性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒感染(扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。我们发现muFAP-IL2wt疗法与muPD-L1疗法增强LCMV-specific CD8主体性gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞反应的DbGP33的扩张gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和DbGP276gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba1 b, cgydF4y2Ba)。相反,muPD-L1结合muFAP-IL2v并不优于muPD-L1单方增加LCMV-specific CD8的数量gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba1 b, cgydF4y2Ba)。除了其量化优势muPD-L1单一疗法,muPD-L1结合muFAP-IL2wt改变LCMV-specific CD8上的各种表型标记的表达gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)。muPD-L1和muFAP-IL2wt联合治疗CD127的表达水平升高,CD218a和CXCR3 LCMV-specific CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞,所有的功能效应和CD8记忆的关键分子gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在急性感染T细胞分化。相比之下,表达抑制性受体TIM-3 LCMV-specific CD8降低gydF4y2Ba^+gydF4y2BamuPD-L1和muFAP-IL2wt联合治疗后T细胞。这些表型的变化通过添加muFAP-IL2wt muPD-L1治疗缺席当muPD-L1结合muFAP-IL2v(扩展数据图。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)。扩大LCMV-specific CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞后得到muPD-L1和muFAP-IL2wt治疗也更功能效应的细胞因子的生产比获得muPD-L1单一疗法针对抗原刺激,而muFAP-IL2v政府没有添加剂影响muPD-L1疗法(扩展数据图。gydF4y2Ba1 e, fgydF4y2Ba)。值得注意的是,最有效的病毒控制观察当muPD-L1结合muFAP-IL2wt疗法。相比之下,muFAP-IL2v治疗没有显示协同muPD-L1治疗减少病毒(扩展数据图。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

重要的是要注意muFAP-IL2v体内生物活性,如muPD-L1结合muFAP-IL2v总CD8的数量显著增加gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞相比,在结合muFAP-IL2wt muPD-L1作为单一疗法或慢性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒感染(扩展数据图。gydF4y2Ba2 a - cgydF4y2Ba)。然而,当我们描述CD8的增加数量gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞,我们发现组合的muPD-L1 muFAP-IL2v主要扩大non-LCMV-specific PD-1gydF4y2Ba^{- - - - - -gydF4y2Ba}CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞在慢性感染(扩展数据图。gydF4y2Ba2 d, egydF4y2Ba)。这是muPD-L1和muFAP-IL2wt组合形成鲜明对比,这优先PD-1扩大gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba包括LCMV-specific CD8 T细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba2 d, egydF4y2Ba)。non-LCMV-specific CD8的扩张gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞通过muPD-L1和muFAP-IL2v联合治疗隐含要求目标交付IL-2v PD-1-expressing LCMV-specific CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞来达到理想的生物的结果。gydF4y2Ba

PD-1表示长期激活表面抗原T细胞,包括病毒——tumour-reactive T细胞,是一种善意的标志来识别抗原T细胞gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba}。我们设计了PD1-IL2v提供IL-2R激动PD-1优先gydF4y2Ba^+gydF4y2Batumour-reactive T细胞通过绑定和阻塞PD-1抑制性通路而痛苦IL-2R信号在相同的细胞。测量PD1-IL2v的效力与FAP-IL2v,这里使用IL-2v不是针对T细胞,我们简要孵化vitro-activated PD-1-expressing多克隆人类的CD4细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞与越来越多的PD1-IL2v或FAP-IL2v之前测量IL-2R信号通过磷酸化水平STAT5 (STAT5-P)。在这个试验,PD1-IL2v被发现约40倍更有效比FAP-IL2v交付IL-2R PD-1激动gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。验证PD-1针对介导观察到这两个化合物之间的能力差异,我们包括一组激活T细胞pre-incubated过量的父母PD-1-blocking抗体与PD1-IL2v PD-1绑定。PD-1-mediated针对预防时,PD1-IL2v成为可比的效力的FAP-IL2v(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

评估是否交付PD1-IL2v IL-2v IL-2Rβγ在同一PD-1-expressing T细胞,我们开发了一个“gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba与gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba人类CD4的化验,vitro-activated多克隆gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞,与同质PD-1表达,分为两组,并贴上两个不同的膜染料:carboxyfluorescein succinimidyl酯(CFSE)和CellTrace紫(CTV)。CFSE-labelled T细胞被进一步分为两组,其中一个是与父母anti-PD-1抗体pre-incubated饱和浓度PD-1培养gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞和CTV贴上标签。有趣的是,接触PD1-IL2v后,STAT5-P的频率gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞在T细胞只有大约25% preblocked PD-1,尽管他们在靠近无堵塞PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞,几乎所有STAT5-PgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。因此,PD1-IL2v交付IL-2R激动gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba在相同的T细胞后绑定到PD-1受体而不是gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba邻近的细胞。综上所述,这些数据表明,优先gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba针对PD-1 PD1-IL2v导致增强的力量gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞。gydF4y2Ba

TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}T细胞的细胞是一个关键的子集能够渗透到肿瘤微环境并创建一个免疫抑制环境限制了抗肿瘤免疫反应gydF4y2Ba^{17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba}。此外,TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞代表一个关键免疫疗法基于责任- 2,因为他们既定的CD25表达高,导致其有害的增殖和抑制的功能gydF4y2Ba^{19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba}。出于这个原因,我们进行了绑定竞争分析中等量的天然TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞(CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD25gydF4y2Ba^+gydF4y2BaFOXP3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)和常规CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT (T)gydF4y2Ba_{convgydF4y2Ba})细胞,从人类外周血,被贴上了不同膜染料和一起培养。随后,被激活的细胞在体外对3 d之前接触的非饱和浓度直接贴上PD1-IL2v或父母anti-PD-1抗体。PD1-IL2v,同样anti-PD-1抗体,优先绑定到TgydF4y2Ba_{convgydF4y2Ba}而不是TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞(图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)。同意这一发现,我们观察到一个大约twofold-higher PD-1受体在T / T细胞的数量gydF4y2Ba_{convgydF4y2Ba}细胞比TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞(图。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

在TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}抑制试验,抑制T的能力来衡量gydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞抑制TgydF4y2Ba_{convgydF4y2Ba}效应等功能granzyme B分泌,PD1-IL2v T的优惠绑定gydF4y2Ba_{convgydF4y2Ba}允许他们克服T细胞gydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}以剂量依赖性的方式介导的抑制。控制,我们用另一种PD1-IL2v分子,称为“非阻塞PD1-IL2v”,组成anti-PD-1一半non-PD-L1 / PD-L2-blocking函数,简单地提供IL-2v PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞,以及父母的结合与FAP-IL2v阻塞anti-PD-1抗体,阻止PD-1通路没有PD-1-mediated交付IL-2v PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞。浓度为630点,PD1-IL2v克服了TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}介导的抑制,和更高的浓度进一步引起效应T的函数gydF4y2Ba_{convgydF4y2Ba}细胞,无论T的存在gydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞(图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)。非阻塞PD1-IL2v和父母anti-PD-1抗体的结合与FAP-IL2v只取得了类似的效果比PD1-IL2v tenfold-higher浓度,表明封锁PD-1信号和PD-1-mediated交付IL-2v PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞是至关重要的方面的PD1-IL2v的作用机制。gydF4y2Ba

鉴于此,绑定到- 2后,T细胞内化IL-2R几分钟gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba,我们评估了荧光标记PD1-IL2v的内化和FAP-IL2v作为控制使用vitro-activated PD-1-expressing多克隆人类的CD4细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞。此外,我们跟踪的命运同时绑定PD-1受体使用荧光标记,其间anti-PD-1抗体。我们观察到,虽然FAP-IL2v内化在1 h在37°C(扩展数据图。gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba),PD1-IL2v内化与慢动力学(扩展数据图。gydF4y2Ba3 a, cgydF4y2Ba)。有趣的是,慢PD1-IL2v内化伴随着同时绑定的内化PD-1受体(扩展数据图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)。预处理的PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞与竞争anti-PD-1抗体预防绑定PD1-IL2v PD-1,因此诱导PD1-IL2v内化通过IL-2R利率FAP-IL2v引起的类似,而离开PD-1 T细胞表面的受体(扩展数据图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)。预处理与anti-PD-1抗体并不影响FAP-IL2v内化或表面的表达PD-1受体(扩展数据图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

这些数据表明一个意想不到的额外PD1-IL2v的作用机制在细胞水平上,长期互动的IL-2v IL-2R可能导致连续信号随后内化和删除绑定PD-1 T细胞表面的受体。gydF4y2Ba

已被证明- 2诱导的分泌由T细胞集落刺激因子(gm - csf)gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba树突状细胞激活和成熟,这是重要的,除了增强T细胞的细胞毒性效应的功能gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba。出于这个原因,我们测试是否PD1-IL2v也可能引起gm - csf分泌,除了granzyme B,从PD-1-expressing多克隆人类的CD4细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞在体外激活5 d。正如预期的那样,PD1-IL2v诱导激活T细胞gm - csf和granzyme B分泌的时尚和存在剂量依赖的相关性比非针对性FAP-IL2v大约30倍更强,而独自PD-1封锁并没有引起任何显著变化效应的功能。有趣的是,PD1-IL2v是强有力的野生型与完整的CD25绑定- 2 (aldesleukin)诱发T细胞效应的功能,符合PD-1-mediated的假设gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba交付IL-2v充当CD25的代理gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba绑定在T细胞表面(图。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

工程- 2系统性治疗另一种方法是增加其亲和力IL-2Rβ,降低信号依赖的目的gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba通过CD25锚定。这样的设计被称为“superkine”(ref - 2。gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba)。这是一个不同的方法与目标细胞因子特异性免疫细胞等免疫受体靶向抗体融合在PD1-IL2v或其他最近报道融合蛋白gydF4y2Ba^{25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}。因此,我们制作了一个FAP-IL2 superkine模拟相比增加了IL-2Rβ亲和力和PD1-IL2v效力和gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba针对在gydF4y2Ba顺反gydF4y2Ba在激活T细胞STAT5-P化验。作为对照,我们使用FAP-IL2v IL-2Rβγ结合的亲和力与野生型没有IL-2Rα- 2。我们观察到FAP-IL2 superkine模拟是十倍更有效比FAP-IL2v交付IL-2R激动T细胞。然而,FAP-IL2 superkine模拟和FAP-IL2v PD-1活跃gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞PD-1gydF4y2Ba^−gydF4y2BaT细胞,无论PD-1表达式(扩展数据图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)。相反,PD1-IL2v PD-1约40倍更有效gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba比在PD-1 T细胞gydF4y2Ba^−gydF4y2BaT细胞,PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞PD1-IL2v是五倍更有效比FAP-IL2 superkine模拟(扩展数据图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

然后我们扩展我们的观察生理状态下,通过公开外周血单核细胞(PBMCs)健康的捐赠者PD1-IL2v非饱和浓度(630点),FAP-IL2 superkine模拟或FAP-IL2v 30分钟之前和藻红蛋白染色(PE)共轭anti-PGLALA抗体检测抗体的绑定分子和面板的表型特征T细胞通过流式细胞术子集。PD-1 PD1-IL2v显著绑定gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTCF-1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba茎状的CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞和PD1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTCF-1gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba与天真的CD8 T细胞相比gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞,gydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞和自然杀伤(NK)细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)。相比之下,FAP-IL2 superkine模拟和FAP-IL2v PD-1适度gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTCF-1gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞,没有绑定到PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTCF-1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba茎状的CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞,可能因为他们的IL-2Rβ表达水平较低。此外,FAP-IL2 superkine模拟是唯一融合蛋白强烈结合NK细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

这一发现表明突变的一个基本目标交付功能区别2缺乏PD-1 antigen-experienced细胞CD25绑定gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba就工程- 2增加亲和力的受体细胞。前者方法提供了选择性增加IL-2R激动在特定的T细胞的数量,而后者增加信号的能力在许多细胞无论其抗原经验和只是由由整体IL-2R淋巴细胞的表达谱。gydF4y2Ba

考虑到有效的gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba交付IL-2v PD1-IL2v体外PD-1-expressing T细胞,我们怀疑muPD1-IL2v(扩展数据图。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)可以有效地交付IL-2v LCMV-specific CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在慢性感染T细胞体内。值得注意的是,PD-1 LCMV-specific CD8表达最高gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞与其他T细胞数量在慢性感染(扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。我们比较muPD-L1的治疗效果,在结合muFAP-IL2v muPD-L1, muPD-L1结合muPD1-IL2v在慢性感染和LCMV-specific CD8进行定量和定性分析gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)。正如前面所示,muFAP-IL2v疗法没有添加剂效果相比muPD-L1疗法增强LCMV-specific CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞反应(扩展数据图。gydF4y2Ba5汉英gydF4y2Ba)。有趣的是,组合的muPD-L1 muPD1-IL2v明显优于muPD-L1单方增加LCMV-specific CD8的数量gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞在所有组织分析(扩展数据图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)。此外,muPD-L1结合muPD1-IL2v诱导LCMV-specific CD8的质的变化gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞,以多官能的签名(IFN-γgydF4y2Ba^+gydF4y2BaTNF-αgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和IFN-γgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba- 2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)(扩展数据图。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba),改变了表达谱的几个表型标记,如TIM-3 CD127, CD218a和CXCR3(扩展数据图。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

获得进一步洞察LCMV-specific CD8的定性属性gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞muPD-L1和muPD1-IL2v联合治疗后,我们进行了转录分析LCMV-specific CD8的RNA序列(RNA-seq)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba治疗后T细胞。主成分分析(PCA)表明,转录LCMV-specific CD8的签名gydF4y2Ba^+gydF4y2BamuPD-L1单药治疗后T细胞非常相似的治疗组(扩展数据图。gydF4y2Ba5克gydF4y2Ba)。值得注意的是,增加muPD1-IL2v muPD-L1疗法改变了转录LCMV-specific CD8的签名gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞,这表明与生成muPD1-IL2v LCMV-specific muPD-L1 CD8的组合gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞是不同于那些未经处理或muPD-L1治疗方法组(扩展数据图。gydF4y2Ba5克gydF4y2Ba)。整个治疗组差异表达基因的热图强调muPD1-IL2v疗法的治疗可能产生的调制LCMV-specific CD8的分化状态gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞在慢性感染(扩展数据图。gydF4y2Ba5 hgydF4y2Ba)。例如,muPD-L1结合muPD1-IL2v表达水平的升高gydF4y2BaCd28gydF4y2Ba,一个重要co-stimulatory分子CD8的改善gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞反应anti-PD-1疗法gydF4y2Ba^{27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}。包括调节细胞因子受体gydF4y2BaIl2ragydF4y2Ba,gydF4y2BaIl7rgydF4y2Ba,gydF4y2BaIl18r1gydF4y2Ba,gydF4y2BaIfngr1gydF4y2Ba和gydF4y2BaIl18rapgydF4y2Ba,这表明LCMV-specific CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞由muPD-L1和muPD1-IL2v联合治疗更敏感炎性细胞因子(2、地震和interferon-γ(IFNγ))和自我平衡的细胞因子IL-7,后者是一种重要的细胞因子为生存和维护的天真和CD8记忆gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞gydF4y2Ba^{29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba}。muPD-L1 muPD1-IL2v疗法也增加了大量的分子调节T细胞迁移(gydF4y2BaCcr2gydF4y2Ba,gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba和gydF4y2BaCxcr3gydF4y2Ba)gydF4y2Ba^{31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba}粘连(gydF4y2BaLy6c2gydF4y2Ba和gydF4y2BaCd44gydF4y2Ba从淋巴组织)和出口(gydF4y2BaS1pr1gydF4y2Ba和gydF4y2BaKlf2gydF4y2Ba)gydF4y2Ba^{35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}。所有的这些功能组件的功能效应CD8至关重要gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞对各种co-stimulatory信号,细胞因子和趋化因子,其次是他们的迁移主要感染的网站发挥效应的功能。的确,gydF4y2BaTbx21gydF4y2Ba,一个关键的转录因子效应CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞分化gydF4y2Ba^{37gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba}也通过合并施打muPD-L1和muPD1-IL2v调节。相反,由muPD-L1和muPD1-IL2v疗法包括基因表达下调gydF4y2Ba托克斯gydF4y2Ba和gydF4y2BaPdcd1gydF4y2Ba,这是两个T细胞衰竭的主要监管机构gydF4y2Ba^{39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba}。其他的抑制性受体(gydF4y2BaLag3gydF4y2Ba,gydF4y2BaCd244agydF4y2Ba和gydF4y2BaHavcr2gydF4y2Ba)和转录因子(gydF4y2BaTox2gydF4y2Ba,gydF4y2BaNr4a2gydF4y2Ba,gydF4y2BaNr4a1gydF4y2Ba,gydF4y2BaPrdm1gydF4y2Ba和gydF4y2BaEgr2gydF4y2Ba与疲惫CD8)相关gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞gydF4y2Ba^{39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba}也表达下调muPD-L1和muPD1-IL2v联合治疗(扩展数据图。gydF4y2Ba5 hgydF4y2Ba)。总的来说,LCMV-specific CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba所产生的T细胞结合muPD-L1和muPD1-IL2v拥有增加分子的表达功能的关键效应细胞和减少主要的转录因子和抑制受体的表达与疲惫的CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞与抗原CD8的感应gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞状态更好的潜在效应和倾斜远离T细胞的疲劳。最值得注意的是,这些定量和定性LCMV-specific CD8的变化gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞通过co-treatment muPD-L1和muPD1-IL2v与改良生物的结果,和muPD-L1 muPD1-IL2v治疗导致最好的病毒控制整个治疗组(扩展数据图。gydF4y2Ba5我gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

有趣的是,muPD1-IL2v单方足以引起LCMV-specific CD8的扩张gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞在不同器官(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。然而,结合muPD-L1更有效地增加的数量多官能的LCMV-specific CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞和印迹明显表型和转录变化引起muPD1-IL2v疗法(图。gydF4y2Ba两个罪犯gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba),导致病毒控制相比,显著提高muPD1-IL2v单一疗法(无花果。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

最后,我们评估了响应LCMV-specific CD8的il - 12和地震gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞生成muPD-L1和muPD1-IL2v co-treatment和各自的单一药物疗法。从vivo-treated小鼠短暂刺激脾细胞与细胞因子在体外测量IFNγ分泌的DgydF4y2Ba^bgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)。有趣的是,LCMV-specific CD8之一gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞从老鼠muPD1-IL2v处理单一疗法或muPD1-IL2结合muPD-L1, T细胞受体表达的一个子集的地震后迅速分泌IFNγ接触il - 12和地震(扩展数据图。gydF4y2Ba6 d, egydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

这些结果说明目标交付IL-2v PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞通过muPD1-IL2v疗法非常有效地提高LCMV-specific CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞反应的转录签名更好的效应器。此外,结合muPD1-IL2v muPD-L1进一步改善一些效应属性,如多官能度与muPD1-IL2v单药治疗相比,在病毒特别有效控制慢性感染模型。gydF4y2Ba

在慢性感染,PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaLCMV-specific CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞是一个异质的细胞群与不同的生物特性,和干细胞(TIM-3gydF4y2Ba^−gydF4y2BaTCF-1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)和终末分化(疲惫;TIM-3gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTCF-1gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba)子集是两个主要组件gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba}。茎状的CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞作为资源细胞保持LCMV-specific CD8的池gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞的自我更新以及通过提供终末分化CD8(疲惫)gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞周围组织的感染的主要网站。它也提供增殖的PD-1茎状的子集gydF4y2Ba^+gydF4y2BaLCMV-specific CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在anti-PD-L1治疗慢性感染T细胞gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

阐明,CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞由muPD1-IL2v目标子集,我们执行过继转移实验。两个PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞的子集,干细胞(PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCXCR5gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTIM-3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba)和终末分化(疲惫;PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCXCR5gydF4y2Ba^−gydF4y2BaTIM-3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba),排序合并脾细胞的长期(CD45.2 LCMV-infected老鼠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba每个CD8),gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞是转移到infection-matched老鼠(CD45.1子集gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba),其次是muPD1-IL2v疗法。治疗2周后,congenically CD45.2标记gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba供者细胞在受体CD45.1检查gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba老鼠(图。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)。值得注意的是,我们发现,增生性破裂只来自干细胞CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BamuPD1-IL2v治疗后T细胞子集,而精疲力竭的CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞子集不扩大在多个组织(无花果。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6 fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

两周在未经处理的受体小鼠转移后,干细胞捐赠CD45.2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞保持TIM-3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba人口,但他们也转换为TIM-3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞,来显示他们的自我更新和分化潜能(无花果。gydF4y2Ba2 hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6克gydF4y2Ba)。这两个TIM-3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba和TIM-3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba隔间表示最低级别的CD218a,表明在慢性感染茎状的T细胞经历了传统传输从干细胞分化途径终末分化CD8(疲惫)gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(图gydF4y2Ba2 hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6克gydF4y2Ba)。相比之下,muPD1-IL2v疗法改变了这种分化过程和转移茎状的T细胞进行了最优效应分化,由标志着upregulation CD218a TIM-3中间表达较低的(无花果。gydF4y2Ba2 hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6克gydF4y2Ba)。这些结果共同表明作用于干细胞CD8 muPD1-IL2v治疗gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞,增强扩散效应差异。gydF4y2Ba

然后我们评估muPD1-IL2v在C57BL / 6小鼠体内功效研究植入orthotopically Panc02-H7-Fluc同源的胰腺癌细胞系。老鼠每周治疗4周muPD1-IL2v(0.5和1毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba),muPD-1抗体(10毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba),muFAP-IL2v(2.5毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)或组合。muPD1-IL2v根除肿瘤在治疗动物和提供长期生存利益的四个七,七7小鼠治疗剂量的0.5和1毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba分别(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。只有一个鼠标集团对待父母muPD-1抗体结合muFAP-IL2v幸存下来,直到实验结束。所有老鼠vehicle-treated对照组和那些接受muPD-1抗体或muFAP-IL2v作为单一疗法去世在100 d(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

免疫组织化学分析PD-1和granzyme B的表达肿瘤获得小鼠在不同治疗显示,muPD1-IL2v诱导显著高于PD-1的数量gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)和granzyme BgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)tumour-infiltrating淋巴细胞(尖)比其他的治疗方法。gydF4y2Ba

为了更好地描述的表型和功能产生的尖muPD1-IL2v治疗,Panc02-H7-Fluc肿瘤细胞植入皮下注射在同基因的老鼠。一旦达到肿瘤大小为200毫米gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba},老鼠接受muPD1-IL2v muFAP-IL2v muPD-1,使用上面的剂量,每周2周和监控肿瘤生长。治疗muPD1-IL2v导致控制肿瘤生长,导致三6小鼠肿瘤根除,而其他治疗未能这样做,既是单方和结合(无花果。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)。尖的表型特征在不同治疗组显示CD8的重要和优先~ 20倍扩张gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba小鼠T细胞在肿瘤治疗muPD1-IL2v,相比之下,控制和其他治疗组(无花果。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba)。值得注意的是,相比之下,CD8的比率gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba对CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞在血液~ 7 - 8倍增加,可比老鼠收到muPD1-IL2v或者muFAP-IL2v,后者作为单一疗法或结合muPD-1抗体(图。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba)。这个观察是一致的概念尖PD-1表情高于外周血T细胞。gydF4y2Ba

CD8的进一步描述gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖在不同治疗组的分化阶段差异突出显示。虽然anti-PD-1疗法丰富终末分化尖,muPD1-IL2v生成和扩展效应内存尖(无花果。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)。相反,muFAP-IL2v扩大天真尖,其结合muPD-1保留两分子的特性通过丰富天真和终末分化尖。CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖诱导muPD1-IL2v是多重的,发生的水平明显高于granzyme B, IFNγ和肿瘤坏死factor-α比CD8 (TNFα)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖孤立从其他治疗组小鼠(扩展数据图。gydF4y2Ba7 a、bgydF4y2Ba)。在血液,muPD1-IL2v治疗的效果相当的muFAP-IL2v(无花果。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba),强调的重要性更高PD-1表达式,如尖和外周血T细胞,在muFAP-IL2v muPD1-IL2v的分化影响治疗。gydF4y2Ba

验证CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞是至关重要的功效与muPD1-IL2v疗法,我们CD8耗尽gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞1周之前管理muPD1-IL2v或muFAP-IL2v和监控CD8的数量gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba血液中的T细胞。CD8的影响gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞耗竭muFAP-IL2v-treated组没有明显的由于缺乏有效性的muFAP-IL2v肿瘤模型(扩展数据图。gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba)。然而,CD8的损耗gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞阻止muPD1-IL2v实现肿瘤生长抑制与muPD1-IL2v-treated相比老鼠不是CD8的枯竭gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba7 c, dgydF4y2Ba),证明CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞确实是需要muPD1-IL2v疗法下的疗效观察。gydF4y2Ba

为了更好地理解PD1-IL2v的肿瘤趋向性,我们孤立的白细胞从人类PD-1-transgenic老鼠轴承皮下的血液和肿瘤Panc02-H7-Fluc肿瘤。体外,然后测量频率的T细胞表达PD-1 IL-2Rβ和量化这些细胞的数量每T细胞受体。而T细胞表达的频率PD-1表面相对比较外周血和肿瘤(扩展数据图。gydF4y2Ba7 e, fgydF4y2Ba),我们发现在肿瘤效应记忆CD8人口gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞表达更高水平的PD-1,大约15000 PD-1受体/ T细胞(图。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)。有趣的是,在血液,相应的T细胞表达~ 700 PD-1子集每T细胞受体,类似于其他包括效应CD4记忆T细胞子集gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞和TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞(图。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)。相比之下,IL-2RβgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba频率和受体数量/ T细胞在肿瘤和外周血,类似与更多的受体表面的中部和效应器CD8记忆gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞在两个隔间(扩展数据图。gydF4y2Ba7 g hgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

然后我们对待人类PD-1-transgenic老鼠皮下植入Panc02-H7-Fluc肿瘤,要么0.5毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba反PD-1抗体PD1-IL2v,包括粘合剂IL-2v融合,或高剂量(aldesleukin) - 2单代理或结合pembrolizumab。通过实验的最后7 12(58%)接受PD1-IL2v小鼠肿瘤小于100毫米gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba}12,而11有一个肿瘤小于500毫米gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba}。相比之下,只有一个七老鼠(14%)接受大剂量aldesleukin结合10毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Bapembrolizumab肿瘤直径小于100毫米gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba}(无花果。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba)。虽然PD-1-binding域与pembrolizumab PD1-IL2v争夺PD-1绑定,组合的PD1-IL2v pembrolizumab没有损害PD1-IL2v功效。这可以解释为PD1-IL2v的优越功能关联,结果从一个大约4倍单价PD-1亲和力和同时绑定gydF4y2Ba独联体gydF4y2BaIL-2R,允许PD1-IL2v取代pembrolizumab即使在饱和浓度的后者(扩展数据图。gydF4y2Ba7我gydF4y2Ba)。符合这一点,结合PD1-IL2v pembrolizumab没有提供任何额外的好处PD1-IL2v单药治疗相比,8 12治疗动物(66%)有一个肿瘤小于100毫米gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba}在实验终止(无花果。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba)。这些数据证实PD1-IL2v作为单一疗法更有效的结合与高剂量aldesleukin pembrolizumab, PD1-IL2v不需要额外PD-1封锁,以增加其疗效在这个肿瘤模型测试剂量,CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖更PD-1表达约20倍每比CD8 T细胞受体gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba血液中的T细胞,支持PD1-IL2v tumour-preferential效应的基本原理。gydF4y2Ba

Immuno-pharmacodynamic分析皮下Panc02-H7-Fluc同系的小鼠肿瘤显示CD8的进步和大规模扩张gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞的肿瘤内动物接受muPD1-IL2v和CD8有益gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞/ TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}比后两个单剂量muPD1-IL2v(无花果。gydF4y2Ba4 a、bgydF4y2Ba)。这个观察是一致的目标和活动优惠的体外研究结果PD1-IL2v效应T细胞,而不是TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞。gydF4y2Ba

PD-1和TCF-1表达式的基础上,据桥本等。gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba和以前的出版物gydF4y2Ba^{1克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba},我们发现antigen-experienced PD-1茎状的T细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTCF-1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba而他们的后代被确认为PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTCF-1gydF4y2Ba^{低gydF4y2Ba/gydF4y2Ba−gydF4y2Ba}(无花果。gydF4y2Ba四氟gydF4y2Ba)。然后我们进一步识别功能和更成熟的PD-1的疲劳程度gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞的表达水平的基础上granzyme B和TIM-3(无花果。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)。有趣的是,muPD1-IL2v开车茎状的CD8的扩张gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖(无花果。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)和显著增加的频率granzyme BgydF4y2Ba^+gydF4y2BaTIM-3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba人口在PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTCF-1gydF4y2Ba^{低/−gydF4y2Ba}CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖(无花果。gydF4y2Ba4 d, egydF4y2Ba),这里叫“更好的效应物”,强调其高度功能效应和低程度的疲惫。相反,muPD-1单一疗法和结合muPD-1 muFAP-IL2v显著增加的频率granzyme BgydF4y2Ba^−gydF4y2BaTIM-3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞内PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTCF-1gydF4y2Ba^{低/−gydF4y2Ba}CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖(无花果。gydF4y2Ba4 d, fgydF4y2Ba),显示低功能和更高程度的疲惫。gydF4y2Ba

单细胞RNA-seq CD8的条码(scRNA-seq)和特性gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖获得相同的体内实验显示一个独特的基因表达签名后管理muPD1-IL2v与muPD-1作为单一疗法,结合muFAP-IL2v(无花果。gydF4y2Ba4 g hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8个模拟gydF4y2Ba)。muPD1-IL2v开一个新的CD8的浓缩gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞群更好的效应器(集群3、4、12、14、16、17),在其他治疗组缺失或不足(无花果。gydF4y2Ba4 g hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8个模拟gydF4y2Ba)。muPD-1疗法,muPD-1结合muFAP-IL2v更是如此,开车的扩张终末分化/疲惫尖(集群1和11)(图gydF4y2Ba4 g hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8个模拟gydF4y2Ba)。类似研究结果为慢性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒设置之前报道,我们发现muPD1-IL2v人口更好的效应物基因表达的诱导受体对促炎细胞因子,如gydF4y2BaIl2rggydF4y2Ba,gydF4y2BaIl18r1gydF4y2Ba,gydF4y2BaIl18rapgydF4y2Ba和gydF4y2BaIfngrgydF4y2Ba,以及稳态扩散和记忆形成,包括gydF4y2BaIl7rgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4 i, jgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8 dgydF4y2Ba)。此外,这个CD8人口gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖也表达了高水平的成绩单gydF4y2BaPdcd1gydF4y2Ba(PD-1)和中级水平gydF4y2BaLag3gydF4y2Ba而低水平的表达gydF4y2BaHavcr2gydF4y2Ba(TIM-3),gydF4y2BaTigitgydF4y2Ba和gydF4y2Ba托克斯gydF4y2Ba,符合non-exhausted概要(无花果。gydF4y2Ba4 i, jgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8 dgydF4y2Ba)。表达的存在gydF4y2BaIfitm1gydF4y2Ba和gydF4y2BaTbx21gydF4y2Ba与多官能的效应的签名gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba和gydF4y2BaIfnggydF4y2Ba,以及细胞毒性效应的签名gydF4y2BaGzmgydF4y2Ba基因家族和gydF4y2BaLamp1gydF4y2Ba,支持发现muPD1-IL2v能够促进耐用,生产和保护性免疫记忆。相反,终末分化CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖(集群1和11)生成与muPD-1作为单药治疗或治疗后结合muFAP-IL2v,高水平的表达gydF4y2BaHavcr2gydF4y2Ba,gydF4y2BaLag3gydF4y2Ba,gydF4y2BaTigitgydF4y2Ba,gydF4y2Ba托克斯gydF4y2Ba和gydF4y2BaIl10gydF4y2Ba典型的疲惫的T细胞gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4 i, jgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8 dgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

这些差异都是定性和定量,通过更好的效应器的更高频率响应muPD1-IL2v治疗,与疲惫CD8明显更高的频率gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba仅靠muPD-1尖了,结合muFAP-IL2v(无花果。gydF4y2Ba4 kgydF4y2Ba)。CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖由muPD1-IL2v拥有得分显著高于茎状和迁移签名,表明他们保留一些转录茎状的PD-1的特征gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTCF-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖(无花果。gydF4y2Ba4 kgydF4y2Ba)。相比之下,immune-checkpoint和疲惫的签名在CD8分数更高gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖产生的组合治疗muPD-1和muFAP-IL2v(无花果。gydF4y2Ba4 kgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

单细胞TCR-seq显示更好的效应器,生成muPD1-IL2v治疗后,精疲力竭的T细胞,治疗后出现muPD-1作为单一疗法或结合muFAP-IL2v CD8由无性繁殖系地扩大gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖(无花果。gydF4y2Ba4 jgydF4y2Ba),一个善意的指标肿瘤特异性和高效的免疫反应gydF4y2Ba^{48gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba}。然后,我们评估了克隆干细胞中CD8的总数gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖及其后代的效应细胞不同的治疗组,不管他们的功能表型。muPD1-IL2v-treated组中,我们发现大量的克隆在效应细胞克隆(768),97年与茎状的CD8共享gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖(扩展数据图。gydF4y2Ba8 egydF4y2Ba,最高)。我们还观察到最多的细胞高度(> 10)扩大muPD1-IL2v治疗所产生的效应细胞克隆,对应于一个超过两方面的差异与muPD-1作为单一疗法或结合muFAP-IL2v(扩展数据图。gydF4y2Ba8 egydF4y2Ba、中)。此外,muPD1-IL2v-treated组分数最高的克隆效应后代和茎状的CD8之间共享gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖(46.4%)相比,muPD-1作为单一疗法(17.1%)或结合muFAP-IL2v (22.1%)。共享46.4%的克隆,16.4%是高度clonotypes扩张,而不是只有5.9%和8.1%的共享克隆与muPD-1单一疗法,结合muFAP-IL2v,分别(扩展数据图。gydF4y2Ba8 egydF4y2Ba,底部)。gydF4y2Ba

这些结果综合起来表明作用于干细胞CD8 muPD1-IL2v治疗gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖,导致一个独特的CD8的扩张gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞群更好的效应器与转录签名包含生产和保护性免疫记忆的标志。此外,更好的效应CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖高重叠与茎状的CD8 clonotypesgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖,表明他们的发展路径,最多的克隆扩张,暗示他们的肿瘤特异性。gydF4y2Ba

然后我们评估muPD1-IL2v在C57BL / 6小鼠体内功效研究植入皮下的B16-F10-OVA同源的细胞系。老鼠每周治疗2周muPD1-IL2v(0.5毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)或muFAP-IL2v(1.5或3毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)作为单一疗法或结合muPD-1(10毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)。muPD1-IL2v提供更长时间的生存利益的50%治疗动物,在总数的20%和肿瘤根除老鼠(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。所有的老鼠接受muFAP-IL2v作为单一疗法或结合muPD-1幸存下来,直到实验结束或显示控制肿瘤生长(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9 b, cgydF4y2Ba)。muPD1-IL2v显著增加intratumoural CD8的总数gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(图gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba),但更值得注意的是,大大扩展了频率和总菌数的卵清蛋白(OVA)特殊CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖与muFAP-IL2v相比单一疗法或结合muPD-1(无花果。gydF4y2Ba5 c, dgydF4y2Ba,最高)。有趣的是,与muFAP-IL2v muPD-1的结合大大扩展了频率和总OVA-specific CD8计数gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba血液中的T细胞而不是肿瘤(图。gydF4y2Ba5 c, dgydF4y2Ba,底部)。gydF4y2Ba

除此之外,muPD1-IL2v大幅扩大intratumoural OVA-specific PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTCF-1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba茎状的T细胞相比其他疗法(无花果。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

PD-1的表型和功能特性gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTCF-1gydF4y2Ba^{低/−gydF4y2Ba}OVA-specific CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖表明muPD1-IL2v诱导频率的显著扩张granzyme BgydF4y2Ba^+gydF4y2BaTIM-3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba和granzyme BgydF4y2Ba^+gydF4y2BaTIM-3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba人口,而muFAP-IL2v及其结合muPD-1 granzyme B的频率增加gydF4y2Ba^−gydF4y2BaTIM-3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba人口(图。gydF4y2Ba5 f, ggydF4y2Ba)。TIM-3观察到的差异表达谱治疗后与muPD1-IL2v B16-F10-OVA小鼠模型和皮下Panc02-H7-Fluc小鼠模型可能反映了不同的两种类型的肿瘤的免疫原性和相对差异贪欲的T细胞受体(tcr)肿瘤抗原gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖隔绝老鼠muPD1-IL2v显示山的能力快速处理抗原特异效应响应当刺激之后谈恋爱5 h和一个卵子肽(无花果。gydF4y2Ba5 hgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

我们进一步探讨两个额外的鼠标模型响应对muPD1-IL2v: mca - 205肉瘤,PD-1封锁,这是部分敏感和自发RIP-Tag5胰腺神经内分泌肿瘤模型对anti-PD-1疗法。在mca - 205肿瘤模型中,muPD1-IL2v提供优于治疗小鼠的肿瘤生长抑制相比muPD-1和muFAP-IL2v作为单一疗法和结合(图gydF4y2Ba5我gydF4y2Ba)。同样,治疗RIP-Tag5小鼠muPD1-IL2v导致的生存利益而联合治疗增加muPD-1 +没有针对性muIL-2v(无花果。gydF4y2Ba5 jgydF4y2Ba)。感兴趣的,两个完整的救援人员从RIP-Tag5研究必须被杀死在研究过程中由于高血糖症的结果强有力的抗肿瘤muPD1-IL2v引发的免疫反应,显然导致瀑特异性自身免疫性。gydF4y2Ba

茎状,antigen-experienced PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTCF-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞或干细胞T细胞,已成为重要的决定因素的慢性感染和癌症的免疫反应,与肿瘤的大小池关键癌症免疫疗法的成功阻止PD-1或PD-L1(参考文献。gydF4y2Ba^{1克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba})。在本研究和与其相关的文章gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba,我们表明,PD-1抑制单独作用于干细胞T细胞扩大人口的暂时的效应细胞但最终导致精疲力竭的T细胞的积累。相比之下,添加2触发另一个从干细胞样细胞分化的路径高度增殖和细胞毒性CD8的不同子集gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞,或更好的效果器。我们发现绑定到non-signalling组件- 2受体的CD25、需要这个过程。然而,CD25绑定也可以导致系统性- 2治疗的副作用,与大剂量发生aldesleukin疗法,这导致了各种IL-2Rβγ-biased受体激动剂的发展与减少或废除CD25绑定,目前在临床试验中gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba51gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

解决系统性的挑战- 2治疗不丢失的有益特性- 2茎状的T细胞,我们替换绑定CD25通过瞄准PD-1阻塞,高亲和性anti-PD-1抗体融合CD25的变体- 2没有约束力。这使得增强的具体交付gydF4y2Ba独联体gydF4y2BaIL-2R激动到PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2Baantigen-experienced T细胞,如特异性和tumour-reactive T细胞。我们发现绑定gydF4y2Ba独联体gydF4y2BaPD1-IL2v PD-1和IL-2Rβγ在细胞表面相同的T细胞允许IL-2v茎状的CD8区分开来gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞在没有更好的效应器CD25绑定在慢性感染和癌症模型。gydF4y2Ba

在慢性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒感染模型中,我们表明,这些更好的效应器产生PD1-IL2v从茎状的T细胞转录效应CD8密切相似gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba篇文章中描述的T细胞gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba,生成与PD-1抑制和治疗后2,与正常CD25绑定。他们分享的特点效应器产生急性感染期间,有低水平的抑制性受体(例如,TIM-3)和转录因子与T细胞衰竭(例如,托克斯)和更高水平的IFNγ和- 2生产。更好的效果器也有更高水平的效应分子(例如,granzyme家庭成员)和炎症细胞因子受体(例如,IL-18R)。此外,编码基因的表达与记忆相关的因素(例如,IL-7R)和移民(例如,CXCR3)增强效应子集。这些高度增殖和细胞毒性CD8的扩张gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞有不同的转录概况与优越的抗病毒和抗肿瘤反应。相比之下,抗体阻断PD-1 PD-L1孤独,或结合临床相关的剂量- 2分子缺乏CD25绑定,不针对PD-1,无法扩大更好的感受器而引起疲惫的T细胞,导致劣质治疗功效。gydF4y2Ba

在过去的十年中,immune-checkpoint抑制剂针对PD-1-PD-L1通路已经彻底改变了肿瘤的几种类型的护理标准作用于茎状的T细胞和扩大肿瘤特异短暂的效应细胞。这里描述的研究提供一个基础的发展新一代的PD-1 -gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba针对IL-2Rβγ受体激动剂,优先目标抗原茎状的T细胞,但扩大与增强的另一种更好的人口效应细胞治疗的潜在治疗癌症和慢性感染。gydF4y2Ba

人类PBMC隔离gydF4y2Ba

健康志愿者的血样通过献血中心(瑞士苏黎世)州的伦理委员会批准(苏黎世)。PBMCs分离得到不同健康献血者的血液用密度梯度离心法histopaque - 1077(σ)。所有细胞培养在rpmi - 1640 (Gibco)补充10% heat-inactivated的边后卫(Gibco) GlutaMAX penicillin-streptomycin (Gibco)和1% (100×;Gibco)。gydF4y2Ba

人类和小鼠CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞的分离和体外激活gydF4y2Ba

人类CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba使用CD4 T细胞被排序gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba后选择Miltenyi珠系统制造商的指示。此后,细胞与CFSE标记(5μM,室温下5分钟;eBioscience)或CTV(5μM,室温下5分钟;热科学)来测量细胞增殖。gydF4y2Ba

CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞被播种到板与anti-CD3抗体(1μg毫升预镀gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba;克隆OKT3 BioLegend;一夜之间,4°C)的可溶性anti-CD28抗体(1μg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba;克隆CD28.2 BioLegend)。细胞培养的3 d诱导激活和upregulation PD-1 CD4细胞表面的受体gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞。gydF4y2Ba

C57BL / 6小鼠脾脏均相混合的单细胞悬液通过100 -µm脾脏细胞过滤器,和红血球细胞溶解和ACK (chloride-potassium铵)裂解缓冲在4°C为5分钟。CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞CD4消极的选择排序Miltenyi珠系统遵循制造商的指示。CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞被播种到板预镀anti-CD3 / anti-CD28抗体(5μg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba克隆145 - 2 - c11μg (BioLegend)和5毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba对于克隆37.51 (BioLegend))和3 d的激活。gydF4y2Ba

在PD-1 IL-2R信号(STAT5-P)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和PD-1-blocked CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞gydF4y2Ba

体外激活3 d后,细胞被收集并多次清洗去除内源性- 2。一部分CFSE-labelled T细胞暴露在µg 10毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba父母阻止PD-1 anti-PD-1抗体抗原决定基在室温下30分钟,此后,游离抗体被冲走了。gydF4y2Ba

评估IL-2R信号(STAT5-P)对人类T细胞治疗后,anti-PD-1-pretreated和未经处理的细胞暴露于浓度增加PD1-IL2v, FAP-IL2v或FAP-IL2 superkine模拟gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba12分钟在37°C。调查gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba/gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba绑定PD1-IL2v, anti-PD-1-pretreated或未经处理的CFSE-labelled细胞培养与未经处理的CTV-labelled细胞1:1。细胞被暴露在12分钟37°C到0.1μg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba(630点)的融合蛋白。gydF4y2Ba

小鼠体外实验,细胞治疗剂量的增加muPD1-IL2v或muFAP-IL2v 30分钟在37°C。gydF4y2Ba

后直接治疗,细胞被固定Phosphoflow修复缓冲我(BD)和孵化为30分钟37°C。细胞被permeabilized一夜之间在−80°C Phosphoflow PermBuffer III (BD)在染色前30分钟在4°C anti-STAT5-P-AF647抗体(克隆47 / pY694 BD生物科学;1:20)。gydF4y2Ba

绑定竞争TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}和TgydF4y2Ba_{convgydF4y2Ba}细胞和TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}抑制化验gydF4y2Ba

CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD25gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD127gydF4y2Ba^低gydF4y2BaTgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞被从人类分离外周血两步调节性T细胞隔离设备(Miltenyi)。同时,CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD25gydF4y2Ba^−gydF4y2BaTgydF4y2Ba_{convgydF4y2Ba}细胞被孤立的通过收集CD25的负面分数选择gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞(Miltenyi)浓缩的CD4紧随其后gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞(Miltenyi)。TgydF4y2Ba_{convgydF4y2Ba}与CFSE标记和T细胞gydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞被标记和CTV跟踪两种群的扩散。gydF4y2Ba

PD-1和IL-2Rβ受体量化和PD1-IL2v绑定竞争,TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}和TgydF4y2Ba_{convgydF4y2Ba}细胞培养在一个盘子一个1:1比例与anti-CD3抗体(1μg毫升预镀gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba;克隆OKT3, BioLegend)和可溶性anti-CD28抗体(1μg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba;克隆CD28.2 BioLegend)。3 d的刺激后,进行竞争结合试验1μg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba(6.3 nM)的父母anti-PD-1抗体或PD1-IL2v,都直接与AF647贴上标签。细胞直接耦合的抗体孵育30分钟在4°C和固定CellFIX (BD)。gydF4y2Ba

在TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}T的抑制试验,营救gydF4y2Ba_{convgydF4y2Ba}granzyme治疗后B生产PD1-IL2v共培养后测定TgydF4y2Ba_{convgydF4y2Ba}细胞与TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}在2:1比例5 d细胞,在治疗的存在与否。辐照(40 Gy)喂食器从一个捐赠者被用来引出allospecific刺激无关。抑制TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞是用以下公式计算:gydF4y2Ba

细胞因子在%gydF4y2Ba_{Tconv + Treg±疗法gydF4y2Ba}由T细胞因子分泌的水平gydF4y2Ba_{convgydF4y2Ba}T细胞的存在gydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞±治疗和%细胞因子gydF4y2Ba_{(Tconv)gydF4y2Ba}由T细胞因子分泌的水平gydF4y2Ba_{convgydF4y2Ba}T细胞的缺失gydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞并没有治疗。gydF4y2Ba

gm - csf, granzyme B和IFNγCD4细胞的分泌gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞gydF4y2Ba

排序和人类多克隆CD4 CTV-labelledgydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞被激活与可溶性anti-CD3抗体(1μg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)的辐射(40 Gy)馈线同一捐献者的细胞在一个1:1比例和浓度增加治疗抗体或aldesleukin (Proleukin,诺华公司)。5 d后,gm - csf分泌以ELISA (BioLegend)后,制造商的指示。细胞内染色流式细胞术,积累会刺激引起的细胞因子在高尔基氏复合体细胞ionomycin ng(500毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)和佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA;ng 50毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)与蛋白质运输抑制剂(1μl GolgiPlug GolgiStop, BD)染色前5 h。gydF4y2Ba

绑定的竞争gydF4y2Ba

CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞激活对3 d受到PD1-IL2v克分子数相等的浓度的增加,pembrolizumab或非阻塞PD1-IL2v 30分钟在4°C。洗后一步,细胞培养一个额外的30分钟在4°C饱和浓度(10μg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba的父母anti-PD-1抗体直接共轭AF647用于生成PD1-IL2v。细胞被固定与CellFIX (BD)额外后洗净。gydF4y2Ba

染色流式细胞术对细胞因子受体检测和量化gydF4y2Ba

细胞与细胞表面标记的抗体染色在PBS为30分钟在4°C和生活/死亡状态(与水死细胞染色(英杰公司)在孵化的最后10分钟或可以解决的可行性染料eFluor 780 (eBioscience) 30分钟在4°C)。细胞内染色,细胞被permeabilized流式细胞仪透化作用缓冲(固定/透化作用,BD生物科学或Foxp3转录因子固定装备,eBioscience)然后孵化与抗体特定细胞因子在4°C 60分钟。下面的抗体混合使用:(1)人类蛋白质抗体:anti-PD-1(2.5μg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba;克隆EH12.2H7 BioLegend) anti-IL-2Rβ(2.5μg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba;克隆TU27 BioLegend),同形像控制(2.5μg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba;克隆MOPC-21 BioLegend) anti-CD4 (1:50;克隆RPA-T4 eBioscience) anti-GM-CSF (1:10 0;克隆BVD2-21C11 BioLegend) anti-granzyme B (1:10 0;GB11 BD生物科学),anti-IFNγ(1:10 0;克隆4 s。B3, eBioscience);(2)小鼠抗体蛋白质:anti-PD-1(2.5μg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba;克隆29 f。1A12 (for syngeneic mice) or clone EH12.2H7 (for human PD-1-transgenic mice), BioLegend), anti-IL-2Rβ (2.5 μg ml^1gydF4y2Ba;克隆5 h4, BioLegend),同形像控制(2.5μg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba;克隆RTK2758 BioLegend) anti-TCRβ(1:200;克隆h57 - 597, BioLegend)、anti-CD8 (1:200;克隆53 - 6.7,BioLegend)、anti-CD4 (1:10 0;克隆GK1.5 BioLegend) anti-CD45(施用;克隆30-F11 BioLegend) anti-CD62L (1:200;克隆MEL-14 BioLegend) anti-CD44 (1:200;克隆IM7 BD) anti-FoxP3 (1:10 0;克隆150 d, BioLegend)。gydF4y2Ba

PD-1和IL-2Rβ受体是细胞表面的量化PBMCs和尖PD-1-transgenic老鼠轴承Panc02-H7-Fluc肿瘤和激活人类TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}和TgydF4y2Ba_{convgydF4y2Ba}细胞与PE荧光定量工具(BD)后,制造商的指示。PE-labelled单克隆抗体(2.5µg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)被用来量化利息的受体封闭感兴趣的人群。细胞和PE Quantibrite珠子固定遵循同样的协议,和荧光数据被收购而使用相同的设置。受体的数量是量化后设备的指令。gydF4y2Ba

体外结合PD1-IL2v, FAP-IL2v FAP-superkine模拟是由孵化630点的30分钟的构造PBMCs从健康的捐赠者。清洗步骤后,细胞培养一个额外的30分钟在4°C PE-labelled抗体识别的Fc的PGLALA突变部分主要抗体与抗体小组immune-cytokine靶向细胞的表型特征:anti-CD3 (1:10 0;克隆OKT3 BioLegend) anti-CD4 (1:10 0;克隆OKT4, BD生物科学)、anti-CD8 (1:10 0;克隆RPA-T8, BD生物科学)、anti-TIM-3 (1:20;克隆F38-2E2 BioLegend) anti-CD218a (1:10 0;克隆只好BioLegend) anti-CD56 (1:20;克隆NCAM16.2, BD生物科学)、anti-TCF-1 (1:10 0;C63D9、细胞信号技术)、anti-FOXP3 (1:50;克隆206 d, BioLegend)和anti-PD-1 (1:10 0; clone D4W2J, Cell Signaling Technology) followed by polyclonal goat anti-rabbit antibody (1.50; BioLegend).

样本采集进行BD生物科学LSRII Fortessa或交响乐A5仪器FACSDiva (v9.1;BD生物科学)和数据分析使用FlowJo软件(v10.8.1;BD生物科学)。gydF4y2Ba

老鼠,病毒和感染模型gydF4y2Ba

6至8-week-old女性C57BL / 6 j和CD45.1句老鼠从杰克逊实验室购买。以下住房条件使用的老鼠:12-h-light周期(上午7点,下午7点),温度在68 - 74°F,湿度30 - 70 g mgydF4y2Ba^{- - - - - -gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba}。长期LCMV-infected老鼠生成如下;老鼠是暂时性的CD4枯竭的境地gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞通过与300μg GK1.5抗体腹腔内注射2 d当天再感染和感染,其次是感染小鼠2×10gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba空斑形成单位的淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒克隆13尾静脉静脉注射。病毒空斑实验测定的滴定度州立E6细胞。所有动物实验进行符合国家卫生研究院和埃默里大学制度动物保健和使用委员会的指导方针。gydF4y2Ba

小鼠肿瘤模型gydF4y2Ba

Panc02-H7-FlucgydF4y2Ba

原位和皮下同源的模型被用来评估的体内疗效muPD1-IL2v相比单一代理muPD1和muFAP-IL2v C57BL / 6 j小鼠或它们的组合。皮下同源的模型被用来评估的体内疗效PD1-IL2v相比pembrolizumab和aldesleukin或其组合在人类PD-1-transgenic C57BL / 6 j小鼠(牛津大学)。生存和肿瘤生长抑制原位的读数和皮下模型,分别。总之,6 - 8-week-old女性C57BL / 6 j小鼠(Charles River)注射1×10gydF4y2Ba^5克ydF4y2BaPanc02-H7-Fluc细胞注入胰腺(胰腺癌原位模型)或5×10gydF4y2Ba^5克ydF4y2BaPanc02-H7-Fluc细胞注入皮下注射(皮下模型)。老鼠specific-pathogen-free条件下保持日常周期12 h光/ 12 h黑暗根据指南(温度22°C,黑/光周期12 h和湿度50%;GV-SOLAS FELASA),食物和水都随意。连续进行健康监测,实验研究了协议和批准广东苏黎世的兽医部门。gydF4y2Ba

小鼠随机分为不同的治疗组,治疗开始时肿瘤生长的证据,可见在靶器官的生物荧光肿瘤细胞接种后(7 d)在原位模型或肿瘤达到平均200毫米的体积gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba}以卡尺在皮下模型中。所有的治疗方法都进行静脉注射,以下剂量调查:muPD1-IL2v 0.5和1毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba,muFAP-IL2v 2.5毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba,muPD1 10毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba,PD1-IL2v 0.5毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba,pembrolizumab 10毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba,aldesleukin 900000 IU公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba每天两次。原位模型杀死动物的终止准则与运动障碍疾病,和总体生存中值被定义为的实验一天50%的动物被杀。使用kaplan - meier生存曲线和成对生存率较比较治疗组动物之间的生存。在皮下模型中,肿瘤生长抑制作用是用作读出;测试组对多个显著差异的比较,标准方差分析(ANOVA)是用于Dunnett的方法。JMP统计软件被用于分析。gydF4y2Ba

在原位模型中,胰腺癌细胞系Panc02-H7-Fluc被用在一个原位胰腺癌模型。总之,深全身麻醉下剖腹手术进行中值和胰腺被曝光。1×10的整除gydF4y2Ba^5克ydF4y2BaPanc02-H7-Fluc细胞被注入胰腺。胰腺是取代,腹壁是关闭。治疗开始7 d后胰腺肿瘤细胞接种在固体肿瘤观察通过生物荧光成像。gydF4y2Ba

在皮下模型中,胰腺癌细胞系Panc02-H7-Fluc (5×10gydF4y2Ba^5克ydF4y2Ba细胞)注入左翼的皮下组织。肿瘤体积使用卡尺测量。肿瘤体积的计算公式:gydF4y2Ba

治疗开始时肿瘤体积达到150 - 200毫米gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

CD8的gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗的研究中,所有老鼠轴承Panc02-H7-Fluc皮下肿瘤与anti-mouse CD8管理静脉注射抗体(InVivoPlus anti-mouse CD8α,克隆2.43,BioXCell), 5毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba每周3次,1周之前第一个政府的治疗。鼠标CD8枯竭gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba血液中细胞评估开始前通过流式细胞术治疗。gydF4y2Ba

B16F10-OVAgydF4y2Ba

皮下黑色素瘤同系的模型被用来评估的体内疗效muPD1-IL2v相比单一代理muPD1和muFAP-IL2v C57BL / 6 j小鼠或它们的组合。肿瘤生长抑制和存活率的读数皮下模型。总之,6 - 8-week-old女性C57BL / 6 j小鼠(Charles River)皮下注射2×10gydF4y2Ba^5克ydF4y2BaB16F10-OVA细胞B16转椅细胞系overexpressing卵巢蛋白。作为Panc02-H7-Fluc前面描述的模型,小鼠specific-pathogen-free条件下保持日常周期12 h光/ 12 h黑暗根据指南(GV-SOLAS FELASA)和食物和水是随意提供。连续进行健康监测,实验研究了协议和批准广东苏黎世的兽医部门。肿瘤体积使用卡尺测量。肿瘤体积的计算公式:gydF4y2Ba

老鼠被随机分配,肿瘤接种后10 d,到不同的治疗组肿瘤的基础上的大小。治疗肿瘤接种后开始11 d。所有的治疗方法都给予皮下注射一周一次,以下剂量调查:muPD1-IL2v 0.5毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba,muFAP-IL2v 1.5和3毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba,结合muPD1 10毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba和FAP-IL2v 1.5毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。存活率曲线,终止判据杀死动物是肿瘤大小或肿瘤溃疡。肿瘤生长抑制是一个额外的读出;测试组对多个显著差异的比较,标准方差分析(ANOVA)是用于Dunnett的方法。GraphPad棱镜软件(v8)被用于图形表示和分析。gydF4y2Ba

mca - 205肉瘤gydF4y2Ba

一个皮下纤维肉瘤同源的模型也被用来评估的体内疗效muPD1-IL2v相比单一代理muPD1和muFAP-IL2v或它们的组合在C57BL / 6 j小鼠CRO Antineo(法国里昂)。肿瘤生长抑制的读出这皮下模型。总之,6 - 8-week-old女性C57BL / 6 j小鼠(Charles River)注射5×10gydF4y2Ba^5克ydF4y2Bamca - 205细胞皮下注射。老鼠specific-pathogen-free条件下保持连续健康监测根据指南(Animalerie公社疤痕洛克菲勒,里昂,法国)。gydF4y2Ba

小鼠随机分为不同的治疗组,治疗开始时肿瘤达到平均100毫米的体积gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba}以卡尺在皮下模型中。所有治疗都进行静脉注射,使用以下剂量调查:muPD1-IL2v 1和2毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba,muFAP-IL2v 2毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba和muPD1 3毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。肿瘤体积使用卡尺测量和计算公式:gydF4y2Ba

肿瘤生长抑制作用是用作读出;测试组对多个显著差异的比较,标准方差分析(ANOVA)是用于Dunnett的方法。JMP统计软件被用于分析。gydF4y2Ba

PanNET RIP-Tag5转基因小鼠模型gydF4y2Ba

代RIP-Tag5老鼠曾被描述gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba。RIP-Tag5老鼠在本研究C57BL6 / N背景(Charles River),男性年龄在21到31周。根据批准的协议进行了动物实验的兽医当局广州沃州和瑞士法律。gydF4y2Ba

报名RIP-Tag5小鼠试验,小鼠年龄从22周显示血糖水平低于7毫米被筛查PanNET胰岛肿瘤的存在使用Vevo2100超声波成像系统MS550D 40-MHz换能器(视觉声波)。RIP-Tag5小鼠被随机分配到不同的治疗组的基础上累积肿瘤负担。平均起肿瘤负担是27毫米gydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba},平均年龄是26周开始,平均起血糖水平是5.5毫米。肿瘤是由超声波成像监测每2周,或每4周完成反应者,最多16周后开始治疗。血糖监控每周使用一个Accu-Chek glucometer(罗氏)。端点定义的标准由肿瘤负担(> 50 mmgydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba}或2 - 4倍增加复发肿瘤进展),低血糖(血糖水平或低于3毫米)和健康状况。gydF4y2Ba

治疗是由腹腔内注射用下面的数量每鼠:muPD1, 250μg一周一次;DP47-muIL2v(非针对性muIL-2v), 25μg一周一次;PD1-IL2v 25μg每周8周时间。gydF4y2Ba

组织学gydF4y2Ba

组织学分析、组织样本收集、固定在10%福尔马林(σ)和后加工FFPET(徕卡,1020)。Four-micrometre石蜡部分随后被切成一个切片机(徕卡,RM2235)。苏木精和伊红染色后自动执行徕卡系统制造商的指示。鼠标PD-1进行免疫组织化学与anti-mouse PD-1(摘要;克隆AF1021、研发系统)而执行鼠标granzyme B染色anti-mouse GZMB(摘要;克隆ab4059, CD3 Abcam)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(1:10 0;克隆SP7、诊断生物系统)和CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(施用;克隆4 sm15 eBiosciences) T细胞。徕卡autostainer染色进行(徕卡,ST5010)后生产的协议。部分与苏木精复染色(Sigma-Aldrich),并使用奥林巴斯VS120-L100虚拟幻灯片幻灯片进行扫描显微镜扫描。量化的阳性细胞与定义软件执行扫描图像。为此,整个扫描上传在组织开发人员与细分分析模块和坏死区域被排除在外。第二,一个阈值被设置为识别目标细胞的棕色染色,以及细胞的算法量化或百分比正面区域随后自动运行。输出数据被转移到GraphPad棱镜(v8)分析意义的标准方差分析(ANOVA) Dunnett的修正。gydF4y2Ba

细胞系gydF4y2Ba

维罗E6细胞从美国获得类型文化收藏、鼠标胰腺癌细胞系Panc02-H7-Fluc生成罗氏Glycart和B16-OVA细胞系从ProQinase购买。mca - 205小鼠纤维肉瘤细胞系从Sigma-Aldrich购买,源自3-methylcholanthrene-induced C57BL / 6小鼠纤维肉瘤。连续皮下移植肿瘤维持体内的同源的老鼠,和单细胞悬浮体被酶消化准备从固体肿瘤。从这些细胞,mca - 205细胞株体外建立和维护。维罗E6细胞没有经过身份验证,而mca - 205、B16-OVA和Panc02-H7-Fluc细胞被验证通过形态学和物种特异性引物PCR检测。mca - 205细胞检测结果为阴性传染病使用鼠标基本清晰面板由查尔斯河动物诊断服务和负了支原体污染。批Panc02-H7-Fluc和B16-OVA细胞系通常测试支原体和房子是负面的。gydF4y2Ba

淋巴细胞分离gydF4y2Ba

慢性感染实验gydF4y2Ba

血液中的淋巴细胞分离,脾和肺如前所述gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba。总之,脾脏分离通过他们70 -μm细胞通过一个过滤器(康宁)。肺在哈佛商学院1.3毫米EDTA处理30分钟在37°C,用颤抖的200 r.p.m。,其次是治疗150 U mlgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba胶原酶(热费希尔科学)rpmi - 1640含5%的边后卫,MgCl 1毫米gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}和1毫米CaClgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}60分钟与震动200 r.p.m 37°C。Collagenase-treated肺组织均质和70 -μm细胞过滤器过滤。从肺淋巴细胞纯化使用44 - 67% Percoll梯度(800 g 20°C 20分钟)。gydF4y2Ba

癌症模型试验gydF4y2Ba

老鼠被杀死根据动物福利指南;肿瘤组织和血液中孤立动物设施。肿瘤组织被转移到PBS和中断使用手工剪刀和Miltenyi温柔的mac机。随后,在组成的混合酶消化RPMI 10毫克毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2BaDNase (Sigma-Aldrich)和0.25毫克毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2BaLiberase (Sigma-Aldrich)。经过30分钟的消化在37°C,组织70 -µm过滤器过滤,混合resuspended作为后续的单细胞悬液与适当的体积与荧光标记的抗体染色。血液被转移到肝素管,以及红细胞和红细胞裂解缓冲细胞溶解。血红细胞溶菌作用后,细胞resuspended作为单细胞悬液与适当的体积为后续染色荧光标记的抗体。淋巴细胞从排水机械孤立淋巴结用杵,透过70 -µm过滤器和resuspended作为单细胞悬液与适当的体积为后续染色荧光标记的抗体。gydF4y2Ba

试剂、流式细胞术和体外刺激gydF4y2Ba

慢性感染实验gydF4y2Ba

所有抗体流式细胞术从BD购买生物科学,BioLegend,热费希尔科学、细胞信号技术和研发系统。DgydF4y2Ba^bgydF4y2BaGP33-41和DgydF4y2Ba^bgydF4y2Bagp276 - 286四聚体准备房子,被用来检测LCMV-specific CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞。从热费希尔科学Streptavidin-PE或streptavidin-APC购买。死细胞已排除了使用现场/死亡可以解决的近红外线或黄色死细胞染色设备(热费希尔科学)。细胞表面染色,稀释的抗体被添加到细胞1:20的边后卫在PBS补充1:50 0 2%和0.1%叠氮化钠对冰30分钟。细胞被洗了三次,用2%多聚甲醛固定。检测细胞因子生产,1×10gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba脾细胞被刺激的池九ng LCMV-specific肽(200毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Bagp92每个GP33-41 gp70 - 77 - 101, gp118 - 125, gp276 - 286, np166 - 175, np235 np205 - 212 - 249和np396 - 404)在96年-圆底板5 h在37°C有限公司gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}孵化器的GolgiPlug (BD生物科学)。样本获得的第二章,LSR II或FACSymphony A3仪器(BD生物科学)与FACSDiva (v9.1;BD生物科学)和数据分析了通过使用FlowJo (v9.9.6或v10.8.1;BD生物科学)。gydF4y2Ba

癌症模型试验gydF4y2Ba

单细胞悬浮体从肿瘤和血液沾以下抗体:可以解决的可行性染料eFluor 455紫外线(1:50 0),AF700 anti-CD45(施用;克隆30-F11 BioLegend) PercP-Cy5.5 anti-TCRβ(1:200;克隆h57 - 597, BioLegend), APC-Cy7 anti-CD8 (1:200;克隆53 - 6.7,BioLegend), PE-Cy7 anti-CD4 (1:200;克隆GK1.5 BioLegend) FITC anti-CD62L (1:200;克隆MEL-14 BioLegend)、PE anti-CD127 (1:10 0;克隆A7R34 BioLegend) BV421 anti-CD4 (1:200;克隆GK1.5 BioLegend) AF647 anti-granzyme B (1:10 0;克隆GB11 BioLegend) BV786 anti-IFNγ(1:10 0;克隆XMG1.2 BioLegend) PE-Cy7 anti-TNFα(1:10 0; clone MP6-XT22, BioLegend), BV421 anti-FoxP3 (1:100; clone MF-14, BioLegend), AF647 anti-CD39 (1:200; clone Duha59, BioLegend), AF700 anti-granzyme B (1:100; clone QA16A02, BioLegend), PE-Cy7 anti-Ki67 (1:300; clone 16A8, BioLegend), PE-Cy7 anti-PD-1 (1:200; clone RMP1-30, BioLegend), BV711 anti-CD25 (1:200; clone RMT3-23, BioLegend), PE-Dazzle594 anti-TIGIT (1:100; clone 1G9, BioLegend), BV605 anti-IFNγ (1:100; clone XMG1.2, BioLegend), BV421 anti-TNFα (1:100; clone MP6-XT22, BioLegend), AF488 anti-CD107a (1:100; clone 1D4B, BioLegend), BV510 anti-CD44 (1:200; clone IM7, BD Biosciences), BUV805 anti-CD45 (1:100; clone 30-F11, BD Biosciences), BV786 anti-TCRβ (1:100; clone H57-597, BD Biosciences), BUV496 anti-CD4 (1:100; clone RM4-5, BD Biosciences), BUV395 anti-CD8 (1:100; clone 53-6.7, BD Biosciences), BUV737 anti-PD-1 (1:100; clone RMP1-30, BD Biosciences), PE-CF594 anti-CD25 (1:100; clone PC61, BD Biosciences), BV650 anti-TIM-3 (1:100; clone 5D12, BD Biosciences), PE anti-TCF-1 (1:100; clone S33-966, BD Biosciences), BV650 anti-LAG3 (1:100; clone C9B7W, BD Biosciences), BV510 anti-SLAMF6 (1:50; clone 13G3, BD Biosciences) and FITC anti-CD218a (1:50; clone REA947, Miltenyi).

检测OVA-specific CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞是由使用APC-labelled Dextramer H-2Kb (SIINFEKL) Immudex (1:10 0)。染色Dextramer是由使用0.1% BSA在PBS。细胞内染色,细胞被固定和使用FOXP3 permeabilized转录因子染色缓冲区设置从eBioscience或转录缓冲区设置从双相障碍。gydF4y2Ba

检测细胞因子,肿瘤细胞悬浮液与6.25 ng ml刺激之后谈恋爱gydF4y2Ba^1gydF4y2BaPMA (Sigma-Aldrich)和1.87μg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Baionomycin (Sigma-Aldrich) 5 h 37°C。re-stimulation 1 h后,GolgiPlug (BD)和GolgiStop (BD)添加到细胞悬液。re-stimulation为抗原,肿瘤细胞悬浮液与0.1µg ml刺激之后谈恋爱gydF4y2Ba^1gydF4y2Bagp100或SIINFEKL肽,5 h在37°C。Anti-CD107a抗体一起添加肽5 h在37°C。和之前一样,re-stimulation 1 h后,GolgiPlug (BD)和GolgiStop (BD)添加到细胞悬液。gydF4y2Ba

歧视的活细胞坏死细胞进行使用DAPI (Sigma-Aldrich),可以解决的可行性染料eFluor 780 (eBioscience)或生活/死亡APC-Cy7 (eBioscience)。样本获得的BD LSRII Fortessa和BD FACSymphony A5仪器使用FACSDiva (v9.1;BD生物科学)。数据分析通过使用FlowJo (v10.8.1;BD生物科学)。gydF4y2Ba

细胞分类gydF4y2Ba

慢性感染实验gydF4y2Ba

细胞分类进行FACSAria II (BD生物科学)。过继转移实验中,两个PD-1-expressing CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(PD-1子集gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCXCR5gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTIM-3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba和PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCXCR5gydF4y2Ba^−gydF4y2BaTIM-3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba从联合脾脏)排序(gydF4y2BangydF4y2Ba= -)的长期LCMV-infected老鼠。RNA-seq LCMV-specific CD8的分析gydF4y2Ba^+gydF4y2BamuPD-L1后T细胞,muPD1-IL2v和muPD-L1 + muPD1-IL2v疗法,长期LCMV-infected老鼠(超过40 d后感染;gydF4y2BangydF4y2Ba=队)不及时治疗或治疗2周,和DgydF4y2Ba^bgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba从合并脾脏T细胞分类获得至少2×10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba细胞。天真(CD44gydF4y2Ba^低gydF4y2Ba)CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba联合脾脏T细胞分类的未受感染的老鼠(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2 - 3)。所有样品纯度大于95%。gydF4y2Ba

癌症模型试验gydF4y2Ba

肿瘤单细胞悬浮体保持在冰在染色和排序过程。从3 - 5相同的治疗组肿瘤细胞悬浊液是沾染了以下抗体:AF700 anti-CD45 (1:10 0;克隆30-F11 BioLegend) BV711 anti-CD8 (1:10 0;克隆53 - 6.7,BioLegend)和本频道BV605 anti-CD4 (1:10 0;克隆GK1.5, BioLegend)和BV605 anti-CD11c (1:10 0;克隆N418 BioLegend)。歧视的活细胞坏死细胞进行使用生活/死APC-Cy7 (eBioscience, 65-0865-14;1:50 0为非固定样本和细胞孵化20分钟)。细胞被洗两次,40-µm细胞过滤器过滤,排序第三FACSAria仪器和收购FACSDiva(单一CD45充实可行的gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD11cgydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba细胞。gydF4y2Ba

鼠标与muFAP-IL2wt PD-L1封锁和治疗,muFAP-IL2v muPD1-IL2v体内gydF4y2Ba

PD-L1封锁,200μg DAPG突变的老鼠muPD-L1抗体(罗氏)腹腔注射到长期LCMV-infected老鼠每3 d为2周。适当的同形像控制(鼠标IgG1同形像控制(MOPC-21 BioXCell))在未经处理的小鼠接种。muFAP-IL2药物治疗1毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2BamuFAP-IL2wt或muFAP-IL2v腹腔内注射到长期LCMV-infected老鼠连续两周每周两次。muPD1-IL2v药物治疗1毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2BamuPD1-IL2v intraperiotenally管理到长期LCMV-infected老鼠连续两周每周两次。gydF4y2Ba

两个CD8的过继转移gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞亚群gydF4y2Ba

从两个CD8细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(4 - 8×10子集gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba细胞;PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCXCR5gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTIM-3gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba和PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCXCR5gydF4y2Ba^−gydF4y2BaTIM-3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)从长期LCMV-infected分离小鼠(CD45.2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)被转移到老鼠infection-matched接受者(CD45.1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba),其次是muPD1-IL2v治疗2周。gydF4y2Ba

RNA隔离和RNA-seqgydF4y2Ba

慢性感染实验gydF4y2Ba

总RNA提取利用RNeasy微工具包(试剂盒)或Direct-zol RNA Microprep工具包(Zymo研究)根据生产的协议在埃默里整合基因组学核心或房子。准备在哈森阿尔法或执行标准RNA-seq库在埃默里大学耶基斯非人灵长类动物研究中心(NPRC)基因组学的核心。总之,RNA扩增都使用了Nugen鼓掌RNAseq v2工具包或Clontech SMART-Seq v4超低输入RNA工具包(豆类生物)。放大cDNA支离破碎,样本准备使用KAPAHyper准备工具包或Nextera XT DNA库准备工具包(Illumina公司)。集中库测序在Illumina公司NovaSeq 6000 100 - bp paired-end读取。gydF4y2Ba

癌症模型试验gydF4y2Ba

肿瘤和淋巴结消化如前所述,和1 - 10绪细胞在Ibidi储存在液氮冷冻剂。样本随机和加工在四个不同的批次10样本(肿瘤和淋巴结是分开处理)。解冻了一批样品后,细胞被染色和流式细胞术和oligonucleotide-labelled抗体(表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)和CD8的排序gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba执行scRNA-seq前T细胞。总之,细胞被洗一次手机号和可行性的评估与PBS使用Nexcelom Cellometer汽车2000。大约一绪细胞样本resuspended 50µl PBS和孵化5µl鼠标TruStain FcX Fc阻塞试剂(BioLegend)。流式细胞术和oligonucleotide-labelled抗体被加入到细胞体积50µl(最后一卷,100µl)。孵化后30分钟在4°C, PBS的细胞被洗了三次,500年resuspendedµl PBS获得约1×10的浓度gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba细胞每毫升。细胞40-µm细胞过滤器过滤和排序BD FACSAria III系统。细胞数量和生存能力的排序细胞测定使用Nexcelom Cellometer汽车2000,和10000可行的细胞每样都加载到10倍基因组铬控制器。互补脱氧核糖核酸和图书馆准备进行根据制造商的迹象(scRNA-seq 5′和TCR v2装备特性条码),以及由此产生的图书馆是测序的Illumina公司NovaSeq 6000测序仪根据10 x基因组学的建议(R1 = 26日i7 = 10, i5 = 10, R2 = 90)的深度约20000读取每细胞GEX库和5000年读条码库细胞识别和特征。gydF4y2Ba

为病毒特异性CD8 RNA-seq分析数据gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在慢性感染T细胞gydF4y2Ba

读取映射到GRCm38 / mm10基因组gydF4y2Ba^54gydF4y2BaHISAT2 (v2.1.0)gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba。基因表达与featureCounts量化gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba(v1.5.2)。DESeq2 (ref。gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba;v1.24.0)是用于规范化图书馆跨组大小和计算微分表达式。被认为是两组之间的差异表达基因的调整gydF4y2BaPgydF4y2Ba值< 0.05,平均表达式> 20规范化计算所有样本。PCA进行所有检测到的基因从DESeq2使用正规化日志转换。RNA-seq数据可视化通过棱镜软件(v9.3.1;GraphPad)和ComplexHeatmap R包(v2.2.0)gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

单细胞RNA、蛋白质和细胞测序分析尖gydF4y2Ba

Fastq文件对齐到鼠标转录组(mm10 - 2020 a)使用CellRanger(计数和vdj) v6.0.0参数——expect-cells = 6000。所有细胞显示> 200数量进一步合并所有样本与scanpy和加工gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba和bescagydF4y2Ba^60gydF4y2Ba标准工作流程。执行过滤参数min_genes = 500, min_cells = 20, min_counts = 1000, n_genes = 6000, percent_mito = 0.08, max_counts = 40000。此外,细胞没有抗体被移除。两个样品被排除在外,因为较低的整体质量和非常低的细胞数量;所有其他的样本包括在分析中。每10000,总之,RNA数量标准化最顶部高度变量选择基因,基因和线粒体读取退化了,PCA进行50和第一主成分用于近邻计算和莱顿集群,以及UMAP-based可视化。蛋白质数量中央日志比(CLR)转变。注释使用besca sig-annot执行模块,和更详细的CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba亚种群是由RNA和蛋白质标记表达式的基础上和签名浓缩(scanpy.tl.score_genes)。只有集群包含CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在分析T细胞数量保留;集群21(无免疫力),18 (non-T细胞),7和19(骨髓T细胞紧身上衣),22(17岁辅助T细胞)和20 (TgydF4y2Ba_{注册gydF4y2Ba}细胞)作为可能的污染物被排除在外。基因签名用于无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba提供在表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba。细胞分析与工具箱scirpy PythongydF4y2Ba^{61年gydF4y2Ba},clonotypes CDR3上序列的基础上,确定身份,与参数receptor_arms =“所有”,dual_ir =“primary_only”。Jupyter笔记本可用于数据预处理,集群和可视化,和细胞注释,以及识别分析gydF4y2Bahttps://github.com/bedapub/PD1-IL2v_in-vivo_TILs_Panc02_publicationgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

内化化验gydF4y2Ba

成像gydF4y2Ba

人类CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba从PBMCs被激活T细胞刚纯化anti-CD3 / CD28-coated盘子。三天之后激活,CD4细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞收集和沾10μM CellTracker蓝色小脑染料(表达载体,C2110) 15分钟37°C;150000个细胞被播种RetroNectin-coated成像幻灯片和允许坚持30分钟在37°C。RetroNectin涂层,成像幻灯片处理1μgμlgydF4y2Ba^1gydF4y2BaRetroNectin(豆类,T100B)在室温下40分钟。随后,T细胞治疗1 h - 3 h在4°C或37°C和630点(0.1μg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)in-house-produced FAP-IL2v AF647或630点(0.1μg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)in-house-produced PD1-IL2v AF647。表明,细胞使用10μg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Baanti-PD-1饱和PD-1结合位点。之后,样品被固定和permeabilized (BD Cytofix / Cytoperm 554714) 20分钟在4°C,然后沾其间,非结合的anti-PD-1抗体(1:10 0;D4W2J、细胞信号技术在4°C) 45分钟,其次是染色与山羊anti-rabbit免疫球蛋白(H + L), F (ab′)gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}片段AF488(细胞信号技术,4412年,许多18;2毫克毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba;1:1,000)。所有样本然后用倒置的共焦显微镜成像(徕卡Sp8),采用×40目的。对于每一个形象,一个光学部分收购分辨率为1024×1024像素大小的0.379μm。gydF4y2Ba

数据分析gydF4y2Ba

图像进行分析使用伊万里瓷器9.5.1 (Bitplane), MATLAB 2020 (Mathworks)和GraphPad棱镜(v8;GraphPad软件)。在伊万里瓷器,图像被打开了,细胞质被分割的基础上CellTracker蓝色小脑染料通道(表面晶粒尺寸,0.758)。随后,图像被转换为32位;然后,使用伊万里瓷器Xtension距离变换,距离“细胞质等值面”是计算并保存为一个单独的通道。接下来的细分,近似膜的位置,正是基于这一距离细胞质的通道(表面晶粒尺寸,0.758;距离阈值,0 - 0.759µm细胞质)。任何触摸分割对象分割,例如对于每个分段细胞质分段膜。膜和细胞质统计出口进行进一步分析。gydF4y2Ba

一个定制的MATLAB脚本是用于匹配的药物平均强度的值和PD-1平均强度的膜和细胞质对象,最近的距离分段的基础上物体质心。随后,比率计算,导出为csv文件。从导出的. csv文件,值复制到GraphPad棱镜进行绘图和统计分析。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

棱镜软件(v8和v9.3.1;GraphPad)是用于统计分析。差异实验小组评估了通过使用一个未配对的测试或Mann-Whitney测试比较两组。单向或双向方差分析Dunnett或图基的事后测试或克鲁斯卡尔-沃利斯检验被用于比较两个以上的组。测试之间的显著差异在肿瘤生长抑制组意味着多个比较,标准方差分析(ANOVA)使用Dunnett的事后考验Panc02小鼠肿瘤模型。Log-rank Mantel-Cox测试是用于比较muPD1-IL2v和muPD1 +没有针对性muIL-2v生存RIP-Tag5小鼠肿瘤模型;Wilcoxon生存的测试被用于比较的原位Panc02小鼠肿瘤模型。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

进一步研究信息设计是可用的gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba与这篇文章有关。gydF4y2Ba