具有持久亲和力、成熟和克隆迁移的长启动生发中心gydF4y2Ba

抗体是抵御大多数传染病的有效的适应性免疫防线。因此，最有效的疫苗旨在预防性地引发有效的中和抗体和对目标病原体的持久免疫记忆。对于快速突变的病原体，如人类免疫缺陷病毒(HIV)，有一个额外的并发症水平，其中理想的疫苗应该产生交叉反应或广泛中和的抗体，可以防止变异gydF4y2Ba^{3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba};然而，到目前为止，还没有通过疫苗接种在人类或非人灵长类动物(NHPs)的血清中诱导出广泛中和的HIV抗体gydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

高亲和力抗体通常是生发中心(GCs)亲和力成熟的结果。GCs代表了微型进化，增殖(世代)伴随着突变和对抗原和T细胞帮助形式的有限资源的竞争gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba}．为了完成这种进化，GC B细胞(BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba细胞)快速增殖-每4-6小时gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10克ydF4y2Ba}．急性抗原暴露后，通常在几周内观察到GCs。抗原BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba在大多数模型系统中，细胞已被广泛观察到14-28天，这样的时间窗口可以代表BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba由于它们的细胞周期快gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba}．我们之前的研究表明，相对于传统的大剂量免疫，在7-14天的时间内缓慢递送疫苗的方法，如使用渗透泵或重复小剂量注射，可以增强免疫反应gydF4y2Ba^{11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba}有一些证据表明，GCs的耐久性增加了2个月gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba．然而，对于GCs的全部潜在寿命、长期GCs的生物编程、在这种条件下的抗体成熟以及较老的GCs的功能和生产力，人们知之甚少。在这里，我们使用了12天，缓慢递送的蛋白质免疫策略和抗原特异性分子和细胞工具来探索启动免疫后GC持久性的程度，以及随后的免疫结果。gydF4y2Ba

明矾是许多人类疫苗中使用的经典佐剂gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba．一组恒河猴(RMs)注射了重组表达的稳定HIV Env trimer MD39(参考文献)。gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba)用明矾佐剂配制(每侧50µg蛋白质和500µg醛凝胶佐剂)，反映了大多数许可的人类蛋白质疫苗是如何配制和作为丸剂给药的(第1组)(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。为了产生更强的GCs，我们用新的免疫刺激复合物型佐剂皂苷/MPLA纳米颗粒(SMNP)配制的MD39 Env三聚体免疫两组RMs。gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba(第2组和第3组)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。这两组的启动免疫是通过一种称为递增剂量的缓慢递送疫苗接种方法进行的gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba，其中MD39加SMNP制剂的总剂量(每侧50µg蛋白质和375µg佐剂)分为7个逐渐增加的剂量，每隔一天给药，共12天(扩展数据图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。第3组设计了异常长的起始期，以评估初次免疫后GCs的持久性。研究中的每只动物都是双侧免疫的，因此随着时间的推移，可以追踪的淋巴结(LNs)和GCs的数量增加了一倍。每2-3周用细针抽吸(FNA)取样一次GCs。gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba腹股沟ln (iln)的变化(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

启动免疫后，常规MD39加明矾丸免疫的猴子(1组)总B增加gydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba电池(CD71gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD38gydF4y2Ba^{- - - - - -gydF4y2Ba}免疫后第3周的百分比(图2)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba);env结合B的频率gydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba细胞(CD71gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD38gydF4y2Ba^{- - - - - -gydF4y2Ba}EnvgydF4y2Ba^+/+gydF4y2Ba)在第3周达到顶峰，此后下降(Env-binding BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba细胞占总B细胞的百分比)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)。总B和env结合BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba与接受常规蛋白+明矾丸免疫的RMs相比，MD39 + SMNP ed免疫的RMs细胞显著增加(图2)。gydF4y2Ba1 b, cgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1 b, cgydF4y2Ba和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。中峰BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba观察到的细胞频率为24-33%，而对照组为3.5% (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001，第3周，第2组和第3组联合对比第1组;无花果。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。中位数env结合BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba细胞频率在第3周增加了约7.8倍(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0025，第2组和第3组与第1组比较)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)。引人注目的是，与常规引物1组相比，env结合B的频率gydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba第2组和第3组的细胞继续增加，到第10周时，GC差异为186倍(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001，第2组和第3组与第1组比较)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

对第3组猴子的启动免疫反应的跟踪持续到第10周之后(第1组和第2组猴子在第10周被增强)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。在第13、16、21、25和29周，GC反应仍然活跃(图2)。gydF4y2Ba1罪犯gydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba)。在第2组中，MD39结合的几何平均荧光强度在第10周后继续增加，表明MD39特异性BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba在没有增强剂的情况下，细胞继续获得亲和力(扩展数据图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)。Env-binding BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba第29周的细胞频率仍然比常规明矾免疫后观察到的峰值高27倍，并且也大于常规明矾免疫的增强反应(图2)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)。在起始剂量结束后191天(27周)(从第0天算起29周)，中位env结合BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Bailn中的细胞频率仍然比基线高49倍左右(图2)。gydF4y2Ba1罪犯gydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba)。因此，在没有进一步引入抗原的情况下，GCs存在超过191天。gydF4y2Ba

GC-T滤泡辅助剂gydF4y2Ba_{跳频gydF4y2Ba})细胞在B的募集和选择中起着关键作用gydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba细胞gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba．GC-T的总频率gydF4y2Ba_{跳频gydF4y2Ba}iln中的细胞在启动期间发生了变化(扩展数据图)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)。Env-specific GC-TgydF4y2Ba_{跳频gydF4y2Ba}3组经强化后细胞频率增高(扩展数据图)。gydF4y2Ba2 e, fgydF4y2Ba）gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba;由于FNA样本有限，无法进行纵向定量。长效先导gc可能有助于改善抗原特异性GC-TgydF4y2Ba_{跳频gydF4y2Ba}加强免疫后的反应。gydF4y2Ba

在没有加强免疫的情况下，第3组RMs的env结合血清IgG滴度从启动期的第3周到第29周保持稳定(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。在增强后，2组和3组猴子产生了相似的峰值结合抗体滴度(增强后2 - 3周)，但3组猴子在增强后第6周保持了明显更高的env结合IgG滴度(图2)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)。对抗体反应的质量进行了评价，以评估其中和自身2级BG505假病毒的能力。值得注意的是，仅在启动免疫后，所有长引物组3猴子均可检测到自体2级中和抗体(29周时几何平均滴度(GMT)约为170)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)。所有接受递增剂量免疫的猴子在增强后都产生了强大的中和抗体反应。gydF4y2Ba2 c, dgydF4y2Ba);相比之下，只有一只接受常规大剂量免疫的动物能够检测到低滴度(约37)的自体中和抗体(扩展数据图)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。第3组观察到的峰值自体中和GMTs均大于2000(增强后第3周)(图2)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)。在增强后6周，第3组的自体中和效价是第2组的4倍。gydF4y2Ba2 c, dgydF4y2Ba)。在我们的任何研究中，所描述的滴度代表了两次免疫后rm中最稳健和一致的自体2级中和抗体反应gydF4y2Ba^{12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

第2组和第3组增强后血清表现出一些由Env三聚体免疫引起的最广泛的第2层中和抗体特异性，第3组的大多数猴子表现出比第2组更广泛的特异性(图2)。gydF4y2Ba2 e, fgydF4y2Ba)。一个独立的实验室重复了12种病毒的全球中和面板，具有类似的中和广度观察(扩展数据图)。gydF4y2Ba3 b, cgydF4y2Ba)。在头对头的试验中，从先前的一项RM研究中观察到有限的2级中和广度，该研究采用递增剂量免疫和两次加强免疫，使用类似的Env三聚体(Olio6)和早期的免疫刺激复合佐剂(不含MPLA的SMNP)。gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba(扩展数据图gydF4y2Ba3 d, f-hgydF4y2Ba)，同样也适用于接种三次MD39 Env三聚体和SMNP的RM研究血清(扩展数据图。gydF4y2Ba3情况gydF4y2Ba）gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

大多数HIV Env结合B细胞和抗体通常指向免疫优势的非中和表位，如可溶性重组Env三聚体的碱基gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}．电镜多克隆表位定位(EMPEM)gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba循环抗体结果显示，2组和3组的靶向表位数量明显高于1组(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0066)。gydF4y2Ba2 g hgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba)，其与自身中和效价相关(图2)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba(后助推器)和扩展数据图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。第2组和第3组猴子产生针对V5/C3和V1/V3表位的抗体应答(图3)。gydF4y2Ba2 g hgydF4y2Ba)与自体BG505 SHIV保护相关gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba．传统的丸加铝免疫猴子的抗体反应主要局限于Env三聚体碱基(图2)。gydF4y2Ba2 g hgydF4y2Ba)。总之，所使用的引物免疫策略与中和抗体的表位宽度和质量的显著改善有关。gydF4y2Ba

B的特点gydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba对启动后的细胞进行更详细的询问，以评估它们随时间的功能。BCL6是B的谱系定义转录因子gydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba对细胞的功能至关重要gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba．KI67(由gydF4y2BaMKI67gydF4y2Ba)标志着快速分裂的细胞。第5 ~ 6个月(21 ~ 25周)LN B细胞进行BCL6和KI67蛋白染色。平均约72%的env结合CD71gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD38gydF4y2Ba^{- - - - - -gydF4y2Ba}BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba细胞为KI67gydF4y2Ba^+gydF4y2BaBCL6gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，表示保留gydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba编程和扩散。为了进一步确定BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba在不同时间点的lnfnas细胞中，对约70,000个细胞进行了单细胞转录谱分析，这些细胞主要由env结合B组成，分别为3,4,7,10,13,16,29和33周gydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba细胞和外周血分选的env结合记忆B (BgydF4y2Ba_memgydF4y2Ba第16周(第2组)和第36周(第3组)的细胞。当分析所有时间点时，可以清楚地观察到LN B细胞中的暗区和亮区细胞团(图2)。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。然后我们检查了BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba3组RM长启动期(第3、7、16和29周;无花果。gydF4y2Ba3 d - hgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）gydF4y2Ba^{23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}．亮区和暗区状态持续了6个月。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)。关键功能B的表达gydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba基因gydF4y2BaMKI67gydF4y2Ba，gydF4y2BaAICDAgydF4y2Ba，gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba和gydF4y2BaCD40gydF4y2Ba随着时间的推移保持不变，并且在所有时间点都被划分为暗区和亮区细胞类型(图2)。gydF4y2Ba3情况gydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba6 dgydF4y2Ba)。在整个启动过程中，暗区与亮区细胞的比例保持相对一致。gydF4y2Ba3我gydF4y2Ba)。总的来说，抗原特异性BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba在6个月的时间内，细胞具有稳定的表型特征，表明功能性BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba在没有进一步免疫的情况下细胞特性。gydF4y2Ba

为了直接评估这些延长时间内gc的功能，使用多种实验方法比较2组和3组的RMs。env结合LN fna衍生B细胞受体(BCR)测序gydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba从9个时间点对细胞进行检测，以评估抗体体细胞超突变(SHM)随时间的变化，以及克隆谱系中的克隆多样性和突变模式(图2)。gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba10克ydF4y2Ba)。Env-binding BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba细胞重链(HC)核苷酸突变在第3周和第10周之间显著增加(gydF4y2BaPgydF4y2Ba第2组和第3组的Mann-Whitney标准< 0.0001;无花果。gydF4y2Ba4 a、bgydF4y2Ba)。值得注意的是,BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba在没有进一步免疫的情况下，3 RMs组的细胞继续积累突变，直到第29周，此时HC突变的中位数为17，其中前25%为BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba含有22-45个HC突变的细胞(图2)gydF4y2Ba4 a、bgydF4y2Ba)。长启动期(第29周)与10周启动期的SHM差异非常显著(gydF4y2BaPgydF4y2BaMann-Whitney < 0.0001，图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba;gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0009，图。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)，并且第10周和第29周之间的中位突变差异与第4周和第10周之间的差异一样大，表明强健的GC功能至少持续到第29周(图2)。gydF4y2Ba4得了gydF4y2Ba)。未突变env结合B的比例gydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba随着时间的推移，细胞数量下降，到第7周，未突变的细胞数量为0.19-0.42%(图2)。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)。在轻链(LC)中也观察到大量突变，其模式与hc相当(扩展数据图)。gydF4y2Ba7模拟gydF4y2Ba)。Env-binding BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba随着时间的推移，细胞的估计克隆丰富度逐渐降低(Chao1)。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba7 egydF4y2Ba)，具有持续的多样性(辛普森多样性指数)(扩展数据图。gydF4y2Ba7 f, ggydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

加强免疫后，HC突变在env结合B中增加gydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba2组和3组RMs的细胞中，长引物RMs的突变总数最高(增强后第3周HC中位突变数为13比20)。gydF4y2Ba4 b, cgydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba)。对LC突变进行了类似的观察(扩展数据图)。gydF4y2Ba7 dgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

预助推Env-binding BgydF4y2Ba_memgydF4y2Ba电池(CD20gydF4y2Ba^+gydF4y2BaIgDgydF4y2Ba^{- - - - - -gydF4y2Ba}EnvgydF4y2Ba^+/+gydF4y2Ba)外周血频率在RMs 2和3组是相等的(图2)。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba及扩展数据图gydF4y2Ba7小时gydF4y2Ba)。增强env结合BgydF4y2Ba_memgydF4y2Ba两组的频率(图2)gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)。具有长撇的RMs具有更多高度突变的BgydF4y2Ba_memgydF4y2Ba克隆丰富度较高gydF4y2Ba_memgydF4y2Ba细胞(图。gydF4y2Ba4 f, ggydF4y2Ba)，具有等效的辛普森多样性指数(扩展数据图。gydF4y2Ba7我gydF4y2Ba)。这也反映在免疫优势、碱基结合、env特异性B的显著转变上gydF4y2Ba_memgydF4y2Ba长引物组的细胞增强后，在2组中未见(图2)。gydF4y2Ba4 hgydF4y2Ba)，这种现象也反映在循环抗体滴度中(图2)。gydF4y2Ba4我gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

配对BCR序列的克隆谱系分析用于检测单次免疫后几个月的GC持续时间和功能。鉴定出许多克隆系，其中BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba在第一个和最后一个LN FNA时间点观察到的克隆在prime和广泛的SHMs之间(图2)。gydF4y2Ba4 j, kgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba10克ydF4y2Ba)。部分克隆系与BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba在每一个或几乎每一个lnfna时间点观察到克隆，提供了BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba细胞持续时间超过29周(图2)。gydF4y2Ba4 j, kgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba和gydF4y2Ba10 a, cgydF4y2Ba)。无性系中无性系分化明显。与种系进化差异最大的子克隆通常出现在较晚的时间点(突变与时间相关性:谱系21094;gydF4y2BaRgydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba}= 0.72,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001;29121年传承,gydF4y2BaRgydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba}= 0.68,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001)。gydF4y2Ba4 jgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba和gydF4y2Ba9 c, dgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

对于一些血统，如5491和29183，大多数早期的BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba流式细胞术检测细胞克隆未与Env结合gydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}B项正确。gydF4y2Ba_GCgydF4y2BaBgydF4y2Ba_memgydF4y2Ba通过流式细胞术(Env)克隆结合EnvgydF4y2Ba^+/+gydF4y2Ba)，表明克隆开始时对Env的亲和力较低，随后成熟(扩展数据图。gydF4y2Ba10 a, bgydF4y2Ba)。为了直接评估这些谱系的亲和成熟度，从三个大的克隆谱系的几个时间点产生了单克隆抗体。来自谱系20181的早期单克隆抗体对MD39的亲和力相对较低(第4周);gydF4y2Ba解离常数KgydF4y2Ba_dgydF4y2Ba) = 2.19 × 10gydF4y2Ba^{−7gydF4y2Ba}M)。亲合力增加了大约17倍(gydF4y2BaKgydF4y2Ba_dgydF4y2Ba= 1.23 × 10gydF4y2Ba^{−8gydF4y2Ba}到第16周观察到，到第29周进一步(大约)增加了两倍(gydF4y2BaKgydF4y2Ba_dgydF4y2Ba= 6.52 × 10gydF4y2Ba^{−9gydF4y2Ba}M)，表示亲和性总体增加了约30倍(扩展数据图)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。在29121谱系中，第3周亲和力最低的抗体(gydF4y2BaKgydF4y2Ba_dgydF4y2Ba= 1.55 × 10gydF4y2Ba^{−6gydF4y2Ba}M)使用与未突变共同祖先(UCA)的氨基酸序列相同的HC(扩展数据图)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。在这个谱系中，通过流式细胞术，在第3周发现的几乎三分之一的细胞没有结合MD39，包括UCA HC克隆(扩展数据图)。gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba)，这表明该谱系开始具有非常弱的亲和力，并且仍然能够大量参与GC反应。在同一谱系中，在第16周和第29周分离出的抗体亲和度约为200倍(gydF4y2BaKgydF4y2Ba_dgydF4y2Ba= 7.70 × 10gydF4y2Ba^{−9gydF4y2Ba}M)和950倍(gydF4y2BaKgydF4y2Ba_dgydF4y2Ba= 1.63 × 10gydF4y2Ba^{−9gydF4y2Ba}M)高于第3周HC UCA克隆(扩展数据图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。最后，低亲和力的21094抗体(第3周)，gydF4y2BaKgydF4y2Ba_dgydF4y2Ba> 1.00 × 10gydF4y2Ba^{−5gydF4y2Ba}M;EnvgydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}通过流式细胞术，在第29周时，亲和力提高了1000倍以上(gydF4y2BaKgydF4y2Ba_dgydF4y2Ba= 9.55 × 10gydF4y2Ba^{−9gydF4y2Ba}M, 6.49 × 10gydF4y2Ba^{−9gydF4y2Ba}M)(扩展数据图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。综上所述，这些数据有力地支持了以下结论:在6个月的启动期间，大量亲和成熟发生，在某些情况下导致BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba细胞的亲和力提高了约1000倍。gydF4y2Ba

BgydF4y2Ba_memgydF4y2Ba细胞通常在多个亚谱系的克隆谱系树中表现出来，包括在LN FNA B晚期观察到的突变最多的分支gydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba时间点(图2)gydF4y2Ba4 j, kgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9 a、bgydF4y2Ba和gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)，表明GCs有效地输出高度突变的BgydF4y2Ba_memgydF4y2Ba细胞。在长端GCs中观察到具有其他有趣特征的克隆谱系，包括谱系21275，从第3周到第29周几乎完全是IgM(扩展数据图)。gydF4y2Ba10 cgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

在长引物gc中，在不同时间点的左、右ILN中都检测到克隆谱系(图2)。gydF4y2Ba4 kgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9 a、bgydF4y2Ba和gydF4y2Ba10 b, cgydF4y2Ba)。在169个通过严格标准的克隆谱系中(HC互补决定区3 (H-CDR3)长度大于14,H-CDR3中多个N的添加，总数超过20个细胞和一个匹配的LC)， 11个谱系在不同时间点在两个LN中都被观察到(每个LN有10个或更多细胞)，提供了BgydF4y2Ba_memgydF4y2Ba一个LN中由GCs产生的细胞可以退出，再循环并进入另一个LN中正在进行的GCs。使用限制性较低的克隆谱系标准(包含至少5个H-CDR3长度大于10的细胞和匹配的LC)，我们观察到889个克隆谱系中有54个可以在双边LNs中找到(扩展数据图)。gydF4y2Ba10 fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

总之，在许多抗原特异性克隆谱系中观察到的关键特征提供了BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba细胞持续超过29周，体细胞突变以相当大的速率持续积累，亲和成熟，克隆迁移和外周B的播种gydF4y2Ba_memgydF4y2Ba这些结果共同表明，在特定条件下，GCs能够在没有新抗原暴露的情况下进行极长时间的克隆进化。gydF4y2Ba

长期GCs通常在慢性感染和肠道微生物群暴露的情况下被观察到gydF4y2Ba^{25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}已知有持续的活的更新抗原来源的条件。最近关于流感感染中持续时间较长的GCs的报告gydF4y2Ba^27gydF4y2BaSARS-CoV-2感染gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba和人类RNA疫苗gydF4y2Ba^{29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba}重新引起了人们对长期GCs的可能性的兴趣，这些GCs可能在低水平或无重新抗原暴露的条件下发生。在这里，我们清楚地证明，在没有新抗原的情况下，GCs可以持续至少191天，使用的实验系统利用了蛋白质免疫、12天慢递送免疫策略、强效佐剂和使用Env探针来识别抗原特异性BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba细胞。此外，我们证明了GCs在6个月内是非常健壮和功能的。BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba细胞保持增殖、SHM和亲和成熟，持久的GCs可以产生高的自体2层中和抗体滴度、异源中和抗体滴度和高度体细胞突变的循环env特异性BgydF4y2Ba_memgydF4y2Ba细胞转移到非env碱基表位。gydF4y2Ba

12至14天的缓慢递送免疫方案可导致基质滤泡树突状细胞更大程度地捕获疫苗抗原gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba．6个月以上的GCs观察表明滤泡树突状细胞对免疫复合物的内吞循环gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba在维持GCs中的蛋白质并保护它们免受损害方面效率惊人。GCs缓慢递送增强的一个可能机制是，由于抗体应答开始后抗原的供应，免疫复合物的形成得到了改善。鉴于常规免疫后抗体对Env三聚体非中和碱基的免疫优势，以及缓慢递送免疫中抗原表位向非碱基表位的多样化(图2)。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba)，我们推测在缓慢递送条件下，具有Env的免疫复合物主要由碱基结合抗体组成，该抗体在GCs中屏蔽Env三聚体的碱基，并使三聚体定向以更好地展示与碱基对映的中和表位，从而富集以中和抗体B细胞。这进一步说明了B中从碱基定向免疫优势的转变gydF4y2Ba_memgydF4y2Ba长起始期的细胞(图2)gydF4y2Ba4 hgydF4y2Ba)。因此，在第3组猴子中发现的自体和异源中和的改善可能部分是由于募集的B细胞的多样性，部分是由于广泛的GC反应增加了亲和成熟。这些结果与我们的预测相符，即免疫优势是影响候选HIV疫苗中和抗体反应的主要因素，非中和抗体反应的免疫优势可以通过向GCs招募更多不同的B细胞并为这些细胞提供足够的时间来使亲和成熟成为具有竞争力的B细胞来克服gydF4y2Ba_memgydF4y2Ba非中和性B细胞gydF4y2Ba_memgydF4y2Ba加强免疫时的细胞gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba．研究延长两次加强免疫接种之间的时间的潜在影响是有意义的。gydF4y2Ba

长引物组3在引物后第20周至第29周之间出现中和效价，表明亲和力持续成熟，导致GC输出新的浆细胞，这些浆细胞可以在初始免疫后数月产生中和抗体。关于B细胞记忆发育的动力学，我们的数据与以早期B细胞为主的模型不一致gydF4y2Ba_memgydF4y2Ba持续的gc产生的细胞如果是这样，中值BgydF4y2Ba_memgydF4y2Ba细胞HC SHMs较低(例如，2 - 5个突变)，对应于早期BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba细胞(3-4周)。相比之下，中位数BgydF4y2Ba_memgydF4y2Ba细胞HC SHM在第36周为17(图2)。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)和少于15%的BgydF4y2Ba_memgydF4y2Ba细胞的突变少于10个。对这些观察的最简单的解释是，早期的BgydF4y2Ba_memgydF4y2Ba细胞可能重新进入GCs，进行进一步的SHM和亲和成熟。我们发现共享BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba左右两侧的l和循环B之间的克隆gydF4y2Ba_memgydF4y2Ba细胞最符合这个BgydF4y2Ba_memgydF4y2BaGC再入模型。此外，这些数据与B的一个模型不一致gydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba大约1个月后细胞消失，并被传入的初始B细胞取代，因为1个月后未突变的B细胞在GCs中很少见(图2)。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)和中位数BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba细胞SHM水平持续升高超过6个月。BgydF4y2Ba_GCgydF4y2Ba细胞克隆谱系也被观察到在启动后跨越了整整6个月。总的来说，我们的数据与B正在进行的生产或回收是一致的gydF4y2Ba_memgydF4y2Ba在整个启动过程中，持续的GCs产生浆细胞。gydF4y2Ba

我们已经证明，GCs在启动免疫后可以持续6个月以上，并有几个显著的结果。这些发现表明，耐心在允许GCs抗体在较长时间内多样化和进化方面具有价值，并且这种长起始期、缓慢递送的免疫方法有望针对困难的疫苗目标。gydF4y2Ba

蛋白表达与纯化gydF4y2Ba

BG505 MD39 SOSIP Env trimers (MD39)在HEK293F细胞中与furin共表达，表达方式如上所述gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba．用于免疫的三聚体是无标记表达的，并进行了低内毒素水平的质量检查。BG505 MD39 SOSIP和BG505 MD39敲除三聚体作为流式细胞术的诱饵，使用c端Avi-tag表达，并根据制造商的说明使用BirA生物素化试剂盒进行生物素化(Avidity)。BG505 MD39碱基敲除三聚体相对于BG505 MD39 SOSIP有以下突变:A73C、R500A、P561C、C605T、S613T、Q658T、L660N、A662T和L663C。gydF4y2Ba

将合成的Fab可变区基因克隆到人抗体表达载体中，制备单克隆抗体。hc表达为人IgG1。用Genscript制备抗体表达质粒和重组表达的单克隆抗体。gydF4y2Ba

动物和免疫gydF4y2Ba

对于MD39 + SMNP升级剂量免疫组，印度恒河猴(gydF4y2Ba解剖gydF4y2Ba)被安置在Alpha Genesis，并按照Alpha Genesis动物护理和使用委员会(IACUC)批准的协议进行治疗。两名女性和两名男性，年龄和体重相匹配，被分配到每个实验组。在启动免疫时，猴子的年龄为2-3岁。所有免疫接种均在左、右大腿中部皮下注射，总剂量为MD39 50µg, SMNP 375µg。对于启动，采用12天递增剂量策略(扩展数据图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

对于MD39加明胶丸组，RMs被安置在杜兰国家灵长类动物研究中心，作为更大的NHP研究的一部分(I.P.等人，手稿正在准备中)。这项研究得到了杜兰大学IACUC的批准。动物按年龄、体重和性别分组。第一次免疫时动物年龄为3.5 ~ 5.0岁，研究组雌性3只，雄性3只。所有免疫接种均在左、右大腿中部皮下注射50µg MD39和500µg明矾(2%的醛凝胶佐剂);每边InvivoGen)。所有动物均按照NIH的指导方针进行饲养。gydF4y2Ba

LN FNA)gydF4y2Ba

使用fna对左、右il n进行取样，并由兽医执行。通过触诊确定引流LNs。连接3毫升注射器的22号针头进入LN最多5次。样品置于含有10% (v/v)胎牛血清(FBS)和1倍青霉素/链霉素(pen/strep)的RPMI中。样品离心，如果样品被红细胞污染，则使用氯化铵-钾裂解缓冲液。样品被冷冻并保存在液氮中直到分析。gydF4y2Ba

流式细胞术和分选gydF4y2Ba

冷冻的FNA或PBMC样品解冻，并在RPMI中以50% (v/v) FBS恢复。对回收的活细胞进行计数，并用相应的染色板进行染色。将生物素化的MD39与荧光基团偶联的链亲和素(SA)在室温(RT)下，在适当体积的1倍PBS中混合45分钟，制备MD39和MD39碱基敲除诱饵。将MD39和链亲和素加入细胞中20分钟，然后将抗体主混合物在4°C下继续添加30分钟。在使用敲除诱饵的情况下，首先将这些诱饵添加到细胞中20分钟，然后将WT MD39和链亲和素诱饵添加到细胞中再添加20分钟，然后将染色板的剩余部分添加到4°C下再添加30分钟，类似于先前描述的方案gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba．完全补充RPMI (R10;10% (v/v) FBS, 1× pen/strep, 1× GlutaMAX)作为FACS缓冲液。为了分选，在添加主混合物时，每个样品中分别添加抗人标签抗体(biolgend)，浓度为每500万个细胞2.5µg。第一组样品在FACSFusion (BD Biosciences)上进行分类;从第2组和第3组获得或在FACSymphony S6 (BD Biosciences)上进行分类。按照Single Indexed 10X Genomics V(D)J 5’V .1.1的协议，使用Feature Barcode kit (10X Genomics)制备lnfna样品的Indexed V(D)J、Feature Barcode和GEX文库。对于已分类的PBMC样本，使用Dual Indexed 10X Genomics V(D)J 5’V .2和Feature Barcode kit (10X Genomics)制备Indexed V(D)J、Feature Barcode和GEX文库。定制引物设计针对RM BCR恒定区域。PCR 1引物组:forward, aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacctc; reverse, AGGGCACAGCCACATCCT, TTGGTGTTGCTGGGCTT, TGACGTCCTTGGAAGCCA, TGTGGGACTTCCACTGGT, TGACTTCGCAGGCATAGA. Primer set for PCR 2: forward, AATGATACGGCGACCACCGAGATCT; reverse, TCACGTTGAGTGGCTCCT, AGCCCTGAGGACTGTAGGA, AACGGCCACTTCGTTTGT, ATCTGCCTTCCAGGCCA, ACCTTCCACTTTACGCT. Forward primers were used at a final concentration of 1 µM and reverse primers at 0.5 µM, each per 100 µl of PCR reaction. Libraries were pooled and sequenced on a NovaSeq Sequencer (Illumina) as previously described^33gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

在长质点跟踪阶段(16-25周，右LNs)，样品按上述方法染色，在BD Cytofix (BD Biosciences)中固定，然后在FACSCelesta (BD Biosciences)上分析。对于细胞内染色，如上所述对细胞进行染色，然后用Foxp3/转录因子染色试剂盒(Invitrogen)进行固定。用1倍稀释的渗透缓冲液洗涤细胞，然后用针对目标转录因子的抗体染色1小时。细胞清洗并在Cytek Aurora (Cytek Biosciences)上进行分析。所有流式细胞术数据在Flowjo v.10中进行分析(BD生物科学)。gydF4y2Ba

对于GC门控中的LN FNA数据包含，使用样品中250个B细胞的阈值，对于env结合GC B细胞门控，使用75个GC B细胞的阈值。任何GC B细胞少于75个但B细胞计数超过500个的样品均设置为0.001% Env的基线gydF4y2Ba^+gydF4y2BaGC B细胞(B百分比);否则，根据免疫前LN FNA样品中(3/(收集的B细胞数))的中位数计算检测限。一些第2组和第3组LN FNA小瓶在染色样品中几乎检测不到细胞，因此未进行分析。gydF4y2Ba

使用以下试剂进行染色:Alexa Fluor 647链亲和素(Invitrogen)， BV421链亲和素(biolgend)， BV711链亲和素(biolgend)， PE链亲和素(Invitrogen)，活/死固定水(Invitrogen)，碘化丙烯(Invitrogen)， eBioscience固定活力染料eFluor 780 (Invitrogen)，小鼠抗人CD20 BV785, BUV395, Alexa Fluor 488, PerCP-Cy5.5 (2H7, biolgend)，小鼠抗人IgM PerCP-Cy5.5, BV605 (G20-127, BD Biosciences)，小鼠抗人CD4 BV650, Alexa Fluor 700 (OKT4, biolgend)，小鼠抗人PD1 BV605 (EH12.2H7, biolgend)、小鼠抗人CD3 BV786、APC- cy7 (Sp34-2, BD Biosciences)、小鼠抗人CXCR5 PE- cy7 (MU5UBEE, ThermoFisher)、小鼠抗人CD71 PE- cf594、FITC (L01.1)、小鼠抗人CD38 PE、APC (OKT10, NHP试剂)、小鼠抗人CD8a APC- efluor 780 (RPA-T8, ThermoFisher)、小鼠抗人CD14 APC- cy7 (M5E2, biolgend)、小鼠抗人CD16 APC- cy7 (3G8, biolgend)、小鼠抗人CD16 APC- efluor 780 (ebioCD16, Invitrogen)、小鼠抗人IgG Alexa Fluor 700、BV510和BV786 (G18-145, BD Biosciences)，小鼠抗nhp CD45 BUV395 (D058-1283, BD Biosciences)，小鼠抗人BCL6 Alexa Fluor 647 (K112-91, BD Biosciences)，小鼠抗人KI67 BV480 (B56, BD Biosciences)，小鼠抗人FoxP3 BB700 (236A/E7, BD Biosciences)，小鼠抗人CD27 PE- cy7 (O323, biolgend)，山羊抗人IgD FITC(多克隆，Southern Biotech)，亚美尼亚地鼠抗鼠/人Helios PE/Dazzle 594 (22F6, biolgend)，TotalSeq-C抗人标签抗体1-8 (LNH-94和2M2, biolgend)和TotalSeq-C0953 PE Streptavidin (biolgend)。gydF4y2Ba

抗原特异性GC-T检测gydF4y2Ba_{跳频gydF4y2Ba}细胞gydF4y2Ba

抗原诱导标记物鉴定env特异性GC-TgydF4y2Ba_{跳频gydF4y2Ba}细胞按前面描述的进行gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba}．总之，细胞在50% (v/v)的RPMI中解冻，在500µl的R10中重悬(100µl的R10中重悬)，在37°C的CO中悬浮15分钟gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}在恒温箱和湿度控制箱中，加入5 ml R10，细胞进一步休息3小时。在R10中以每孔约100万个细胞计数并播种，末浓度为2.5µg ml孵育gydF4y2Ba^1gydF4y2BaMD39 Env肽池，10 pg mlgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba仅限葡萄球菌肠毒素或培养基(未刺激)，在37°C的CO中培养18小时gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}和湿度控制的培养箱。小鼠抗人CXCR5 PE-Cy7 (1:100, MU5UBEE;在增产作业开始时，每口井都加入了ThermoFisher。细胞在4°C的黑暗中洗涤和染色45分钟。染色后，冲洗细胞并用BD Cytofix (BD Biosciences)固定，并在BD FACSCelesta (BD Biosciences)上分析。在流动面板中使用了以下抗体:小鼠抗人CD4 Alexa Fluor 700 (OKT4, biolgend)、小鼠抗人CD20 BV785 (2H7, biolgend)、小鼠抗人PD1 BV605 (EH12.2H7, biolgend)、小鼠抗人CXCR5 PE- cy7 (MU5UBEE, ThermoFisher)、小鼠抗人CD134 PE (L106, BD biolgend)、小鼠抗人4-1BB APC (4b1 -1, biolgend)、小鼠抗人CD25 FITC (BC96, biolgend)、小鼠抗人CD16 APC- efluor 780 (ebioCD16, Invitrogen)、小鼠抗人CD8a APC- efluor 780 (RPA-T8, ThermoFisher)、小鼠抗人CD14 APC-Cy7 (M5E2, BioLegend)和eBioscience固定活力染料eFluor 780 (Invitrogen)。gydF4y2Ba

中和化验gydF4y2Ba

在斯克里普斯进行假病毒中和试验，如前所述gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba．采用BG505. w6m . env对BG505假病毒进行中和试验。C2分离物T332N突变恢复N332糖基化位点。每个分析用重复的孔进行分析，并进行4次独立重复。异种中和广度在12个跨进化支分离株上进行了测试，这些分离株代表了从不同地理位置和进化支分离的较大病毒群gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba．在某些图形中，病毒名称缩写如下:398-F1_F6_20: 398F1;246年的今天,f3_c10_2: 246 f3;CNE55:不缩写;CNE8:不缩写;X2278-C2-B6: X2278;tr .11:不缩写;BJOX002000.03.2: BJOX2000;CH119.10:不缩写;Ce703010217_B6: Ce0217; Ce1176_A3: Ce1176; 25710-2.43: 25710; X1632_S2_B10: X1632. Heterologous neutralization breadth assays at Scripps were performed with duplicate wells per assay, and four independent repeats of heterologous neutralization breadth assays. The cut-off for neutralizing serum dilution was set at 1:30 or 1:20 depending on the starting serum dilution. For Fig.2 c, dgydF4y2Ba，身份证gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba小于或等于30被认为是非中和的。绝对的IDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba采用归一化相对发光单位和自定义非线性回归模型计算值:gydF4y2Ba

底部约束设置为0，顶部约束设置为Prism 8 (GraphPad)中的<100模型。杜克大学假病毒中和试验如前所述进行gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba．阳性对照(单克隆抗体)包括在每一个实验运行的每一个病毒和跟踪作为实验质量控制的一部分，以及小鼠白血病病毒阴性对照。杜克大学的样品进行了重复检测，并按照良好的临床实验室规范进行了检测。gydF4y2Ba

ELISAgydF4y2Ba

血浆样品解冻，在56°C下热灭活至少30分钟，然后纺丝。康宁96孔半面积板涂上链霉亲和素(2.5µg ml)过夜gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba．用洗涤液(PBS, 0.05% (v/v) Tween-20)洗涤三次，然后用生物素化MD39或MD39碱基敲除三聚体(1µg ml)包被gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba．用洗涤缓冲液洗涤三次后，用阻断缓冲液(PBS, 3% (w/v) BSA)阻断1小时，在阻断缓冲液中稀释的血浆在rt下与三聚体结合1小时。冲洗三次，用山羊抗恒河猴IgG-HRP抗体(Southern Biotech, 1:10 000阻断缓冲液)在rt下孵育1小时。冲洗六次，用1- step Ultra TMB (ThermoFisher)冲洗。用等量的2N H停止反应gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}所以gydF4y2Ba_{4 gydF4y2Ba}(Ricca Chemical Co.)，在EnVision平板阅读器(Perkin Elmer)上以450 nm的光密度读取信号。终点滴度从Prism 9 (GraphPad)中的不对称s型，5PL X对数(浓度)模型插值。gydF4y2Ba

表面等离子体共振gydF4y2Ba

研究了表面等离子体共振(SPR)传感器芯片捕获的MD39三聚体分析物与igg的相互作用。在这些实验中确定的明显亲和力并不反映单价fab -三聚体相互作用，而是包括由于亲和性而增强的结合。在Biacore 8K (Cytiva)上，使用Series S CM5 Sensor Chip (Cytiva)和1× HBS-EP+ pH 7.4运行缓冲液(来自Teknova的20×原液)，添加1 mg ml的BSA，测量抗体-抗原相互作用的表观动力学和亲和性gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba．根据制造商的说明书(GE)使用人抗体捕获试剂盒在每个流式细胞上固定约7000个捕获抗体反应单位。在一个典型的实验中，在每个流动细胞上捕获大约300-400个单克隆抗体反应单位，三聚体分析物以15µl min的速度通过它们gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba2分钟，然后5分钟的解离时间。用3m MgCl完成再生gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}接触时间为240秒。gp140原聚体的最高浓度为10µM，每个三聚体有3个原聚体。测试了五种分析物浓度，稀释倍数为四倍。原始传感器图使用Biacore Insight Evaluation软件v.3.0.12.15655 (Cytiva)进行分析，包括空白双参考，并使用1:1结合化学计量学的Langmuir模型动力学拟合。在NanoDrop 2000c分光光度计上使用280 nm的吸收信号测量分析物浓度。gydF4y2Ba

EMPEM分析gydF4y2Ba

如前所述，我们进行了多克隆电镜分析gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}．血浆抗体使用Protein A Sepharose resin (GE Healthcare)纯化，用0.1 M甘氨酸在pH 2.5下从树脂中洗脱，将缓冲液交换到1倍PBS中。晶圆片使用结晶木瓜蛋白酶(Thermo Scientific)生成，在37°C下消化5小时，并使用Superdex 200 Increase 10/300柱(GE Healthcare)通过粒径隔离层析(SEC)纯化。配合物用0.5 mg多克隆Fab与15µg MD39 Env三聚体在RT下孵育过夜组装，然后使用Superose 6 Increase 10/300色谱柱(GE Healthcare)通过SEC纯化去除未结合的Fab。配合物稀释至30-50µg mlgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba，立即放置在400目铜网格上，用2% (w/v)甲酸铀酰染色40秒。通过Leginon自动成像接口，使用Tecnai Spirit电子显微镜(工作电压为120千伏)或Tecnai TF20电子显微镜(工作电压为200千伏)采集图像;前者的标称放大倍率为×52,000，像素尺寸为2.06 Å;TF20的标称放大倍率为×62,000，像素尺寸为1.77 Å。显微照片记录使用Tietz 4k × 4k TemCam-F416 CMOS相机。通过Appion数据处理包提取粒子gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba其中大约有10万个粒子被自动挑选和提取。使用Relion 3.0(参考。gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba)，将颗粒二维分为100类，并选择具有抗原- fab特征的颗粒进行三维(3D)分析。最初使用20-40个类别进行3D分类，以非配体HIV Env外域的低分辨率模型作为参考。来自相似外观类的粒子被组合并重新分类，使用3D自动细化处理3D类的子组。使用UCSF Chimera 1.13对3d精细地图进行可视化和分割。表位识别定量图。gydF4y2Ba2 hgydF4y2Ba通过将每组每只动物识别的表位数量制成表格，然后对每组进行整理(例如，总共6个表位位点× 4只动物= 24)。每只动物未识别的表位位点也被制成表格，以解释动物群体大小的变化。Fisher的精确测试被用来测试各组识别的表位数量的显著差异。gydF4y2Ba

BCR的测序和处理gydF4y2Ba

使用先前发布的引用生成了一个自定义RM生殖系VDJ库gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba^39gydF4y2Ba．CellRanger V .3.0用于组装全长V(D)J读取。修改了CellRanger VDJ python库中的constants.py文件，将可接受的最大CDR3长度增加到110个核苷酸。使用CellRanger v.6从测序的GEX文库中获得基因表达计数。文库与Ensemble Mmul10参考基因组对齐，并添加了来自Mmul9的线粒体基因。在Seurat v.4中，使用MULTIseqDemux命令通过标签对序列进行解复用(ref。gydF4y2Ba^40gydF4y2Ba)。对于同时检测到kappa和lambda轻链(LC) contigs的HC序列，B细胞被分配为lambda LC，因为lambda LC重排仅在kappa LC不产生时发生。gydF4y2Ba

BCR序列的纵向谱系和体细胞突变分析gydF4y2Ba

使用来自魔咒门户的包进一步分析了CellRanger的VDJ序列输出gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba．从定制RM种系VDJ库构建IgBLAST数据库，然后使用Change-O管道将CellRanger的10xv (D)J输出解析为AIRR社区标准化格式，以便通过imcantation门户进行进一步的下游分析。使用DefineClones.py对每只动物的克隆谱系进行确定，使用适当的聚类阈值(由r中SHazaM包中的distToNearest命令确定)。从参考库中推断出的种系V和J序列与CreateGermline.py一起添加。由于种系D基因序列和N核苷酸的添加不能准确预测，因此这些在进一步的分析中被掩盖了。Env的稀薄分析gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba样品使用iNext R包进行gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba确认可接受的序列覆盖范围(扩展数据图。gydF4y2Ba10克gydF4y2Ba)。每个HC和LC序列的总突变数(V-和j基因)是通过Shazam的观察突变命令计算观察到的和预测的种系序列之间的核苷酸变化数来计算的。为了分析总HC突变，分析了所有高产HC contigs;对于lc，仅评估与hc配对的组群。VH或VL序列与等位基因IGHV3-100*01、IGHV3-100*01_S4205、IGHV3-100*01_S4375、IGHV3-36*01_S5206、IGHV3-36*01_S6650、IGHV3-NL_11*01_S5714、IGHV4-79-a、IGHV4-NL_1*01_S0419、IGLV1-69、IGLV1-ACR*0或IGLV2-ABX*01在所有时间点上与推断的种系序列相比，具有极高的取代核苷酸程度，可能是由于V(D)J参考文库不完整导致V基因分配不佳。这些序列被排除在进一步的分析之外。在构建克隆树时，只分析含有配对HC-LC BCR序列的克隆。建立了Dowser克隆家族的最大似然谱系树gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba使用GetTrees函数中的pml方法。对于谱系树，分支长度代表了每个HC序列及其最近的共同祖先在谱系中发生的总突变的估计数量，而不是简单的种系序列核苷酸变化的计数。在左右两个LNs中都能找到克隆谱系的严格鉴定标准包括以下要求:H-CDR3长度大于14,H-CDR3中有多个N添加，总数大于20个细胞，并且在谱系中有匹配的LC。还使用了一套更宽松的标准，包括以下要求:H-CDR3长度大于10，总共超过5个细胞，并且在谱系中具有匹配的LC。gydF4y2Ba

多样性分析gydF4y2Ba

利用iNext R计算克隆丰富度的Chao1估计gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba按以下公式包装:gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba_{奥林匹克广播服务公司gydF4y2Ba}观察到的物种总数和gydF4y2BaFgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba和gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}分别为单态和双态的个数。使用Alakazam的alphaDiversity函数计算Simpson多样性指数，LN FNA样品均匀重采样至50次，PBMC样品均匀重采样至25次，以校正测序深度，按多样性顺序(gydF4y2Ba问gydF4y2Ba) = 2。少于50个细胞的FNA样本和少于25个细胞的PBMC样本被排除在多样性分析之外。辛普森多样性(gydF4y2BaDgydF4y2Ba)采用逆辛普森指数公式计算，其中gydF4y2BaRgydF4y2Ba为丰富度(样本中单一谱系的总数)，PgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba的比例丰度是gydF4y2Ba我gydF4y2Bath血统:gydF4y2Ba

转录组分析gydF4y2Ba

软件包Seurat v.4(ref。gydF4y2Ba^40gydF4y2Ba)用于CellRanger生成的基因表达数据的基于图形的聚类和可视化。对每个样本进行初始过滤，以去除表达少于200个或多于4500个基因的细胞，以及那些转录组中包含线粒体DNA的比例低于10%的细胞。通过NormalizeData命令对基因表达计数进行日志规范化。通过SelectIntergrationFeatures函数确定了所有样本中的共同可变基因列表。使用RunPCA进行的主成分分析(PCA)对这些常见变量基因的表达进行了缩放。接下来，使用互反PCA约简将所有样本集成到单个数据集中，通过命令findinintegrationanchors和integredata删除批处理效果。利用findneighbors和FindCluster函数对整个集成数据集进行Louvain聚类。含有大量mtDNA水平高的细胞群，以及mtDNA水平低的细胞群gydF4y2BaMS4A1gydF4y2Ba(CD20)和gydF4y2BaCD19gydF4y2Ba的表达，被排除在进一步的分析之外。差异表达基因在Seurat中使用FindMarkers功能，通过对每个簇与所有其他簇运行Wilcoxon秩和检验来鉴定。基因集富集分析(GSEA)采用R - GSEA封装gydF4y2Ba^{44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba}．先前鉴定的人类光区、暗区、中间、B区差异表达基因gydF4y2Ba_memgydF4y2Ba浆细胞亚群之前也有描述gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba并结合在一起创造了用于GSEA的基因集。根据GSEA评分，选择LZ1和DZ5分别作为具有代表性的亮区和暗区集群。gydF4y2Ba

图形，统计和单元格生成计算gydF4y2Ba

除非另有说明，所有统计数据均在Prism 9或R中计算。所使用的统计检验显示在各自的图例中，并纳入了双尾检验。所有图形均在Prism 9或r中生成。在对数上绘制的数据显示几何平均值和几何标准差gydF4y2Ba_{10克ydF4y2Ba}轴;在线性轴上绘制数据的平均值和标准差。中位数和四分位数1和3显示了小提琴图。使用Seurat v.4生成UMAP图(ref。gydF4y2Ba^40gydF4y2Ba)。对于2组和3组HC和LC总突变的比较，只有按单只动物比较，平均突变有显著差异时才计算有统计学意义。在个体中提供额外的统计测试信息gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba实验方法部分。所有的曼-惠特尼测试都是双侧的。gydF4y2BaPgydF4y2Ba值的定义如下:不显著;gydF4y2BaPgydF4y2Ba> 0.05;＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba≤0.05;**gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01;* * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001;＊＊＊＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba≤0.0001。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba