摘要gydF4y2Ba
溶酶体有许多作用，包括降解大分子和向细胞核发送信号gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．溶酶体功能障碍发生在各种人类疾病中，如常见的神经退行性疾病和单基因溶酶体储存障碍(LSDs)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．对于大多数lsd，已经确定了致病基因，但在一些lsd中，所涉基因的功能尚不清楚，部分原因是溶酶体占细胞体积的一小部分，因此难以检测溶酶体含量的变化。在这里，我们开发了LysoTag鼠标，用于完整溶酶体的组织特异性分离，与其内容物的多模态分析兼容。我们使用LysoTag小鼠研究CLN3，一种功能未知的溶酶体跨膜蛋白。在儿童，失去gydF4y2BaCLN3gydF4y2Ba导致青少年神经元蜡样脂褐沉着病(巴顿病)，一种致命的神经退行性LSD。来自缺乏CLN3的小鼠大脑溶酶体的非靶向代谢物分析显示，甘油磷脂二酯(gpd)大量积累——甘油磷脂分解代谢的最终产物。GPDs也聚集在缺乏CLN3的培养细胞的溶酶体中，我们发现CLN3是它们溶酶体排出所必需的。CLN3的缺失也会破坏溶酶体中的甘油磷脂分解代谢。最后，我们发现Batten病患者脑脊液中甘油磷酸肌醇水平升高，提示甘油磷酸肌醇有可能用作疾病生物标志物。我们的研究结果表明CLN3对GPDs的溶酶体清除是必需的，并揭示了Batten病是一种神经退行性LSD，伴有甘油磷脂代谢缺陷。gydF4y2Ba
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MS蛋白质组数据通过PRIDE合作伙伴存储库保存到ProteomeXchange Consortium，并带有数据集标识符gydF4y2BaPXD018624gydF4y2Ba．我们的蛋白质组学分析中已知的溶酶体蛋白是基于基因本体细胞成分或UniProt亚细胞定位注释(gydF4y2Bahttps://www.uniprot.org/gydF4y2Ba)．条件LysoTag小鼠存放在Jackson实验室(菌株035401)。质粒或细胞系形式的其他独特生物材料可根据要求从通讯作者处获得。详细的脂组学和代谢组学数据见补充表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,分别。所生成的其他数据可根据要求从相应作者处获得。gydF4y2Ba源数据gydF4y2Ba提供了这篇论文。gydF4y2Ba
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确认gydF4y2Ba
我们感谢Abu-Remaileh和Sabatini实验室成员的见解;J. M. Kirkpatrick和FLI核心蛋白质组学;感谢这项研究的参与者和他们的家庭做出的宝贵贡献。这项工作得到了NIH (d02 - ca271386)、斯坦福阿尔茨海默病研究中心(ADRC)、查尔斯·金奖学金、BeatBatten(荷兰)和NCL-Stiftung(德国)基金会对m.a.r的资助。从NIH (R01 CA103866和R01 CA129105)到D.M.S. n.n.l和W.D.也得到了BeatBatten(荷兰)和NCL-Stiftung(德国)基金会的支持;斯坦福化学- h化学/生物接口项目、O 'Leary-Thiry研究生奖学金和NIH T32培训补助金(T32GM120007);A.L.C.由F31博士预科NRSA (5F31DK113665);C.G.和R.T.的部分资助来自德国研究基金会(DFG，德国研究基金会)，项目编号23928380-TRR 152和NCL-Stiftung(德国);A.O.由DFG通过研究培训集团ProMoAge (GRK 2155)， Else Kröner费森尤斯基金会(no.;2019_A79)、弗里茨-蒂森基金会(Fritz-Thyssen foundation); 10.20.1.022MN) and the Chan Zuckerberg Initiative Neurodegeneration Challenge Network (nos 2020-221617 and 2021-230967). The FLI is a member of the Leibniz Association and is financially supported by the Federal Government of Germany and the State of Thuringia. The CLN3 natural history study is funded by an NIH Clinical Center Bench to Bedside award and the NICHD intramural research programme (ZIA HD008989). M.A.-R. is a Terman Faculty Fellow at Stanford University.
作者信息gydF4y2Ba
作者及隶属关系gydF4y2Ba
贡献gydF4y2Ba
M.A.-R。D.M.S.发起了这个项目，并在N.N.L的帮助下设计了研究计划。N.N.L.和W.D.在a.l.c.、V.D.和S.H.C.的帮助下完成了大部分实验，并分析了数据;s.h.c.、T.K.和C.A.L.在LC-MS分析中起关键作用。W.D.还帮助分析LC-MS数据和u.n.m生成的GPD化学标准。I.H.和A.O.设计了蛋白质组学实验，并分析了溶酶体蛋白质组学数据。我们咨询了R.T.和C.G.关于CLN3的功能并编辑了手稿。A.N.D.D.和F.D.P.监督了CLN3的自然史研究，并提供了CSF样本。M.A.-R。nnl写了稿子，dms编辑了。gydF4y2Ba
相应的作者gydF4y2Ba
道德声明gydF4y2Ba
相互竞争的利益gydF4y2Ba
M.A.-R。他是Lycia Therapeutics的科学顾问委员会成员。andd和F.D.P.和Amicus治疗公司签订了合作研究协议。其他作者宣称没有利益竞争。gydF4y2Ba
同行评审gydF4y2Ba
同行评审信息gydF4y2Ba
自然gydF4y2Ba感谢David Pearce、Peter Vangheluwe和其他匿名审稿人对这项工作的同行评审所作的贡献。gydF4y2Ba
额外的信息gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba
扩展的数据图形和表格gydF4y2Ba
图1 LysoTag表达对体内溶酶体的影响。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba在组成型LysoTag小鼠中，通过使用HA表位抗体的免疫印迹法检测，TMEM192-3×HA在所有组织中表达。在TMEM192-3×HA的表达上观察到溶酶体标记物LAMP1、Cathepsin B、C和D的表达没有差异。以Vinculin和AKT作为加载对照。根据同一凝胶上运行的蛋白质标准，数字表示以kDa为单位的分子量。免疫印迹是两个独立实验的代表。gydF4y2BabgydF4y2Ba， 5-9周龄时具有所示基因型小鼠的归一化体重。小鼠分别称重。将每只小鼠的体重归一化为性别匹配的野生型同窝小鼠的平均质量，然后进行基因型池化，使用双尾未配对进行统计分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。（gydF4y2BangydF4y2Ba野性型、LysoTag+和LysoTag = 25、19和10gydF4y2BaLSLgydF4y2Ba小鼠,分别)。gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba在组成型LysoTag小鼠的大脑和肝脏组织中，对溶酶体水解酶活性的测量显示TMEM192-3×HA表达对溶酶体功能没有影响。为了测量组织蛋白酶B的活性，将其荧光底物与相应组织的匀浆孵育(见方法)。为了测定β-己糖苷酶活性，使用了荧光性4-甲基伞形基(MUF)- n -乙酰-β-氨基葡萄糖作为底物(见方法)。在37°C下测量荧光，并在无匀浆时观察到的背景荧光减法后显示数据(mean±s.e.m.;gydF4y2Ban =gydF4y2Ba4）.gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba有代表性的透射电子显微图显示来自LysoTag-(对照)和LysoTag+小鼠大脑和肝脏组织的溶酶体。溶酶体通过存在单膜和颗粒状，电子密集外观被识别。白色和红色箭头分别表示来自LysoTag-和LysoTag+小鼠细胞中的溶酶体。gydF4y2BangydF4y2Ba＝gydF4y2Ba每组2只小鼠，比例尺，500nm。该图显示了多个定量细胞中溶酶体的平均直径。用ImageJ v1.52测量各组溶酶体直径。(大脑,gydF4y2BangydF4y2Ba= 42和gydF4y2BangydF4y2Ba= 55个分别取自LysoTag-和LysoTag+小鼠的溶酶体。为肝、gydF4y2BangydF4y2Ba= 51和gydF4y2BangydF4y2Ba= 56个测定的溶酶体LysoTag-和LysoTag+小鼠。数据以均数±s.e.m.n.s表示:无显著性;双尾未配对gydF4y2BatgydF4y2Ba以及(gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba)．gydF4y2BaggydF4y2Ba，热图显示小鼠肝组织溶酶ip中早期和晚期内体标记物以及溶酶体标记物的富集。浓缩值来源于补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．凝胶源数据参见补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
扩展数据图2用于巴顿病研究的LysoTag小鼠模型的生成和验证。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，描述用于巴顿病研究的生成LysoTag模型的育种策略的示意图。gydF4y2BaCln3gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba将小鼠与杂合子组成型LysoTag小鼠杂交，然后将其后代杂交回gydF4y2BaCln3gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba动物产生指示的实验小鼠基因型。鼠标绘图是用BioRender创建的。gydF4y2BabgydF4y2BaTMEM192-3×HA融合蛋白在脑神经元溶酶体中的表达及定位gydF4y2BaCln3gydF4y2Ba+/+gydF4y2Ba, Cln3gydF4y2Ba+ /−gydF4y2Ba和Cln3gydF4y2Ba−−/gydF4y2BaLysoTag老鼠。TMEM192-3×HA，分别使用HA表位(溶酶体标记物LAMP1和神经元标记物neun)抗体进行免疫荧光检测，检测到溶酶体和神经元。比例尺= 5µm，放大的插图在主图像中用白框标记。在右侧面板中显示的TMEM192-3×HA和LAMP1之间的共定位百分比为gydF4y2BangydF4y2Ba=每个基因型7个细胞。数据以均数±s.e.m表示。显微照片至少代表三个独立的实验。gydF4y2BacgydF4y2Ba，火山图比较全脑匀浆的脂质组数据gydF4y2BaCln3gydF4y2Ba+ /−gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCln3gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba小鼠显示，只有少数脂类发生了明显的变化，它们属于磷脂(黄色)和溶血磷脂酰甘油(红色)。CLN3的缺失也导致大脑中双(单酰甘油)磷酸(BMP)的减少，这是一类溶酶体脂质(蓝色)。当未获得MS/MS碎片时，使用BMP/PG(青色)注释(见补充表)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba详细方法)。横线表示p值为0.05，垂直虚线表示折叠变化为2。每个点代表一种脂类。在负离子模式下获取数据，并归一化至内部脂质标准，以获得最佳匹配的脂质类别(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5和4为gydF4y2BaCln3gydF4y2Ba+ /−gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCln3gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba小鼠,分别)。使用的是平均年龄为7个月的雌性小鼠。数据见补充表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．双尾未配对gydF4y2BatgydF4y2Ba-test被使用。gydF4y2Ba
图3验证甘油磷酸二酯(GPDs)作为CLN3丢失后在溶酶体中积累的代谢物。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，使用非靶向代谢组学分析鉴定和注释代谢物。非靶向代谢组学实验流程概述在高分辨率精确质量仪上使用全扫描模式收集每个样品的MS1数据。MS/MS数据采集于混合样品，仅用于化合物鉴定。然后使用Thermo Compound Discoverer v3.1对数据进行分析，生成一个独特特征列表，该列表被反卷积为一个独特化合物列表。进行了差异和统计分析。在差异分析中具有统计学意义的化合物在可用时使用真实标准进行验证和识别。如果没有可靠的标准，则通过将MS/MS数据与数据库进行比较来注释化合物gydF4y2Ba在网上gydF4y2Ba碎片预测(竞争碎片建模id, CFM-ID)。然后根据代谢组学标准倡议(MSI)指南报告数据。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba，负离子模式下GPC和GPI的镜像图。甘油-磷酸基常见片段用星号*表示。与Kopp等报道的MS/MS谱中发现的片段相同。gydF4y2Ba32gydF4y2Ba用†表示。gydF4y2BadgydF4y2Ba与内部生成的标准(Std)一起分析了一系列样品中GPE和GPG的eic，并显示了匹配的保留时间(RT)。e,f，分别为GPE和GPG的镜像图。甘油-磷酸基常见片段用星号*表示。与Kopp等报道的MS/MS谱中发现的片段相同。gydF4y2Ba32gydF4y2Ba用†表示。gydF4y2BaggydF4y2Ba，镜像图显示来自实验样品的甘油磷酸丝氨酸的MS/MS光谱与生成的MS/MS光谱的比较gydF4y2Ba在网上gydF4y2Ba使用CFM-ID。甘油-磷酸基常见片段用星号*表示。与Kopp等报道的MS/MS谱中发现的片段相同。gydF4y2Ba32gydF4y2Ba用†表示。gydF4y2BahgydF4y2Ba，用Amplicon测序进行验证gydF4y2BaCLN3gydF4y2Ba敲除使用CRISPR-Cas9生成的细胞。鉴定出三个突变等位基因，并发现所有突变等位基因都产生移码缺失gydF4y2BaCLN3gydF4y2Ba编码序列与野生型序列的比较。gydF4y2Ba我,gydF4y2BaFlag-CLN3蛋白在溶酶体中的定位。分别使用Flag表位抗体和溶酶体标记LAMP2进行免疫荧光检测Flag- cln3和溶酶体。比例尺= 5 μm。显微照片是三个实验的代表性图像。gydF4y2Baj,gydF4y2Ba表达TMEM192-3×HA或LAMP1-3×HA标记的cln3缺陷细胞中GPD水平的变化。在LAMP1-3×HA标记的溶酶体中，与TMEM192-3×HA标记的溶酶体中CLN3丢失后，GPDs溶酶体丰度的增加进行了比较(mean±s.e.m.;gydF4y2BangydF4y2Ba＝gydF4y2Ba4个生物独立样本)。n:非标准;双尾未配对t检验。gydF4y2Ba
图4检测CLN3缺失对溶酶体pH值和细胞脂质代谢的影响。gydF4y2Ba
a至d, CLN3损失不增加溶酶体pH值。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，比例染料LysoSensor黄/蓝DND-160的标准校准曲线。详见实验方法。gydF4y2BabgydF4y2Ba，野生型和CLN3 KO HEK293T细胞中溶酶体pH值用标准曲线计算gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．数据以均数±标准差表示，gydF4y2BangydF4y2Ba＝gydF4y2Ba12个生物独立样本gydF4y2Ba．gydF4y2BacgydF4y2Ba在表达CLN3的HEK293T细胞中，用500 nM巴菲霉素A1处理6 h后，靶向分析GPDs全细胞和溶酶体水平的折叠变化。数据以均数±标准差表示，gydF4y2BangydF4y2Ba＝gydF4y2Ba3个生物独立样本gydF4y2Ba，(双尾不配对gydF4y2BatgydF4y2Ba以及)。gydF4y2BadgydF4y2Ba从溶酶体中释放出来的几种氨基酸对穿过溶酶体膜的质子梯度敏感，它们的水平不受CLN3损失的影响。用500 nM Bafilomycin A1 (BafA1)处理6小时，比较有和没有CLN3 cDNA加回的CLN3 KO细胞和溶酶体中脯氨酸、丙氨酸和谷氨酸的水平。数据以均数±标准差表示，gydF4y2BangydF4y2Ba＝gydF4y2Ba3个生物独立样本gydF4y2Ba，(双尾不配对gydF4y2BatgydF4y2Ba以及)。gydF4y2BaegydF4y2Ba重组CLN3蛋白不具有甘油磷酸二酯酶活性。氘化GPC (D9-GPC)与重组3×Flag-CLN3或阳性对照甘油磷酸二酯酶1 (3×Flag-GDE-1)孵育在指定的时间点。通过测定D9-GPC水解水平的下降和产物d9 -胆碱水平的增加来确定D9-GPC水解的程度。数据以均数±s.e.m.表示gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立的样本。gydF4y2BafgydF4y2Ba， CLN3的损失不会降低示踪剂的摄取。示踪剂水平的折叠变化(D9-16:0-16:0 PC)归一化为图中测量的样品的总蛋白。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba而且gydF4y2BaggydF4y2Ba．数据以均数±s.e.m.表示gydF4y2BangydF4y2Ba= 4个生物独立的样本。gydF4y2BaggydF4y2Ba， CLN3的损失不影响细胞内PC和鞘磷脂(SM)的生物合成和周转。游离d9 -胆碱作为示踪剂。在皮质神经元培养物中制备的含d9 -胆碱脂质的全细胞摩尔百分比富集(MPE)的数据显示为折叠变化gydF4y2BaCln3gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠相对于那些来自gydF4y2BaCln3gydF4y2Ba+ /−gydF4y2Ba动物(均值±s.e.m，gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立样本，(双尾未配对gydF4y2BatgydF4y2Ba以及))。gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充图1;补充表1-6和补充参考的图例。gydF4y2Ba
权利和权限gydF4y2Ba
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Laqtom, n.n.， Dong, W.， Medoh，联合国gydF4y2Baet al。gydF4y2BaCLN3是清除溶酶体中的甘油磷酸二酯所必需的。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba609gydF4y2Ba， 1005-1011(2022)。https://doi.org/10.1038/s41586-022-05221-ygydF4y2Ba
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