摘要gydF4y2Ba
PD-1阻断剂和IL-2联合治疗对慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染非常有效gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．在这里，我们将研究这种协同作用的潜在基础。我们发现，与PD-1单一治疗相比，PD-1 + IL-2联合治疗从根本上改变了PD-1的分化程序gydF4y2Ba+gydF4y2BaTCF1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba茎状的CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞和结果在转录和表观遗传不同的效应子CD8的产生gydF4y2Ba+gydF4y2Ba类似于高功能效应因子CD8的T细胞gydF4y2Ba+gydF4y2Ba急性病毒感染后的T细胞。这些CD8的生成品质优越gydF4y2Ba+gydF4y2Ba介导病毒控制的T细胞是PD-1和IL-2之间协同作用的基础。我们的结果表明PD-1gydF4y2Ba+gydF4y2BaTCF1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba茎状的CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞，也被称为耗尽CD8的前体gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞并不是命中注定的衰竭程序，它们的分化轨迹可以被IL-2信号改变。这些病毒特异性效应器CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞从类似干细胞的CD8中产生gydF4y2Ba+gydF4y2Ba联合治疗后的T细胞表达高亲和力IL-2三聚体(CD25-CD122-CD132)受体水平升高。这在PD-1单独封锁后是看不到的。最后，我们发现CD25与IL-2的接合在IL-2细胞因子和PD-1阻断之间的协同作用中具有重要作用。无论是用抗体阻断CD25，还是使用不与CD25结合但仍与CD122和CD132结合的IL-2突变版本，几乎完全消除了PD-1 + IL-2联合治疗后观察到的协同效应。PD-1 + IL-2联合治疗癌症患者引起了相当大的兴趣gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba我们的基础研究定义了IL-2如何与PD-1阻断协同作用的潜在机制，应该为这些人类转化研究提供信息。gydF4y2Ba
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确认gydF4y2Ba
这项工作得到了美国国立卫生研究院(NIH)资助R01AI030048(给R.A.)， P01AI056299(给R.A.， G.J.F.和A.H.S.)， P50CA101942(给G.J.F.和A.H.S.)， P01CA236749(给G.J.F.和A.H.S.)， R01AI129191(给J.J.G.)， P50CA217691(给S.S.R.和R.A.)，以及罗氏pRED ROADS项目(由罗氏资助，ID ROADS-034;R.A.)。我们感谢埃默里大学医学院流式细胞仪核心(K. Fife和R. Karaffa)的工作人员，Yerkes非人类灵长类基因组学核心(K. Pellegrini和S. Bosinger;埃默里大学温希普癌症研究所和NIH/NCI共享资源(L. Griffiths;2P30CA138292-04)，埃默里大学温希普癌症研究所和NIH/NCI的癌症组织和病理共享资源设施(P30CA138292)，以及西北大学罗伯特·h·Lurie综合癌症中心和NIH/NCI的小鼠组织学和表型实验室(P30CA060553)。世卫组织由美国国立卫生研究院K99AI153736拨款和癌症研究所欧文顿博士后奖学金支持。S.J.I.由韩国国家研究基金会(NRF)资助，由韩国政府(MSIT)资助，资助2020R1F1A1075668。内容仅为作者的责任，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。gydF4y2Ba
作者信息gydF4y2Ba
作者及隶属关系gydF4y2Ba
贡献gydF4y2Ba
m.h.， K.A.和R.A.设计了实验。M.H K.A。,R.C.O A.W。Judong Lee D.T.M, cd S.S.R, W.J.G, J.J.G W.J.L.和R.A.分析实验。M.H R.C.O。,A.W Judong Lee D.T.M, J.L.R, cd, S.J.I, Junghwa Lee J.-X.L林丙辉和E.E.W.进行实验。m.h.， p.l.， H.T.K.和W.H.H.分析了RNA-seq数据。M.A.C, H.T.K.和D.J.M.分析了scRNA-seq数据。R.R.J, W.J.G.和j.j.g分析了ATAC-seq数据。G.J.F a.h.。美国专利,变压器,C.K、动力装置和K.A.S.贡献资料。M.H.和R.A.写了手稿。所有的作者都参与了手稿的撰写并提供了反馈。gydF4y2Ba
相应的作者gydF4y2Ba
道德声明gydF4y2Ba
相互竞争的利益gydF4y2Ba
罗氏拥有与PD-1途径相关的专利(8,652,465和9,457,080)。A.H.S拥有来自罗氏和诺华的PD-1途径知识产权专利和未决专利费(专利7,432,059项，专利费来自罗氏、默克、百时美施贵宝、emd -雪兰诺、勃林格-殷格翰、阿斯利康、徕卡、梅奥诊所、Dako和诺华;专利7,722,868项，由罗氏、默克、百时美施贵宝、emd -雪兰诺、勃林格-殷格翰、阿斯利康、徕卡、梅奥诊所、达科和诺华支付专利费;专利8,652,465项和9,457,080项授权给罗氏;专利9,683,048,9,815,898,9,845,356,10,202,454和10,457,733授权给诺华;9,580,684, 9,988,452和10,370,446项专利都没有颁发)。G.J.F.拥有罗氏、默克、百时美施贵宝、默克、勃林格-殷格翰、阿斯利康、Dako、徕卡、梅奥诊所和诺华的PD-1-PD-L1通路专利和未决专利费(见补充数据)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．G.J.F.曾担任Roche、Bristol Myers Squibb、Xios、origomed、Triursus、itos、NextPoint、IgM、Jubilant、Trillium、GV20和Geode的顾问委员会成员。G.J.F.持有Nextpoint、Triursus、Xios、itos、IgM、GV20和Geode的股权。v.t.， C.K.和P.U.受雇于罗氏，并享有股票期权。C.K.和P.U已向罗氏申请专利:WO2012107417。其他作者宣称没有利益竞争。gydF4y2Ba
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自然gydF4y2Ba感谢Stephen Jameson和其他匿名审稿人对本工作的同行评审所作的贡献。gydF4y2Ba
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扩展的数据图形和表格gydF4y2Ba
图1 PD-1 + IL-2联合治疗可协同扩展功能性lcmv特异性CD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在慢性感染期间介导病毒控制的T细胞。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，面板的实验设置gydF4y2Ba抵扣gydF4y2Ba．慢性感染LCMV的小鼠要么不治疗，要么单独使用抗pd - l1抗体(200 μg i.p，每3天)，单独使用IL-2治疗(15,000 IU i.p，每天两次)，或联合治疗2周。gydF4y2BabgydF4y2Ba， D的数字gydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞在指定组织和血液(每1 x 10gydF4y2Ba6gydF4y2BaPBMCs)。gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba，用lcmv特异性肽池刺激脾脏细胞5小时，并通过细胞内细胞因子染色分析(gydF4y2BacgydF4y2Ba)和脱颗粒(gydF4y2BadgydF4y2Ba)．gydF4y2BaegydF4y2Ba，指示组织中的病毒滴度。gydF4y2BafgydF4y2Ba，面板的实验设置gydF4y2Ba胃肠道gydF4y2Ba．对慢性LCMV感染小鼠不加治疗，或联合治疗，或联合治疗加抗cd8消耗抗体(200 μg i.p，每3天)，持续2周。gydF4y2BaggydF4y2Ba，三组小鼠指示组织中的病毒滴度。gydF4y2BahgydF4y2Ba，gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，各组织中病毒滴度与CD8数量的相关性gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(gydF4y2BahgydF4y2Ba)，或lcmv特异性(DgydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和DgydF4y2BabgydF4y2BaGP276gydF4y2Ba+gydF4y2Ba) CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)．3-13个实验的结果汇总(gydF4y2Ba抵扣gydF4y2Ba)与n = 25-32(脾),n = 14 - 18(肝脏),n = 7 - 8(肺),n =特尔(血液)(gydF4y2BabgydF4y2Ba)， n = 28-38 (IFNγgydF4y2Ba+gydF4y2Ba)， n = 28-38 (IFNγgydF4y2Ba+gydF4y2Ba肿瘤坏死因子αgydF4y2Ba+gydF4y2Ba)， n = 16-23 (IFNγgydF4y2Ba+gydF4y2Ba- 2gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)， n = 18-25 (CD107a .gydF4y2Ba+gydF4y2Ba) (gydF4y2BacgydF4y2Ba),并与n = 16 - 19(脾),n = 12 - 15(肝脏),n = 13 - 14日(肺)(gydF4y2BaegydF4y2Ba)或从2-3个实验中汇集，每个实验中每组2-4只小鼠(gydF4y2Ba胃肠道gydF4y2Ba)．数据以几何平均值和95% CI (gydF4y2Ba罪犯gydF4y2Ba)、平均值及标准差(gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba)，或线性回归线和Pearson相关系数(双尾)(gydF4y2BahgydF4y2Ba，gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)，其中p个值。统计学比较采用Kruskal-Wallis检验与Dunn多重比较检验(gydF4y2Ba罪犯gydF4y2Ba)或Tukey多重比较检验的单因素方差分析(gydF4y2BaegydF4y2Ba)．Untx,未经处理的gydF4y2Ba
图2 PD-1阻断、IL-2治疗和PD-1 + IL-2联合治疗后的增殖反应来自同一PD-1人群gydF4y2Ba+gydF4y2BaTCF1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba茎状的CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，茎样排序的门控策略(PD-1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCXCR5gydF4y2Ba+gydF4y2BaTIM3gydF4y2Ba−gydF4y2Ba)和精疲力竭(PD-1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCXCR5gydF4y2Ba−gydF4y2BaTIM3gydF4y2Ba+gydF4y2Ba) CD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba从CD45.2脾脏分离的t细胞亚群gydF4y2Ba+gydF4y2BaLCMV慢性感染小鼠。gydF4y2Ba罪犯gydF4y2Ba，供体CD45.2号汇总数据gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba2周的PD-1治疗、IL-2治疗和肝脏联合治疗后的T细胞(gydF4y2BabgydF4y2Ba)、肺(gydF4y2BacgydF4y2Ba)，以及血液(每1x10gydF4y2Ba6gydF4y2BaPBMCs) (gydF4y2BadgydF4y2Ba)。结果汇集于3-4个实验，每组n = 7-9 (PD-1治疗)，n = 5-13 (IL-2治疗)，n = 5-11 (PD-1 + IL-2联合治疗)。数据以几何平均值和95% CI (gydF4y2Ba罪犯gydF4y2Ba)，其中p个值。虚线表示检测极限。采用双尾未配对Mann-Whitney检验进行统计学比较。AF, Alexa Fluor;英孚,eFluor;Tx,治疗;Untx,未经处理的gydF4y2Ba
图3 lcmv特异性CD8转录谱分析gydF4y2Ba+gydF4y2Ba慢性感染时PD-1单药治疗、IL-2治疗、PD-1 + IL-2联合治疗产生的T细胞。gydF4y2Ba
慢性LCMV感染小鼠分别用PD-1单药治疗、IL-2单独治疗或联合治疗2周。LCMV-specific DgydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba对各治疗组脾脏T细胞进行RNA-seq排序(gydF4y2Ba模拟gydF4y2Ba)和scRNA-seq (gydF4y2Bae-jgydF4y2Ba)．作为对照组，naive (CD44 .gydF4y2Ba罗gydF4y2Ba) CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞也进行了scRNA-seq (gydF4y2Bae-jgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba， D基因表达的MA图gydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞后的指示处理。gydF4y2Ba罪犯gydF4y2Ba， D的GSEAgydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞产生的指示治疗效应信号(急性感染)(gydF4y2BabgydF4y2Ba)、记忆标记(急性感染)(gydF4y2BacgydF4y2Ba)，以及衰竭特征(慢性感染)(gydF4y2BadgydF4y2Ba)．gydF4y2BaegydF4y2Ba，幼稚CD44的t-SNE投影gydF4y2Ba罗gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞和DgydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba4个治疗组慢性感染时T细胞的变化。Naive和4个处理样本被分布并覆盖在4个簇上。gydF4y2BafgydF4y2Ba，簇1、2、3的单元格数。gydF4y2BaggydF4y2Ba，集群1的单元数。总D数gydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba每个脾脏的T细胞由扩展数据图的几何平均值估计。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba（gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba)．gydF4y2BahgydF4y2Ba， 4个聚类中有几个代表性基因的归一化表达gydF4y2Ba我gydF4y2Ba的共表达模式gydF4y2BaTcf7gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGzmbgydF4y2Ba在每个集群的细胞中显示。gydF4y2BajgydF4y2Ba， D的GSEAgydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞产生的不同处理效应特征(急性感染)和衰竭特征(慢性感染)。四个处理样本的特征富集分数用小提琴图表示，图中均值为水平条。结果汇集自2 (gydF4y2Ba模拟gydF4y2Ba)及1-2 (gydF4y2Bae-jgydF4y2Ba)实验，每组n = 2-18只小鼠。ES，浓缩分数;Untx,未经处理的。gydF4y2Ba
图4 lcmv特异性CD8表型和功能分析gydF4y2Ba+gydF4y2Ba慢性感染期间PD-1、IL-2和联合治疗产生的T细胞。gydF4y2Ba
LCMV慢性感染小鼠要么不治疗，要么单独抗pd - l1抗体治疗，单独IL-2治疗，或联合治疗2周。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba， D上TIM3与各种表型标记共表达的代表性FACS图gydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba脾脏中的T细胞。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba用重组小鼠IL-12和IL-18 (20 ng mlgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba分别)培养5 h，然后加入GolgiPlug，培养1 h。注意培养物中没有添加病毒肽。细胞表面标记包括DgydF4y2BabgydF4y2Bagp33特异性四聚体，固定，然后进行细胞内IFNγ染色。gydF4y2BabgydF4y2Ba， CD218a和IFNγ在D上共染的代表性FACS图gydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞后的指示处理。gydF4y2BacgydF4y2Ba， IFNγ频率的总结图gydF4y2Ba+gydF4y2BaD细胞gydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞。所示结果为2-7次实验的代表性流程图(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba)或从7个实验(gydF4y2BacgydF4y2Ba)，每组n = 2-5。数据以均值和标准差表示，p值为(gydF4y2BacgydF4y2Ba)．统计学比较采用单因素方差分析及Tukey多重比较检验(gydF4y2BacgydF4y2Ba)．AF, Alexa Fluor;英孚,eFluor;Untx,未经处理的。gydF4y2Ba
图5 lcmv特异性CD8的鉴定gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在PD-1、IL-2和肽刺激后产生细胞因子的联合治疗后产生的T细胞。gydF4y2Ba
LCMV慢性感染小鼠要么不治疗，要么单独抗pd - l1抗体治疗，单独IL-2治疗，或联合治疗2周。用lcmv特异性肽池刺激脾脏细胞5小时，并通过细胞内染色分析细胞因子的产生。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，代表UMAP与D的FlowSOM叠加gydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba治疗后从脾脏分离的T细胞呈三簇分布。gydF4y2BabgydF4y2Ba， IFNγ数量的汇总数据gydF4y2Ba+gydF4y2BaLCMV-specific CD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba不同治疗组中定义的3个簇中的T细胞显示。结果汇集自4个实验，每个实验每组2-3只小鼠。数据以均值和SEM (gydF4y2BabgydF4y2Ba)，其中p个值。统计学比较采用Kruskal-Wallis检验和Dunn 's多重比较检验(d, e)。Untx，未经处理。gydF4y2Ba
图6 lcmv特异性CD8的染色质可及性分析gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞在急性和慢性感染和PD-1治疗后，IL-2或PD-1 + IL-2联合治疗。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， D中差异可达远端调控区的基因注释gydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba抗pd - l1和PD-1 + IL-2联合治疗小鼠的T细胞。D中功能重要基因的差异开放基因调控区域的数量gydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba显示PD-1单药治疗vs. PD-1 + IL-2联合治疗后的T细胞。gydF4y2BabgydF4y2Ba， lcmv特异性D中代表性基因的可达性跟踪gydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba慢性感染过程中各种治疗产生的T细胞。每个面板下方的浅蓝色线表示D中不同的可达区域gydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-1治疗与PD-1 + IL-2联合治疗产生的T细胞。红色虚线突出了由浅蓝色线表示的区域。gydF4y2BacgydF4y2Ba，生成10个簇的热图gydF4y2BakgydF4y2Ba-均值16,758 dar聚类DgydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba联合疗法产生的T细胞。然后是朴素CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞和各种lcmv特异性CD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba急性和慢性感染期间的t细胞亚群被纳入热图。ATAC-seq的结果来自3个实验，未处理的小鼠n = 12-18，每个实验中每组处理样本n = 1-3。原发性、急性(记忆前体(MP)、终末效应物(TE)和记忆)和慢性(茎样和耗尽)的ATAC-seq数据来自我们之前的研究gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba．Untx,未经处理的。gydF4y2Ba
图7 PD-1/PD-L1阻断靶点在慢性LCMV感染中降低病毒载量的重要性gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，实验设计。慢性LCMV感染小鼠分为两组;一组仅使用IL-2治疗13天(IL-2组)，第二组使用IL-2治疗10天，随后在第10天和第12天使用2剂抗pd - l1抗体(IL-2 +晚期抗pd - l1组)。然后在第14天对小鼠进行lcmv特异性CD8分析gydF4y2Ba+gydF4y2Bat细胞反应，病毒滴度，肝脏免疫病理。gydF4y2BabgydF4y2Ba， lcmv特异性的数量(DgydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和DgydF4y2BabgydF4y2BaGP276gydF4y2Ba+gydF4y2Ba) CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞。gydF4y2BacgydF4y2Ba，指示组织中的病毒滴度。gydF4y2Bad-fgydF4y2Ba免疫病理评估。血清谷丙转氨酶(ALT)水平(gydF4y2BadgydF4y2Ba)、肝脏病理评分(gydF4y2BaegydF4y2Ba)，以及TUNEL的编号gydF4y2Ba+gydF4y2Ba窦状细胞及肝细胞(gydF4y2BafgydF4y2Ba)．汇集2-4个实验结果，每个实验每组n = 2-5 (gydF4y2Bab-fgydF4y2Ba)．对于血清ALT水平，收集2-3只小鼠的血清样本。在其中一个代表性实验中进行TUNEL染色，每组n = 4。数据以几何平均值和95% CI (gydF4y2BabgydF4y2Ba)或mean及SD (gydF4y2Ba氟gydF4y2Ba)，其中p个值。采用双尾未配对Mann-Whitney检验进行统计学比较(gydF4y2BabgydF4y2Ba)，或双尾未配对t检验(gydF4y2Ba氟gydF4y2Ba)．谷丙转氨酶。TUNEL，末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记。gydF4y2Ba
图8 PD-1 + IL-2联合治疗导致更有利的CD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba效应/ CD4gydF4y2Ba+gydF4y2Ba与IL-2单药治疗相比。gydF4y2Ba
慢性感染的小鼠要么不治疗，要么单独使用抗pd - l1抗体，单独使用IL-2治疗，或联合治疗。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba， FOXP3数量gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba+gydF4y2Ba调节性T细胞(treg)。gydF4y2BabgydF4y2Ba， lcmv特异性的数量(DgydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和DgydF4y2BabgydF4y2BaGP276gydF4y2Ba+gydF4y2Ba) CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞。gydF4y2BacgydF4y2Ba， lcmv特异性比例(DgydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和DgydF4y2BabgydF4y2BaGP276gydF4y2Ba+gydF4y2Ba) CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞vs. FOXP3gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(CD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba效应/ CD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaTreg比率)。gydF4y2BadgydF4y2Ba，病毒滴度与CD8的相关性gydF4y2Ba+gydF4y2Ba效应/ CD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaTreg在不同组织中的比例。将5-8个实验的结果汇总，每个实验每组n = 2-4。数据以几何平均值和95% CI (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba)、平均值和SEM (gydF4y2BacgydF4y2Ba)，或线性回归线和Pearson相关系数(双尾)(gydF4y2BadgydF4y2Ba)，其中p个值。统计学比较采用Kruskal-Wallis检验与Dunn多重比较检验(gydF4y2Ba得了gydF4y2Ba)．Untx,未经处理的。gydF4y2Ba
扩展数据图9 PD-1gydF4y2Ba+gydF4y2BaTCF1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba茎状的CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞增殖并分化为效应体CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-1 + IL-2联合治疗后表达高亲和力三聚体(CD25, CD122, CD132) IL-2受体的T细胞。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，面板的实验设置gydF4y2Ba罪犯gydF4y2Ba．干细胞(PD-1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCXCR5gydF4y2Ba+gydF4y2BaTim-3gydF4y2Ba−gydF4y2Ba)和精疲力竭(PD-1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCXCR5gydF4y2Ba−gydF4y2BaTIM3gydF4y2Ba+gydF4y2Ba) CD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba从慢性LCMV感染CD45.2的小鼠脾脏中分离t细胞亚群gydF4y2Ba+gydF4y2Ba转入感染匹配CD45.1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba收件人老鼠。然后这些小鼠组要么不治疗，给予抗pd - l1抗体，IL-2治疗，或联合治疗2周。CD25在供体CD45.2上的表达gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba治疗前后分别检查T细胞。gydF4y2BabgydF4y2Ba， CD25在慢性CD8上表达的代表性直方图gydF4y2Ba+gydF4y2Bat细胞亚群预转移。天真(CD44gydF4y2Ba罗gydF4y2Ba) CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞也显示为阴性对照。gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba， CD25表达的代表性FACS图和CD25频率的汇总数据gydF4y2Ba+gydF4y2Ba供体CD45.2中的细胞gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞起源于干细胞样或耗尽的CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞后的指示处理。gydF4y2BaegydF4y2Ba，面板的实验设置gydF4y2Ba岗gydF4y2Ba．用抗pd - l1抗体、IL-2单独或联合治疗LCMV慢性感染小鼠。在指定的日子处死小鼠，检测lcmv特异性CD8上CD25、CD122和CD132的表达gydF4y2Ba+gydF4y2Ba脾脏中的T细胞。gydF4y2BafgydF4y2Ba， CD25和Ki-67在D上共表达的代表性流图gydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞在治疗后第0天或第6天。gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2BajgydF4y2Ba，gydF4y2Ba米gydF4y2Ba， CD25表达的代表性直方图(gydF4y2BaggydF4y2Ba)， cd122 (gydF4y2BajgydF4y2Ba)和CD132 (gydF4y2Ba米gydF4y2Ba)在茎样和耗尽的lcmv特异性DbGP33上gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8子集gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞在开始治疗慢性LCMV感染小鼠之前。原始细胞是CD44gydF4y2Ba罗gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞出现在同一个宿主中。gydF4y2BahgydF4y2Ba，gydF4y2BakgydF4y2Ba，gydF4y2BangydF4y2Ba， CD25表达的代表性直方图(gydF4y2BahgydF4y2Ba)， cd122 (gydF4y2BakgydF4y2Ba)和CD132 (gydF4y2BangydF4y2Ba答案:DgydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞在开始指定治疗后的0-6天。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，gydF4y2BalgydF4y2Ba，gydF4y2BaogydF4y2Ba， CD25频率的汇总箱图gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)， CD122的MFI (gydF4y2BalgydF4y2Ba)和CD132的MFI (gydF4y2BaogydF4y2Ba答案:DgydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞后的指示处理。结果汇集自2-5个实验，每组至少4只小鼠(gydF4y2Ba光学gydF4y2Ba)．数据以均值和标准差表示(gydF4y2BadgydF4y2Ba)或方框(第25至75百分位)、晶须(最小至最大)和直线(中位数)(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，gydF4y2BalgydF4y2Ba，gydF4y2BaogydF4y2Ba)，其中p个值。统计学比较采用单因素方差分析和Tukey多重比较检验。Untx,未经处理的。gydF4y2Ba
图10慢性LCMV感染期间IL-2(V)不与PD-1阻断协同作用。gydF4y2Ba
LCMV慢性感染小鼠不治疗，或用抗pd - l1抗体、抗pd - l1 + IL-2野生型(IL-2(WT))或抗pd - l1 + IL-2(V)(修饰IL-2，取消CD25结合)治疗2周。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba， D的数字gydF4y2BabgydF4y2BaGP276gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞在四组小鼠的指示组织中。gydF4y2BabgydF4y2Ba， D的数字gydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和DgydF4y2BabgydF4y2BaGP276gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba血液中的T细胞(每1x 10gydF4y2Ba6gydF4y2BaPBMCs)。gydF4y2BacgydF4y2Ba， IFNγ的数量gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba不同组的T细胞。用lcmv特异性肽池刺激脾脏细胞5小时，并通过细胞内细胞因子染色分析。gydF4y2BadgydF4y2BaD .各种表型标记的表达数据汇总gydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和DgydF4y2BabgydF4y2BaGP276gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba不同处理后的T细胞。结果来自2-3个实验，每个实验每组2-3只小鼠。数据以几何平均值和95% CI (gydF4y2Ba得了gydF4y2Ba)或mean及SD (gydF4y2BadgydF4y2Ba)，其中p个值。统计学比较采用Kruskal-Wallis检验与Dunn多重比较检验(gydF4y2Ba得了gydF4y2Ba)或Tukey多重比较检验的单因素方差分析(gydF4y2BadgydF4y2Ba)．Untx,未经处理的。gydF4y2Ba
图11 IL-2(V)在体内具有生物活性，但PD-1 + IL-2v联合治疗优先扩增非lcmv特异性PD-1阴性CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，实验设置gydF4y2BacgydF4y2Ba．慢性感染LCMV的小鼠不治疗，或用IL-2(WT)或IL-2(V)(修饰的IL-2，取消CD25结合)治疗2周。CD8的扩增gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在三组小鼠的脾脏和血液中检测T细胞。gydF4y2BabgydF4y2Ba， CD8的数目gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞。gydF4y2BacgydF4y2Ba， CD44的数量gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞。gydF4y2BadgydF4y2Ba，面板的实验设置gydF4y2BaeggydF4y2Ba．慢性感染小鼠不治疗，或用抗pd - l1抗体、抗pd - l1加IL-2(WT)或抗pd - l1加IL-2(V)治疗2周。PD-1阴性和PD-1阳性CD8扩增gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在四组小鼠的脾脏和血液中检测了T细胞。gydF4y2BaegydF4y2Ba， CD44的代表性FACS图和CD8上PD-1的表达gydF4y2Ba+gydF4y2Ba脾脏和血液中的T细胞。gydF4y2BafgydF4y2Ba， CD44的数量gydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-1阴性CD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba脾脏和血液中的T细胞。gydF4y2BaggydF4y2Ba， CD44的数量gydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-1阳性CD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba脾脏和血液中的T细胞(参见1×10gydF4y2Ba6gydF4y2BaPBMCs)。结果来自3个实验，每组至少6只小鼠。数据以几何平均值和95% CI (gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba)，其中p个值。红框显示PD-1阴性CD8优先扩增gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞通过抗pd - l1和IL-2联合治疗(V)，而抗pd - l1和IL-2联合治疗(WT)扩大PD-1阳性CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞。采用Kruskal-Wallis检验和Dunn’s多重比较检验进行统计学比较。Untx,未经处理的。gydF4y2Ba
图12 IL-2(WT)与IL-2(V)对lcmv特异性CD8的影响gydF4y2Ba+gydF4y2Ba慢性感染中的T细胞。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，面板数据的实验设计gydF4y2BabgydF4y2Ba而且gydF4y2BacgydF4y2Ba．慢性LCMV感染小鼠(>感染后40天)不治疗或用IL-2(WT)治疗5天，在PD-1阴性和PD-1上检测CD25表达gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba脾脏中的T细胞。gydF4y2BabgydF4y2Ba， CD25表达的代表性FACS图。gydF4y2BacgydF4y2Ba， IL-2(WT)和IL-2(V)处理后CD25表达的汇总图。gydF4y2BadgydF4y2Ba，面板数据的实验设计gydF4y2BaegydF4y2Ba而且gydF4y2BafgydF4y2Ba．慢性LCMV感染小鼠不治疗，用IL-2(WT)治疗或用IL-2(V)治疗6天。IL-2受体(CD25, CD122和CD132)在lcmv特异性CD8上的表达gydF4y2Ba+gydF4y2Ba检查脾脏中的T细胞。gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba，代表性直方图(gydF4y2BaegydF4y2Ba)和概要图(gydF4y2BafgydF4y2BaIL-2受体在DgydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba治疗后的T细胞。结果汇集自2个实验，每个实验每组2-3只小鼠。数据以均值和标准差表示(gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba)，其中p个值。统计学比较采用单因素方差分析和Tukey多重比较检验。Untx,未经处理的。gydF4y2Ba
图13在含有CD4细胞的LCMV慢性感染模型中，PD-1联合治疗IL-2(WT)细胞因子与IL-2(V)细胞因子的作用比较gydF4y2Ba+gydF4y2Bat细胞的帮助。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，实验设计。感染LCMV克隆13(感染后第25天)的小鼠不治疗，或用抗pd - l1抗体、抗pd - l1加IL-2(WT)或抗pd - l1加IL-2(V)治疗。gydF4y2BabgydF4y2Ba， lcmv特异性D数gydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞在不同处理后的指示组织中。gydF4y2BacgydF4y2Ba，表型标记在D上表达的汇总数据gydF4y2BabgydF4y2BaGP33gydF4y2Ba+gydF4y2Ba或维gydF4y2BabgydF4y2BaGP276gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞在不同处理后的脾脏。gydF4y2BadgydF4y2Ba， IFNγ的数量gydF4y2Ba+gydF4y2Ba，和IFNγgydF4y2Ba+gydF4y2Ba肿瘤坏死因子αgydF4y2Ba+gydF4y2BaLCMV-specific CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞在四组中。用lcmv特异性肽池刺激脾脏细胞5小时，并通过细胞内细胞因子染色分析gydF4y2BaegydF4y2Ba、各组小鼠脾脏和血清病毒滴度。虚线表示检测极限。结果来自3-4个实验，每个实验每组2-5只小鼠。数据以几何平均值和95% CI (gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba)或mean及SD (gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba)，其中p个值。统计学比较采用Kruskal-Wallis检验与Dunn多重比较检验(gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba(lcmv特异性CD4的数量gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞))或Tukey多重比较检验的单因素方差分析(gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba(lcmv特异性CD4表型gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞))。Untx,未经处理的。gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充图1-15，补充附注1-3和补充数据1-3。补充说明包括对补充数据1-3的说明，包括统计分析的信息。gydF4y2Ba
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桥本，男，荒木，K，卡德纳斯，硕士gydF4y2Baet al。gydF4y2BaPD-1联合IL-2治疗改变CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞衰竭程序。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba610gydF4y2Ba， 173-181(2022)。https://doi.org/10.1038/s41586-022-05257-0gydF4y2Ba
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