主要gydF4y2Ba

CAFs在形成肿瘤微环境(TME)和对癌症免疫治疗的反应中起着关键作用gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．先前对接受免疫检查点阻断(ICB)治疗的肿瘤患者的基因表达数据的研究已经推断出CAF的丰富程度与免疫治疗反应的缺乏之间的联系gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba．适当靶向CAF的治疗药物可能会缓解这种耐药性，但由于对CAF异质性的不完全理解和临床相关亚群的识别仍然有限。单细胞RNA测序(scRNA-seq)的使用提高了健康和病变组织间质细胞景观的分辨率。scRNA-seq分析了胰腺导管腺癌(PDAC)和乳腺癌中CAF的进化，发现了由LRRC15标记的激活肌成纤维细胞的优势(在小鼠和人类中)gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．该CAF群体表达大量与细胞外基质和免疫抑制相关的基因gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba．临床上，LRRC15高表达gydF4y2Ba+gydF4y2Ba癌症患者大量RNA-seq数据中的CAF基因签名与抗程序性死亡配体1 (PDL1) ICB缺乏反应相关gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba．目前尚不清楚LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAFs是这种缺乏反应的基础，或者它们是否代表了驱动这种关联的肿瘤内在特征的解读。同样缺少的是促进LRRC15的细胞和分子信号在体内的证实gydF4y2Ba+gydF4y2Ba肌成纤维细胞的发育及其对抗肿瘤免疫的直接影响。gydF4y2Ba

LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAF的形成依赖于TGFβ受体2gydF4y2Ba

最近的scRNA-seq研究用于硅预测，将活性TGFβ信号与LRRC15联系起来gydF4y2Ba+gydF4y2Ba肿瘤发生过程中肌成纤维细胞的形成gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．独立的单细胞图谱研究已经推断，在受干扰组织中激活的成纤维细胞亚群是从泛组织通用成纤维细胞发展而来的gydF4y2Ba10gydF4y2Ba．我们的目标是在这两个推论之间提供一个体内遗传联系，提出TGFβ信号在万能成纤维细胞中是LRRC15形成不可或缺的gydF4y2Ba+gydF4y2Ba肿瘤进展过程中的肌成纤维细胞。我们使用了一种靶向皮肤桥蛋白(DPT)的小鼠系统，DPT是一种标记通用成纤维细胞的细胞外基质蛋白gydF4y2Ba10gydF4y2Ba．gydF4y2BaDptgydF4y2BaIresCreERT2gydF4y2Ba小鼠与TGFβ受体2型(TGFβ r2，编码于gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Ba)软绒鼠(gydF4y2BaDptgydF4y2BaIresCreERT2gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba)产生可诱导的和有条件的敲除gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Ba在DPTgydF4y2Ba+gydF4y2Ba普遍的成纤维细胞(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,最高)。gydF4y2BaDptgydF4y2Bawt / wtgydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba(控制)或gydF4y2BaDptgydF4y2Baki /吻gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba（gydF4y2BaDptgydF4y2Ba-条件敲除)小鼠置于他莫西芬(TAM)方案，并皮下植入KPR3070 (KPR;gydF4y2Ba喀斯特gydF4y2BaLSL。G12D / wtgydF4y2Ba; p16 / p19gydF4y2Bafl / wtgydF4y2Ba; p53gydF4y2BaLSL。R270H / wtgydF4y2Ba；gydF4y2BaPdx1。CregydF4y2BaPDAC肿瘤细胞gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba．植入后21天收集肿瘤进行流式细胞术分析。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,底部)。确保高效的敲除gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Ba，同样的TAM方案(如图所示)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)首次演出于gydF4y2BaDptgydF4y2BaIresCreERT2gydF4y2BaRosa26gydF4y2BaLSLYFPgydF4y2Ba记者的老鼠gydF4y2Ba10gydF4y2Ba含有皮下KPR肿瘤。这样做是为了了解肿瘤成纤维细胞中来自DPT的比例gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞，一种大量存在于原始皮肤组织中的成纤维细胞gydF4y2Ba10gydF4y2Ba．植入21天后，大多数(约84%)的PDPNgydF4y2Ba+gydF4y2Ba肿瘤中的成纤维细胞为YFPgydF4y2Ba+gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．TGFβR2在PDPN上的表达gydF4y2Ba+gydF4y2Ba战乱国家从gydF4y2BaDptgydF4y2Baki /吻gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba肿瘤减少了约90%gydF4y2BaDptgydF4y2Bawt / wtgydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba肿瘤(扩展数据图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．作为一个结果,gydF4y2BaDptgydF4y2Baki /吻gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba肿瘤LRRC15的总数显著减少gydF4y2Ba+gydF4y2BaPDPNgydF4y2Ba+gydF4y2Ba与对照组比较gydF4y2BaDptgydF4y2Bawt / wtgydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba肿瘤，这表明LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2BaDPT细胞依赖TGFβR2信号gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞的形成(图。gydF4y2Ba1 b, cgydF4y2Ba)．尽管LRRC15明显减少gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞gydF4y2BaDptgydF4y2Baki /吻gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba肿瘤中PDPN的总数gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD31gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba成纤维细胞在两组之间没有变化，这表明发生了一种补偿机制来维持CAF隔室(图。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

图1:DPT中的tgf - β r2信号gydF4y2Ba+gydF4y2Ba通用型成纤维细胞驱动LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Bamyofibroblast分化。gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，遗传(上)和实验(下)方法的生成示意图gydF4y2BaDptgydF4y2BaIresCreERT2gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba老鼠。南卡罗来纳州,皮下。gydF4y2BabgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaggydF4y2Ba，数据来自皮下KPR肿瘤植入后21天gydF4y2BaDptgydF4y2Bawt / wtgydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba而且gydF4y2BaDptgydF4y2Baki /吻gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba老鼠。gydF4y2BabgydF4y2Ba，代表性的流式细胞仪图显示PDPN的频率gydF4y2Ba+gydF4y2BaLRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞。细胞被PDPN门控gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD31gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba细胞。gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba， PDPN总数的量化gydF4y2Ba+gydF4y2BaLRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞(gydF4y2BacgydF4y2Ba)和PDPNgydF4y2Ba+gydF4y2BaCD31gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba细胞(gydF4y2BadgydF4y2Ba)以肿瘤重量归一化(gydF4y2BangydF4y2Ba= 12老鼠)。gydF4y2BaegydF4y2Ba， 6525个单个成纤维细胞的统一歧形近似和投影(UMAP)图，按簇成员着色(左，gydF4y2BangydF4y2Ba=每组5只)和UMAP中指示标记基因簇(C0-C5)的相对平均表达(右)。gydF4y2BafgydF4y2Ba， UMAP为gydF4y2BaegydF4y2Ba分裂的基因型。gydF4y2BaggydF4y2Ba， UMAP为gydF4y2BaegydF4y2Ba按基因型拆分，按表达着色gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba．gydF4y2BahgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BajgydF4y2Ba数据来自植入后15天的原位胰腺KPR肿瘤gydF4y2BaDptgydF4y2Bawt / wtgydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba或gydF4y2BaDptgydF4y2Baki /吻gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba老鼠gydF4y2BahgydF4y2Ba，代表性的流式细胞仪图显示PDPN的频率gydF4y2Ba+gydF4y2BaLRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞。细胞被PDPN门控gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD31gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba细胞。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，gydF4y2BajgydF4y2Ba， PDPN总数的量化gydF4y2Ba+gydF4y2BaLRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)和PDPNgydF4y2Ba+gydF4y2BaCD31gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba细胞(gydF4y2BajgydF4y2Ba)以肿瘤重量归一化(gydF4y2BangydF4y2Ba= 11或14只老鼠)。gydF4y2BakgydF4y2Ba，人体样本的采集方案。NAT，正常相邻组织;膀胱尿路上皮癌;妇科,妇科的肿瘤;PDAC，胰导管腺癌;头颈部鳞状细胞癌;SRC,肉瘤;孩子,肾癌;HEP，肝细胞癌;CRC,结直肠癌; LUNG, lung cancer; MEL, melanoma; ADR, adrenal cancer; PNET, pancreatic neuroendocrine tumour; GALL, gallbladder cancer.lgydF4y2Ba，基质细胞样品的PCA。形状表示样品的起源;颜色代表癌症适应症。gydF4y2Ba米gydF4y2Ba， PC1的基因装载gydF4y2BalgydF4y2Ba．gydF4y2BangydF4y2Ba，特定适应症的样品在PC1中的分布gydF4y2BalgydF4y2Ba．gydF4y2BaogydF4y2Ba，之间的Pearson相关系数(PCC)gydF4y2BaLRRC15gydF4y2BaTGFβ通路在样品中的表达和活性(填充的圆圈)。线性回归线(虚线)。gydF4y2BapgydF4y2Ba，森林图描述TGFβ CAF在特定TCGA适应症下的总体生存危险比(HRs)。数据gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2Ba我gydF4y2Ba而且gydF4y2BajgydF4y2Ba为平均值±标准差。数据gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2Ba我gydF4y2Ba而且gydF4y2BajgydF4y2Ba都来自于两三个独立的实验。为gydF4y2BangydF4y2Ba，须表示最小值和最大值，方框表示四分位区间，中线表示中值。为gydF4y2BapgydF4y2Ba，中心点为HR，直线为95%置信区间(CI)。统计数据的计算采用双尾，未配对的学生gydF4y2BatgydF4y2Ba以及(gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2Ba我,我gydF4y2Ba)或Cox比例风险回归模型(gydF4y2BapgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

在LRRC15缺失的情况下维持成纤维细胞总含量gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAF形成gydF4y2BaDptgydF4y2Baki /吻gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba肿瘤需要对这些小鼠的成纤维细胞组成进行更深入的研究。在CD24上执行scRNA-seqgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaCD45gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba基质细胞和CD45gydF4y2Ba+gydF4y2Ba两者的免疫细胞gydF4y2BaDptgydF4y2Bawt / wtgydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba而且gydF4y2BaDptgydF4y2Baki /吻gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba肿瘤(扩展数据图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．经过质量控制、降维和聚类，我们确定了四组主要的细胞，每组都由来自多种动物的细胞代表(扩展数据图)。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)．这些是免疫细胞(gydF4y2BaPtprcgydF4y2Ba+gydF4y2Ba，也被称为gydF4y2BaCd45gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)、内皮细胞(gydF4y2BaPecam1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba，也被称为gydF4y2BaCd31gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)、周(gydF4y2BaRgs5gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)和成纤维细胞(gydF4y2Ba亮度gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)(补充表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．我们对成纤维细胞的下游分析发现了6个cafa特异性簇。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba和补充表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba):gydF4y2BaPi16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba强表达通用成纤维细胞标记的聚类(聚类3);一个gydF4y2BaCxcl12gydF4y2Ba+gydF4y2Ba集群集群(2);一群gydF4y2BaCrabp1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba战乱国家集群(1);高表达增殖标记的聚类(聚类4);以及两个高聚类(聚0)和低聚类(聚5)gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba表达式(无花果。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)．簇0和簇5表达额外的肌成纤维细胞标记物gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba，提示TGFβ信号通路，如gydF4y2BaActa2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaTaglngydF4y2Ba．这两个群体的a得分也很高gydF4y2BaTgfbgydF4y2BaCAF基因特征先前从PDAC基因工程小鼠模型(GEMMs)中推断出来gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)．证实了我们的假设，TGFβR2信号在DPT中gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞是LRRC15所需的gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAF发育过程中，5和0两类聚类均不存在gydF4y2BaDptgydF4y2Baki /吻gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba老鼠(图。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)．此外,gydF4y2BaDptgydF4y2Baki /吻gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba动物几乎没有表达的细胞gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba，gydF4y2BaActa2gydF4y2Ba或gydF4y2BaTaglngydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)．LRRC15缺失gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAFs导致了相应的相对丰度的增加gydF4y2BaPi16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba通用成纤维细胞簇3和gydF4y2BaCrabp1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba集群1gydF4y2BaDptgydF4y2Baki /吻gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba老鼠。这一结果证实了我们的发现，即肿瘤成纤维细胞的总含量在LRRC15缺失时得到补偿gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAF开发(扩展数据图)gydF4y2Ba1 g hgydF4y2Ba)．增殖簇4的相对丰度没有明显变化，但增殖细胞从gydF4y2BaDptgydF4y2Baki /吻gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba老鼠的得分很低gydF4y2BaTgfbgydF4y2BaCAF PDAC GEMM签名。相比之下，细胞来自gydF4y2BaDptgydF4y2Bawt / wtgydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba动物在这一特征上得分很高，这与我们的发现LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba由DPT形成CAFgydF4y2Ba+gydF4y2Ba通用成纤维细胞依赖于TGFβR2(扩展数据图)。gydF4y2Ba1我gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

我们接下来问LRRC15是否需要同样的通路激活gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAF在胰腺的发育，与DPT含量相似的组织部位gydF4y2Ba+gydF4y2Ba稳定状态下的通用成纤维细胞gydF4y2Ba10gydF4y2Ba．将KPR肿瘤细胞原位植入大鼠胰腺gydF4y2BaDptgydF4y2Bawt / wtgydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba或gydF4y2BaDptgydF4y2Baki /吻gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba15天后对肿瘤进行分析。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,底部)。与皮下KPR肿瘤相似，LRRC15的发展gydF4y2Ba+gydF4y2BaPDPNgydF4y2Ba+gydF4y2Ba原位胰腺肿瘤的CAFs明显受损gydF4y2BaDptgydF4y2Baki /吻gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba与对照组小鼠比较gydF4y2BaDptgydF4y2Bawt / wtgydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba小鼠，而PDPN的总数gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD31gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba成纤维细胞保持不变。gydF4y2Ba1 h-jgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

这些数据提供了在体内的直接证据，表明TGFβ信号是DPT分化所必需的gydF4y2Ba+gydF4y2Ba将成纤维细胞转化为LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Bamyofibroblasts。削弱LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAF的发展导致了DPT的积累gydF4y2Ba+gydF4y2Ba通用成纤维细胞和不依赖于tgf β r2的CAFs在没有它们的情况下维持CAF室。重要的是，这种谱系关系和信号依赖性需要在多个组织位点，这证实了DPT的普遍性gydF4y2Ba+gydF4y2Ba成纤维细胞。gydF4y2Ba

定义人类癌症成纤维细胞轴gydF4y2Ba

接下来，我们的目标是了解万能成纤维细胞和LRRC15之间的轴是否gydF4y2Ba+gydF4y2Ba肌成纤维细胞是人类癌症成纤维细胞室的代表。先前的研究gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba依赖于从癌症基因组图谱(TCGA)中提取的整个肿瘤样本大块RNA-seq数据的反褶积来推断跨适应症的特定CAF子集的丰度。为了特别关注不同人类癌症类型的成纤维细胞间室的异质性，我们对CD45进行了分类gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD90gydF4y2Ba+gydF4y2Ba来自13种适应症159例患者样本的基质细胞(图。gydF4y2Ba1 kgydF4y2Ba和补充表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，生成大量RNA-seq表达谱。在主成分分析(PCA)和分层聚类的基础上筛选高纯度样本，使对人类CAF表达程序及其泛癌症患病率的不偏不倚的看法成为可能(扩展数据图)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．我们在PCA空间中没有观察到癌症指征的清晰分离，这表明泛癌间质细胞特征驱动着两个第一主成分(图)。gydF4y2Ba1 lgydF4y2Ba)．PC1阳性权重最强的基因包括已知的LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAF表达标记基因等gydF4y2BaCOL10A1gydF4y2Ba，gydF4y2BaCOL11A1gydF4y2Ba，gydF4y2BaMMP11gydF4y2Ba而且gydF4y2BaLRRC15gydF4y2Ba(ref。gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．相反，与之前描述的普遍成纤维细胞相关的标记，如gydF4y2BaCD34和gydF4y2BaPI16gydF4y2Ba， PC1的负权重最强(参考文献。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba1米gydF4y2Ba)．一致地，从正常相邻组织中获得的样本PC1值大多为负值(扩展数据图)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．在分析的适应症中，胰腺癌和膀胱癌样本的PC1值最高，说明LRRC15较强富集gydF4y2Ba+gydF4y2Ba战乱国家(无花果。gydF4y2Ba1 ngydF4y2Ba)．LRRC15高的趋势gydF4y2Ba+gydF4y2Ba胰腺癌中的CAF水平是在一个独立的数据集中确认的(扩展数据图)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．途径富集分析显示样品中含有高水平的gydF4y2BaLRRC15gydF4y2Ba表达表达的TGFβ通路激活增加，因此强烈提示LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba正如在我们的小鼠模型中所证实的那样，人类CAF表达程序同样由TGFβ信号驱动(图1)。gydF4y2Ba1阿gydF4y2Ba)．TGFβ CAF标记物的高表达水平与TCGA中所有适应症和某些肿瘤类型(包括膀胱癌和胰腺癌)的较差生存率显著相关。gydF4y2Ba1便士gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)．这些人类数据揭示了由通用成纤维细胞和LRRC15定义的人类癌症CAF异质性的中轴gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba战乱国家非常丰富。gydF4y2Ba

结合我们的遗传小鼠系统的结果，这些发现表明TGFβ信号作为一个变阻器，决定了肿瘤成纤维细胞的普遍成纤维细胞和LRRC15之间的设定点gydF4y2Ba+gydF4y2Ba肌成纤维细胞可能是患者预后的潜在预测因子。gydF4y2Ba

LRRC15仅在CAFs中表达gydF4y2Ba

研究LRRC15的影响gydF4y2Ba+gydF4y2Ba将白喉毒素受体(DTR) -GFP盒敲入该基因起始密码子下游的外显子2，建立了一种遗传小鼠模型gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba（gydF4y2BaLrrc15gydF4y2BaDTRGFPgydF4y2Ba敲入小鼠)。在白喉毒素(DT)作用下，该模型可控制表达lrrc15的细胞的损耗。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,最高)。为了确保这种方法能够选择性消融该cas亚群，我们评估了小鼠中LRRC15的表达。在KPR肿瘤中，LRRC15的表达仅限于PDPNgydF4y2Ba+gydF4y2Ba成纤维细胞和大部分在其他隔室中缺失(扩展数据图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．肿瘤外，原位杂交和大体积rna序列gydF4y2Ba12gydF4y2Ba分析表明,gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba在多个组织中表达低甚至无表达(扩展数据图。gydF4y2Ba3 b, cgydF4y2Ba)．在人类肿瘤和外周组织中也报道了类似的结果gydF4y2Ba13gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

图2:LRRC15靶向耗竭gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAFs显著抑制肿瘤生长。gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，遗传(上)和实验(下)方法的示意图gydF4y2BaLrrc15gydF4y2BaDTRGFPgydF4y2Ba老鼠。gydF4y2BabgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba数据来自DTR中DT治疗后8天皮下KPR肿瘤gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba和DTRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba老鼠。gydF4y2BabgydF4y2Ba，代表性的流式细胞仪图显示PDPN的频率gydF4y2Ba+gydF4y2BaLRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞。细胞在CD24上被门控gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaCD45gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba(左)或PDPNgydF4y2Ba+gydF4y2BaCD31gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba细胞(右)。gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba， PDPN总数的量化gydF4y2Ba+gydF4y2BaLRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞(gydF4y2BacgydF4y2Ba)和PDPNgydF4y2Ba+gydF4y2BaCD31gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba细胞(gydF4y2BadgydF4y2Ba)以肿瘤重量归一化(gydF4y2BangydF4y2Ba= 12或14只老鼠)。gydF4y2BaegydF4y2Ba， LRRC15和DAPI的代表性免疫荧光图像。比例尺，250 μ m。gydF4y2BafgydF4y2Ba，肿瘤生长曲线从DTRgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba和DTRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba用DT (gydF4y2BangydF4y2Ba=每组9或11只)。左:所有动物的平均肿瘤体积(*gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.015, * * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0006, * * * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001)。中、右:每个基因型的个体动物生长曲线。的gydF4y2BaxgydF4y2Ba轴为DT治疗后天数。红色虚线表示控件(Ctrl)组的平均引用适合度。数据gydF4y2BacgydF4y2Ba而且gydF4y2BadgydF4y2Ba来自四个独立的实验。数据gydF4y2BaegydF4y2Ba而且gydF4y2BafgydF4y2Ba代表了两个或三个独立的实验。数据gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba而且gydF4y2BafgydF4y2Ba为平均值±标准差。统计数据的计算采用双尾，未配对的学生gydF4y2BatgydF4y2Ba以及(gydF4y2BacgydF4y2Ba而且gydF4y2BadgydF4y2Ba)或普通的双向方差分析(gydF4y2BafgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

由于以前的消耗钙的策略使用的标记，如α平滑肌肌动蛋白(αSMA，编码gydF4y2BaActa2gydF4y2Ba)和成纤维细胞激活蛋白(FAP，由gydF4y2BaFapgydF4y2Ba）gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba的表达水平比较gydF4y2BaFapgydF4y2Ba而且gydF4y2BaActa2gydF4y2Ba来gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba．在公司KPR肿瘤,gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba表达仅限于成纤维细胞，而gydF4y2BaActa2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaFapgydF4y2Ba在成纤维细胞和周细胞中均观察到表达(扩展数据图。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)．在肿瘤之外，两者都有表达gydF4y2BaFapgydF4y2Ba而且gydF4y2BaActa2gydF4y2Ba在多个组织的基质细胞中观察到，而gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba)．在小鼠皮肤引流淋巴结中，gydF4y2BaActa2gydF4y2Ba在周细胞中高度表达，两者都是gydF4y2BaFap和Acta2gydF4y2Ba表情明显重叠在一起gydF4y2BaCcl19gydF4y2Ba+gydF4y2Ba成纤维细胞的网状细胞。相比之下,gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba在LN成纤维网状细胞或周细胞中检测不到gydF4y2Ba16gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)．总的来说，这些数据表明LRRC15是tgf β驱动的CAFs的一个真正的标记物，它不会与肿瘤内外的其他细胞重叠。gydF4y2Ba

LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAF损耗减慢肿瘤生长gydF4y2Ba

考虑到gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba表达后，我们开始评估选择性消耗LRRC15的影响gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAFs对肿瘤生长的影响。KPR肿瘤被皮下植入gydF4y2BaLrrc15gydF4y2BaDTRGFPwt / wtgydF4y2Ba(DTRgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba)或gydF4y2BaLrrc15gydF4y2BaDTRGFPwt /吻gydF4y2Ba(DTRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba)小鼠，当肿瘤达到平均体积100-200 mm时，两组小鼠开始DT治疗gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba(植入后约10天)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,底部)。8天后，收集肿瘤并评估LRRC15的存在gydF4y2Ba+gydF4y2Ba战乱国家。dt治疗的DTR肿瘤gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaLRRC15是小鼠的优势群体gydF4y2Ba+gydF4y2Ba而DT治疗在DTRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba肿瘤导致LRRC15总损失约98%gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞(图。gydF4y2Ba2 b, cgydF4y2Ba)．重要的是LRRC15缺失gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在DTR战乱国家gydF4y2Ba+gydF4y2Ba小鼠对DT治疗有特异性，而不是在DT缺失的情况下这些细胞发育不充分的结果。gydF4y2Ba4 a、bgydF4y2Ba)．总PDPNgydF4y2Ba+gydF4y2Ba在dt处理的DTR中，成纤维细胞数量也显著减少约70%gydF4y2Ba+gydF4y2Ba老鼠(图。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)．免疫荧光成像证实了这些结果，显示DTR中没有LRRC15染色gydF4y2Ba+gydF4y2Ba肿瘤(无花果。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)．持续的DT治疗维持显著的LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAF损耗和PDPN减少gydF4y2Ba+gydF4y2Ba超过第8天，并没有引起任何显著的体重变化的两组小鼠(扩展数据图。gydF4y2Ba4 c, dgydF4y2Ba)．结果，LRRC15持续耗竭后，肿瘤生长明显减慢gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在DTR战乱国家gydF4y2Ba+gydF4y2Ba小鼠与DTR比较gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba控制老鼠(无花果。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)．总的来说，这些数据表明LRRC15的选择性消融gydF4y2Ba+gydF4y2Ba肿瘤中CAF的亚型导致CAF总含量的显著降低和肿瘤负担的显著持续降低。gydF4y2Ba

重新校准肿瘤成纤维细胞设定值gydF4y2Ba

LRRC15的显著影响gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAF在成纤维细胞腔室上的消融使我们得以研究CAF缺失时剩余CAF环境的组成。scRNA-seq CD24的gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaCD45gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaDTR肿瘤基质细胞gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba和DTRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba小鼠在4个不同时间点进行实验，包括肿瘤植入后10天、DT治疗(IOT)开始前(第0天)和IOT治疗后第7天、14天和21天(图1)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,最高)。DT治疗开始于所有小鼠从第0天到第14天，然后在研究的最后一周到第21天停止(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．此外,EPCAMgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaCD45gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba来自未经治疗的，非肿瘤皮肤组织的基质细胞被鉴定为肿瘤植入前的基线轮廓(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,底部)。gydF4y2Ba

图3:正常组织普遍的成纤维细胞样活性在LRRC15后增强gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAF损耗。gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，实验方案(gydF4y2BangydF4y2Ba=每个时间点和组5只老鼠)。gydF4y2BabgydF4y2Ba， 37383个单个成纤维细胞的UMAP图，按簇成员着色(左)或按起源组织着色(中)。从左侧UMAP(右)的簇间指示标记基因的相对平均表达。gydF4y2BacgydF4y2Ba， UMAP为gydF4y2BabgydF4y2Ba的表情gydF4y2BaPi16gydF4y2Ba而且gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba按时间点和条件拆分。gydF4y2BadgydF4y2Ba，可见阳性成纤维细胞百分比(点大小)和相对平均表达(颜色)的点图gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPi16gydF4y2Ba在每个时间点和情况下的肿瘤样本。gydF4y2BaegydF4y2Ba，各处理组0簇中细胞的百分率(gydF4y2BangydF4y2Ba=每组5只小鼠)在所有四个时间点的肿瘤样本。gydF4y2BafgydF4y2Ba，为每个指定的时间点和条件(下行)汇集的细胞的PROGENy途径富集分数(颜色)。数据gydF4y2BaegydF4y2Ba是均值+ s.e.m.。，而且statistics were calculated using two-tailed, unpaired Student’stgydF4y2Ba以及。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

质量控制后，对所有时间点和治疗组的54,240个单基质细胞进行分析。降维和聚类显示周细胞(gydF4y2BaRgs5gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)、内皮细胞(gydF4y2BaPecam1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba，也被称为gydF4y2BaCd31gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)和成纤维细胞(gydF4y2Ba亮度gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)作为三个主要的基质细胞群(扩展数据图。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba、左、下、补充表gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba)．所有的细胞簇都被来自多种动物的细胞填充，随后的分析集中在成纤维细胞上。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba，右，和补充表gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．来自未成熟皮肤组织的成纤维细胞形成了两个独立的簇(簇3和簇4)，几乎没有来自荷瘤小鼠的细胞的混合(图4)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．在肿瘤承载组织中，成纤维细胞可以被分配到四种转录表达表型gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba簇(簇0)也表达肌成纤维细胞标志物如gydF4y2BaTaglngydF4y2Ba而且gydF4y2BaSpp1gydF4y2Ba；增殖的CAFs簇(簇5);一群gydF4y2BaCxcl14gydF4y2Ba-表达的CAFs(簇2);还有一群gydF4y2BaPi16gydF4y2Ba高gydF4y2BaCAFs(簇1)表达模式与通用成纤维细胞相同gydF4y2Ba10gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

dt处理的DTR中成纤维细胞的动态gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba和DTRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba然后对小鼠进行监测，发现gydF4y2BaPi16gydF4y2Ba而且gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba在每个时间点进行比较(图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)．在没有肿瘤的皮肤上，gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba无表达，细胞形态均匀gydF4y2BaPi16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba．这一结果表明了一种与正常胰腺组织成纤维细胞相似的通用成纤维细胞表型gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba．在肿瘤组织中，第0天，gydF4y2BaPi16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞和gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞被检测到。在DTRgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba动物,LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba从第7天开始，一直持续到第21天，CAF在整个时间过程中都是占主导地位的CAF种群。gydF4y2Ba3 c, dgydF4y2Ba)．反之,在DTRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba动物,gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞在DT治疗的前2周内消失，并伴随相对增加gydF4y2BaPi16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞，其中的一个子集也表达gydF4y2BaCxcl12gydF4y2Ba，观察到(图。gydF4y2Ba3 c, dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)．第21天，停止DT治疗后1周，gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞重新出现(图gydF4y2Ba3 c, dgydF4y2Ba)．同样的模式gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba动力学反应在簇水平上，其中细胞的频率从LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAF集群0增加，并在DTR中维持gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba动物。相比之下,DTRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba在DT去除后重新出现之前，动物的0簇CAFs已经耗尽。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba)．DTR中肿瘤相关簇1、2和5的相对频率也有所增加gydF4y2Ba+gydF4y2Ba动物(扩展数据图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．部分保留gydF4y2BaPi16gydF4y2Ba簇1、簇2和簇5 CAFs的表达表明它们处于更类似于正常组织成纤维细胞的状态。为了支持这一观察，簇1和簇2在簇3和簇4的正常皮肤成纤维细胞特征上得分高于簇0和簇5(扩展数据图)。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

PROGENy通路活性分析gydF4y2Ba17gydF4y2Ba发现在LRRC15的样品中TGFβ活性较高gydF4y2Ba+gydF4y2Ba战乱国家。相比之下，LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAFs的缺失与未成熟皮肤的成纤维细胞样品最相似，且JAK-STAT、NF-κB和TNF信号通路富集(图1)。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)．这在很大程度上是由上述簇丰度的变化所解释的，其中簇1和簇2与正常组织成纤维细胞(簇3和簇4)相比具有最高的TGFβ活性的簇0共享JAK-STAT, NF-κB和TNF信号通路。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba)．总之，这些数据表明LRRC15的损耗gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAFs不仅降低了KPR肿瘤中成纤维细胞的总体含量，还重新校准了剩余CAFs的定位点，使其趋于更普遍的成纤维细胞样状态。gydF4y2Ba

LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba战乱国家阻碍CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞的功能gydF4y2Ba

最近的研究已经确定了LRRC15高表达之间的临床联系gydF4y2Ba+gydF4y2Ba多种癌症类型的CAF特征和抗pdl1治疗缺乏应答gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．然而，LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAFs是这种关联的直接原因。我们认为，在LRRC15缺失的情况下，T细胞免疫和ICB反应性会受到影响gydF4y2Ba+gydF4y2Ba并在我们的临床前模型中进行了测试。首先，我们确定在LRRC15后是否观察到肿瘤控制的改善gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAF消融依赖于CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞。为此，DTRgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba和DTRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba携带皮下KPR肿瘤并经DT治疗的小鼠也给予cd8消耗型或同型对照抗体。在治疗过程中监测肿瘤生长情况(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba与LRRC15充足的小鼠相比，CAFs枯竭的小鼠肿瘤负担明显减轻gydF4y2Ba+gydF4y2Ba战乱国家(无花果。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．CD8 T细胞的耗竭逆转了这一效应，这表明CD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在缺少LRRC15的情况下，T细胞在减轻肿瘤负担方面发挥了作用gydF4y2Ba+gydF4y2Ba战乱国家(无花果。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

图4:LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAF损耗增强CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞效应功能和对抗pdl1治疗的响应性。gydF4y2Ba
图4gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba，数据来自DTRgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba和DTRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba用DT和cd8消耗抗体治疗皮下KPR肿瘤的小鼠。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba、实验方案。gydF4y2BabgydF4y2Ba，平均肿瘤生长曲线(gydF4y2BangydF4y2Ba=每组10只;＊＊＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0002, * * * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001)。gydF4y2BacgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2BaDTR中DT治疗后第12天皮下KPR肿瘤分析gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba和DTRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba老鼠。gydF4y2BacgydF4y2Ba， CD8的定量gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞按肿瘤重量归一化(gydF4y2BangydF4y2Ba老鼠= 10)。gydF4y2BadgydF4y2BaTIM3、LAG3和CD39在CD8上的平均荧光强度(MFI)量化gydF4y2Ba+gydF4y2BaPD1gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5老鼠)。gydF4y2BaegydF4y2BaTNF发生频率的量化gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和干扰素γgydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(gydF4y2BangydF4y2Ba老鼠= 10)。gydF4y2BafgydF4y2BaTNF发生频率的量化gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和干扰素γgydF4y2Ba+gydF4y2Ba抗cd3和抗cd28激活的CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞单独培养72 h或与分类的CAFs (L15, LRRC15;gydF4y2BangydF4y2Ba= 4样品)。gydF4y2BaggydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BajgydF4y2Ba，数据来自DTRgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba和DTRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba带有皮下KPR肿瘤的小鼠用DT和抗pdl1抗体治疗。gydF4y2BaggydF4y2Ba、实验方案。gydF4y2BahgydF4y2Ba，平均肿瘤生长曲线(gydF4y2BangydF4y2Ba=每组9或10只小鼠;＊＊＊＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001)。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，gydF4y2BajgydF4y2Ba治疗后12天皮下KPR肿瘤分析显示颗粒酶B的定量频率gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(gydF4y2BangydF4y2Ba= 10只老鼠)(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)和肿瘤坏死因子gydF4y2Ba+gydF4y2BaIFNγgydF4y2Ba+gydF4y2Bagranzyme BgydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(gydF4y2BangydF4y2Ba= 10只老鼠)(gydF4y2BajgydF4y2Ba)．gydF4y2BakgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，数据来自DTRgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba和DTRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba用DT和抗pdl1抗体治疗的原位胰腺KPR肿瘤小鼠gydF4y2BakgydF4y2Ba、实验方案。gydF4y2BalgydF4y2Ba，平均肿瘤生长曲线(gydF4y2BangydF4y2Ba=每组7只)。的gydF4y2BaxgydF4y2Ba轴代表着床后的天数。gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，植入后第24天的肿瘤重量(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5老鼠)。数据gydF4y2BabgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BajgydF4y2Ba，gydF4y2BalgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba米gydF4y2Ba为平均值±标准差。数据gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba而且gydF4y2BafgydF4y2Ba代表两个独立的实验和gydF4y2BalgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba米gydF4y2Ba代表了一个独立的实验。数据gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2Ba我gydF4y2Ba而且gydF4y2BajgydF4y2Ba来自两个独立的实验。统计数据采用普通单因素方差分析检验(gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BajgydF4y2Ba，gydF4y2Bal, mgydF4y2Ba)或双尾，未配对的学生gydF4y2BatgydF4y2Ba以及(gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba)．显著性值标记DTRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba+同型组gydF4y2BabgydF4y2Ba和DTRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba+反pdl1组在gydF4y2BahgydF4y2Ba相对于其他三组。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

了解LRRC15的药效学作用gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAF衰竭对T细胞功能的影响，我们用流式细胞术检测肿瘤内CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAF衰竭后12天。肿瘤内CD8的总数无差异gydF4y2Ba+gydF4y2BaLRRC15之间的T细胞gydF4y2Ba+gydF4y2Ba观察到咖啡因充足和咖啡因缺乏的肿瘤(图。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)．然而，在LRRC15缺失的情况下gydF4y2Ba+gydF4y2Ba战乱国家,PD1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞表现出与T细胞衰竭和功能障碍相关的分子表面标记物表达显著减少gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，包括TIM3, LAG3和CD39(图4)。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)．此外，我们观察到CD8的增强gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞功能，如TNF和IFNγ表达增加所示(图。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

KPR肿瘤的免疫荧光分析显示肿瘤浸润CD8的比例很高gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞与LRRC15非常接近gydF4y2Ba+gydF4y2Ba这表明细胞间直接相互作用正在发生(扩展数据图。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)．这让我们问LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAFs可直接影响效应T细胞电位。LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和LRRC15gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba从DTR战乱国家gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba肿瘤或PDPNgydF4y2Ba+gydF4y2BaDTR中lrrc15耗尽的CAFsgydF4y2Ba+gydF4y2BaDT治疗后12天对肿瘤进行分类。然后分别与脾脏CD8共培养gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞存在抗cd3和抗cd28抗体(扩展数据图)。gydF4y2Ba6 c, dgydF4y2Ba)．三天后，CD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba重新刺激T细胞并评估TNF和IFNγ蛋白的表达。相比之下,CD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在LRRC15的存在下，T细胞、TNF和ifn - γ的表达显著降低gydF4y2Ba+gydF4y2Ba而在LRRC15存在的情况下，T细胞功能没有变化gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Bacas或归一化lrrc15耗尽的cas(图。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)．这些结果证明了LRRC15的作用gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAFs在抑制肿瘤内CD8中的作用gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞功能显示LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAFs可以直接限制CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞效应电位。gydF4y2Ba

LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAF消融增强ICB反应gydF4y2Ba

先前的研究表明FAP的损耗gydF4y2Ba+gydF4y2Ba肿瘤模型中的肌成纤维细胞可以提高抗pdl1的反应性gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba．我们想测试在LRRC15之后是否观察到类似的效应gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAF消融。DTRgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba和DTRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba携带皮下KPR肿瘤并经DT治疗的小鼠被给予抗pdl1或同型对照抗体，并评估肿瘤生长(图。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)．LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Bacafa充足的小鼠对抗pdl1治疗表现出一定的敏感性，这可以通过部分降低肿瘤负担来证明。相反，LRRC15对抗pdl1治疗的反应性显著增强gydF4y2Ba+gydF4y2Ba咖啡因耗尽的小鼠，反映在肿瘤负担更大幅度的减少。(无花果。gydF4y2Ba4 hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba)．这种组合设置不仅改善了肿瘤控制，而且通过衡量肿瘤进展的时间，也带来了显著的生存效益(扩展数据图)。gydF4y2Ba6 fgydF4y2Ba)．流式细胞术分析CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaLRRC15抗pdl1治疗后12天gydF4y2Ba+gydF4y2Ba通过颗粒酶B的表达测定，CAF的损耗表明其细胞溶解潜力增加。多功能T细胞的频率也增加了，这可以从TNF的数量上反映出来gydF4y2Ba+gydF4y2BaIFNγgydF4y2Ba+gydF4y2Bagranzyme BgydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(图gydF4y2Ba4 i, jgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

我们接着问是否缺少LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在胰腺生长的KPR肿瘤中，CAFs提高了抗pdl1治疗的反应性。KPR肿瘤细胞原位植入DTR胰腺gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba或DTRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba老鼠。植入后第7天开始DT联合抗pdl1抗体或同型对照治疗，超声成像测量肿瘤负荷(图1)。gydF4y2Ba4 kgydF4y2Ba和扩展数据图gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)．类似皮下肿瘤，切除LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba原位胰腺肿瘤中的CAFs显著改善了肿瘤控制，并与抗pdl1协同进一步减少肿瘤负担(图。gydF4y2Ba4 lgydF4y2Ba和扩展数据图gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba)．第24天从DTR中收集肿瘤gydF4y2Ba+gydF4y2Ba接受抗pdl1治疗的小鼠肿瘤重量明显低于对照组小鼠，这反映了治疗期间观察到的肿瘤体积动力学(图。gydF4y2Ba4米gydF4y2Ba)．此外,DTRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba无论用抗pdl1还是同型对照治疗，胰腺肿瘤均显示LRRC15几乎完全消融gydF4y2Ba+gydF4y2Bacas和总PDPN显著降低gydF4y2Ba+gydF4y2Ba成纤维细胞室(扩展数据图)gydF4y2Ba7汉英gydF4y2Ba)．总之，这些发现表明LRRC15的治疗性耗竭gydF4y2Ba+gydF4y2Ba来自胰腺肿瘤微环境的CAFs可显著改善抗pdl1 ICB治疗的反应性。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

在本研究中，我们提供了TGFβ信号在DPT中的直接遗传学证据gydF4y2Ba+gydF4y2Ba万能成纤维细胞促进LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在肿瘤发生过程中形成肌成纤维细胞，构成多种人类癌症的中心成纤维细胞轴。LRRC15选择性耗竭gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAFs显著降低了成纤维细胞的总含量，并使基质室恢复到普遍的成纤维细胞样状态。反过来，这又增强了瘤内CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞效应功能和增强的抗pdl1反应性。gydF4y2Ba

LRRC15作为肌成纤维细胞亚群高度受限的标记，使我们能够直接研究它们在形成TME中的作用，而不干扰其他组织中的成纤维细胞，如LNs，其中组织结构和T细胞启动和功能是由局部成纤维细胞网络形成的gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba．分析LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Bacaf耗尽的肿瘤显示，普遍的成纤维细胞样活性增强，但没有持续的消融，LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba肌成纤维细胞可以在CAF腔室中补充和重建它们的立脚点。这些数据强调了LRRC15的“推拉”关系gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAFs与通用成纤维细胞建立肿瘤成纤维细胞设定值，最终抑制抗肿瘤T细胞免疫和ICB治疗的有效性。免疫学方面，进一步的研究有必要了解CD8之间关系的本质gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞和LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba导致功能抑制的CAFs。此外，了解LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在不同的适应症和肿瘤免疫表型中，CAFs同样指示ICB的反应性。gydF4y2Ba

在治疗方面，我们的发现提出了调节LRRC15的最佳策略的问题gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAF活动。TGFβ抑制剂的使用，目前正在多个临床试验中进行评估gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，是一个有吸引力的治疗选择损害LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAF的形成。然而，在DPT中TGFβ信号的去除gydF4y2Ba+gydF4y2Ba前体使一种代偿机制能够维持成纤维细胞的总数。相反,LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAF消融显著降低了TME的成纤维细胞数量。如果有效的抗肿瘤免疫反应的最佳环境需要一个更小且没有LRRC15的CAF隔室gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAFs，我们的数据强烈表明消耗LRRC15gydF4y2Ba+gydF4y2BaCAFs本身可能是一种更有吸引力的治疗策略，对癌症免疫治疗产生强大和持久的反应。此外，LRRC15的存在gydF4y2Ba+gydF4y2Ba其他非肿瘤性疾病的肌成纤维细胞，如特发性肺纤维化和溃疡性结肠炎gydF4y2Ba10gydF4y2Ba的研究表明，这种治疗方法可能会被扩大，使患者在其他疾病领域受益。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

老鼠gydF4y2Ba

DptgydF4y2BaIresCreERT2gydF4y2Ba老鼠gydF4y2Ba10gydF4y2Ba而且gydF4y2BaLrrc15gydF4y2BaDTRGFPgydF4y2Ba小鼠在基因泰克公司设计、生产和繁殖。gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba小鼠(012603)取自Jackson实验室。所有研究均使用年龄和性别匹配的小鼠(6-12周大)。小鼠按照美国国立卫生研究院的指导方针在特定的无病原体条件下进行饲养。每个研究的样本量在图图例中有描述。所有实验都是在基因泰克动物保护和使用机构委员会批准的协议下进行的。gydF4y2Ba

一代的gydF4y2BaLrrc15gydF4y2BaDTRGFPgydF4y2Ba敲入小鼠gydF4y2Ba

同源重组和小鼠胚胎干细胞技术gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba被用来制造转基因小鼠品系gydF4y2BaLrrc15gydF4y2BaDTR-GFP撞倒。构建了与GRCm38/mm10 16号染色体30,274,520-30,276,223对应的1,704 bp的5 '同源臂和与16号染色体30,270,786-30,272,779对应的1,94 bp的3 '同源臂的基因靶向载体。后删除外显子2gydF4y2BaATGgydF4y2Ba对应于染色体16:30,272,780-30,274,516。随后立即插入DTR-EGFP-SV40-FRT-PGK-neo-FRTgydF4y2BaATGgydF4y2Ba外显子2。最终载体经DNA测序确认，线性化，并使用标准方法(G418 . c)靶向C2 (C57BL/6N) ES细胞gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和更昔洛韦gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba选择)gydF4y2Ba26gydF4y2BaC57BL/6N C2 ES细胞gydF4y2Ba27gydF4y2Ba用20 μ g线性化靶向载体DNA电穿孔，并按照前面描述的药物选择进行培养gydF4y2Ba28gydF4y2Ba．阳性克隆采用远程PCR鉴定，然后进行序列确认。对正确定位的ES细胞进行核型分析。用Adeno-FLP对整倍体基因靶向的ES细胞克隆进行去除PGK新霉素的处理，并对ES细胞克隆进行检测，以识别无PGK新霉素盒式拷贝的克隆，验证靶向等位基因的正确序列。在微量注射白化Bl/6N胚胎前，验证Y染色体的存在。在与C57BL/6N雌性杂交后获得种系传播。利用远程PCR技术筛选幼鼠基因组DNA，验证所需要的基因靶向结构，然后进行小鼠群体扩展。用于基因分型，使用以下引物:5 ' - agggaggcgattg -3 '， 5 ' -CGATGAGGGCTGAAATGT-3 '和5 ' -TGGTCCGTGGATACAGT-3 '扩增408 bp野生型和313 bp敲入DNA片段。PCR周期如下:94°C 4 min，(94°C 1 min, 55°C 30 s, 72°C 1 min) 30个循环;72°C保温10分钟; 4 °C ad infinitum.

细胞系gydF4y2Ba

KPR小鼠胰腺腺癌细胞系由基因泰克的Junttila集团从KPR PDAC GEMMs (gydF4y2Ba喀斯特gydF4y2BaLSL。G12D / wtgydF4y2Ba; p16 / p19gydF4y2Bafl / wtgydF4y2Ba; p53gydF4y2BaLSL。R270H / wtgydF4y2Ba；gydF4y2BaPdx1。CregydF4y2Ba）gydF4y2Ba11gydF4y2Ba．KPR细胞在含10% FBS (Hyclone) + 2 mmol l的RPMI中培养gydF4y2Ba1gydF4y2BalgydF4y2Ba谷氨酰胺。所有细胞株都进行了检测gydF4y2Ba支原体gydF4y2Ba定量PCR检测污染(Lonza Mycoalert和Stratagene Mycosensor)。对于所有注射的肿瘤，细胞在前三次传代中被使用。gydF4y2Ba

体内肿瘤研究gydF4y2Ba

对于皮下KPR肿瘤，将KPR细胞胰蛋白酶化、过滤、计数并在Hanks 's缓冲生理盐水和无酚红基质凝胶(康宁)以1 × 10浓度为1:1的混合溶液中重悬gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞毫升gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．所有基因型小鼠均采用6 - 12周龄、性别相匹配的小鼠右侧翼皮下接种1 × 10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba公司KPR肿瘤细胞。植入前刮除侧皮毛。每周测量和计算2-3次肿瘤体积，使用以下修正椭球公式:½×(长×宽gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．肿瘤> 1000毫米gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba被认为进展了，动物被从研究中移除。同样，肿瘤溃烂超过5毫米的动物也被从研究中移除。用于皮下肿瘤的研究gydF4y2BaLrrc15gydF4y2BaDTRGFPgydF4y2Ba小鼠，当肿瘤达到100-200毫米的体积gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba(接种后约10天)，根据肿瘤体积将动物分成治疗组，开始治疗。gydF4y2Ba

对于原位胰腺KPR肿瘤，将胰腺肿瘤细胞注射到小鼠胰腺中，如前所述gydF4y2Ba29gydF4y2Ba．KPR细胞在汉克斯缓冲盐水溶液和无酚红基质胶(康宁)以2 × 10浓度任一浓度的1:1混合溶液中重悬gydF4y2Ba5gydF4y2Ba或者2 × 10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞毫升gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2BaDptgydF4y2BaCreERT2gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba或gydF4y2BaLrrc15gydF4y2BaDTRgydF4y2Ba小鼠采用吸入麻醉，放置在加热垫上并给予眼药水凝胶。左侧或腹部剃毛并用ChloraPrep (BD)消毒，然后用无菌微剪刀在脾廓内侧切开约1厘米的切口。切开皮下肌肉层，用钝鼻钳取出胰腺和脾脏。制备含细胞液的31号针插入胰腺尾部，取含1 × 10的细胞液50µlgydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞被慢慢地注射进去。用可吸收缝合线和伤口夹缝合伤口，让小鼠恢复。所有动物均给予0.5 mg kg的丁丙诺啡缓释镇痛药SR LABgydF4y2Ba1gydF4y2Ba．在手术结束后，每天对小鼠进行监测，以观察感染或痛苦的迹象。用于原位肿瘤研究gydF4y2BaLrrc15gydF4y2BaDTRGFPgydF4y2Ba小鼠植入后7天，根据肿瘤体积将动物分成治疗组并开始治疗。gydF4y2Ba

在治疗后的指定时间点收集小鼠进行分析或用于肿瘤生长研究。小鼠研究的样本量是基于常规需要的小鼠数量，以建立基于研究组内可变性的统计显著性。治疗组尽可能进行盲法治疗。这里所有的动物研究都得到了基因泰克机构动物护理和使用委员会的批准。gydF4y2Ba

原位胰腺肿瘤的超声成像gydF4y2Ba

用于原位胰腺肿瘤的研究gydF4y2BaLrrc15gydF4y2BaDTRGFPgydF4y2Ba小鼠，肿瘤体积测量超声成像。小鼠在温暖的诱导箱中用4%七氟醚(Zoetis)麻醉，并在成像过程中在2.5-3%七氟醚持续流动的条件下右侧体位。去除毛发后，在皮肤上放置超声耦合凝胶，在vevo2100(富士visual超音速-)上获得横向和纵向平面上的解剖b模式图像，捕获最大肿瘤横截面(MS-550D探针;中心频率40 MHz，轴向分辨率40 μ m，横向分辨率90 μ m，场深12 mm)。使用Vevo LAB v.5.5.1对每只小鼠的胰腺肿瘤体积进行分析，椭球体的公式如下gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba) = π/6 ×长×宽×深。gydF4y2Ba

体内的治疗gydF4y2Ba

对于TAM-inducedgydF4y2BaCregydF4y2Ba小鼠腹腔注射2 mg TAM (Sigma, T5648)稀释于葵花籽油(Sigma, 88921)连续5天，或喂含有TAM的饲料(Envigo, TD.130859)。为了消融LRRC15 CAF，小鼠腹腔内注射25 ng ggydF4y2Ba1gydF4y2BaDT (Enzo Life Sciences, bl - g135)每周两次。在cd8耗损研究中，用大鼠IgG2b同型对照抗体或大鼠抗cd8 IgG2b耗损抗体(BioXcell, BE0061)以10 mg kg的剂量治疗小鼠gydF4y2Ba1gydF4y2Ba每周腹腔注射三次。在抗pdl1研究中，小鼠用同型对照抗体或抗pdl1 (6E11)抗体(内部)处理。第一剂剂量为10 mg kggydF4y2Ba1gydF4y2Ba其次是5毫克公斤gydF4y2Ba1gydF4y2Ba此后每周腹腔内注射两次。gydF4y2Ba

小鼠组织消化，细胞分离和流式细胞术gydF4y2Ba

肿瘤被收集起来，称好重量，切成小块。为了分离未成熟的侧腹皮肤，毛发被剃掉，脂肪组织被去除，皮肤组织被切碎。所有组织随后使用disase (Life Technologies)、胶原酶P和DNaseI (Roche)的混合物在37°C下酶解45分钟，以获得单细胞悬浮液。细胞计数使用Vi-CELL XR (Beckman Coulter)。对于细胞因子染色，用eBioscience细胞刺激鸡尾酒和蛋白质转运抑制剂(00-4975-93)刺激细胞悬液，再悬浮在RPMI中，加入10%胎牛血清+ 2 mmol lgydF4y2Ba1gydF4y2BalgydF4y2Ba-谷氨酰胺和2-巯基乙醇在37°C下浸泡2小时。细胞用以下单克隆抗体标记，这些抗体购自BioLegend或BD Biosciences，在4ºC的冰上放置20-30分钟(除非另有说明)。在细胞表面用以下荧光标记抗体染色之前，细胞被Fc阻滞(2.4G2;1∶553142)。使用以下表面或细胞内抗体:CD45 (30-F11, 103139);EPCAM (G8.8, 118218);CD31(390、561410);PDPN (8.1.1 (127410);CD24 (M1/69, 612832);LRRC15 (M25公路、内部); CD90.2 (53-2.1, 565527); CD8 (53-6.7, 612759); PD1 (29F.1A12, 135225); TIM3 (RMT3-23, 119727); LAG3 (C9B7W, 125227); CD39 (Duha59, 143812); IFNγ (XMG1.2, 505846); granzyme B (GB11, 515408); and TNF (MP6-XT22, 506324). Live cells were identified by incubation with calcein blue (Invitrogen, C1429, 1:1,000) after surface staining. For intracellular staining, samples were fixed, permeabilized and stained using a BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization kit (554714) according to the manufacturer’s instructions. Data were acquired using a Fortessa, Symphony or LSRII (BD Biosciences) flow cytometer and analysed using FlowJo (Tree Star, v.10.7.1), or cells were sorted using a Fusion or Aria (BD Biosciences). instrument Data were processed using Prism GraphPad. Additional information is provided in Supplementary Table6gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

cafa - cd8 T细胞共培养gydF4y2Ba

为了刺激板结合抗cd3, 96孔平底板在4℃下涂敷10 μ g ml过夜gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗cd3 (BioLegend, 100340，克隆145-2C11)，并用PBS冲洗一次。相关的原发CAFs从DTR消化的KPR皮下肿瘤中分类gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba或DTRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba小鼠，3 × 10gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba然后将细胞添加到抗cd3包被孔(100 μ l)中。细胞在37°C下孵育1 h以促进附着。在孵育期间，小鼠CD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba利用EasySep小鼠CD8免疫磁阴性选择从原始脾细胞的单细胞悬浮液中分离T细胞gydF4y2Ba+gydF4y2Ba根据制造商的指南，从干细胞(19853)获得T细胞富集试剂盒。约6 × 10gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba纯化CD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba将T细胞加入到含有可溶性0.50 μ g ml的孔中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗cd28 (BioLegend, 102115，克隆37.51)(100 μ l)。分析当日更换培养基，用1×细胞刺激鸡尾酒(eBioscience 500×细胞刺激鸡尾酒+蛋白转运抑制剂，00-4975)和55 μ M 2-巯基乙醇在37℃培养4 h。收集细胞，过滤和表面标记染色。表面染色后，在细胞内细胞因子染色前，根据制造商的指南使用细胞内固定和渗透缓冲液对细胞进行固定和渗透。然后用流式细胞仪对细胞进行分析。gydF4y2Ba

小鼠肿瘤的免疫荧光和图像分析gydF4y2Ba

肿瘤在4%多聚甲醛中固定过夜，并嵌入最佳切割温度培养基(Sakura Finetek)中，在- 80℃冷冻存储。切片(8 ~ 12 μm厚)冷冻切片并染色。染色用正常小鼠血清(1:50)、小鼠Fc块(1:100)和0.3%的Triton-X在室温下稀释PBS 30分钟。组织切片与一抗在室温下孵育1小时或在4℃下过夜。洗净后，室温下加入二抗1 h。为了进行反染色，将载玻片冲洗并在室温下用DAPI (ThermoFisher, D1306)在300 nM PBS中孵育5分钟。所使用抗体的详细信息可在补充表中找到gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．玻片在PBS中冲洗几次，排出多余的缓冲液，切片安装在Vectashield (H-1000)中。使用配备Plan apo lambda NA 0.75 ×20镜头的尼康A1R共聚焦显微镜获取图像。激光器被设置在488 nm, 561 nm和640 nm的激发，和一个完美的聚焦模块。使用NIS Elements采集软件，2倍的数字变焦进行组织全切片成像，7倍的数字变焦进行细节成像，并对单面图像进行拼接。在500 × 500 × 10 μ m内，计算CD8 T细胞和lrrc15 CAF相互作用率gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba3个不同肿瘤的组织切片。gydF4y2Ba

Lrrc15gydF4y2Ba原位杂交gydF4y2Ba

原位杂交组织用福尔马林固定，石蜡包埋。小鼠LRRC15原位杂交使用ACD探针(Advanced Cell Diagnostics, 467838，杂交120分钟)进行。ER2检索(徕卡)在95°C 15分钟和RNAscope 2.5 LS蛋白酶III消化(ACD)在徕卡邦德自动染色器上进行。采用RNAscope 2.5 LS试剂盒Red (ACD)进行检测。gydF4y2Ba

鼠标scRNA-seq和单元格哈希gydF4y2Ba

小鼠scRNA-seq和具有独特条形码抗体(BioLegend)的细胞哈希处理使用铬单细胞基因表达3 ' v3文库和凝胶珠试剂盒，按照制造商的说明(10x Genomics, PN-1000075)。使用维细胞XR细胞计数器(Beckman Coulter)对细胞进行计数和活力检查，然后将细胞注入微流控芯片，在10x铬仪器中形成凝胶珠状乳状液。对凝胶珠进行反转录，纯化和扩增产物。基于SPRIselect珠的大小选择，将抗体衍生标签的DNA从cDNA中分离(Beckman Coulter, B23318)。使用生物分析仪高灵敏度DNA试剂盒(Agilent Technologies, 5067-4626)生成表达文库和抗体衍生标记文库，并用Kapa文库量化试剂盒(Roche, 07960255001)进行定量分析。所有文库用HiSeq4000和NovaSeq (Illumina)测序gydF4y2Ba

鼠标scRNA-seq数据处理gydF4y2Ba

初始数据处理gydF4y2Ba

基于小鼠参考基因组GRCm38和GENCODE基因模型的自定义参考，使用CellRanger计数(CellRanger 3.1, 10x Genomics)处理每种细胞类型的每个文库的scRNA-seq数据。使用带有默认参数的DemuxEM处理用于标记单个复制的条形码抗体计数，以分配单个样本标签gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba．鉴定为双重或hto阴性细胞的细胞被排除在分析之外。对于基因表达计数，单个样本被合并到一个表达矩阵中，并使用Seurat包进行分析。表达基因少于300个或线粒体计数超过5%的细胞被移除。转录本计数进行对数归一化(Seurat, NormalizeData)，使用方差稳定变换(FindVariableFeatures)选择变量最多的前2000个基因，然后进行数据变换(ScaleData)。然后对该基因空间(RunPCA)进行主成分分析。聚类是基于细胞之间的共享近邻(FindNeighbors, 30个pc)和基于图的聚类(30个pc，分辨率为0.1gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba0.5损耗,gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2BaKO实验)。我们使用Seurat中的findmarks函数计算单个集群的标记(Wilcoxon’s秩和检验，Benjamini-Hochberg调整用于多重检验)。为了可视化单个聚类的基因表达水平，我们计算了每个聚类的平均基因表达量，并计算了agydF4y2BazgydF4y2Ba-基于基因的评分值。gydF4y2Ba

过滤的细胞gydF4y2Ba

为gydF4y2BaDptgydF4y2BaIresCreERT2gydF4y2BaTgfbr2gydF4y2Bafl / flgydF4y2Ba在实验中，根据已知细胞类型标记的表达，对初始数据处理步骤得到的Seurat对象中的细胞进行进一步的过滤。只有0、2、3、4、5和8簇的成纤维细胞表达gydF4y2Ba亮度gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba宽带运gydF4y2Ba,但不gydF4y2BaPecam1gydF4y2Ba(内皮细胞),gydF4y2BaPtprcgydF4y2Ba(免疫细胞)或gydF4y2BaRgs5gydF4y2Ba(周细胞)，留作后续分析。然后我们进行上述降维和聚类，并去除剩余的小污染非成纤维细胞。最后使用30个pc进行降维和聚类，聚类分辨率为0.3。gydF4y2Ba

为gydF4y2BaLrrc15gydF4y2BaDTRGFPgydF4y2Ba在耗尽实验中，通过排除聚类表达，从初始数据处理步骤得到的Seurat对象中分离成纤维细胞(簇0、1、2和5)gydF4y2BaPecam1gydF4y2Ba(内皮细胞),gydF4y2BaPtprcgydF4y2Ba(免疫细胞)gydF4y2Ba, Rgs5gydF4y2Ba(周),gydF4y2BaKrt18gydF4y2Ba(上皮)或gydF4y2BaMyl1gydF4y2Ba(平滑肌细胞)。然后我们进行上述降维和聚类，并去除剩余的小污染非成纤维细胞。最后使用30个pc进行降维和聚类，聚类分辨率为0.2。gydF4y2Ba

基因表达程序的细胞评分gydF4y2Ba

使用Seurat中的addModuleScore函数和感兴趣的基因集作为输入对基因表达程序的细胞进行评分。PDAC小鼠GEMM程序推导如下。在我们之前的研究中，我们使用了TGFβ CAFs(簇2)中至少有0.6个平均对数折叠变化上调的基因gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba作为这些条件的标记基因。为了识别正常组织成纤维细胞(簇3和簇4)的基因集，我们确定了簇3和簇4的前20个标记，并使用Seurat中的FindMarkers功能将其与数据集中的所有其他细胞进行比较。gydF4y2Ba

人口频率分析gydF4y2Ba

为了评估不同条件下特定细胞簇的细胞丰度差异，我们使用了R包散斑(gydF4y2Bahttps://github.com/Oshlack/specklegydF4y2Ba)，旨在发现细胞类型比例的显著差异。简单地说，speckle在每个生物复制中计算分配给特定集群的细胞比例，对比例进行方差稳定转换，并确定不同组间细胞类型比例是否显著。鉴于我们在所有实验中只比较了两组人，gydF4y2BatgydF4y2Baspeckle使用-test进行计算gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用Benjamini-Hochberg校正对这些值进行多次测试调整。gydF4y2Ba

通路富集分析gydF4y2Ba

我们使用的后代gydF4y2Ba17gydF4y2Ba从我们的单细胞基因表达数据推断通路活性，如前所述gydF4y2Ba10gydF4y2Ba按照作者提供的单细胞教程(gydF4y2Bahttps://saezlab.github.io/progeny/articles/ProgenySingleCell.htmlgydF4y2Ba)．我们将后代分数与群集或实验时间点/条件进行匹配，并按种群汇总数据。gydF4y2Ba

Lrrc15gydF4y2Ba小鼠组织中的基因表达gydF4y2Ba

每百万映射读值的序列千基归一化片段检索自ref中的补充表6。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba．数据进行对数变换，表达水平gydF4y2BaLrrc15gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGapdhgydF4y2Ba被组织可视化。gydF4y2Ba

TCGA数据分析gydF4y2Ba

批校正归一化TCGA Pan-Cancer mRNA数据来自UCSC Xenabrowser (gydF4y2Bahttps://xenabrowser.net/gydF4y2Ba)(gydF4y2BaNgydF4y2Ba= 11060)。去除含有NA表达值的样本。此外，我们对数据进行了过滤，只包含来自原发性实体肿瘤的样本(样本代码01;gydF4y2BaNgydF4y2Ba= 9702)。生存数据来自参考文献中的表S1。gydF4y2Ba31gydF4y2Ba并使用唯一的TCGA参与者条形码链接到Pan-Cancer数据集。少于80例患者的适应症被排除在分析之外(最终数据集:gydF4y2BaNgydF4y2Ba= 9195名患者)。gydF4y2BaTGFBgydF4y2Ba通过计算我们之前发表的标记签名的平均表达来推断CAF水平gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba在一个样本中gydF4y2BazgydF4y2Ba-得分转换的每个基因在样本。通过多变量Cox回归和TCGA指征作为协变量确定TCGA数据与生存的相关性，并在每个指征中进行单变量Cox回归分析。风险比定义为TGFβ CAF评分增加一个单位时死亡风险的变化。gydF4y2Ba

人肿瘤消化和基质细胞RNA-seq分析gydF4y2Ba

肿瘤组gydF4y2Ba

用于免疫剖析器计划(IPI)的肿瘤样本是从各种癌症手术室和门诊诊所运送过来的。所有患者都向加州大学旧金山分校(UCSF) IPI临床协调小组提供了组织收集的同意，根据机构审查委员会(UCSF IRB 20-31740)批准的UCSF协议。标本在外科切除和病理助理的活检后获得，以确认肿瘤细胞的存在。选择患者时不考虑之前的治疗。新鲜切除的样本被放置在50ml锥形管中冰冷的PBS或莱博维茨的L-15培养基中，并立即运输到实验室进行样本标记和处理。样本被用于全组织消化成单细胞悬浮液或部分组织切片保存用于成像分析。gydF4y2Ba

细胞分选，文库制备和测序gydF4y2Ba

细胞分选、文库制备、测序和生物信息学数据处理如前所述gydF4y2Ba32gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

排序基质rna序列的计算分析gydF4y2Ba

从归一化基因×细胞表达值的对数转换矩阵中，我们根据它们的四分位范围确定了2500个最易变的基因，并在这些基因的空间中进行PCA。然后我们使用PC1-PC6中阳性和负性负载最强的10个基因进行样本和基因的层次聚类(完全连锁和欧氏距离)。集群树状图被分成gydF4y2BakgydF4y2Ba=基于树高的6个集群。我们解释了高表达的样本群gydF4y2BaEPCAMgydF4y2Ba，gydF4y2BaKRT8和KRT18gydF4y2Baepithelial-driven和gydF4y2BaTYROBPgydF4y2Ba而且gydF4y2BaCSF3RgydF4y2Ba并将这些样本从我们后续的分析中排除。接下来，我们对剩下的样本进行PCA分析。然后将所得PC空间的负载用于将上皮和髓系驱动的样本投射到PC1和PC2上。同样，参考文献中提供的PDAC患者的显微解剖大体积RNA-seq样本。gydF4y2Ba33gydF4y2Ba从基因表达综合数据库(identifiergydF4y2BaGSE93326gydF4y2Ba)并投射到PC1和PC2上。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

关于研究设计的进一步信息可在gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到本文。gydF4y2Ba