多通膜蛋白膜内伴侣的作用机制gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，gydF4y2Ba^35gydF4y2BaS-methionine贴上ρgydF4y2Ba^extgydF4y2Ba在兔网织红细胞裂解液(RRL)中，在犬胰源粗粒体(RMs)存在下合成了指定长度的核糖体新生链复合体(rnc)。在说明的地方，rnc使用双马来酰亚胺己烷(BMH)进行化学交联。标明了糖基化(+糖基化)和非糖基化(-糖基化)翻译产物的位置。与Asterix的交联(用x-Asx表示)在变性条件下使用抗Asterix抗体(底部面板)进行免疫沉淀验证。Rho的PAT复合招募模式gydF4y2Ba^extgydF4y2Ba构造类似于前面描述的非扩展Rho构造gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba．gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2Ba^35gydF4y2BaS-methionine贴上ρgydF4y2Ba^extgydF4y2Ba在含有或不含有糖基化位点的RRL中合成指定长度的RNC。翻译产物用蛋白酶K (PK)消化。插入膜的多肽群体被保护免受PK。gydF4y2BacgydF4y2Ba，翻译产物如b组(车道1和4)生产，之后RMs被沉积分离(车道2和5)，并与BMH交联(车道3和6)。与Asterix的交联显示。gydF4y2BadgydF4y2Ba， FLAG或双链标记(TST)，包含Rho的膜插入rnagydF4y2Ba^extgydF4y2Ba对TMD1以外的70个截断氨基酸(aa)进行分馏和亲和纯化。IVT的总产物被离心，以获得膜部分，然后在非变性条件下溶解(可溶性部分)。可溶性部分进行抗flag亲和纯化。用抗flag免疫印迹法(上图)分析纯化等分物(洗脱部分多5倍)。底板显示了CCDC47、Asterix、RPL8、Sec61β和EMC2免疫印迹的两种纯化物的洗脱部分。对ER微粒体的连续稀释进行平行分析。共和党全国委员会的ρgydF4y2Ba^extgydF4y2Ba可以有效的亲和纯化，回收相关的PAT复合物。请注意，CCDC47和Asterix印迹的左右车道是来自同一种凝胶和相同的曝光，竖线表示车道拼接在一起的点。gydF4y2BaegydF4y2Ba，牛催乳前蛋白(pPL)的膜插入rna在信号序列之外截断了56个残基gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba和ρgydF4y2Ba^extgydF4y2Ba在TMD1以外截断的70个残基进行反flag亲和纯化，如图d所示gydF4y2Ba^extgydF4y2Ba作为特异性对照。在说明的地方，样品在RMs溶解之前与BMH交联。上图为亲和纯化步骤的抗flag免疫印迹图(见图d)，下图为CCDC47、Asterix、RPL8和Sec61α各纯化免疫印迹图的洗脱组分。印迹结果表明pPL转译中间体与PAT复合体没有关联，而PAT复合体与Rho有关联gydF4y2Ba^extgydF4y2Ba在没有交联或有交联的情况下都具有相当的效率，从几乎没有非交联的Asterix来判断，这证明几乎是定量的。这表明PAT复合体与Rho有关联gydF4y2Ba^extgydF4y2BaRNCs在所采用的纯化条件下是耐盐和耐洗涤剂的。CCDC47末巷的弱带为IgG重链污染。gydF4y2BafgydF4y2Ba上面的图描述了编码全长n端标记TRAM2的结构，其拓扑结构与Rho的拓扑结构相反。下面的面板显示了一个类似于罗的实验gydF4y2Ba^extgydF4y2Ba图所示。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba．纯化的样品在RMs系列稀释旁边用免疫印迹法进行分析。相同的翻译水平和rnc的恢复反映在底物印迹和类似水平的Sec61亚基和核糖体上。缺乏mRNA的反应作为与亲和树脂非特异性结合的阴性对照。注意，对于gydF4y2Ba^extgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)， PAT复合体向TRAM2转译中间体的募集依赖于新生链的长度。虽然在超过TMD1的70-100 aa处可以检测到少量的募集，但在超过TMD1的110 aa处可以观察到稳定的最大募集起始点。gydF4y2BaggydF4y2Ba，图显示了Rho和TRAM2在PAT复合体初始稳定招募点的底物配置，近似于比例。这对应于Rho在TMD1之外的~70 aa和TRAM2在TMD1之外的~110 aa。长度上的差异可以由TMD1的不同拓扑结构解释。为了简单起见，这里没有显示translocon。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，描述Rho-2TMD RNC样品的分类方案和冷冻- em显微图分析的流程图。被称为“TRAP复合体”的类似乎只包含由Sec61和TRAP复合体组成的核心转位子，其构象明显有些不同，正如先前在低温电子显微镜和低温电子断层扫描工作中所描述的那样gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba}．这些问题没有进一步讨论。注意，模型构建几乎完全依赖于Rho-2TMD参考地图，少数地区使用两个子地图进行验证。复合图如图5所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba只是为了说明的目的，作为一种同时显示每个地图贡献的最佳区域的方法。FCwSS是信号相减的集中分类。gydF4y2BabgydF4y2Ba， Rho-2TMD参考图的傅里叶壳层相关(FSC)曲线，通过金标准方法显示总体分辨率为3.25 ÅgydF4y2Ba^64gydF4y2Ba．gydF4y2BacgydF4y2Ba，两张根据局部分辨率着色的rh - 2tmd参考地图的视图。指出了关键的结构元件。gydF4y2Ba

a、bgydF4y2Ba，从Rho-2TMD参考图的膜平面的两个视图，低通滤波到7 Å分辨率，与模型拟合。给出了膜的近似位置。为了清楚起见，省略了洗涤胶束和核糖体。gydF4y2BacgydF4y2Ba，从与模型拟合的低通滤波Rho-2TMD参考图的ER管腔观察。剪切面在膜内靠近内质腔。为清晰起见，省略了洗涤胶束和核糖体，核糖体隧道出口的位置已标明。gydF4y2BadgydF4y2Ba，洗涤胶束和核糖体中低通过滤参考图谱概述。这张地图在两个等高线上标出。蓝线显示低轮廓水平，管腔密度和完整胶束可见。不透明密度显示在更高的等高线水平，以可视化translocon，颜色如面板a-c。核糖体和胶束呈透明灰色。gydF4y2BaegydF4y2Ba， PAT子分类图(扩展数据图子图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)经核糖体局部分辨率过滤，以说明最接近核糖体(并由核糖体稳定)的区域分辨率特别高。表明了新生链密度的位置和核糖体出口通道的入口。gydF4y2BafgydF4y2BaRho-2TMD模型的空间填充描述说明了CCDC47的c端区域如何进入核糖体出口隧道口，毗邻新生链，并缩小出口隧道尺寸。顶部显示了剪辑前后的概况，虚线框表示下面放大倍数更高的区域。gydF4y2Ba

所有的AlphaFold2预测都是使用ColabFold获得的。对于所有的配合物，预测对齐误差(PAE)矩阵，由预测局部距离差异检验(pLDDT)着色的结构模型和拟合到各自密度的最终模型都显示出来。请注意，PAE矩阵的范围是从0-5 Å，而不是默认的0-30 Å输出，以强调非常高的置信度交互。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，人类PAT复合物，由CCDC47和Asterix组成。最终模型拟合到来自PAT子分类图(扩展数据图中的子图2)的各自密度中。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)由本地分辨率过滤。gydF4y2BabgydF4y2Ba犬Sec61复合物。最后的模型拟合到各自的密度从Rho-2TMD参考地图通过局部分辨率过滤。gydF4y2BacgydF4y2Ba人BOS复合物，由TMEM147、Nicalin和NOMO组成。最终模型(省略了NOMO，因为它没有在地图中显示出来)拟合到从TMEM147子分类地图(扩展数据图中的子地图1)中获取的各自密度。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)由本地分辨率过滤。尼卡林的密度也显示在一个非常低的阈值透明白色，以可视化管腔域密度。gydF4y2BadgydF4y2Ba，人凝胶复合物，由TMCO1和OPTI (C20orf24)组成。最后的模型拟合到各自的密度从Rho-4TMD地图通过局部分辨率过滤。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，图解了用Asterix变体进行PAT复合体重构的策略，然后分析衬底相互作用。Asterix KO细胞含有内源性CCDC47的残留水平。当阿斯泰里克斯gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba在RRL中翻译，辅以Asterix KO半渗透(SP)细胞，插入并与CCDC47相互作用重建PAT复合体。当底物rna随后被引入时，可以测试它们与PAT复合物的相互作用。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2Ba^35gydF4y2Bas标记的Asterix在Asterix KO SP细胞存在下被翻译。然后用离心分离法分离细胞，用蛋白酶保护法分析Asterix拓扑结构(左)，并通过共免疫沉淀(IP;右)。Asterix的胞质n端可被蛋白酶(胰蛋白酶)接触，剩下的受保护片段可通过c端FLAG-tag免疫沉淀回收。右边的面板显示了总数gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba翻译产物(巷1)，沉积的SP细胞(巷2)，带有CCDC47抗体的原生IP(巷3)或使用对照抗体的原生IP(巷4)。gydF4y2BacgydF4y2Ba在含有Asterix KO SP细胞的RRL(非放射性蛋氨酸)和琥珀抑制试剂中翻译了野生型和琥珀密码子的Asterix变体(在指定的位置)，用于光交联氨基酸BPA的位点特异性结合。细胞被分离并孵育gydF4y2Ba^35gydF4y2Bas标记Rho rna在TMD1以外的70个残基处截断。然后，在指定的地方使用双马来酰亚胺己烷(BMH)交联样品。底物中唯一的半胱氨酸位于第一个TMD。注意，所有的Asterix变体与底物形成bmh介导的交联，表明底物-Asterix相互作用成功重建。为了进行比较，对含有BPA的样品进行了紫外线照射，说明Asterix和衬底之间的光交联也可以看到(参见图。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba和e).正如预期的那样，光交联的效率低于化学交联。gydF4y2BadgydF4y2Ba， Asterix和CCDC47之间光交联实验的放射自显像。gydF4y2Ba^35gydF4y2Bas标记的带有BPA的Asterix变体被重组为Asterix KO SP细胞，如c图所示。细胞被分离，紫外线照射，并直接分析或使用抗ccdc47抗体变性IP后进行分析。gydF4y2BaegydF4y2Ba如图c所示，在指示位置上含有BPA的非放射性asterix变体被重组为asterix KO SP细胞。然后将重组的SP细胞在32°c下孵育10分钟，分离出来gydF4y2Ba^35gydF4y2Bas标记Rho rna截断了TMD1以外的70个残基。样品经紫外光照射，SDS-PAGE和放射自显影分析。指出了非糖基化和糖基化Rho的位置，以及与Asterix (x-Asterix)的交联。在这个实验中，只有42号位置显示出强烈的交联。gydF4y2BafgydF4y2Ba图中分析了Asterix突变体的原生CCDC47 IPs。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba．gydF4y2Ba^35gydF4y2Bas标记的Asterix变体在RRL中翻译，并添加Asterix KO SP细胞。SP细胞经离心分离，在原生条件下溶解，用抗ccdc47抗体进行免疫沉淀。分离的SP细胞的等分图(上图)和CCDC47 IP的产物(下图)。值得注意的是，一小部分Asterix明显地以反向插入(“inv. Asterix”)并变成糖基化。该种群不与CCDC47共ip，提供内部特异性控制。突变位置的描述方案如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

一个gydF4y2BaRho-2TMD模型中的Sec61复合体(左)呈封闭构象，CCDC47的锁存螺旋紧挨着Sec61α的TMD2和TMD3之间的胞质环。开放的Sec61复合体(中间，PDB 3JC2)会与CCDC47发生冲突，因为Sec61的n -半部分需要从核糖体结合的c -半部分旋转，以适应侧门的底物(如该结构中的信号肽)。右图显示了两个结构通过核糖体结合域的排列，说明了Sec61的n -半部分在侧门打开时需要如何旋转。gydF4y2BabgydF4y2Ba， Rho-2TMD数据集中含有(左)或缺乏(右)PAT复合物的粒子重建的实验低温- em密度。在相似的等高线水平上，Sec61的核糖体和c -半区在两个图谱中基本相同，含ccdc47的图谱中n -半区密度明显更好。在低等高线水平，在ccdc47缺失的地图中可以看到n -一半，尽管由于假定位置的异质性，分辨率较低。没有和有PAT配合物的粒子中Sec61密度的差异不能归因于细化的差异。精化过程中的粒子排列主要由核糖体提供的强信号所主导，这在两类之间没有区别。聚焦分类后未进行重排。两个图谱中核糖体和Sec61许多部分的密度非常相似，这一事实提供了事后验证，即精化过程是一致的。转孔胶束复合体相对于核糖体的整体灵活性差异可以被排除，因为只有在门控过程中已知的Sec61移动的部分可以看到实质性的密度差异。相比之下，Sec61位于RBD远端但不受门控影响的部分保持不变。基于这些原因，我们将含有pat和不含pat的映射之间的Sec61密度差异归因于前者被稳定在封闭状态。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba在添加HEK293 SP细胞的RRL中合成了在指定长度截断的FLAG-TRAM2 rna(见图)。rna在原生条件下通过n端flag标记进行亲和纯化(如扩展数据图。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)，并用免疫印迹法对指示蛋白进行分析。阴性对照(neg)是一种没有mRNA的翻译反应。gydF4y2BabgydF4y2BaRNCs of Twin-Strep Tag (TST)-RhogydF4y2Ba^extgydF4y2Ba(见图)对TMD2、TMD3、TMD5或TMD7下游截断的40个残基进行了PAT复合体关联分析，如图所示。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba．长度为7+的RNC表示一个比TMD7截断了70个残基的新生链。gydF4y2BacgydF4y2Ba如扩展数据图所示，对TMD下游截断40个残基的FLAG-TRAM2 rnc(见图)进行PAT复合体关联分析。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba．gydF4y2BadgydF4y2Ba光交联分析gydF4y2Ba^35gydF4y2Bas -蛋氨酸标记的Rho-4TMD易位中间体(如图所示)。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)通过安装在TMD1 (Amb1)、TMD3 (Amb3)或两者琥珀密码子上的BPA。上面的面板显示了超离心分离后总rna的自动放射照相。其中三个关键样本也使用指定的抗体进行免疫沉淀，并在底部面板进行放射自显影分析。非糖基化和糖基化底物(Rho和Rho+glyc。，respectively) and the adducts to Asterix (x-Asterix), Sec61β (x-S61β) and Sec61α (x-S61α) are indicated.egydF4y2Ba光交联分析gydF4y2Ba^35gydF4y2Bas -蛋氨酸标记的Rho-4TMD易位中间体通过BPA安装在TMD2(位置85)。比较三种半透化细胞:野生型(WT)、TMCO1 KO(∆TMCO1)和瞬时转染标记TMCO1的∆TMCO1细胞。与WT SP细胞的主要交联在∆TMCO1 SP细胞中丢失，在∆TMCO1 SP细胞中可以看到与大小相似的未知蛋白的其他弱交联。当∆TMCO1细胞的一个子集现在表达FLAG-TMCO1时，可以看到一个新的交联，其迁移速度略慢于WT细胞中的主要产物。这些结果验证了WT细胞中主要的交联是TMCO1，而在重构后的∆TMCO1细胞中稍大的交联是FLAG-TMCO1。与TMD2中不同位置的BPA交联表明其亲水面与TMCO1相互作用(如图所示)。gydF4y2BafgydF4y2BaWT或∆TMCO1 SP细胞中Rho-4TMD RNC的蛋白酶保护试验。放射自显像显示相同的糖基化表明TMD1插入效率相同，但不同数量的完全保护产物表明3-TMD插入成功。在∆TMCO1细胞中，大量的蛋白质无法插入TMDs 2和3，导致蛋白酶可及性(见图)。在洗涤剂(下标d)存在的情况下，PK消化导致完全消化。图表显示了三个独立实验的量化结果，显示了平均值和标准差。通过双尾Student 's t检验，观察到差异有统计学意义(p = 0.01)。该图的源数据见补充表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．gydF4y2BaggydF4y2BaRNCs of RhogydF4y2Ba^extgydF4y2Ba将超过TMD1的70个残基组装在WT、∆Asterix、∆CCDC47、∆TMCO1和∆TMEM147 SP细胞中，并在原生条件下通过FLAG-tag进行亲近纯化，如图所示。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba．用免疫印迹法对指示蛋白的细胞裂解物和纯化rna进行分析。gydF4y2BahgydF4y2Ba双马来酰亚胺正己烷(BMH)介导的交联通过半胱氨酸取代了红紫红质TMD1中的F56，使TMD1下游的70个残基中断(上面板)，或者相当于RNC，其中TMD1被22个亮氨酸残基和一个类似位置的半胱氨酸残基取代(下面板)。gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba将s -甲硫氨酸标记的rnc与WT、∆Asterix、∆TMCO1和∆TMEM147 SP细胞组装，进行BMH交联，并通过SDS-PAGE和放射自成像直接分析，或在变性抗Asterix IP后进行分析。在没有BMH交联的所有样品中，相同的糖基化效率表明TMD1插入不受MPT组分丢失的影响。在∆TMCO1和∆TMEM147 SP细胞中，Asterix交联(标记为x-Asx)未受损伤。在∆Asterix细胞中，Rho的TMD1交联到一个未知的产品，其迁移速度略快于Asterix(向上箭头)。22L TMD没有与Asterix或未知产品交联，这表明这些相互作用需要部分TMD亲水性。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，描述Rho-4TMD RNC样品的分类方案和冷冻- em显微图分析的流程图。被称为“TRAP复合体”的类似乎只包含由Sec61和TRAP复合体组成的核心转位子，其构象明显有些不同，正如先前在低温电子显微镜和低温电子断层扫描工作中所描述的那样gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba}．这些问题没有进一步讨论。gydF4y2BabgydF4y2Ba， Rho-4TMD图的傅里叶壳层相关(FSC)曲线，通过金标准方法显示总体分辨率为3.88 ÅgydF4y2Ba^64gydF4y2Ba．gydF4y2BacgydF4y2Ba，两张根据局部分辨率着色的rh - 4tmd参考地图的视图。指出了关键的结构元素，包括分配给基板TMD3的密度。gydF4y2BadgydF4y2Ba，空间填充模型显示了多通道转位子高度保守的内表面，面对充满脂质的腔(gydF4y2Ba左gydF4y2Ba)和面对周围膜的保守性差的外表面(gydF4y2Ba正确的gydF4y2Ba)．模型按蛋白质、疏水性、电荷和守恒(由ConSurf计算)依次上色(从上到下)gydF4y2Ba^65gydF4y2Ba)．PAT复合物的保守的两亲性底物结合结构域、GEL复合物的保守的带正电亲水性前庭以及BOS复合物上的保守sec61 -对接位点都被指出。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，检测其对Sec61抑制剂敏感性的底物示意图。可切割信号序列(棕色)，糖基化位点(绿色)，和实验确定的蛋白酶可达性位点(淡紫色)。抗蛋白酶消化的β1AR∆CL3的核心也被指出。PrP是朊病毒蛋白;LeP是先导肽酶;ASGR1是唾液糖蛋白受体1;肿瘤坏死因子α是肿瘤坏死因子α。gydF4y2Ba罪犯gydF4y2Ba，gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba用蛋白酶保护法分析含有RMs和Sec61抑制剂2 μ M的s -蛋氨酸的RRL翻译反应。b组使用Apratoxin A (ApraA，见图。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)， c组使用Ipomeassin F (Ipom-F)， d组使用cotransin-8 (CT8)。等量DMSO作为阴性对照。翻译产物要么不处理，要么用蛋白酶K (PK)消化，不使用洗涤剂(下标d)。通过SDS-PAGE和放射自显影或c端FLAG标记的免疫印迹法(在TNFα的情况下，它在蛋白酶保护的片段中缺乏蛋氨酸)对样本进行直接分析。红色箭头表示未被PK消化的片段，表明易位成功。β1AR∆CL3的抗蛋白酶折叠核以蓝色箭头标记。NTF和CTF分别代表n端片段和c端片段。TNFα印迹中的星号标志着FLAG抗体有时能检测到的背景带。gydF4y2BaegydF4y2Ba通过删除61个残基(从T166到D326)，对C3AR1(一种GPCR)或一个约180个氨基酸长的第二细胞外环(EL2)的变体进行蛋白酶保护分析。为简单起见，构造中省略了大部分c端胞质结构域。C3AR1(左)和C3AR1∆EL2(右)在2µM ApraA存在或不存在的情况下进行翻译反应，并用蛋白酶保护法进行分析。在使用的蛋白酶浓度下，如果蛋白质正确插入，所有的胞质短环都对消化有抵抗作用，但如果任何插入步骤失败，就可以进入胞质短环(见图表)。成功插入和抗pk产品用向下的红色箭头表示。在ApraA存在的情况下，TMD4插入失败有两个后果:下游环没有糖基化，蛋白质在TMD3下游是蛋白酶可达的。因此，没有观察到双糖基化产物，在PK消化过程中产生了一个受保护的n端片段(NTF，用深蓝色向上箭头标记)，代表前三个tmd。注意，根据这些标准，即使没有ApraA，也会出现一些插入失败的情况。C3AR1∆EL2不受ApraA影响，且大部分均正确插入。星号标记的是由PK消化非插入(因此是非糖基化)种群产生的C3AR1∆EL2片段的位置。gydF4y2BafgydF4y2Ba，荧光蛋白(FP)标记的底物对细胞中Sec61抑制剂的敏感性测试图。2A是病毒序列，在该序列上肽键形成失败而不中断延伸。因此，每个翻译周期产生两个产品:一个FP标记的基质和一个不同颜色的FP作为翻译级别的内部控制。对于RFP标记的ASGR1和SQS，在病毒2A序列之前的GFP作为转译控制，而RFP的荧光水平报告在底物上。其他底物是gfp标记的，RFP作为翻译控制。gydF4y2BaggydF4y2Ba，指示的报告者的散点图，每个报告者在稳定细胞系中从一个诱导启动子表达。在报告因子诱导过程中，用200 nM Apratoxin A (ApraA)处理的细胞显示为蓝色，而用载体处理的细胞显示为红色。与这些结构相对应的直方图如图所示。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba．gydF4y2BahgydF4y2Ba， N端点扩展(NgydF4y2Ba_extgydF4y2Baβ1AR和AGTR2(见图a)的实验结果与图b相似gydF4y2Ba_extgydF4y2Ba-AGTR2表达稳定，NgydF4y2Ba_extgydF4y2Ba-β1-AR通过瞬时转染表达24 h，最后12 h包含ApraA。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，在载物(灰色)、200 nM ipomoeasin F (Ipom-F，浅蓝色)或1 μ M CT8(深蓝色)存在下表达6 h后归一化底物水平的直方图。gydF4y2Ba