主要gydF4y2Ba

高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)的主要特征是拷贝数改变和基因组重排形式的深刻结构变异，这几乎是在无处不在的遗传背景下发生的gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba突变gydF4y2Ba14gydF4y2Ba。体细胞和种系的同源重组(HR)修复途径基因的改变，如gydF4y2Ba乳腺癌易感基因1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBRCA2gydF4y2Ba在大约一半的HGSOC病例中导致HR缺陷(HRD)gydF4y2Ba15gydF4y2Ba。除了基因改变外，患者还通过内源性突变过程进行分层gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba根据全基因组测序(WGS)的结构变异模式推断，包括HRD亚型(gydF4y2Ba乳腺癌易感基因1gydF4y2Ba-相关串联复制，hdd - dup;gydF4y2BaBRCA2gydF4y2Ba-相关间质缺失，HRD-Del)，gydF4y2BaCCNE1gydF4y2Ba带有放大相关折叠反转(FBI)的肿瘤和gydF4y2BaCDK12gydF4y2Ba-相关串联复制因子(TD)肿瘤gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

HGSOC在诊断时由于广泛的腹腔内疾病而呈现出独特的临床挑战。长潜伏期允许长时间的克隆多样化和肿瘤-免疫相互作用在腹腔的异质微环境中展开gydF4y2Ba7 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba。这就提出了一些关键问题，即潜在的突变过程和局部组织位点如何影响克隆选择、肿瘤微环境(TMEs)和免疫识别。我们进行了一项前瞻性研究，从WGS中捕捉突变过程，从单细胞RNA测序(scRNA-seq)中捕捉细胞表型，从HGSOC多位点病例的原位多重细胞成像中捕捉空间拓扑。我们的发现确定了不同的免疫刺激和免疫抑制机制，这些机制与疾病和突变过程的位点共同隔离，从而确定了HGSOC中免疫识别和逃逸的新决定因素。gydF4y2Ba

多部位组织活组织检查(gydF4y2BangydF4y2Ba= 160)是从新诊断的、未接受治疗的患者(gydF4y2BangydF4y2Ba= 42)在24个月的时间内接受腹腔镜或初级减脂手术(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．收集的解剖部位包括附件(即潜在的原发病变)、网膜、腹膜、肠、腹水和其他腹膜内部位(扩展数据图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．所有患者的临床特征汇总在扩展数据图中。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba。使用scRNA-seq分析患者样本的CD45gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和CD45gydF4y2Ba−gydF4y2Ba流排序分数(补充表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，苏木素和伊红(H&E)染色和多重免疫荧光(mpIF)固定组织切片，用MSK-IMPACT对468个肿瘤基因进行临床肿瘤正常测序和全基因组肿瘤正常测序(扩展数据图)。gydF4y2Ba1 a, bgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)．WGS拷贝数谱与从HGSOC WGS研究中获得的外部“元队列”高度一致gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．WGS数据的突变特征推断产生了16个hdd - dup, 6个hdd - del和14个FBI肿瘤(扩展数据图)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba2 b, cgydF4y2Ba及补充表格gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba而且gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba)，其模式特征与以往报告一致gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba2 d, egydF4y2Ba)，在多种计算方法中是稳定的gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba并且同意gydF4y2Ba乳腺癌易感基因1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBRCA2gydF4y2Ba突变和临床HRD检测(扩展数据图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．此外，高水平扩增的肿瘤gydF4y2BaCCNE1gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba),gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba在签名分配和显示预期的基因扩增分布gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-作用基因表达相关(扩展数据图。gydF4y2Ba2 g hgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

图1:单细胞分辨率下HGSOC的TME。gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba

一个gydF4y2BaMSK SPECTRUM队列和标本采集流程概述。gydF4y2BabgydF4y2Ba，患者用scRNA-seq染色的细胞UMAP图。单元格类型用灰色轮廓突出显示。gydF4y2BacgydF4y2Ba，每种细胞类型的患者特异性(gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)．机汇,卵巢。gydF4y2BadgydF4y2Ba， UMAP图旁每个细胞类型所识别的细胞数量，细胞按细胞类型着色。gydF4y2BaegydF4y2Ba， UMAP图旁每个肿瘤部位的细胞数量，细胞按肿瘤部位着色。UQ，上象限。gydF4y2BafgydF4y2Ba， scRNA-seq中细胞类型组成的位点特异性富集，H&E和mpIF数据使用GLM拟合。H&E和mpIF数据的GLMs由肿瘤(T)和间质(S)区域分开。颜色梯度表示对数gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-变换优势比(红色，富集;蓝色，耗尽)，大小表示bonferroni校正的-loggydF4y2Ba10gydF4y2Ba（gydF4y2BaPgydF4y2Ba值)。gydF4y2BaggydF4y2Ba基于CD45的scRNA-seq数据的细胞类型组成gydF4y2Ba−gydF4y2Ba和CD45gydF4y2Ba+gydF4y2Ba样本。上面板，绝对和相对单元格类型编号;下面板，样本的盒状分布排列相对于肿瘤部位。gydF4y2BahgydF4y2Ba以淋巴细胞为基础的H&E细胞类型组成排列在肿瘤和间质中。面板类似于gydF4y2BaggydF4y2Ba。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，基于mpIF和CD8的细胞类型组成gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞在肿瘤和间质中有重要地位。面板类似于gydF4y2BaggydF4y2Ba。为gydF4y2BacgydF4y2Ba而且gydF4y2BaggydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，小提琴图和箱形图分别表示为中位数、顶部和底部四分位数;晶须对应1.5×四分位间距(IQR)。＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05， **gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

特有的颜料gydF4y2Ba

我们根据scRNA-seq数据构建了一个细胞类型图，量化了9种广泛的细胞谱系:上皮细胞、淋巴细胞(T细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)、B细胞、浆细胞)、髓系细胞(单核/巨噬细胞、树突状细胞(dc)、肥大细胞)和基质细胞(成纤维细胞、内皮细胞)(图2)。gydF4y2Ba1 b, dgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba)．卵巢癌细胞表现出较高的患者特异性(图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)，归因于肿瘤细胞特异性体细胞拷贝数改变驱动基因剂量效应。患者体内不同解剖部位的免疫细胞组成不同。gydF4y2Ba1 e, fgydF4y2Ba)．而CD45gydF4y2Ba−gydF4y2Ba部分(从富含成纤维细胞的样本到富含癌细胞的样本)在解剖部位之间很大程度上是保守的。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)、CD45gydF4y2Ba+gydF4y2Ba分数(从丰富的骨髓到丰富的淋巴样本)有很大的不同(图。gydF4y2Ba1 f, ggydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)．不出所料，腹水样本富集T细胞(Mann-WhitneygydF4y2BaUgydF4y2Ba检验，Benjamini-Hochberg (BH)校正gydF4y2Ba问gydF4y2Ba= 0.0195)和dc (gydF4y2Ba问gydF4y2Ba< 1 × 10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba)，而附件样本中的T细胞相对较少(gydF4y2Ba问gydF4y2Ba= 1.95 × 10gydF4y2Ba−2gydF4y2Ba)、B细胞(gydF4y2Ba问gydF4y2Ba= 4.1 × 10gydF4y2Ba−3gydF4y2Ba)及dc (gydF4y2Ba问gydF4y2Ba= 6 × 10gydF4y2Ba−3gydF4y2Ba)．实体瘤部位以高淋巴细胞和CD8为主gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在scRNA-seq、整片H&E和mpIF的非附件位点发现了T细胞片段(图2)。gydF4y2Ba1胃肠道gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3汉英gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba4得了gydF4y2Ba)在肿瘤和间质区(扩展数据图。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

患者体内的位点间成分变异刺激了更深入的分析，以评估免疫细胞的表型状态。我们鉴定出10个主要的T和NK细胞簇，41个次要的亚簇(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba5 a、bgydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba)，广义定义CD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(簇1-10)，CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(簇11-19)，先天样和γδ T细胞(簇20-23)，NK细胞(簇24-33)和循环细胞(簇34-41)。聚类在已知标记基因的基础上进行注释，并与其他发表的注释进行交叉引用gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)．T和NK细胞簇遵循均匀流形近似和投影(UMAP)空间的梯度(图2)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)，强调了通过拟合聚类组成的广义线性模型(GLM)量化的位点特异性表型差异(图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．特别是幼稚/茎样和中央记忆CD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(簇1)在附件样本中被耗尽，而在腹水中富集(扩展数据图)。gydF4y2Ba7 a、bgydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba)．相反，CD4功能失调gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(3-5和15-17簇)在腹水中耗尽，但在附件和其他肿瘤部位富集(补充表gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba)，这与实体肿瘤中慢性抗原暴露引起的功能障碍一致。调节性T细胞(7-10)和调节性NK细胞(27-33)的簇也在附件样品中富集。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)，可能表明这些位点的免疫调节反馈增加。gydF4y2Ba

图2:免疫表型的位点特异性。gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba， scRNA-seq分析T和NK细胞簇的UMAP图。簇被着色和编号，以参考簇标签gydF4y2BacgydF4y2Ba。gydF4y2BabgydF4y2Ba， UMAP空间中核密度估计的两两比较。gydF4y2BacgydF4y2Ba，左，整个CD4的平均T细胞状态模块得分(左)和信号通路活性得分(右)的热图gydF4y2Ba+gydF4y2BaT, CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT，先天淋巴样细胞(ILC)， NK和循环细胞簇。右，点状图显示基于GLM的T和NK细胞簇的特定位点富集。颜色梯度表示对数gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-变换优势比(红色，富集;蓝色，耗尽)，大小表示bonferroni校正的-loggydF4y2Ba10gydF4y2Ba（gydF4y2BaPgydF4y2Ba值)。gydF4y2BadgydF4y2Ba，样本内T和NK细胞簇的多样性，由Shannon熵估计，样本按部位分组(患者和样本计数所示)，样本对的T和NK细胞簇组成的患者内和患者间不相似性，使用Bray-Curtis距离估计(患者和样本对计数所示)。所有异型位点(附件与非附件，附件与腹水，非附件与腹水)均呈现成对差异。小提琴图显示中位数、顶部和底部四分位数;晶须对应1.5× IQR。＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05， **gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01， ***gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001， ****gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001。gydF4y2BaegydF4y2Ba，上，CD8亚群的扩散图gydF4y2Ba+gydF4y2Ba用scRNA-seq分析T细胞，细胞用CD8染色gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞簇和伪时间。下图为CD8标记基因的相对表达gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞簇在扩散空间。直流，扩散分量。gydF4y2BafgydF4y2Ba，缩放模块相对于伪时间的分数。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

患者体内实体瘤部位的比较显示，非附件部位的幼稚/干样和中央记忆T细胞富集(31例患者中22例)，附件部位的功能失调T细胞富集(31例患者中19例)(扩展数据图)。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba，向量图)。Shannon熵分析表明，附件样本中T细胞表型的位点内变异较高，这表明与非附件样本相比，原发部位内存在分化状态(图2)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)．有趣的是，对不同部位的Bray-Curtis差异的分析显示，在患者内部和患者之间，实体肿瘤和腹水之间存在很大的成分差异。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba)．分化轨迹投射CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞沿(1)终末期功能障碍和(2)干扰素刺激基因(ISG) T细胞状态的两个轴(图。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)，定义为失去幼稚T细胞标记物和获得功能障碍和细胞毒性性状(图。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)．这些轨迹与原始T细胞和中央记忆T细胞中表达的转录因子的丢失有关(gydF4y2BaTCF1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaLEF1gydF4y2Ba)及获得I型干扰素(gydF4y2BaISG15gydF4y2Ba)、细胞毒功能(gydF4y2BaGZMKgydF4y2Ba)和T细胞功能障碍(gydF4y2Ba托克斯gydF4y2Ba，gydF4y2BaCXCL13gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPDCD1gydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba7 dgydF4y2Ba)．值得注意的是，不同部位的表达轨迹也不同，腹水表现出较高的细胞毒性模块评分，而附件和网膜的功能失调T细胞评分较高(扩展数据图)。gydF4y2Ba7 egydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

髓系和DC区室的表型状态组成也随部位而变化(扩展数据图)。gydF4y2Ba6 a - cgydF4y2Ba)．dc聚集为常规dc (cDC1s, cDC2s)，成熟dc (mDCs)和浆细胞样dc (pDCs)，以表达gydF4y2BaCLEC9AgydF4y2Ba，gydF4y2BaCLEC10AgydF4y2Ba，gydF4y2BaBIRC3gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPTGDSgydF4y2Ba，(扩展数据图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba6gydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba)．此外，还鉴定了六种不同的经典和交替激活的巨噬细胞簇gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，以及循环巨噬细胞(cycle . m)和吞噬巨噬细胞(Clearing.M)(扩展数据图。gydF4y2Ba5 d, egydF4y2Ba而且gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba)．聚类组成的GLMs和核密度估计都突出了站点间的差异(扩展数据图。gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba)，包括cDC2和M2。SELENOP在腹水中的耗竭和附件中的富集(扩展数据图。gydF4y2Ba6 a - cgydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba)．相反,M1。S100A8米一个crophage fractions were decreased in adnexa and increased in ascites (Extended Data Figs.6 b, cgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba)．与T细胞相似，在患者内部和患者之间的实体瘤病灶和腹水之间注意到主要的组成差异(扩展数据图)。gydF4y2Ba6 dgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

因此，淋巴细胞和髓系细胞的表型免疫状态分化与肿瘤部位密切相关，在患者TMEs内和患者之间都存在差异，并提供了腹水免疫表型组成不能代表实体肿瘤的明确证据。gydF4y2Ba

肿瘤细胞表型多样化gydF4y2Ba

接下来，我们定义了癌细胞中的突变过程如何影响癌细胞固有信号和免疫表型。我们从CD45中鉴定出10个上皮细胞簇gydF4y2Ba−gydF4y2Ba细胞(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba)，包括Janus激酶(JAK)信号换能器和转录激活器(STAT)、核因子(NF)-κB和肿瘤坏死因子(TNF)信号通路(Cancer.cell.3)、转化生长因子β (TGFβ)信号通路(Cancer.cell.4)和缺氧(Cancer.cell.6)的细胞(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．突变特征特异性簇富集包括Cancer.cell。3在hdd - dup和Cancer.cell。6在FBI(图。gydF4y2Ba3 c, dgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba8 c, dgydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba)．癌细胞中的三种免疫信号通路。3.were substantially increased in the adnexal lesions of HRD-Dup cases compared with FBI cases (Fig.3 egydF4y2Ba；gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 4.1 × 10gydF4y2Ba−3gydF4y2Ba， 5.2 × 10gydF4y2Ba−3gydF4y2Ba5.2 × 10gydF4y2Ba−3gydF4y2Ba)．这在非附件病变中未见，这意味着hdd - dup病例中的细胞固有免疫信号源于原发肿瘤。相比之下，TGFβ信号在FBI病例的非附件部位更为突出(图2)。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba；gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 1 × 10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba)，将fbi特异性激活TGFβ信号通路与转移过程联系起来。我们注意到患者内部通路活性的差异与复制数克隆身份无关(扩展数据图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba）;例如，在同一患者中，我们看到独立于复制数的JAK-STAT通路活性的差异(扩展数据图。gydF4y2Ba9 b, cgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

图3:恶性细胞表型及其与突变特征的关系。gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba(左)上皮细胞簇染色的UMAP图。集群编号是为了参考热图中的集群标签。右图为标度标记基因表达的热图，每簇平均表达，列为簇，行为差异表达基因。每个簇的前两个基因被突出显示。gydF4y2BabgydF4y2Ba，顶部，每个位点的平均信号通路活性得分热图。底部，UMAP绘图，细胞通过感兴趣的通路的信号活性评分着色。EGFR，表皮生长因子受体;MAPK，丝裂原活化蛋白激酶;PI3K，磷酸肌醇3-激酶;VEGF，血管内皮生长因子。gydF4y2BacgydF4y2Ba，相对核密度在UMAP空间中显示富集(红色)和耗尽(蓝色)，用于突变特征和位点的成对比较。gydF4y2BadgydF4y2Ba(左)基于GLM估计解剖位点和突变特征对上皮簇组成的影响。颜色梯度表示对数gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-变换优势比(红色，富集;蓝色，耗尽)，大小表示bonferroni校正的-loggydF4y2Ba10gydF4y2Ba（gydF4y2BaPgydF4y2Ba值)。右，上皮细胞簇组成由Cancer.cell。3部分。箱形图面板显示了按突变特征缩放样本秩的分布。gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba，信号通路活性评分分布(gydF4y2BaegydF4y2Ba)和HLA基因表达(gydF4y2BafgydF4y2Ba)在附件和非附件样本中作为突变特征的函数(患者计数所示)。gydF4y2BaggydF4y2Ba，左，附件和非附件样本中恶性细胞簇的样本内多样性，样本按突变特征和位点分组(显示患者和样本计数)。右，患者内和患者间成对样本恶性簇组成的不相似性。除腹水(上)和附件部位与非附件部位对(下)外，所有部位对(患者和样本对计数显示)均显示出两两不同。在gydF4y2BadgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaggydF4y2Ba，箱形图和小提琴图显示中位、上、下四分位数;晶须对应1.5× IQR。颜色在gydF4y2BaegydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaggydF4y2Ba类似于gydF4y2BadgydF4y2Ba。＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05， **gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01， ***gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001， ****gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001;括号表示双侧Wilcoxon成对比较gydF4y2BaegydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaggydF4y2Ba。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

值得注意的是，癌细胞簇因主要组织相容性复合体(MHC)编码基因的表达而不同。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8 eggydF4y2Ba)．MHC I类基因(gydF4y2Ba抗原gydF4y2Ba，gydF4y2BaHLA-BgydF4y2Ba，gydF4y2BaHLA-CgydF4y2Ba而且gydF4y2BaB2MgydF4y2Ba)和MHC II类基因(gydF4y2BaHLA-DRAgydF4y2Ba而且gydF4y2BaHLA-DRB1gydF4y2Ba)在Cancer.cell中高表达。3.，with upregulation in HRD relative to FBI adnexal tumours (Fig.3 fgydF4y2Ba)，表明抗原提呈增加，并伴有抗原表达上调gydF4y2BaCD274gydF4y2Ba(PD-L1)(扩展数据图gydF4y2Ba8 hgydF4y2Ba；gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 2.8 × 10gydF4y2Ba−3gydF4y2Ba)．虽然在样本水平上，Shannon熵在突变特征中显示了相似水平的细胞内在多样化，但FBI肿瘤在附件样本对与非附件样本对中表现出统计学上更高的bry - curtis差异(图2)。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8我gydF4y2Ba)，这可能表明这些癌细胞在迁移到远端位点时具有更大的表型多样性能力。gydF4y2Ba

此外，观察到原始T细胞和功能失调T细胞组成的显著差异是突变特征的函数(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)， FBI肿瘤中原始/茎样和中央记忆T细胞簇(1,2,11和12)和HRD肿瘤中功能失调T细胞(3-5和15-17)富集(图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba10 bgydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba)．这同样反映在HRD-Dup肿瘤中较高的JAK-STAT信号。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)和沿着T细胞表型的分化轨迹(图。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)．在突变亚型的匹配样本中，T细胞固有的和癌细胞固有的JAK-STAT信号是相关的。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)．在HRD-Dup肿瘤中发现了更高的表型T细胞状态多样性，并伴有患者内部非常一致的Bray-Curtis指数，这表明多样化过程在患者中反复出现(图2)。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

图4:作为免疫表型决定因素的突变标记。gydF4y2Ba
图4gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba， UMAP空间中核密度估计的差异，用于突变特征的成对比较。gydF4y2BabgydF4y2Ba，基于GLM估计突变特征和解剖部位对T和NK细胞簇组成的影响，模型拟合排除腹水样本。颜色梯度表示对数gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-变换优势比(红色，富集;蓝色，耗尽)，大小表示bonferroni校正的-loggydF4y2Ba10gydF4y2Ba（gydF4y2BaPgydF4y2Ba值)。gydF4y2BacgydF4y2Ba， CD8的分布gydF4y2Ba+gydF4y2Ba与突变特征相关的T细胞状态模块评分和JAK-STAT信号通路活性评分(患者计数显示)。gydF4y2BadgydF4y2Ba， CD8子集内的缩放模块得分gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞的伪时间和突变特征。gydF4y2BaegydF4y2Ba， CD8中JAK-STAT信号转导评分的相关性gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD45中的T细胞gydF4y2Ba+gydF4y2Ba与癌细胞中CD45匹配的样本gydF4y2Ba−gydF4y2Ba样本。gydF4y2BafgydF4y2Ba，左，附件和非附件样本中T和NK细胞簇的样本内多样性，Shannon熵估计，样本按突变特征分组(患者和样本计数显示)。右，患者内部和患者间T和NK细胞簇组成的差异，样本按突变特征分组，使用Bray-Curtis距离估计。除腹水(上)和附件部位与非附件部位对(下)外，所有部位对(患者和样本对计数显示)均显示出两两不同。gydF4y2BaggydF4y2Ba， CD8的空间密度gydF4y2Ba+gydF4y2Ba附件和非附件mpIF样本中的T细胞表型是到肿瘤间质界面距离的函数，样本按突变特征分组(gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)．在gydF4y2BacgydF4y2Ba而且gydF4y2BafgydF4y2Ba，箱形图和小提琴图显示中位、上、下四分位数;晶须对应1.5× IQR。颜色在gydF4y2BafgydF4y2Ba而且gydF4y2BaggydF4y2Ba类似于gydF4y2BacgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba。＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05， **gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01， ***gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001， ****gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001;括号表示双侧Wilcoxon成对比较gydF4y2BacgydF4y2Ba而且gydF4y2BafgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

使用mpIF，我们测试了HRD肿瘤中增强的免疫信号是否可以归因于肿瘤中癌细胞和免疫细胞之间的相互作用以及TME中的基质区室(图2)。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba10 dgydF4y2Ba)．激活CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba托克斯gydF4y2Ba−gydF4y2Ba与附件样本相比，T细胞在非附件样本中更普遍，HRD亚型的间室差异比FBI病例更明显(图2)。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)．类似地，终末期功能失调的CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba托克斯gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在hdd - dup病例和hdd - del病例的肿瘤中，T细胞在瘤周间质中富集。相比之下，CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba托克斯gydF4y2Ba−gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba托克斯gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在FBI病例中，T细胞含量较低，在肿瘤和间质中均匀分布，这意味着T细胞-抗原相互作用减少(图。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

DC和巨噬细胞表型状态类似地由肿瘤突变特征塑造，包括cDC2和M2。HRD-Del病例中SELENOP富集，FBI病例中M1巨噬细胞富集(扩展数据图)。gydF4y2Ba11 a, egydF4y2Ba)．在高熵的HRD-Dup附件样本中，髓系细胞的表型多样化升高。gydF4y2Ba11 bgydF4y2Ba(左);然而，在FBI肿瘤中，患者间的Bray-Curtis差异在统计学上更高，这表明FBI相对于HRD-Dup病例具有更高的患者特异性(扩展数据图)。gydF4y2Ba11 bgydF4y2Ba,对吧)。多样化以M2为特征。CXCL10米一个crophage enrichment in HRD-Dup and depletion in FBI (Supplementary Table5克ydF4y2Ba)，而FBI肿瘤也显示较少的PD-L1 (gydF4y2BaCD274gydF4y2Ba)-阳性巨噬细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba11 a, dgydF4y2Ba)．与…一致gydF4y2BaCXCL10gydF4y2Ba作为JAK-STAT信号通路的靶标，HRD-Dup中的巨噬细胞，而不是FBI中的，样本表现出更高的JAK-STAT通路活性(扩展数据图。gydF4y2Ba11 cgydF4y2Ba)．在空间上，我们观察到CD68的定位升高gydF4y2Ba+gydF4y2BaHRD-Dup和FBI附件样本外周的巨噬细胞都延伸到HRD-Dup的肿瘤中，但没有FBI，样本(扩展数据图。gydF4y2Ba11 ggydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

所有细胞亚型之间JAK-STAT通路激活的一致性意味着一个共同的上游效应。因此，我们研究了dc中的I型IFN通路调控因子，它通常作为JAK-STAT信号的关键激活因子。我们观察到，dc中的IFN调节模块评分与癌细胞、T细胞和巨噬细胞中的JAK-STAT通路激活之间存在很强的正相关(扩展数据图)。gydF4y2Ba11小时gydF4y2Ba)．因此，HRD-Dup肿瘤中dc中I型IFN激活的增加可能作为JAK-STAT信号的激活物，在癌细胞和巨噬细胞中人类白细胞抗原(HLA)分子和PD-L1的下游上调。gydF4y2Ba

突变过程驱动免疫编辑gydF4y2Ba

接下来，我们研究了HRD亚型中免疫信号的增加是否导致了介导免疫逃逸的机制。我们分析了HLA表达机制的缺失gydF4y2Ba24gydF4y2Ba通过在单细胞水平上使用SIGNALS算法推断携带HLA I类和II类基因的染色体臂6p杂合度(LOH)的损失gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba。预测仅限于癌细胞(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，每个细胞b等位基因分数(BAFs)被分类为平衡、不平衡或LOH(扩展数据图。gydF4y2Ba12 a, bgydF4y2Ba)和来自位点匹配的WGS和MSK-IMPACT数据集的正交基因组验证(扩展数据图。gydF4y2Ba12氟gydF4y2Ba)．我们观察到明显的患者间异质性(图。gydF4y2Ba5 b, cgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba12 a, bgydF4y2Ba)， 41例患者中有4例(10%)存在6p克隆性LOH, 7例(17%)存在6p亚克隆性LOH;无花果。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba(左)。有趣的是，41例患者中有4例发现了特定部位的损失。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba,对吧)。克隆6p LOH主要在hdd - dup病例中观察到，而亚克隆分布在FBI肿瘤患者中更为常见(图2)。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)．一项独立队列研究证实hdd - dup中6p LOH患病率较高(gydF4y2BangydF4y2Ba= 1298例患者)可用的MSK-IMPACT测序(31%在gydF4y2Ba乳腺癌易感基因1gydF4y2Ba-突变病例，19%gydF4y2BaBRCA2gydF4y2Ba-突变病例，24%gydF4y2BaCCNE1gydF4y2Ba-放大病例gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．值得注意的是，47个样本中有5个附件病变中存在克隆性6p LOH。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)，与原发部位的“早期”免疫进化选择相一致。HRD-Dup亚型患者022和FBI亚型患者065进一步显示6p LOH的患者特异性进化时间(图2)。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba)．6p LOH在HRD-Dup中的功能后果也被观察到，包括JAK-STAT信号的上调(扩展数据图。gydF4y2Ba12 g hgydF4y2Ba)，在肠道样本中最为明显(扩展数据图。gydF4y2Ba12我gydF4y2Ba)， CD4功能障碍增加gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(图;gydF4y2Ba5克gydF4y2Ba)．总之，HLA等位基因的LOH与增强的JAK-STAT信号和T细胞功能障碍的关联指向hdd - dup肿瘤中6p丢失的“早期”免疫介导的进化选择，与FBI肿瘤中6p LOH的进化“晚期”克隆扩增形成对比。gydF4y2Ba

图5:HLA缺失作为免疫逃逸机制。gydF4y2Ba
图5gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，左，scRNA-seq数据中染色体臂6p BAF在细胞上的分布，按每种细胞类型6p BAF的中位数排序。右，癌细胞簇中6p BAF的等位基因不平衡。白色竖线表示中位数。空空的。，chromosome.bgydF4y2Ba，左为每位患者伴有6p LOH的癌细胞百分比。右，6p LOH癌细胞的位点特异性和克隆特异性百分比。Het。，heterozygous.cgydF4y2Ba，每个样本中含有6p LOH的癌细胞百分比作为突变特征的函数。饼图显示了杂合、亚克隆LOH和克隆LOH 6p状态的样本比例。gydF4y2BadgydF4y2Ba， MSK-IMPACT HGSOC队列中任何HLA I类基因LOH患者的百分比(gydF4y2BangydF4y2Ba= 1298例)gydF4y2Ba乳腺癌易感基因1gydF4y2Ba-，gydF4y2BaBRCA2gydF4y2Ba- - -gydF4y2BaCDK12gydF4y2Ba突变体,gydF4y2BaCCNE1gydF4y2Ba-放大肿瘤，分别映射到hdd - dup, hdd - del, TD和FBI特征。误差条，95%二项置信区间。gydF4y2BaegydF4y2Ba，每个样品中含有6p LOH的癌细胞百分比作为解剖部位的函数。饼图显示了按6p状态划分的样本比例。gydF4y2BafgydF4y2Ba代表性HRD-Dup和FBI病例的癌细胞UMAP图。密度图显示特定地点的6p BAF。gydF4y2BaggydF4y2BaCD45中幼稚T细胞和功能失调T细胞的比例gydF4y2Ba+gydF4y2Ba样本中匹配CD45的癌细胞的6p LOH克隆性的函数gydF4y2Ba−gydF4y2Ba样本。＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05;括号表示双面Wilcoxon成对比较。在gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba而且gydF4y2BaggydF4y2Ba， 6p LOH状态定义为:杂合，6p LOH百分比≤20%;亚克隆LOH, 20% <百分比6p LOH≤80%;克隆性LOH，百分率6p LOH > 80%。在gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba而且gydF4y2BaggydF4y2Ba，箱形图和小提琴图显示中位、上、下四分位数;晶须对应1.5× IQR。在gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba，仅考虑来自≥10个reads对准6p的细胞的BAF估计值，并根据每个细胞的平均6p BAF分配等位基因不平衡状态如下:平衡，BAF≥0.35;不平衡，0.15≤BAF < 0.35;Loh, baf < 0.15 (gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

微环境的空间拓扑gydF4y2Ba

上述单细胞分析将免疫表型变异与突变特征和肿瘤部位联系起来。我们试图通过主要免疫细胞类型(T细胞和巨噬细胞)及其功能标记物(PD-1, TOX, PD-L1)的原位mpIF分析和空间拓扑来验证这些发现(扩展数据图)。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)．我们列举了天真/记忆(CD8 .gydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-1gydF4y2Ba−gydF4y2Ba托克斯gydF4y2Ba−gydF4y2Ba)，激活/前功能障碍(CD8 .gydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba托克斯gydF4y2Ba−gydF4y2Ba)和功能障碍(CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba托克斯gydF4y2Ba+gydF4y2Ba表达pd - l1的癌细胞(泛细胞角蛋白(panCK))gydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-L1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)．在肠道样本中，表达pd - l1的近端癌细胞与活化的/功能失调前T细胞之间的相互作用特别高，而功能失调的T细胞相互作用在肠道和附件样本中都很高(扩展数据图)。gydF4y2Ba13 b, cgydF4y2Ba)．相比之下，网膜样本表现出相对较少的T细胞或巨噬细胞表型与表达pd - l1的癌细胞的近端相互作用(扩展数据图)。gydF4y2Ba13 d, egydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

突变特征也影响细胞相互作用，正如PD-L1的更高受体-配体共表达所预测的那样(gydF4y2BaCD274gydF4y2Ba)和PD-1 (gydF4y2BaPDCD1gydF4y2Ba来自scRNA-seq数据的HRD亚型的T和NK细胞簇(扩展数据图;gydF4y2Ba13 fgydF4y2Ba)．与这些发现一致，细胞邻居的空间组织也因突变亚型而异，这反映在T细胞和panCK之间的最近邻居距离上gydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-L1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba癌细胞(范例样品的相互作用如图所示。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．Antigen-experienced CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-1gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞在PD-L1半径30 μm范围内gydF4y2Ba+gydF4y2Ba癌细胞在hdd - dup病例中常见，但在FBI肿瘤中罕见或不存在(扩展数据图)。gydF4y2Ba14个gydF4y2Ba)．当结合位点和特征时，在HRD-Dup附件和肠道样本中观察到最短的中位距离，特别是在激活/前功能障碍和功能障碍的T细胞区室中(图2)。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba14 bgydF4y2Ba)，支持PD-L1作为一种负反馈机制，在HRD肿瘤中响应活化的T细胞。T细胞和CD68之间也有类似的相互作用gydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-L1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba巨噬细胞，在HRD-Del病例中尤其普遍(扩展数据图。gydF4y2Ba14氟gydF4y2Ba)，但在FBI肿瘤中基本不存在。总的来说，mpIF分析进一步强调了位点和突变特征依赖的TMEs，这与基于scrna -seq的观察结果一致。gydF4y2Ba

图6:原位细胞相互作用的空间拓扑。gydF4y2Ba
图6gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba代表性mpIF视场(fov)突出了TME的共同特征，并显示每个突变签名的一个附件样本。第一列，原始伪彩色图像;第二列，节段细胞的细胞表型;第三和第四列，表型对的接近度，突出显示PD-L1-PD-1与颜色编码表型的相互作用，以及描述最近邻居距离的边。图中只显示了在250 μm范围内连接细胞对的边缘。gydF4y2BabgydF4y2Ba，到CD8的最近邻居距离gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞表型到panCKgydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-L1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba癌细胞在fov中聚集，样本按解剖部位和突变特征分组。垂直线表示最近邻距离的中位数。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

我们的结果综合解剖位点和突变过程作为HGSOC TMEs及其表型状态的决定因素。我们推测，虽然附件部位免疫细胞的相对缺乏是由卵巢和输卵管的免疫特权所驱动的，但这些部位功能失调T细胞的优势反映了癌症进化早期的免疫反应性，以及随后转移部位的免疫逃逸。此外，对比大网膜和肠道样本的细胞间拓扑特征表明，特定的转移位点可能存在组织特异性免疫监测限制。此外，tme内和tme间的高度异质性突出表明，免疫抵抗机制在特定患者中并不普遍，需要任何治疗方法来解释单个肿瘤中免疫反应的进化。gydF4y2Ba

此外，突变过程如何产生独特的免疫逃避机制提出了更多的问题，因为临床前研究表明，HRD肿瘤的免疫原性可能导致对免疫检查点封锁(ICB)的反应改善。gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba。缺乏临床证据，因为尚未观察到HRD状态、肿瘤突变负担和对ICB单独或联合化疗的反应之间的关联gydF4y2Ba11 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba。我们的研究结果强调，免疫抗性的机制在突变亚型中是不同的，包括T细胞、癌细胞和髓系细胞中激活的I型IFN信号，在HRD-Dup肿瘤中特别丰富。这些数据支持考虑潜在突变过程的免疫治疗重编程的多层面策略，特别是对于对化疗更有耐药性的FBI肿瘤gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba这里发现它们具有免疫惰性。gydF4y2Ba

总之，我们的研究提供了广泛的多模态资源，绘制了HGSOC TMEs的细胞成分，并将它们与突变过程和空间环境联系起来。我们的研究结果表明，即使是个性化的方法也可能对患者中广泛和异质性的疾病无效，突出了在扩散到腹膜腔之前早期检测的迫切需要。这里提供的数据可以广泛地利用，以了解基因组不稳定癌症的免疫治疗反应机制。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

实验方法gydF4y2Ba

样品收集gydF4y2Ba

所有入组患者均同意接受机构生物标本储存方案和MSK-IMPACTgydF4y2Ba29gydF4y2Ba测试和所有分析都是根据生物标本研究方案进行的。所有方案均由纪念斯隆凯特琳癌症中心的机构审查委员会(IRB)批准。患者同意遵循irb批准的知情同意标准操作程序。在进行任何与研究相关的程序之前，所有患者都获得了书面知情同意。该研究是根据赫尔辛基宣言和良好临床实践指南进行的。gydF4y2Ba

我们收集了42例HGSOC患者的新鲜肿瘤组织，同时进行了前期诊断腹腔镜或减容手术。从原发性和多发性转移部位(包括双侧附件、大网膜、盆腔腹膜、双侧上象面和肠道)采集腹水和肿瘤组织，以预定的、系统的方式(每个患者的4个原发性和转移组织的中位数)，并放置在冷的RPMI中进行立即处理。术前采集血液样本，分离正常WGS的外周血单核细胞(pmcs)。将分离的细胞冷冻并保存在−80°C。此外，组织被快速冷冻用于大量DNA提取和肿瘤WGS。组织还接受福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)进行组织学、免疫组化和多重免疫表型表征。gydF4y2Ba

样品处理gydF4y2Ba

我们使用五种不同的实验分析对患者样本进行分析:gydF4y2Ba

  1. 1.gydF4y2Ba

    CD45gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和CD45gydF4y2Ba−gydF4y2Ba从新鲜组织样本中收集流式分选细胞，并在41例患者的156个位点进行scRNA-seq处理(每个位点约6000个细胞;补充表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

  2. 2.gydF4y2Ba

    对于每个具有scRNA-seq数据的标本，使用位置匹配的FFPE组织切片进行全玻片H&E染色和计算分析(gydF4y2BangydF4y2Ba=来自35例患者的100个组织样本)。gydF4y2Ba

  3. 3.gydF4y2Ba

    对于每个具有scRNA-seq数据的标本，与H&E切片相邻的位置匹配的FFPE组织切片用mpIF进行主要细胞类型和免疫调节标记(gydF4y2BangydF4y2Ba=来自35名患者的100个组织样本的1349个高质量过滤FOVs)。gydF4y2Ba

  4. 4.gydF4y2Ba

    美国食品和药物管理局批准的468个癌症基因的临床测序(MSK-IMPACT)对FFPE肿瘤提取的DNA和匹配的正常血液样本进行了每位患者(扩展数据图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

  5. 5.gydF4y2Ba

    对快速冷冻的组织进行处理，以获得与肿瘤正常WGS数据相匹配的单个代表性部位gydF4y2BangydF4y2Ba= 40例患者的scRNA-seq, H&E和mpIF数据，从全基因组单核苷酸和结构变异中获得突变过程。gydF4y2Ba

scRNA-seqgydF4y2Ba

组织分离gydF4y2Ba

肿瘤组织被立即处理以进行组织分离。将新鲜组织切成1毫米的薄片，在37°C下使用humantumor Dissociation kit (Miltenyi Biotec)在gentleMACS Octo Dissociator上进行分离。分离后，过滤单细胞悬液并用氯化铵-钾(ACK)溶解缓冲液洗涤。用台锥蓝染色细胞，使用伯爵夫人II自动细胞计数器(ThermoFisher)评估细胞计数和活力(详细方案见参考文献)。gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

细胞分类gydF4y2Ba

新鲜分离的细胞用GhostRed780活/死标记物(TonBo Biosciences)和Human TruStain FcX Fc受体阻断液(BioLegend)混合染色。染色后的样品用Alexa Fluor 700抗人CD45抗体(bilegend)孵育和染色。染色后，细胞在RPMI + 2% FCS中洗涤和重悬，并进行细胞分选。细胞被分类为CD45gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和CD45gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba在BD FACSAria III流式细胞仪上荧光辅助细胞分选(BD生物科学)。制备阳性和阴性对照，在流式细胞仪上建立代偿。将细胞分装到含有RPMI + 2% FCS的试管中进行测序。gydF4y2Ba

图书馆准备gydF4y2Ba

流式分类的肿瘤细胞用台潘蓝染色，伯爵夫人II自动细胞计数器(ThermoFisher)用于评估细胞数量和活力。在质量控制之后，将单细胞悬液装载到铬芯片B (10x Genomics, PN 2000060)上。根据制造商的协议，使用Chromium Single-Cell 3 ' Reagent kit v3 (10x Genomics, PN 1000075)对1400 - 5000个细胞进行GEM生成、cDNA合成、cDNA扩增和文库制备。cDNA扩增共12个循环，取0.4-419 ng材料制备测序文库，PCR 8-14个循环。gydF4y2Ba

测序gydF4y2Ba

使用HiSeq rapid SBS试剂盒v2或NovaSeq 6000 SP、S1、S2或S4试剂试剂盒(100、200或300个周期)，在HiSeq 2500快速模式或NovaSeq 6000 28 bp/91-bp、100-bp/100-bp或150-bp/150-bp配对运行模式(Illumina)上对等量的索引文库进行池化和测序。gydF4y2Ba

大部分WGSgydF4y2Ba

大块肿瘤WGSgydF4y2Ba

冷冻的组织在带电的显微镜载玻片上切成薄片。组织学检查后，如果需要富集肿瘤细胞，则对肿瘤组织进行显微解剖gydF4y2Ba31gydF4y2Ba并进行DNA提取以获得大块WGS。使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)提取基因组DNA，并使用Qubit 1× dsDNA HS Assay试剂盒(Invitrogen)在Qubit 3荧光仪上定量。gydF4y2Ba

散装正常WGSgydF4y2Ba

将pmcs在冷PBS中培养至15 ml体积，并根据制造商的方案使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen, 69504)分离DNA，在55°C下孵育1小时用于消化。用0.5×缓冲AE洗脱DNA。gydF4y2Ba

测序gydF4y2Ba

使用quantum - it PicoGreen dsDNA测定法(ThermoFisher, P11496)测定DNA数量，使用TapeStation D1000 screenentape (Agilent, 5067-5582)评估DNA质量。在使用安捷伦生物分析仪进行PicoGreen定量和质量控制后，使用le220 +聚焦超声仪(Covaris, 500569)剪切500ng基因组DNA，并使用经过修改的KAPA Hyper Prep试剂盒(KAPA Biosystems, KK8504)制备测序文库。简而言之，图书馆在装订清理后使用AMPure XP珠子(Beckman Coulter, A63882)进行了0.5×大小的选择。文库未通过PCR扩增，并在等量中汇总，并根据其初始测序性能进行量化。使用NovaSeq 6000 SBS v1试剂盒和S1、S2或S4流式细胞(Illumina)，在NovaSeq 6000上进行150 bp/150 bp的配对运行。gydF4y2Ba

组织病理切片的准备、检查和扫描gydF4y2Ba

在高级免疫形态学平台实验室，存档的FFPE组织用于组织学回顾，包括空间拓扑和肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的评估，以及用于TME的免疫组织化学表征和mpIF分析。玻片最初由妇科病理学家复查，用于诊断和FIGO(国际妇产科联合会)分期。来自每个感兴趣的地点的代表性h&e染色幻灯片被数字扫描以生成虚拟幻灯片。两位高级妇科病理学家随后复查这些图像，以确定浆液性输卵管上皮内癌(STIC)、SET结构(实性、伪子宫内膜样和移行细胞样模式)、微乳头状结构的存在和位置gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，存在绒毛球，转移性疾病的结构模式gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，有丝分裂计数(每10个高倍场，HPFs)和肿瘤细胞含量(存活百分比)。有TILs的地区也用定量TIL评分进行评估(低，在热点地区每个HPF <42个TILs;高，热点中每个HPF有42个或更多TILs)gydF4y2Ba32gydF4y2Ba。组织病理学切片使用徕卡Aperio AT2扫描仪(徕卡生物系统公司)在×20放大倍率下扫描成整片切片图像。选择最具代表性的组织块进行切片扫描。gydF4y2Ba

mpIFgydF4y2Ba

概述gydF4y2Ba

我们在MSKCC帕克癌症免疫治疗研究所使用AkoyaBio Vectra自动成像系统对上皮细胞和免疫细胞亚群和激活标记进行了多参数量化。我们对FFPE组织的整个切片进行了卵巢癌细胞(panCK + CK8-CK18)和特定白细胞亚群(包括巨噬细胞(CD68)和细胞毒性T细胞(CD8)、已知免疫抑制蛋白(PD-L1)和CD8激活/衰竭状态标记的标记的染色gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(PD-1, TOX)。fov的选择是，如果组织较小，则包括视野重叠最小的整个组织，或者在边缘有50%间质/肿瘤的视野分布，加上一些肿瘤密集视野的中心区域。对标记强度进行质量控制，使其落在5-30个任意单位的范围内，并帮助指导光谱分解。较低的值可能接近背景，而较高的值提示我们检查通道溢出。gydF4y2Ba

组织染色gydF4y2Ba

在徕卡Bond RX自动研究染色仪(徕卡Bond Polymer Refine detection, DS9800)上，采用标准免疫组化染色优化一抗染色条件。使用4 μ m FFPE组织切片和一系列抗体滴定，确定最佳抗体浓度，然后过渡到具有等效性的七色多重检测。七色试验回合之间的最佳一抗溶出条件是在一个酪胺沉积循环之后进行的，随后是热诱导溶出(见下文)和随后的显色发展(徕卡键合聚合物Regine检测，DS9800)，并由高级病理学家用光学显微镜对显色产物进行视觉检查。多重检测抗体及条件见补充表gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

组织切片在62°C下垂直滑动烘烤3小时，随后在Leica Bond RX上进行脱亲和，随后用Leica Bond ER2进行30分钟的抗原提取，每轮染色6个连续周期，包括30分钟的联合块和一抗孵育(Akoya antibody dilent / block, ARD1001)。gydF4y2Ba

对于panCK和CK8-CK18，使用次级辣根过氧化物酶(HRP)偶联聚合物(Akoya Opal polymer HRP Ms + Rb, ARH1001;10分钟孵化)。所有其他一抗检测使用山羊抗小鼠Poly HRP二抗或山羊抗兔Poly HRP二抗(Invitrogen, B40961和B40962;10分钟孵化)。采用Opal染料520、540、570、620、650和690 (Akoya, FP1487001KT, FP1494001KT, FP1488001KT, FP1495001KT, FP1496001KT, FP1497001KT)荧光信号扩增检测酶标二抗聚合物。共价酪胺反应后，使用PerkinElmer AR9缓冲液(AR900250ML)和Leica Bond ER2 (90% ER2和10% AR9)在100℃下热诱导剥离一抗-二抗复合物，然后进行下一个周期(CD68、PD-1、PD-L1、CD8和panCK/CK8/CK18剥离一个周期，TOX剥离两个周期)。连续6轮染色后，切片用Hoechst (Invitrogen, 33342)染色以显示核，并用延长金抗褪色试剂安装培养基(Invitrogen, P36930)安装。gydF4y2Ba

成像和光谱分解gydF4y2Ba

使用Vectra多光谱成像系统版本3 (PerkinElmer)对七色多重染色玻片进行成像。扫描在×20放大倍率(×200最终放大倍率)下进行。用于多光谱成像的滤波立方体为DAPI、FITC、Cy3、Texas Red和Cy5。使用Vectra图像分析软件(PerkinElmer)创建了包含本研究中荧光团发射光谱峰值的光谱库。使用单个标记的多光谱图像，使用光谱库将每个多光谱立方体分离为单独的组件(光谱分解)，使用InForm 2.4图像分析软件识别感兴趣的7个标记通道。gydF4y2Ba

计算方法gydF4y2Ba

scRNA-seqgydF4y2Ba

概述gydF4y2Ba

该管道是使用10x Genomics Martian语言和计算管道框架构建的。CellRanger软件(3.1.0版本)使用10倍GRCh38转录组(3.0.0版本)对FASTQ输入进行读取比对、条形码过滤和唯一分子标识符(UMI)定量。gydF4y2Ba

质量控制gydF4y2Ba

cellranger过滤矩阵加载到单独的Seurat对象使用Seurat R包(版本3.0.1)gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba。得到的基因-细胞矩阵对每个样本进行归一化和缩放。保留用于分析的细胞至少有500个表达基因和1000个UMI计数，线粒体基因表达少于25%。使用Seurat CellCycleScoring函数分配细胞周期阶段。Scrublet(版本0.2.1)用于计算和过滤双态分数大于0.25的细胞。样本矩阵由患者合并，随后使用默认的Seurat函数进行重整和缩放。gydF4y2Ba

主要细胞类型鉴定gydF4y2Ba

使用CellAssign(0.99.2版本)计算每个患者的主要细胞类型分配gydF4y2Ba36gydF4y2Ba使用一组策划的标记基因。对9种与HGSOC相关的主要细胞类型进行标记基因编译(补充表)gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba)．这些主要的细胞类型被定义为T细胞、B细胞、浆细胞、髓系细胞、dc、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞和卵巢癌细胞。在运行CellAssign之前，将所有标记基因均为零表达的细胞从计数矩阵中移除。使用scran(3.11版本)计算细胞特定的大小因子。默认CellAssign参数与患者批标签的设计矩阵一起使用。CellAssign返回主要细胞类型的概率分布，每个细胞被标记为结果最可能的细胞类型。gydF4y2Ba

降维gydF4y2Ba

对过滤后的条形码特征矩阵进行主成分分析。UMAP嵌入包括所有主要细胞类型的队列级和患者级嵌入都基于前50个主成分。主要细胞类型超集(见下文)的UMAP嵌入基于50个批量校正的和谐组件。对CD8子集使用R包命运(v3.0.1)计算扩散图嵌入和伪时间估计gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞gydF4y2Ba37gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

批量校正与集成gydF4y2Ba

在样本中鉴定出的主要细胞类型被分为六种超集:(1)T细胞;(2) B细胞和浆细胞;(3)髓系细胞、dc和肥大细胞;(4)成纤维细胞;5)内皮细胞;(6)卵巢癌细胞。对于每个超集，使用R包和谐(0.1版)进行批量校正，以考虑患者特异性影响gydF4y2Ba38gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

聚类和细胞亚型鉴定gydF4y2Ba

使用Seurat(3.0.1版本)中实现的Louvain算法在三种不同分辨率(0.1、0.2和0.3)下对每个超集执行基于图的聚类。使用Seurat FindMarkers中实现的双侧Wilcoxon秩和检验计算已识别聚类之间的差异表达式。最终结果按log(fold change) > 0.25和Benjamini-Hochberg-adjusted进行过滤gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。根据差异基因表达分析中鉴定的标记基因，对聚类进行标注。使用相对熵来确定在整个队列中未被代表的患者特异性聚类。每簇的相对熵定义为每簇的最大熵除以患者组合的经验熵。相对熵<0.8的聚类被认为是患者特异性聚类，下游分析不考虑。gydF4y2Ba

对于T细胞聚类，T细胞和NK细胞分两步聚类。最初的粗粒度聚类导致10种不同的T和NK细胞聚类，包括4种CD4细胞gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞簇，三个CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞群，2个NK细胞群和1个循环T/NK细胞群(扩展数据图)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．亚聚类共鉴定出41个不同的细粒聚类，广泛定义了主要的T细胞和NK细胞亚型(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．其中包括CD4细胞gydF4y2Ba+gydF4y2Ba天真和中央记忆细胞(表达gydF4y2BaIL7RgydF4y2Ba而且gydF4y2BaTCF7gydF4y2Ba), CD4gydF4y2Ba+gydF4y2Ba效应记忆细胞(gydF4y2BaIL7RgydF4y2Ba，gydF4y2BaCCL5gydF4y2Ba而且gydF4y2BaKLRB1gydF4y2Ba)，早期和晚期CD4功能异常gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(表达功能失调的T细胞标记物gydF4y2BaCXCL13gydF4y2Ba，gydF4y2BaTOX2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPDCD1gydF4y2Ba)、调节性T细胞(gydF4y2BaFOXP3gydF4y2Ba而且gydF4y2BaIL2RAgydF4y2Ba)和17型辅助T细胞(gydF4y2BaKLRB1gydF4y2Ba，gydF4y2BaRORA基因gydF4y2Ba而且gydF4y2BaRORCgydF4y2Ba)．在CD8中gydF4y2Ba+gydF4y2Ba隔间，我们还确定了朴素/中央记忆的种群(表达gydF4y2BaKLF2gydF4y2Ba，gydF4y2BaKLF3gydF4y2Ba而且gydF4y2BaTCF7gydF4y2Ba)，活化/细胞毒性(gydF4y2BaGZMHgydF4y2Ba，gydF4y2BaGZMKgydF4y2Ba而且gydF4y2BaHLA-DRgydF4y2Ba)及早期及晚期功能失调(gydF4y2BaCXCL13gydF4y2Ba，gydF4y2BaTOX2gydF4y2Ba，gydF4y2BaLAG3gydF4y2Ba，gydF4y2BaHAVCR2gydF4y2Ba，gydF4y2BaTIGITgydF4y2Ba而且gydF4y2BaPDCD1gydF4y2Ba) T细胞。值得注意的是，除了衰竭相关基因外，早期功能障碍集群的特征是表达gydF4y2BaCXCR6gydF4y2Ba而且gydF4y2BaITGAEgydF4y2Ba，通常用于定义组织常驻记忆T细胞。在先天区室中，我们同样发现了几个簇，包括γδ T细胞簇和几个NK细胞簇。最后，在所有区室中，我们鉴定了以I型IFN反应基因表达为标志的细胞群，如gydF4y2BaISG15gydF4y2Ba而且gydF4y2BaIFIT3gydF4y2Ba在此被命名为CD4-ISG, CD8-ISG和NK-ISG，这些细胞的主要特征是JAK-STAT信号通路的强烈上调(图2)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．其余的群集由循环T和NK细胞表达S期标记物如gydF4y2BaMKI67gydF4y2Ba和G2M标记等gydF4y2BaTOP2AgydF4y2Ba(补充表gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

对于髓系细胞簇，髓系的cdc被分为cDC1s, cDC2s和mDCs，以表达gydF4y2BaCLEC9AgydF4y2Ba，gydF4y2BaS100BgydF4y2Ba而且gydF4y2BaBIRC3gydF4y2Ba，(扩展数据图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．pDCs以表达gydF4y2BaPTGDSgydF4y2Ba。巨噬细胞簇被描述为经典(m1样)或另类(m2样)极化。确定了六种不同的包括经典和交替激活的巨噬细胞的群集，以及一群循环巨噬细胞(cycles . m)和一群活跃的吞噬巨噬细胞(Clearing.M)。M1-like和M2-like聚类根据定义聚类的顶级基因(M1。S100A8, M2。CXCL10, M2。SELENOP, M2。马可,M2。COL1A1, M2.MMP9) (Extended Data Figs.5 dgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)．其中，M1。S100A8cluster was the only unambiguous M1-type macrophage cluster, marked by expression of pro-inflammatory calcium-binding protein genesS100A8gydF4y2Ba而且gydF4y2BaS100A9gydF4y2Ba22gydF4y2Ba。M2。CXCL10cluster was characterized by expression of both M1 (for example,CXCL10gydF4y2Ba)和M2(例如，gydF4y2BaPDL1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaC1QCgydF4y2Ba)标记。gydF4y2BaCXCL10gydF4y2Ba是I型和II型IFN信号通路的下游靶点，并与其他cxc基序趋化因子一起表达(gydF4y2BaCXCL9gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCXCL11gydF4y2Ba)．其余M2聚类均为补体成分高表达gydF4y2BaC1QCgydF4y2Ba，这是众所周知的促进M2极化gydF4y2Ba23gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

推断cnv拷贝数克隆分解gydF4y2Ba

InferCNV(版本1.3.5)gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba用于识别CellAssign分类的卵巢癌细胞中的大规模拷贝数改变。为此，研究人员从队列中随机抽取了3200个非癌细胞，并将其作为“正常”细胞的参考。在剔除非癌细胞中的参考表达，用InferCNV进行染色体水平平滑和去噪后，我们得到了一个表示拷贝数信号的经过处理的表达矩阵。癌细胞亚簇按病房进行鉴定。D2h我er一个rch我cal clustering and the ‘random_trees’ partition method usingPgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba

基因特征评分gydF4y2Ba

使用Seurat AddModuleScore方法输入手动管理的基因列表，计算T细胞组中耗尽表型的细胞状态分数gydF4y2Ba40gydF4y2Ba。筛选的基因列表来源于对CD8单细胞分析的回顾gydF4y2Ba+gydF4y2Ba人类癌症中的T细胞状态gydF4y2Ba41gydF4y2Ba(补充表gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

病人特异性gydF4y2Ba

使用共享的最近邻图计算患者特异性评分。对于给定的细胞，患者特异性定义为观察到的最近邻居的分数除以患者子图中最近邻居的期望分数。这里，来自同一患者的邻居的期望分数被定义为每个患者的整体细胞分数。分数是对数gydF4y2Ba2gydF4y2Ba改变了。因此，患者特异性得分为正表明来自同一患者的细胞在其最近的邻居中表现过度，得分为负表明来自同一患者的细胞表现不足，得分为0表示患者标签的邻居完全混合。gydF4y2Ba

群体组成的患者内部和患者之间的差异gydF4y2Ba

为了计算聚类组成的样本内多样性，我们使用了香农熵gydF4y2BaHgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

$ $ H = - \水平间距{-。75米米}\mathop{\sum }\limits_{c=1}^{C}{p}_{c}\log \,{p}_{c}$$

在哪里gydF4y2BapgydF4y2BacgydF4y2Ba簇的丰度是成比例的吗gydF4y2BacgydF4y2Ba而且gydF4y2BaCgydF4y2Ba是集群的总数。gydF4y2Ba

为了估计样本之间的相似性或不相似性，我们使用了Bray-Curtis不相似性指数gydF4y2BaDgydF4y2Ba为样本gydF4y2Ba我gydF4y2Ba而且gydF4y2BajgydF4y2Ba，定义为gydF4y2Ba

$ $ D = 1 - \压裂{2{\总和}_ {c = 1} ^ {c} {\ rm {m}} {\ rm{我}}{\ rm {n}} ({n} _ {c} ^ {}, {n} _ {c} ^ {j})}{{\总和}_ {c = 1} ^ {c} {n} _ {c} ^{我}+{\总和}_ {c = 1} ^ {c} {n} _ {c} ^ {j}} $ $gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2Ba\ ({N} _ {c} ^{我}\)gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba\ ({N} _ {c} ^ {j} \)gydF4y2Ba是集群计数吗gydF4y2BacgydF4y2Ba样本中gydF4y2Ba我gydF4y2Ba而且gydF4y2BajgydF4y2Ba，以及gydF4y2BaCgydF4y2Ba是集群的总数。这一措施gydF4y2BaDgydF4y2Ba取0之间的值(相同的样本:gydF4y2Ba\ ({N} _ {c} ^{我}= {N} _ {c} ^ {j} \)gydF4y2Ba对所有gydF4y2BajgydF4y2Ba)和1(不相交样本:gydF4y2Ba\({N}_{c}^{i} > 0\)gydF4y2Ba意味着gydF4y2Ba\ ({N} _ {c} ^ {j} = 0 \)gydF4y2Ba)．我们只考虑了三角距离矩阵gydF4y2BaDgydF4y2Ba这样gydF4y2Ba我gydF4y2BajgydF4y2Ba。成对距离矩阵的估计方法是随机地对数据集进行子采样，每个样本的单元数最小，并在100次迭代后对子采样数据集进行平均。然后，我们根据平均距离矩阵中非对角线元素的分布(例如，所有对附件样本或所有对hdd - dup样本)评估患者内部和患者间的不相似性。gydF4y2Ba

这些定义被用来估计每个主要细胞类型超集内细胞状态的簇组成的样本内多样性、患者内差异和患者间差异(癌细胞，图)。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba；T细胞和NK细胞，无花果。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba；髓系细胞，扩展数据图。gydF4y2Ba6 dgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba11 bgydF4y2Ba)．样本的稀疏性应用于基于每个子集的细胞数量估计Bray-Curtis不相似矩阵(gydF4y2BangydF4y2Ba=每个样品400个细胞)。gydF4y2Ba

最后，我们还使用非度量多维尺度(NMDS)来可视化低维空间中细胞类型丰度的成对距离。我们使用了成对不相似矩阵gydF4y2BaDgydF4y2Ba使用NMDS (cancer cells, Extended Data Fig.)计算Bray-Curtis距离的秩序，并在二维上投影聚类组成的差异。gydF4y2Ba8我gydF4y2Ba；T和NK细胞，扩展数据图。gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba10 cgydF4y2Ba；髓系细胞，扩展数据图。gydF4y2Ba7小时gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba11 fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

聚类组成的GLMsgydF4y2Ba

为了评估突变特征和肿瘤位点特异性对细胞簇组成的影响，我们考虑了一个GLM，其中包括scRNA-seq、H&E和mpIF数据中定义的每种主要细胞类型的特征、位点和簇特征之间的相互作用。数据矩阵包含了每个聚类的计数gydF4y2BacgydF4y2Ba，从现场取样gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba在一个突变特征亚型的病人身上gydF4y2Ba米gydF4y2Ba。使用二项式线性模型，可以将细胞类型或细胞状态的重复观测计数作为二元选择进行分析:gydF4y2Ba

$${N}_{c} \sim {\rm{Bin}}({p}_{c}，N)$$gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2BaNgydF4y2BacgydF4y2Ba集群的单元格计数吗gydF4y2BacgydF4y2Ba在一个样本中，gydF4y2BaNgydF4y2Ba样本中的细胞总数和检测到聚类的概率是否可以用logit函数描述gydF4y2Ba\(\log \frac{{p}_{c}}{1-{p}_{c}}=\beta X.\)gydF4y2Ba

为了解释突变特征和肿瘤解剖位点对scRNA-seq数据中观察到的簇丰度的影响，我们制定了观察到的细胞计数的GLMgydF4y2BaNgydF4y2BacgydF4y2Ba对于由logit函数描述的单元格类型或单元格状态，其分布为gydF4y2Ba

$ $ \日志\ \压裂{{p} _ {c}} {1 - p {} _ {c}} \ sim {\ rm {N}} {\ rm {o}} {\ rm {r}} {\ rm {m}} {\ rm{一}}{\ rm {l}}({\β}_{0}+{\β}_ {c} {x} _ {c} +{\β}_ {m} {x} _ {m} +{\β}_{年代}{x} _{年代}+{\β}_{厘米}{x} _ {c} {x} _ {m} +{\β}_ {cs} {x} _ {c} {x} _{}, \,{\σ}_ {\ varepsilon} ^ {2}) $ $gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2BaβgydF4y2Ba0gydF4y2Ba是每个集群必须推断的共享常量基线;gydF4y2BaβgydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaβgydF4y2Ba米gydF4y2Ba而且gydF4y2BaβgydF4y2Ba年代gydF4y2Ba是否可以推断出个别的固定效应术语;gydF4y2BaβgydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba而且gydF4y2BaβgydF4y2BacsgydF4y2Ba是否可以推断集群特征和集群-站点交互作用的影响;gydF4y2BaxgydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaxgydF4y2Ba米gydF4y2Ba而且gydF4y2BaxgydF4y2Ba年代gydF4y2Ba模型的元素是设计矩阵吗gydF4y2BaXgydF4y2Ba；而且gydF4y2BaσgydF4y2BaεgydF4y2Ba表示测量噪声。我们注意到，对于每个集群gydF4y2BacgydF4y2Ba我们进行了多次重复测量gydF4y2BaNgydF4y2BacgydF4y2Ba跨越签名和站点。该公式用于拟合主要细胞类型的GLM(图。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)．我们还使用该公式分别为每个粗粒免疫细胞类型(T和NK细胞，扩展数据图)的超集拟合簇组成的GLMs。gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba；髓系细胞，扩展数据图。gydF4y2Ba7 ggydF4y2Ba而且gydF4y2Ba11 egydF4y2Ba)和细粒免疫细胞状态的聚类组成的GLMs (T和NK细胞，图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba；扩展数据图。gydF4y2Ba11个gydF4y2Ba；巨噬细胞，扩展数据图gydF4y2Ba11个gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在CD45的scRNA-seq数据中模拟主要细胞类型的丰度gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和CD45gydF4y2Ba−gydF4y2Ba在样本中，GLM包含CD45的协变量gydF4y2Ba+ /−gydF4y2Ba附加固定效应排序系数的流排序gydF4y2BaβgydF4y2BafgydF4y2Ba以及额外的簇排序交互作用gydF4y2BaβgydF4y2BacfgydF4y2Ba被推断，加上一个额外的元素gydF4y2BaxgydF4y2BafgydF4y2Ba在模型设计矩阵(图;gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)．同样，H&E和mpIF数据的GLMs解释了在肿瘤和基质区域观察到的细胞类型丰度的差异，并将肿瘤或基质区域计数的协变量与附加的固定效应区域系数结合起来gydF4y2BaβgydF4y2BargydF4y2Ba以及额外的聚类区域系数gydF4y2BaβgydF4y2BacrgydF4y2Ba被推断，加上一个额外的元素gydF4y2BaxgydF4y2BargydF4y2Ba在模型设计矩阵(图;gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了量化突变特征和解剖肿瘤位点之间的相互作用，我们还用一个额外的相互作用项对GLMs进行了拟合:gydF4y2Ba

c数组$ $ \开始{}{}\ log \压裂{{p} _ {c}} {1 - p {} _ {c}} \ sim {\ rm {N}} {\ rm {o}} {\ rm {r}} {\ rm {m}} {\ rm{一}}{\ rm {l}}({\β}_{0}+{\β}_ {c} {x} _ {c} +{\β}_ {m} {x} _ {m} +{\β}_{年代}{x} _{年代}+{\β}_{厘米}{x} _ {c} {x} _ {m} \ \ +{\β}_ {cs} {x} _ {c} {x} _{年代}+{\β}_ {csm} {x} _ {c} {x} _{年代}{x} _ {m}, \,{\σ}_ {\ varepsilon} ^{2}) \{数组}$ $gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2BaβgydF4y2BacsmgydF4y2Ba术语是需要推断的集群特定特征-位点相互作用效应。该公式用于拟合每个主要细胞类型超集内细胞状态的簇组成的GLMs，均用于细粒簇(癌细胞，图。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba；T细胞和NK细胞，图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba；扩展数据图。gydF4y2Ba11个gydF4y2Ba；巨噬细胞，扩展数据图gydF4y2Ba11个gydF4y2Ba)和粗粒度聚类(T和NK细胞，扩展数据图。gydF4y2Ba10 egydF4y2Ba；髓系细胞，扩展数据图。gydF4y2Ba11 egydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

PD-1和PD-L1/PD-L2共表达分析gydF4y2Ba

为了确定受体-配体对PD-1-PD-L1 /PD-L2的潜在相互作用的细胞类型亚簇，我们首先计算了表达PD-L1和PD-L2配体的发送者细胞(癌细胞或髓系细胞簇)的比例(gydF4y2BaCD274gydF4y2Ba或gydF4y2BaPDCD1LG2gydF4y2Ba>0在>中10%的细胞)和表达PD-1受体的受体细胞(T细胞簇)的比例(gydF4y2BaPDCD1gydF4y2Ba在>10%的细胞中读取计数>0)为每个患者。共表达网络构建如下:对于一组具有相同突变亚型的患者(扩展数据图。gydF4y2Ba13 fgydF4y2Ba)，如果配体(gydF4y2BaCD274gydF4y2Ba或gydF4y2BaPDCD1LG2gydF4y2Ba)和受体(gydF4y2BaPDCD1gydF4y2Ba)在该组中至少50%的患者的发送者和接收者亚群中共表达。gydF4y2Ba

大部分WGSgydF4y2Ba

对齐gydF4y2Ba

使用Burrows-Wheeler比对仪(BWA-MEM) v0.7.17-r1188(将测序reads与人类基因组参考GRCh37 (hg19)比对gydF4y2Bahttps://sourceforge.net/projects/bio-bwa/gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

单核苷酸变体和indelsgydF4y2Ba

使用mutationSeq(4.3.8版本;型号v4.1.2.npz)gydF4y2Bahttps://github.com/shahcompbio/mutationseqgydF4y2Ba。我们还使用带有默认参数设置的Strelka(版本2.8.2)来识别体细胞snv和indelgydF4y2Ba42gydF4y2Ba。然后使用SnpEff4(版本5.0e)对snv和indes进行变异效应和基因编码状态的注释。我们通过mutationSeq预测的高概率调用(概率≥0.9)和Strelka预测的体细胞snv的交集，确定了一组高置信snv。通过删除位于以下区域中的位置进一步过滤高置信snv集:(1)UCSC基因组浏览器黑名单(Duke和DAC)和(2)“CRG校准性36mer轨道”中定义的超过两个核苷酸错配的区域，即使允许两个不同的核苷酸，也要求基因组中36个核苷酸片段是唯一的。这组来自Strelka的高可信度snv和体细胞索引的后处理涉及去除已知的变异(包括snv和索引)，这些变异来自1000基因组计划(版本20130502)和dbSNP(版本dbSNP 142)。人类9606)。通过上述过滤器的高置信体细胞snv和indels集合用于特征计算，用于突变特征分析和新抗原预测。gydF4y2Ba

重组gydF4y2Ba

使用lumpy预测重排断点(版本0.2.12)gydF4y2Ba43gydF4y2Ba由SpeedSeq执行(版本0.1.08)gydF4y2Ba44gydF4y2Ba和析构(版本0.4.18)派生自nusegydF4y2Ba45gydF4y2Ba，可于gydF4y2Bahttps://github.com/amcpherson/destructgydF4y2Ba。简而言之，destruct从BAM文件中提取不一致的和非映射的读取，并使用播种-扩展策略重新排列读取。对于没有完全对齐到单个位点的读取，尝试跨假定断点进行拆分对齐。不一致的对齐是根据它们来自同一个断点的可能性进行聚类的。使用前面描述的方法将多个映射读取分配到单个映射位置gydF4y2Ba46gydF4y2Ba。最后，启发式过滤器删除了预测断点的序列的不一致读覆盖。gydF4y2Ba

我们应用严格的三步过滤标准来识别高置信度断点调用，用于下游分析，如下所示:gydF4y2Ba

步骤1:采用lumpy和destruct两种算法预测的断点。gydF4y2Ba

步骤2:我们删除了(1)来自可映射性差的区域的断点，(2)断点距离≤30 bp的事件，以及(3)注释为断点大小<1,000 bp的删除的断点。此外，只有在肿瘤样本中至少有5个支持读，而在匹配的正常样本中没有支持读的高置信断点被用于分析。通过删除位于以下区域之一的位置进一步过滤断点:(1)UCSC基因组浏览器黑名单(Duke和DAC)和(2)“CRG校准性36mer轨道”中定义的超过两个核苷酸错配的区域，即使允许两个不同的核苷酸，也要求36个核苷酸片段在基因组中是唯一的。gydF4y2Ba

步骤3:排除肿瘤样本中间断距离小、支持读数数量少的预测。gydF4y2Ba

拷贝数gydF4y2Ba

使用ReMixT在匹配的肿瘤正常WGS样本中调用全基因组等位基因特异性拷贝数gydF4y2Ba47gydF4y2Ba和TitanCNAgydF4y2Ba48gydF4y2Ba使用默认参数。对多个纯度和倍性溶液进行参数网格搜索，人工评估拷贝数分段后选择最顶层溶液。所有肿瘤样本均以倍性= 2和倍性= 4初始化运行。gydF4y2Ba

无数HRD测试gydF4y2Ba

我们使用了一种商业检测方法(Myriad Genetics ' myChoice CDx ')来检测全基因组LOH，大规模状态转变中的染色体断点数量和端粒等位基因不平衡。如果得到的HRD分数大于42，则认为该样本为HRD。gydF4y2Ba

靶向测序(MSK-IMPACT)gydF4y2Ba

从FFPE肿瘤组织和匹配的正常血液中分离的基因组DNA进行杂交捕获，深覆盖测序(700×)gydF4y2Ba49gydF4y2Ba。使用MSK-IMPACT临床管道进行要求MSK-IMPACT基因面板和拷贝数分析的变体(gydF4y2Bahttps://github.com/mskcc/Innovation-IMPACT-PipelinegydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

突变的签名gydF4y2Ba

我们用一种统一的概率方法，即多模态相关主题模型(MMCTM)，通过集成snv和由大量WGS检测到的结构变化来分析突变特征。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。MMCTM分析能够可靠地确定突变特征及其相关结构，并根据点突变特征圈定子组gydF4y2Ba50gydF4y2Ba还有结构上的变化。gydF4y2Ba

我们估计了MSK SPECTRUM队列中大量WGS样本的特征概率(gydF4y2BangydF4y2Ba= 40)利用MMCTM，基于SNV和HGSOC推断的结构变化特征(gydF4y2BangydF4y2Ba= 170)和三阴性乳腺癌(gydF4y2BangydF4y2Ba= 139)散装全基因组(totalgydF4y2BangydF4y2Ba= 309)(扩展数据图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．通过使用UMAP和HDBSCAN对309例HGSOC和三阴性乳腺癌样本进行聚类gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，我们使用元队列作为训练数据集来拟合gydF4y2BakgydF4y2Ba-最近邻(kNN)分类器，并将kNN分类器应用于SPECTRUM样本(gydF4y2BangydF4y2Ba= 40)，将它们分配到仅由SNV和结构变化特征概率定义的四个地层之一。使用欧几里得距离度量建立了最近邻图，并通过大多数投票计算地层的分类gydF4y2BakgydF4y2Ba未知测试样本的最近邻居(gydF4y2BakgydF4y2Ba= 30)，要求gydF4y2Ba米gydF4y2Ba为一项任务投票(gydF4y2Ba米gydF4y2Ba= 25)。4个地层包括(1)富集的地层。gydF4y2Ba乳腺癌易感基因1gydF4y2Ba-相关HRD点突变特征伴串联重复(HRD- dup)， (2)gydF4y2BaBRCA2gydF4y2Ba-伴随间质缺失(HRD- del)的相关HRD点突变特征，(3)由断裂-融合桥循环(FBI)介导的折返反演，以及(4)在分类器决策边界附近的一组模糊样本(“未确定”)(扩展数据图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了验证MMCTM突变特征，我们使用了两种独立的计算方法(扩展数据图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．我们应用了HRDetectgydF4y2Ba18gydF4y2Ba根据先前与HRD相关的SNV签名(SBS3, SBS8)、短微同源介导的索引(ID8)和重排签名(RS3, RS5)来验证HRD状态。HRDetect评分为>0.1的样本定义为HRD。我们还应用了CHORDgydF4y2Ba19gydF4y2Ba从HRD- del病例中验证HRD状态和HRD- dup分层。CHORD结合了snv、索引和结构变化，并依赖于重复(1-100 kb)进行区分gydF4y2Ba乳腺癌易感基因1gydF4y2Ba——从gydF4y2BaBRCA2gydF4y2Ba例如HRD。gydF4y2Ba

wgs衍生的人力资源开发签名在7个案例中有7个是一致的gydF4y2Ba乳腺癌易感基因1gydF4y2Ba或gydF4y2BaBRCA2gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．在6例病例中，5例基于wgs和标准护理的HRD状态是一致的。不一致的情况(024)被所有三种独立的WGS特征推断方法(MMCTM, HRDetect和CHORD)视为HRD。gydF4y2Ba

焦点放大和删除gydF4y2Ba

我们使用ReMixT推断的WGS拷贝数gydF4y2Ba47gydF4y2Ba将MSK SPECTRUM队列中的拷贝数变化分类为局灶性扩增和缺失。对于局部扩增，我们计算了每个基因相对于整个基因组中总拷贝数变化的累积分布的百分位数。在每个基因的平均拷贝数的基础上，我们将高水平扩增分类为具有对数的箱的前2%gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-转换变化除以倍性大于1。对于纯合缺失，我们考虑重叠片段中的基因拷贝数，我们将大小大于10kb且平均拷贝数小于0.5的片段归类为纯合缺失。gydF4y2Ba

类似地，我们使用facet推断的IMPACT拷贝数gydF4y2Ba52gydF4y2Ba以勾画MSK IMPACT HGSOC队列中的局灶性扩增和纯合子缺失。根据每个片段的中位拷贝数日志比来确定病灶扩增和缺失，仅考虑短于10 Mb且有10个或更少基因的片段来抑制臂级事件。总拷贝数大于8的片段被认为是高水平扩增。对于总拷贝数为0的片段称为纯合缺失。gydF4y2Ba

HLA LOHgydF4y2Ba

为了检测通过scRNA-seq分析的单细胞HLA位点的等位基因特异性拷贝数LOH，我们使用SIGNALS推测了携带HLA I类和II类基因的染色体臂6p上的等位基因特异性改变gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba。我们首先使用细胞snp在scRNA-seq肿瘤数据中称为种系杂合单核苷酸多态性(SNPs)gydF4y2Ba53gydF4y2Ba。作为输入，我们使用每个样本在相应的正常WGS数据集中识别的杂合snp集。cellSNP中提供的提升脚本用于将GRCh37 (hg19)参考基因组的SNP坐标提升到GRCh38参考基因组。在进行基因分型后，我们汇总了所有细胞的SNP计数，并将B等位基因定义为每个SNP的等位基因频率最低的等位基因。由于SNP计数在scRNA-seq数据中非常稀少，我们随后汇总了染色体臂上B等位基因的细胞水平计数，以计算每个细胞中每个臂的BAF。然后，我们生成了一个细胞-染色体臂BAF矩阵，并将其纳入Seurat基因表达对象。为了将等位基因不平衡状态(平衡，不平衡，LOH)分配到每个细胞的染色体臂，我们使用每个细胞每个臂的平均BAF如下所示:平衡，BAF≥0.35;不平衡，0.15≤BAF < 0.35;Loh, baf < 0.15。文档和代码可在gydF4y2Bahttps://shahcompbio.github.io/signals/gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

为了验证我们对染色体6p上与HLA位点相关的等位基因特异性改变的观察，我们使用LOHHLA从肿瘤和匹配的正常WGS数据中检测了基因水平的HLA I类LOH，以及从肿瘤和匹配的正常MSK-IMPACT数据中检测了LOHHLAgydF4y2Ba24gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

为了通过WGS验证HLA LOH状态，我们使用了40例患者的40对肿瘤-正常对。利用ReMiXT技术估计肿瘤纯度和倍性gydF4y2Ba47gydF4y2Ba用于后续HLA LOH分析。为了通过MSK-IMPACT验证HLA LOH状态，我们从MSK-IMPACT队列中的1298例患者中选择了1298例肿瘤-正常对，这些患者的HGSOC组织学基于HGSOC或HGSFT OncoTree分类gydF4y2Ba54gydF4y2Ba。该队列不包括来自MSK SPECTRUM队列患者的MSK- impact样本。gydF4y2Ba

使用Polysolver (v4)从肿瘤和正常读数建立患者HLA参考资料gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，用于WGS和MSK-IMPACT数据。使用ReMixT估计WGS数据集中的肿瘤纯度和倍性gydF4y2Ba47gydF4y2Ba用于后续HLA LOH分析。同样，MSK-IMPACT数据集的肿瘤纯度和倍性也使用FACETS进行估计gydF4y2Ba52gydF4y2Ba。利用HLA LOHHLA在肿瘤样本中寻找等位基因。若估计拷贝数<0.2，则观察各HLA基因LOH，等位基因不平衡有统计学意义gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01，检验log(gydF4y2BaRgydF4y2Ba)值之间的两个HLA同源体(配对gydF4y2BatgydF4y2Ba测试)。gydF4y2Ba

数字组织病理学gydF4y2Ba

我们为扫描的H&E图像建立了一个元胞注释训练数据集。专家对H&E切片中细胞和组织类型的描述和量化是在MSK Slide Viewer上进行的，这是一个用于检查和注释组织病理学图像的计算病理学界面。核分割采用基于U-Net神经网络架构的核检测方法StarDist进行gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba。膜分割近似使用3 μm核边界的细胞扩张。训练数据集包括一组61张幻灯片，来自一组有代表性的患者和部位。为了对肿瘤、基质、血管和坏死区域进行分类，我们使用QuPath (v0.2.3)训练了一个基于人工神经网络(ANN)的像素分类器。gydF4y2Ba56gydF4y2Ba该算法对图像中多个通道和尺度上的高阶像素特征进行运算。此外，研究人员使用MSK Slide Viewer在其中19张幻灯片中标注了淋巴细胞和“其他”细胞。在将这些注释导入QuPath后，连同StarDist生成的细胞分割和特征向量，我们训练了一个基于ann的细胞分类器，该分类器在细胞测量数据上操作以识别淋巴细胞。然后，我们应用这些模型对来自35名患者的100张全幻灯片H&E图像进行推理。分割在样本中总共产生了24,628,462个细胞，我们使用模型输出来计算淋巴细胞密度和其他空间衍生测量的统计数据。gydF4y2Ba

mpIFgydF4y2Ba

我们在QuPath (v0.2.3)中使用分水岭算法进行基于DAPI强度的核分割gydF4y2Ba56gydF4y2BaDAPI最小阈值为1个任意单元，期望核面积在5 μm之间gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和100 μmgydF4y2Ba2gydF4y2Ba。膜分割近似使用3 μm核边界的细胞扩张。从来自35名患者的100个组织样本的1349个经过质量过滤的fov开始，分割产生了总共10,892,612个细胞。为了标注肿瘤和间质区域，我们用panCK的例子训练像素分类器gydF4y2Ba+gydF4y2Ba(肿瘤)和panCKgydF4y2Ba−gydF4y2Ba(基质)地区。在细胞核分割之后，我们提取了每个细胞在细胞质(panCK, CD68, CD8, PD-1, PD-L1)和细胞核(TOX)中表达的功能标记的像素强度，以定义细胞类型和细胞状态。每一张幻灯片至少在一个FOV中手动设置所有通道的阈值，并通过在平均像素强度上设置这些阈值来确定标记阳性。对多种细胞类型标记物(panCK, CD68, CD8)双阳性或三阳性的分段对象被计算为单独的细胞，共产生12,359,463个单细胞。标记物分配用于定义上皮细胞的细胞状态(panCKgydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-L1gydF4y2Ba−gydF4y2Ba, panCKgydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-L1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)，巨噬细胞(CD68gydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-L1gydF4y2Ba−gydF4y2Ba、CD68gydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-L1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)和CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-1gydF4y2Ba−gydF4y2Ba托克斯gydF4y2Ba−gydF4y2Ba, CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba托克斯gydF4y2Ba−gydF4y2Ba, CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaPD-1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba托克斯gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

空间拓扑分析包括空间密度估计和胞间最近邻距离估计。空间密度估计作为距离肿瘤间质边界的函数是通过聚集每个FOV中距离边界10 μm范围内的细胞计数来获得的，在FOV中进行分组，并根据给定感兴趣表型的细胞总数进行归一化。误差条被计算为概率的标准误差gydF4y2BapgydF4y2Ba观察一种特定的表现型gydF4y2Ba\ \√{p (1 - p) / N} \)gydF4y2Ba,在那里gydF4y2BaNgydF4y2Ba是距离带中的单元格总数。使用距离矩阵计算最近邻居之间的细胞间距离gydF4y2BargydF4y2Ba我gydF4y2BajgydF4y2Ba为细胞gydF4y2Ba我gydF4y2Ba而且gydF4y2BajgydF4y2Ba，其中(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba,gydF4y2BajgydF4y2Ba)元素为到细胞的径向距离gydF4y2Ba我gydF4y2Ba细胞gydF4y2BajgydF4y2Ba。在计算每个细胞的最近邻居后，估计每个表型的最近邻居距离的汇总统计数据。在固定半径内的表型中，邻近性很重要gydF4y2BaRgydF4y2Ba也是根据每个细胞的最近邻居来确定的。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然组合报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba