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多腔的脂肪细胞是脂肪组织产热的的一个特点gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,但执行这种细胞表型的因素在很大程度上是未知的。在这里,我们表明,adipocyte-selective产品gydF4y2BaClstn3gydF4y2Ba轨迹(CLSTN3β)仅出现在胎盘类哺乳动物促进有效利用存储通过限制脂滴甘油三酸酯(LD)扩张。CLSTN3β是不可或缺的内质网(ER)膜蛋白所在ER-LD联系网站通过一个守恒时发针形般的域。老鼠缺乏CLSTN3βLD异常形态,改变底物利用棕色脂肪组织,和更容易诱使低温尽管没有缺陷在肾上腺素的信号。相反,被迫表达CLSTN3β足以执行多腔的LD表型在培养细胞和脂肪组织。CLSTN3β同事与细胞death-inducing DFFA-like效应蛋白质和损害之间转移脂质摩门教的能力,从而限制了LD融合和扩展。功能上,增加了LD CLSTN3β-expressing脂肪细胞促进接触的表面积分解脂肪的机械和促进脂肪酸氧化。在人类脂肪,gydF4y2BaCLSTN3BgydF4y2Ba是一个多腔的脂肪细胞的选择性标记。这些发现定义一个分子机制,调节LD形式和功能,以促进产热的脂肪细胞中脂质利用率。gydF4y2Ba
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引用gydF4y2Ba
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确认gydF4y2Ba
我们感谢杨h .分享宝贵的经验。我们感谢法拉利,p . j . Sandhu Rajbhandari和所有其他的现任和前任成员Tontonoz实验室技术援助和有价值的讨论。我们感谢美国张坚定的支持。加州纳米系统研究所共焦显微镜进行先进的光学显微镜和光谱实验室。磁共振进行炸弹研究所临床成像技术中心。RNAscope了加州大学洛杉矶分校临床病理核心实验室。这项工作是支持由中国国家自然科学基金(批准号91857103 F.-J.C。)、国家卫生研究院(批准号。R01DK120851和R01HL136618 p)和Leducq基金会(批准号19 cvd04 p)。K.Q.被格兰特没有支持。 NIH F30DK123986 and a David Geffen Medical Scholarship.
作者信息gydF4y2Ba
作者和联系gydF4y2Ba
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概念是由K.Q.完成的,M.J.T.,P。L. and P.T. Methodology was developed by K.Q., M.J.T., L.C., A.H.B., T.A.W., P.S.R., Y.S., B.T.B., J.P.W., J.A.W. and P.L. Software was written by K.Q., B.T.B. and C.-H.L. Validation was carried out by K.Q., M.J.T., J.W., L.F.U., X.X., L.C., A.H.B., T.A.W., P.S.R., L.V., Y.S., Y.Y., Y.J.-A., W.C. and B.J. Formal analysis was carried out by K.Q., M.J.T., J.W., A.H.B., L.V., Y.J.-A., W.C., B.T.B. and C.-H.L. Investigation was done by K.Q., M.J.T., J.W., L.F.U., X.X., L.C., A.H.B., T.A.W., P.S.R., L.V., Y.S., Y.Y., Y.J.-A., W.C. and B.J. Resources were provided by L.A.D., D.L.B., J.P.W., J.A.W., K.R., K.S., F.-J.C., S.G.Y., P.L. and P.T. Data were curated by K.Q., M.J.T., J.W., L.F.U., A.H.B., T.A.W., P.S.R., L.V., Y.Y., Y.J.-A., W.C., B.T.B., C.-H.L. and B.J. The original draft was written by K.Q. and P.T. Review and editing of the draft were done by K.Q., M.J.T., J.W., L.F.U., X.X., L.C., A.H.B., T.A.W., P.S.R., L.V., Y.S., Y.Y., Y.J.-A., W.C., B.T.B., C.-H.L., B.J., L.A.D., D.L.B., J.P.W., J.A.W., K.R., K.S., F.-J.C., S.G.Y., P.L. and P.T. Visualization was done by K.Q., M.J.T., J.W., L.F.U., X.X., L.C., A.H.B., T.A.W., P.S.R., Y.Y., C.-H.L., B.J. and P.T. Supervision was the responsibility of K.Q., D.L.B., K.R., F.-J.C., S.G.Y., P.L. and P.T. Project administration was done by K.Q., F.-J.C., P.L. and P.T. Funding was acquired by S.G.Y., P.L. and P.T.
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一个gydF4y2Ba、RNA ATAC,笼子和H3K4me3 ChIP-seq读取的gydF4y2BaClstn3gydF4y2Ba在鼠标轨迹preadipocytes(第0天的区别),脂肪细胞分化(5天),皮层和蝙蝠。gydF4y2BabgydF4y2Ba,总结鼠标gydF4y2BaClstn3bgydF4y2Ba成绩单变体。箭头标记的位置可能的起始密码子(atg在坐标系gydF4y2BaClstn3gydF4y2Ba外显子17/18)。gydF4y2BacgydF4y2Ba,切叶分析微分拼接网站利用鼠标蝙蝠和大脑皮层。基因内区集群是统计学意义。gydF4y2BaClstn3gydF4y2Ba(8级)是用红色突出显示。gydF4y2BadgydF4y2Ba,饲养的输出gydF4y2BaClstn3gydF4y2Ba基因内区集群。gydF4y2BaegydF4y2Ba5 'rlm-race产品鼠标使用gene-specific引物瞄准蝙蝠gydF4y2BaClstn3gydF4y2Ba外显子17。gydF4y2BafgydF4y2Ba使用引物瞄准,rt - pcr产品鼠标蝙蝠gydF4y2BaClstn3bgydF4y2Ba记录变种2。黑色的箭头标记引物的位置(F1-F7 =向前向前1到7,R =反向)。*这个接头网站实际上是两个接头地点相距4碱基对。一个(30%)是在坐标系gydF4y2BaClstn3gydF4y2Ba外显子17/18并产生一个蛋白编码记录。另一个(5.3%)是在图片gydF4y2BaClstn3gydF4y2Ba外显子17/18并产生一个非编码记录。gydF4y2Ba
扩展数据图2 CLSTN3β蛋白质种类和转录调节的识别gydF4y2BaClstn3bgydF4y2Ba。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba完整的细胞溶解产物(水控制法)和膜制剂(MP)的控制gydF4y2BaClstn3gydF4y2Ba外显子17 KO Pre-BAT细胞(池CRISPR-modified永生的布朗preadipocytes分化5天)。免疫印迹分析与先前未经验证的商业抗体针对的糖基CLSTN3 CLSTN3β(共享)识别两个特定波段的棕色脂肪细胞。gydF4y2BabgydF4y2Ba、膜制剂Pre-BAT细胞分化(第五天)和海拉细胞转染gydF4y2BaClstn3bgydF4y2Ba记录变种2或3(只有变异蛋白编码潜力)。免疫印迹分析CLSTN3抗体显示gydF4y2BaClstn3bgydF4y2Ba记录变种2产生两个相同大小的乐队与表达内生的棕色脂肪细胞。gydF4y2BacgydF4y2Ba、膜制剂的三种不同Pre-BAT CRISPR池:控制、3′(gRNA针对3′末端的变种2,下游的所有可能的起始密码子),和5′(gRNA针对5′末端的变种2,起始密码子的下游产生最长ORF)。剪刀马克gRNAs和黑色的箭头标记可能立即开始密码子gRNAs的上游。CLSTN3抗体的免疫印迹分析表明,~ 25 kDa乐队不是一个乳沟的产物~ 40 kDa乐队,可以独立翻译变体2。gydF4y2BadgydF4y2Ba,整个细胞溶解产物Pre-BAT细胞分化(第五天)和海拉细胞转染gydF4y2BaClstn3bgydF4y2Ba记录变种2包含ATG亚美大陆煤层气有限公司在每个可能的起始密码子突变(由箭头位置标记)。CLSTN3抗体的免疫印迹分析表明,第一个可能的起始密码子(生成最短ORF)发起的翻译~ 25 kDa蛋白质产品。gydF4y2BaegydF4y2Ba免疫沉淀反应(IP)的内源性~ 25 kDa蛋白质控制(C)和3′gRNA (KO) Pre-BAT CRISPR池(分化的第五天)使用CLSTN3抗体。gydF4y2BafgydF4y2Ba,碎片光谱CLSTN3β-specific肽被IP-MS /女士。gydF4y2BaggydF4y2Ba,qPCR分析gydF4y2BaClstn3gydF4y2Ba外显子1/2,gydF4y2BaClstn3gydF4y2Ba外显子17/18,gydF4y2BaClstn3bgydF4y2Ba表达一组15只老鼠组织(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)。gydF4y2BahgydF4y2Ba(左)gydF4y2BaClstn3bgydF4y2Ba表达式的蝙蝠老鼠住在30°C 2周,22°C, 24小时或4°C (gydF4y2BangydF4y2Ba= 4、5、5)。(右)gydF4y2BaClstn3bgydF4y2Ba表达iWAT老鼠住在30°C 2周,22°C,或4°C 48 h (gydF4y2BangydF4y2Ba= 4、5、5)。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba,gydF4y2BaClstn3bgydF4y2Ba表达蝙蝠,iWAT eWAT的老鼠注射PBS或1毫克/公斤/天CL - 316243 (CL) 4天(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)。gydF4y2BajgydF4y2Ba,折叠的感应gydF4y2BaClstn3gydF4y2Ba外显子表达17/18从第0天到第五天在白色和棕色preadipocyte细胞系分化(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。3 t3-l1(摘要)10 t1/2, (3 t3 -) F442A指三种常用白preadipocyte细胞系。Pre-BAT 1, 2, 3指的是三个不同的单细胞克隆分离出一个永生化池主要布朗preadipocytes老鼠。gydF4y2BakgydF4y2Ba,gydF4y2BaClstn3bgydF4y2Ba表达式的eWAT正常食物或60%的高脂肪饮食的老鼠(HFD) 4天(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5,4)。gydF4y2BalgydF4y2Ba,gydF4y2BaClstn3bgydF4y2Ba表达eWAT老鼠强饲法与车辆,GW7647 (PPARα受体激动剂,10毫克/公斤),或罗格列酮(PPARγ受体激动剂,10毫克/公斤)3次2天(gydF4y2BangydF4y2Ba= 8)。gydF4y2Ba米gydF4y2Ba,ChIP-qPCR PPARγ绑定的分析gydF4y2BaFabp4gydF4y2Ba,gydF4y2BaClstn3bgydF4y2Ba,gydF4y2BaClstn3gydF4y2Ba启动子元素在10 t1/2细胞(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。gydF4y2BangydF4y2Ba,PPARγChIP-seq读取的gydF4y2BaClstn3gydF4y2Ba鼠标轨迹在初级蝙蝠,iWAT eWAT脂肪细胞和3 t3-l1细胞。基因组区域针对ChIP-qPCR实验(gydF4y2Ba米gydF4y2Ba)注释。酒吧的情节显示意味着±SEM。每个点代表一个生物复制。双面的* *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01,* * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001普通单向方差分析与Dunnett多个对比测试(gydF4y2BahgydF4y2Ba,gydF4y2BalgydF4y2Ba),多个t Holm-Sidak校正(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba,gydF4y2Ba米gydF4y2Ba),或者韦尔奇t (gydF4y2BakgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
扩展数据图3 CLSTN3β的结构特点。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba,电子显微镜不灭的棕色脂肪细胞分化(第四天)稳定表达(左)没有APEX2或(右)一个氨基端APEX2-CLSTN3β融合。APEX2-CLSTN3β不好表达,因此其定位不是可视化。gydF4y2BabgydF4y2Ba、生化提取CLSTN3β-Flag(整合膜蛋白)和S6(外周膜蛋白)膜HEK293T细胞治疗OA(250µM,一夜之间)。P =小球,S =上层清液。gydF4y2BacgydF4y2Ba、蛋白酶保护分析膜从HEK293T细胞转染CLSTN3β-Flag (c端标记)和治疗OA(250µM,一夜之间)。Calreticulin =呃,内部S6 =外ER。gydF4y2BadgydF4y2Ba螺旋轮块代表从CLSTN3βα-helices,使用HeliQuest生成。gydF4y2BaegydF4y2Ba,总结CLSTN3β二级结构预测。假定的疏水性发夹和β-strand域展露无遗。带正电的和疏水残基β-strand域的颜色为绿色和黄色,分别。gydF4y2BafgydF4y2Ba,RoseTTAFold长篇CLSTN3β模型。(左)模型定位强调发夹域(红色)和TM域(绿色)。(右)模型定位突出发夹1(青色),发夹2(红色),发夹3(黄色),TM域(绿色)。gydF4y2BaggydF4y2Ba,CLSTN3β发夹突变体的示意图。gydF4y2BahgydF4y2Ba,共焦显微镜OA-treated(1毫米,一夜之间)海拉细胞转染∆H1,∆H2,∆H3,∆H12,∆H13、或∆H23 CLSTN3β-Flag构造和沾BODIPY 488或LipidTOX 647。酒吧= 5µm规模。gydF4y2Ba
扩展数据图4 ER-localized CLSTN3β由ERAD退化。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba,维恩图解显示蛋白质的数量确定为潜在的CLSTN3β绑定合作伙伴通过顶点距离标签(PL)和标志免疫沉淀反应(IP)。gydF4y2BabgydF4y2Ba(左)基因本体论(去)分析高信任度CLSTN3βinteractome(287蛋白质)。(右)部分列表ERAD蛋白质的高信任度CLSTN3βinteractome。gydF4y2BacgydF4y2Ba,永生的棕色脂肪细胞的分化(6天)治疗环己酰亚胺(CHXµg 100 /毫升)表示时间和使用车辆(DMSO)或cb - 5083(5µM) 30分钟。gydF4y2BadgydF4y2Ba,共焦显微镜的海拉细胞转染CLSTN3β-Flag和GFP-SEC61β处理车辆(DMSO)或cb - 5083(2.5µM) 8 h。酒吧= 10µm规模。gydF4y2BaegydF4y2Ba,CLSTN3β-Flag从HEK293T细胞免疫沉淀反应co-transfected HA-ubiquitin和处理要么MG132(25µM)或cb - 5083(2.5µM) 4 h。gydF4y2BafgydF4y2Ba,CLSTN3β-Flag从HEK293T细胞免疫沉淀反应co-transfected HA-gp78或myc-UBE2G2和对待cb - 5083(2.5µM) 4 h。gydF4y2BaggydF4y2Ba,HEK293T细胞co-transfected CLSTN3β-Flag和小干扰rna和治疗控制或gp78 CHX(100µg /毫升)表示。gydF4y2Ba
生热作用的扩展数据图5分析CLSTN3β-deficient老鼠。gydF4y2Ba
一个gydF4y2BaCRISPR策略(上)示意图用于生成CLSTN3βKO小鼠。剪刀马克gRNA的位置。(中)CRISP-ID Sanger测序分析跟踪从CLSTN3βKO的创始人。在红色下划线PAM序列上。(底部)WT和CLSTN3βKO等位基因的核苷酸序列。基地KO等位基因中修改用红色突出显示和过早终止密码子是强调。gydF4y2BabgydF4y2Ba、免疫印迹分析膜制剂的脑部和蝙蝠从WT CLSTN3βKO小鼠位于22°C。gydF4y2BacgydF4y2BaCre-Lox策略示意图用于生成AdC3KO老鼠。gydF4y2BadgydF4y2Ba,qPCR分析gydF4y2BaClstn3gydF4y2Ba外显子表达式从WT在大脑(左)和17/18 AdC3KO老鼠住在22°C (gydF4y2BangydF4y2Ba= 4,4)(右)蝙蝠和从WT iWAT AdC3KO老鼠住在4°C为4天(gydF4y2BangydF4y2Ba= 8,6)。gydF4y2BaegydF4y2Ba男性,身体重量和成分的10 - 12星期WT和AdC3KO小鼠正常食物饮食(gydF4y2BangydF4y2Ba= 18、22)。gydF4y2BafgydF4y2Ba核心体温,gydF4y2BaggydF4y2Ba蝙蝠标签内容,gydF4y2BahgydF4y2Ba最大直径摩门教(gydF4y2BangydF4y2Ba= 40、40)gydF4y2Ba我gydF4y2Ba刚刚,他走时的蝙蝠从年级男性WT和AdC3KO老鼠住在4°C为4天(gydF4y2BangydF4y2Ba6)= 8。酒吧= 50µm规模。gydF4y2BajgydF4y2Ba,qPCR分析蝙蝠和iWAT年级刚刚男性WT和AdC3KO老鼠住在4°C为4天(gydF4y2BangydF4y2Ba= 8,6)。gydF4y2BakgydF4y2Ba、qPCR分析和gydF4y2BalgydF4y2Ba,他走时的蝙蝠和iWAT 12 - 14周前男性WT和AdC3KO千卡10%脂肪饮食的老鼠含有50毫克/公斤罗格列酮为2周(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4,5)。酒吧= 50µm规模。酒吧的情节显示意味着±SEM。每个点代表一个生物复制。小提琴的情节显示值(虚线)和质量(虚线)。双面的*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,* *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01,* * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba由多个t Holm-Sidak校正(< 0.001gydF4y2Bad j - kgydF4y2Ba)或韦尔奇t (gydF4y2Bag-hgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
扩展数据图6分析CLSTN3β-deficient小鼠的脂解作用。gydF4y2Ba
(gydF4y2Baa - bgydF4y2Ba),免疫印迹分析蝙蝠摩门教和post-nuclear上层清液(pn)隔绝女WT AdC3KO老鼠住在22°C或24小时4°C (gydF4y2BangydF4y2Ba= 2小鼠每车道)。等量的标签从每个条件都加载到凝胶。从实验和无花果一样。gydF4y2Ba5我gydF4y2Ba。gydF4y2BacgydF4y2Ba,gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba脂类分解试验进行iWAT从11 - 12周前女性WT和AdC3KO老鼠(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5,5)。NT =没有治疗,ISO =异丙肾上腺素(2μM)。酒吧的情节显示意味着±SEM。每个点代表一个生物复制。gydF4y2Ba
扩展数据图7描述CLSTN3β-deficient HFD老鼠。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba,身体重量和成分的男性和女性WT / AdC3KO和WT / CLSTN3βKO小鼠HFD 45%和60%。男性WT / AdC3KO HFD 45% (gydF4y2BangydF4y2Ba= 7、8),男WT / AdC3KO HFD 60% (gydF4y2BangydF4y2Ba13)= 6日,女WT / AdC3KO HFD 45% (gydF4y2BangydF4y2Ba7)= 11日,女WT / AdC3KO HFD 60% (gydF4y2BangydF4y2Ba8)= 11日,男性WT / CLSTN3βKO HFD 45% (gydF4y2BangydF4y2Ba11)= 13日,男性WT / CLSTN3βKO HFD 60% (gydF4y2BangydF4y2Ba9)= 15日,女WT / CLSTN3βKO HFD 45% (gydF4y2BangydF4y2Ba8)= 13日,女WT / CLSTN3βKO HFD 60% (gydF4y2BangydF4y2Ba= 15,10)。gydF4y2BabgydF4y2Ba、蝙蝠重量从男性WT(左)和AdC3KO老鼠45% HFD 10周(gydF4y2BangydF4y2Ba= 7,7)或(右)男性WT CLSTN3βKO小鼠45% HFD 12周(gydF4y2BangydF4y2Ba= 13,11)。gydF4y2BacgydF4y2Ba,eWAT iWAT和肝脏重量从男性WT(左)和AdC3KO老鼠45% HFD 10周(gydF4y2BangydF4y2Ba= 7、8)或(右)男性WT和CLSTN3βKO小鼠45% HFD 12周(gydF4y2BangydF4y2Ba= 13,11)。gydF4y2BadgydF4y2Ba,腹腔内葡萄糖耐量试验进行男性WT和CLSTN3βKO小鼠45% HFD 12周(gydF4y2BangydF4y2Ba= 6,6)。gydF4y2BaegydF4y2Ba耗氧量(签证官gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)在10 - 12周前男性WT和AdC3KO老鼠住在22°C和美联储正常食物的饮食(gydF4y2BangydF4y2Ba= 18、22)。酒吧/线情节展示意味着±SEM。每个点代表一个生物复制。双面的*gydF4y2BaPgydF4y2Ba韦尔奇t < 0.05 (gydF4y2BabgydF4y2Ba)或方差分析(gydF4y2BaegydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
扩展数据图8分析CLSTN3β-deficient老鼠的脂肪神经支配和肾上腺素的信号。gydF4y2Ba
(gydF4y2Ba得了gydF4y2Ba)代表片和最大强度投影(MIPs)整个蝙蝠的叶酪氨酸羟化酶(TH)免疫染色。酒吧= 100µm规模。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba4%多聚甲醛(PFA)比3%乙二醛固定。gydF4y2BabgydF4y2Ba,11 - 12周前男性WT和AdC3KO老鼠住在22°C。gydF4y2BacgydF4y2Ba,男性控制和5 - 6星期gydF4y2Baob / obgydF4y2Ba老鼠住在22°C。gydF4y2Baob / obgydF4y2Ba样本成像在同一激光功率控制样本以及最大的激光功率。控制vs。gydF4y2Baob / obgydF4y2Ba比较积极的控制执行不同的蝙蝠TH免疫染色。gydF4y2BadgydF4y2Ba在WT与AdC3KO、量化的染色(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4,4)和控制vs。gydF4y2Baob / obgydF4y2Ba(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3,3)老鼠。(左)一个值报告/鼠标,(右)一个值报告每sub-volume (60 sub-volumes /鼠标)。免疫印迹分析gydF4y2BaegydF4y2Ba男性WT和AdC3KO老鼠,蝙蝠从11星期住在22°C,gydF4y2BafgydF4y2Ba刚刚,蝙蝠从17 - 18男WT和CLSTN3βKO小鼠位于22°C,gydF4y2BaggydF4y2Ba男性WT和AdC3KO老鼠,蝙蝠从年级星期住在4°C为4天,gydF4y2BahgydF4y2BaiWAT从年级刚刚男性WT和AdC3KO老鼠住在4°C 4天gydF4y2Ba我gydF4y2Ba刚刚,蝙蝠从17 - 18男WT和CLSTN3βKO小鼠位于22°C。gydF4y2BajgydF4y2Ba免疫印迹分析条件媒体(CM)和完整的细胞溶解产物(水控制法)HEK293T细胞转染/处理指定的结构化合物。移频键控= forskolin(5µM)。*这些β-Actin墨迹是相同的。扩展的数据图。gydF4y2Ba8 f,我gydF4y2Ba来自相同的实验,但分手用于演示目的。酒吧的情节显示意味着±SEM。每个点代表一个生物复制。小提琴的情节显示值(虚线)和质量(虚线)。双面的* * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001普通单向方差分析与Dunnett多个对比测试(gydF4y2BadgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
扩展数据图9描述的细胞和老鼠re-expressing CLSTN3β。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba(顶级)CRISP-ID Sanger测序分析跟踪从无限增殖CLSTN3βKO布朗preadipocyte克隆。在红色下划线PAM序列上。CRISPR策略扩展数据图中描述的是一样的。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba。(底部)WT和CLSTN3βKO等位基因的核苷酸序列。基地在KO等位基因是用红色突出显示的删除。gydF4y2BabgydF4y2Ba光学显微镜的永生化CLSTN3βKO棕色脂肪细胞稳定表达(左)(右)或mCherry CLSTN3β-mCherry(第五天的区别)。酒吧= 50µm规模。gydF4y2BacgydF4y2Ba(左)海马的耗氧率(OCR)呼吸运动计量法分析无限增殖CLSTN3βKO棕色脂肪细胞稳定表达mCherry (mCh)或CLSTN3β-mCherry (C3β-mCh)的分化(6天)和处理异丙肾上腺素(ISO, 10µM)寡霉素(益生元、4µM) FCCP(2µM),和鱼藤酮/ myxothiazol (RM 7.5µM)。细胞预处理与atglistatin (ATGLi 40µM) 30 - 45分钟。(右)FCCP-induced OCR规范化的蛋白质含量(gydF4y2BangydF4y2Ba= 6)。gydF4y2BadgydF4y2Ba免疫印迹分析CLSTN3βKO名字的棕色脂肪细胞稳定表达妇幼保健或C3β-mCh分化(6天)。gydF4y2BaegydF4y2Ba、银染色分析大型(500gydF4y2BaggydF4y2Ba),中等(8000gydF4y2BaggydF4y2Ba)、小(200000gydF4y2BaggydF4y2Ba)从永生的摩门教的孤立CLSTN3βKO棕色脂肪细胞稳定表达妇幼保健或C3β-mCh(第八天的区别)。等量的标签从每个条件被加载到凝胶。gydF4y2BafgydF4y2Ba,同样的实验图。gydF4y2Ba4 a egydF4y2Ba。免疫印迹分析蝙蝠。gydF4y2BaggydF4y2Ba,同样的实验图。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba。CLSTN3免疫组织化学(包含IHC) asWAT和蝙蝠。酒吧= 50µm规模。酒吧/线情节展示意味着±SEM。每个点代表一个生物复制。双面的*gydF4y2BaPgydF4y2Ba由多个t Holm-Sidak校正(< 0.05gydF4y2BacgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
扩展数据图10守恒gydF4y2BaCLSTN3BgydF4y2Ba在人类身上。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba的氨基酸排列CLSTN3β代表胎盘类哺乳动物。gydF4y2BabgydF4y2Ba,RNA-seq读取gydF4y2BaCLSTN3gydF4y2Ba轨迹在人类皮层和脂肪组织。gydF4y2BacgydF4y2Ba,微阵列分析gydF4y2BaCLSTN3gydF4y2Ba从脂肪组织表达periadrenal控制病人,嗜铬细胞瘤患者单室的脂肪(PheoUni),和嗜铬细胞瘤患者多腔的脂肪(PheoMulti) (gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)。gydF4y2BadgydF4y2Ba,qPCR分析gydF4y2BaCLSTN3gydF4y2Ba外显子1/2,gydF4y2BaCLSTN3gydF4y2Ba外显子17/18,gydF4y2BaCLSTN3BgydF4y2Ba,gydF4y2BaUCP1gydF4y2Ba表达在人类单房的和多腔的脂肪组织(gydF4y2BangydF4y2Ba= 26日12)。单室的组织包括控制和PheoUni病人。gydF4y2BaegydF4y2Ba,RNAscope分析gydF4y2BaCLSTN3BgydF4y2Ba从精益控制表达式在单室的periadrenal脂肪组织,肥胖控制和嗜铬细胞瘤(PheoUni)患者。酒吧= 50µm规模。gydF4y2BafgydF4y2Ba,克隆人类gydF4y2BaCLSTN3BgydF4y2Ba。gydF4y2BaggydF4y2Ba,共焦显微镜OA-treated(1毫米,一夜之间)海拉细胞转染人类CLSTN3β-Flag和沾LipidTOX 647。酒吧= 5µm规模。gydF4y2BahgydF4y2Ba老鼠和人类的,氨基酸对齐CLSTN3β(参考序列)。假定的疏水性发夹、β-strand域和TM域的颜色为红色,蓝色,紫色。强调了残留在人类的病人改变CLSTN3β是本研究克隆。酒吧的情节显示意味着±SEM。每个点代表一个生物复制。双面的*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,* *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01,* * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001普通单向方差分析与Dunnett多个对比测试(gydF4y2BacgydF4y2Ba)或多个t Holm-Sidak校正(gydF4y2BadgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
扩展数据图11 CLSTN3βassociates CIDE LD融合蛋白和块。gydF4y2Ba
(gydF4y2Ba模拟gydF4y2Ba)免疫印迹分析CLSTN3β-Flag co-immunoprecipitation转染HEK293FT细胞化验。gydF4y2Ba一个gydF4y2BaCIDEC-HA,gydF4y2BabgydF4y2Ba、CIDEA-HA CIDECα-HA CIDECβ-HA,gydF4y2BacgydF4y2BaRAB18-HA CGI58-HA,gydF4y2BadgydF4y2Ba,HA-tagged CIDEC c端地区(CIDEC-C-HA)。gydF4y2BaegydF4y2Ba转染3、CLSTN3β-GFP Co-localization CIDEA-HA t3-l1 preadipocytes OA对待。酒吧= 5µm规模。(gydF4y2Baf-hgydF4y2Ba)荧光光漂白后复苏(收紧)的脂质转染3汇率分析t3-l1 preadipocytes孵化200µM OA和1µg /毫升BODIPY 558/568 CgydF4y2Ba12gydF4y2Ba脂肪酸16 h。gydF4y2BafgydF4y2Ba脂质汇率计算(gydF4y2BangydF4y2Ba= 15,14日,17细胞)。细胞用于代表痕迹以红色突出显示。gydF4y2BaggydF4y2Ba,代表的意思是光强从每组一双摩门教的痕迹。gydF4y2BahgydF4y2Ba代表FRAP-based脂质汇率分析的图像。黄色箭头指向漂白摩门教。酒吧的情节显示意味着±SEM。每个点代表一个生物复制。双面的* * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001普通单向方差分析与图基的多个对比测试(gydF4y2BafgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
扩展数据图12 CLSTN3βassociates CIDE LD融合蛋白和块。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba,共焦显微镜的海拉细胞稳定表达GFP或CLSTN3β-GFP表达CIDEC和瞬变。细胞治疗OA和摩门教沾BODIPY 665。酒吧= 5µm规模。gydF4y2BabgydF4y2Ba,共焦显微镜的永生化CLSTN3βKO棕色脂肪细胞稳定表达mCherry或CLSTN3β-mCherry CIDEC-v5(第五天的区别)。细胞被沾BODIPY 488、DAPI和anti-v5 mCherry信号放大与anti-mCherry Alexa萤石594。酒吧= 5µm规模。gydF4y2BacgydF4y2Ba(顶级)免疫印迹分析蝙蝠从男性WT和AdC3KO老鼠住在(左)22°C或(右)为4天4°C。(底部)量化以上西方的污点。gydF4y2BadgydF4y2Ba,代表FRAP-based相分离的图像分析。黄色箭头指向漂白信号LD-LD联系地点(最不发达国家)。酒吧= 2µm规模。gydF4y2BaegydF4y2Ba、量化FRAP-based相分离试验(gydF4y2BangydF4y2Ba= 22细胞)。gydF4y2BafgydF4y2Ba,比例的细胞与CIDEC冷凝物在没有或存在CLSTN3β(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。酒吧/线情节展示意味着±SEM。每个点代表一个生物复制。双面的*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,* *gydF4y2BaPgydF4y2Ba韦尔奇t < 0.01 (gydF4y2BacgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充图1gydF4y2Ba
凝胶源数据。gydF4y2Ba
补充表1gydF4y2Ba
底漆和指导RNA序列用于这项研究。gydF4y2Ba
补充讨论gydF4y2Ba
进一步讨论和相关的引用。gydF4y2Ba
补充数据1gydF4y2Ba
基因内区集群与微分拼接网站使用在大脑皮层和蝙蝠。gydF4y2Ba
补充数据2gydF4y2Ba
高信任度CLSTN3βinteractome。gydF4y2Ba
补充数据3gydF4y2Ba
鼠标gydF4y2BaClstn3bgydF4y2Ba特殊技能ORF爆炸(物种)。gydF4y2Ba
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鼠标gydF4y2BaClstn3bgydF4y2Ba特殊技能ORF爆炸(分类)。gydF4y2Ba
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酪氨酸羟化酶免疫染色整个WT蝙蝠的叶。三维重建和动画的整个WT蝙蝠叶,彩色的酪氨酸羟化酶使用修改后的Adipo-Clear协议和使用一张光显微镜成像。gydF4y2Ba
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酪氨酸羟化酶免疫染色整个AdC3KO蝙蝠的叶。三维重建和动画的整个AdC3KO蝙蝠叶,彩色的酪氨酸羟化酶使用修改后的Adipo-Clear协议和使用一张光显微镜成像。gydF4y2Ba
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CLSTN3βCIDEC脂质转移活动的影响。FRAP-based脂质汇率分析CIDEC没有或CLSTN3β的存在。gydF4y2Ba
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钱,K。,Tol, M.J., Wu, J.et al。gydF4y2BaCLSTN3β执行脂肪细胞multilocularity促进脂质利用率。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba613年gydF4y2Ba,160 - 168 (2023)。https://doi.org/10.1038/s41586 - 022 - 05507 - 1gydF4y2Ba
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