摘要gydF4y2Ba
核糖体是高度复杂的翻译机器，在蛋白质合成的调节中已被证明是异质的gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．男性生殖细胞发育涉及精子形成过程中复杂的翻译调节gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．然而，尚不清楚精子形成过程中的翻译是否由特定的核糖体完成。在这里，我们报告一个核糖体与一个专门的新生多肽出口隧道，核糖体gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba该蛋白与雄性生殖细胞特异性蛋白RPL39L组装在一起，RPL39L是核心核糖体(ribosome)的副产物gydF4y2Ba核心gydF4y2Ba)蛋白RPL39。核糖体缺失gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba在小鼠中引起精子形成缺陷，导致生育能力大大降低。我们对小鼠肾脏和睾丸核糖体的单颗粒冷冻电镜结构进行了比较，表明核糖体gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba与核糖体相比，具有不同大小和电荷状态的核糖体多肽出口通道gydF4y2Ba核心gydF4y2Ba．核糖体gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba主要对男性生殖细胞特异性蛋白质子集的折叠进行共翻译调节，这些蛋白质对精子的形成至关重要。此外，我们还发现核糖体具有特殊的功能gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba都不能被核糖体替代gydF4y2Ba核心gydF4y2Ba．综上所述，这种精子特异性核糖体的鉴定将极大地扩展我们对核糖体功能和哺乳动物蛋白质表达模式的组织特异性调控的理解。gydF4y2Ba
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MS蛋白质组学数据已通过PRIDE在项目加入下存入ProteomeXchange Consortium:gydF4y2BaPXD020874gydF4y2Ba，gydF4y2BaPXD020864gydF4y2Ba，gydF4y2BaPXD020922gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPXD037257gydF4y2Ba．测序数据存放在BioProject下的国家生物技术信息中心(NCBI)序列读取档案gydF4y2BaPRJNA657531gydF4y2Ba．本文报道的低温电镜密度图可在电子显微镜数据库中以登录代码获得gydF4y2Baemd - 30432gydF4y2Ba(80S核糖体来自小鼠肾脏)和gydF4y2Baemd - 30433gydF4y2Ba(小鼠睾丸80S核糖体);原子坐标在PDB中根据登录代码报告gydF4y2Ba7 cpugydF4y2Ba而且gydF4y2Ba7 cpvgydF4y2Ba,分别。本研究中使用的人40S和60S核糖体结构来自于PDBgydF4y2Ba6 ek0gydF4y2Ba．gydF4y2Ba源数据gydF4y2Ba提供了这篇论文。gydF4y2Ba
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确认gydF4y2Ba
我们感谢中国科学院分子细胞科学卓越研究中心的李迪(Li)和康奈尔大学的钱学森(S. Qian)在实验设计过程中的帮助;朱斌，黄晓霞，季国强(中国科学院生物物理研究所)，生物成像中心(CBI)冷冻电镜数据采集gydF4y2Bahttp://cbi.ibp.ac.cngydF4y2Ba)， ibp, cas;范德东、张丽丽、皇甫(IBP, CAS)在低温电镜样品筛选过程中提供帮助;Q. Dong (IBP, CAS)负责作品制作;李伟(中国科学院动物研究所)协助精子荧光原位杂交分析;和S. Eckardt帮助准备论文。国家重点研发计划(2018YFC1003500、2018YFA0106900、2021YFC2700200)和国家自然科学基金(31890784、31830043)资助。gydF4y2Ba
作者信息gydF4y2Ba
作者及隶属关系gydF4y2Ba
贡献gydF4y2Ba
洪林、杨辉、晓辉、李永利、洪志、崔永元、洪霞进行了大部分实验并分析了数据。洪林、晓辉、崔永元、洪霞、温霞、圣哲、洪涛、永哲对小鼠和细胞系进行了功能研究。洪亮、杨洪亮、薛洪亮、丁智珍、薛正昌、丁俊杰进行核糖体及结构分析。郑永林、郑永武、郑永光进行蛋白质组学分析。H.Z.进行了生物信息学分析。j.s.， Y.Q.和X.G.发起了项目，设计了实验，监督了整个项目并撰写了手稿。gydF4y2Ba
相应的作者gydF4y2Ba
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相互竞争的利益gydF4y2Ba
作者声明没有利益竞争。gydF4y2Ba
同行评审gydF4y2Ba
同行评审信息gydF4y2Ba
自然gydF4y2Ba感谢Jon Oatley, Petra Van Damme和其他匿名审稿人对这项工作的同行评审所做的贡献。gydF4y2Ba
额外的信息gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba
扩展的数据图形和表格gydF4y2Ba
图1细胞类型特异性核糖体:小鼠组织和出生后睾丸发育不同阶段80S单体的核糖体蛋白质组谱和RP鉴定。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，利用不同成年小鼠组织通过蔗糖梯度分馏分离细胞质核糖体。gydF4y2BabgydF4y2Ba在本研究和早期研究的比较分析中，确定的RPs的维恩图。gydF4y2BacgydF4y2Ba，本研究鉴定的RP旁基在不同小鼠组织中的分布。gydF4y2BadgydF4y2Ba，不同小鼠组织的细胞质核糖体相关矩阵。gydF4y2BaegydF4y2Ba， 9种小鼠组织RPs最大SPM密度图。gydF4y2BafgydF4y2Ba，逆转录基因之间的关系gydF4y2BaRpl39lgydF4y2Ba及其x连锁亲本基因gydF4y2BaRpl39gydF4y2Ba．gydF4y2BaggydF4y2Ba的mRNA水平gydF4y2BaRpl39gydF4y2Ba而且gydF4y2BaRpl39lgydF4y2Ba在15个小鼠组织中。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。gydF4y2BahgydF4y2Ba，使用PRM方法对9种小鼠组织中RPL3L的相对定量。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，利用出生后不同发育阶段的小鼠睾丸组织，通过蔗糖梯度分馏分离细胞质核糖体。gydF4y2BajgydF4y2Ba，不同发育阶段小鼠睾丸组织细胞质核糖体的相关矩阵。gydF4y2BakgydF4y2Ba， PRM对非核糖体、40S、60S和核糖体部分RPL4和RPL39L的相对蛋白定量。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。gydF4y2BalgydF4y2Ba、小鼠睾丸细胞的形态学和特异性染色:睾丸间质细胞(IC)、支持细胞(SC)、精原细胞(SG)、粗线精母细胞(PS)、圆形精母细胞(RS)和细长精母细胞(ES)。比例尺，20 μm。gydF4y2Ba米gydF4y2BaSG(82.60%)、PS(82.69%)、RS(87.76%)、ES(81.9%)、IC(92.63%)和SC(96.35%)细胞纯度。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。gydF4y2BangydF4y2Ba，量化gydF4y2BaRpl39gydF4y2Ba而且gydF4y2BaRpl39lgydF4y2BaqPCR检测睾丸细胞mRNA水平。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。gydF4y2BaogydF4y2BaPRM检测睾丸细胞中RPL10、RPL10L、RPL22、RPL22L1的绝对蛋白定量。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。为gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba，gydF4y2BakgydF4y2Ba，gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，gydF4y2BangydF4y2Ba而且gydF4y2BaogydF4y2Ba，数据为均数±s.e.m。gydF4y2BangydF4y2Ba值表示样本的数量。gydF4y2Ba
图2 CRISPR-Cas9基因敲除策略与核糖体表型gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba老鼠。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，使用的CRISPR-Cas9和sgrna的原理图。gydF4y2BabgydF4y2Ba， CRISPR-Cas9生成的3株突变株序列。gydF4y2Bac, dgydF4y2Ba，粗线精母细胞RPL39L相对蛋白表达水平:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 5.63 × 10gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba精子:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 1.47 × 10gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba) (gydF4y2BacgydF4y2Ba)和RPL39(粗线精母细胞:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 1.04 × 10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba精子:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 1.09 × 10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba) (gydF4y2BadgydF4y2Ba)在核糖体中gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba野生型小鼠粗线精母细胞和精子细胞，通过PRM评估。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。gydF4y2BaegydF4y2Ba,核糖体gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba野生型睾丸和40S (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.664)， 60s (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.664)， 80 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 1.25 × 10gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba)， 2-6 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.712)和7+多聚体(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.489)。gydF4y2BangydF4y2Ba= 5。gydF4y2BafgydF4y2Ba，睾丸核糖体形态和大小gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba野生型小鼠。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。比例尺，3毫米。gydF4y2BaggydF4y2Ba、精子形态及头部流行率(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 7.86 × 10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba)和尾巴(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 9.02 × 10gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba)核糖体缺陷gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba还有野生型精子。gydF4y2BangydF4y2Ba= 4。比例尺，10 μm。gydF4y2BahgydF4y2Ba、睾丸激素水平(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.662)、黄体生成素(LH) (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.491)和促卵泡激素(FSH) (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.437)gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba野生型小鼠。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，每只雌性小鼠核糖体阴道栓的平均频率gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba或野生型雄性小鼠在生育测试(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.902,gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。gydF4y2BajgydF4y2Ba，野生型和核糖体的组织学gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba睾丸在第VII-VIII期显示生精小管，用虚线圈出，并在底部放大。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。PL:瘦前精母细胞，黑色箭头;PS:粗线精母细胞，红色箭头;RS:圆形精子细胞，绿色箭头;ES:细长精子细胞，蓝色箭头;支持细胞。顶板比例尺，50 μm;底板比例尺，10 μm。gydF4y2BakgydF4y2Ba，野生型和核糖体的组织学gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba显示完整睾丸切片和第九期切片的睾丸，并统计第九期的百分比(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.179)和每IX期小管未释放精子的平均数量(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 5.87 × 10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba)．红色虚线表示第九期的输精管，黑色虚线表示延迟释放的精子。左面板比例尺，500 μm;右面板比例尺，20 μm。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。gydF4y2BalgydF4y2Ba，野生型和核糖体的组织学gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba睾丸显示未释放的精子处于第九阶段。用虚线标记的区域以高倍放大显示到底部。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。L:细细精母细胞，黑色箭头;PS:粗线精母细胞，红色箭头;ES:细长精子细胞，蓝色箭头;SC:支持细胞;RB:残体。顶板比例尺，50 μm;底板比例尺，10 μm。gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，睾丸图像及睾丸/体重比(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 5.63 × 10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba，gydF4y2BangydF4y2Ba= 6)的三个核糖体gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba品系和野生型小鼠。比例尺，3毫米。gydF4y2BangydF4y2Ba附睾精子计数(品系2:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.048，菌株3:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.045)，运动性(品系2:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 4.03 × 10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba，品系3:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 4.14 × 10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba)和进行性运动(品系2:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 3.77 × 10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba，品系3:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 4.05 × 10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba)再分成两个核糖体gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba品系和野生型小鼠。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。gydF4y2BaogydF4y2Ba、HE染色的睾丸和附睾精子的3个核糖体gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba菌株。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。比例尺，10 μm。gydF4y2BapgydF4y2Ba，雌性核糖体的生育能力gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba与野生型雄鼠交配的小鼠(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.606,gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。为gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba，gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，gydF4y2BakgydF4y2Ba，gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，gydF4y2BangydF4y2Ba而且gydF4y2BapgydF4y2Ba，数据为均数±s.e.m。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用双尾学生的值来确定gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。gydF4y2BangydF4y2Ba数值表示生物独立动物的数量。gydF4y2Ba
图3核糖体表型分析gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba老鼠。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，免疫荧光检测Hoechst 33342染色核的LIN28(红色)，定量3个核糖体阳性细胞gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba毒株和野生型小鼠(毒株1:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.144,gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)(品系2:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.759，菌株3:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.320,gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。左面板比例尺，500 μm;右面板比例尺，20 μm。gydF4y2BabgydF4y2Ba，核糖体中细线、接合线、粗线和双线精母细胞中SYCP3(绿色)和γH2AX(红色)的免疫荧光检测gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba野生型睾丸和核糖体各阶段的定量gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba野生型小鼠。比例尺，10 μm。gydF4y2BacgydF4y2Ba， Hoechst 33342染色核SOX9(红色)免疫荧光检测，核糖体阳性细胞定量gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba野生型小鼠(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.161,gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。左面板比例尺，50 μm;右面板比例尺，20 μm。gydF4y2BadgydF4y2Ba，核糖体的荧光原位杂交gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba野生型精子使用X和Y染色体特异性探针，以及它们相应的比例条形图。比例尺，2 μm。gydF4y2Bae, fgydF4y2Ba、核糖体异常透射电镜分析及示意图gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba附睾中的野生型精子。红色箭头:轴突4-7双态微管缺陷，蓝色箭头:轴突其他缺陷。比例尺，1 μm。（gydF4y2BaegydF4y2Ba）;核糖体轴突中双态微管4-7缺陷和其他缺陷的百分比gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba精尾(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 3.74 × 10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba，gydF4y2BangydF4y2Ba= 3) (gydF4y2BafgydF4y2Ba)．gydF4y2BaggydF4y2Ba，核糖体TUNEL染色(红色)gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2BaHoechst 33342染色的野生型睾丸(蓝色)，以及每个小管TUNEL阳性细胞的定量统计(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.009)和TUNEL阳性小管百分比(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.003,gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。左面板比例尺，50 μm;右面板比例尺，20 μm。为gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba而且gydF4y2BaggydF4y2Ba，数据为均数±s.e.m。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用双尾学生的值来确定gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。gydF4y2BangydF4y2Ba数值表示生物独立动物的数量。gydF4y2Ba
图4核糖体中差异蛋白的蛋白质组学和生物信息学分析gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba精母细胞和ESs。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba荧光激活细胞分选法或STA-PUT法从核糖体中纯化精母细胞和ESs的形态学和Hoechst 33342(蓝色)染色gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba野生型小鼠。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。比例尺，20 μm。gydF4y2BabgydF4y2Ba，精母细胞蛋白表达变化呈对数gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(折叠变化)(核糖体gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2BaVs. wild-type)和-loggydF4y2Ba10gydF4y2Ba(FDR-adjustedgydF4y2Ba问gydF4y2Ba)．gydF4y2BacgydF4y2Ba，富集GO:核糖体中下调的蛋白质gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2BaESs。gydF4y2BadgydF4y2Ba，富集GO:核糖体中上调的蛋白质gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2BaESs。gydF4y2BaegydF4y2Ba， PRM2的验证(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 4.06 × 10gydF4y2Ba−5gydF4y2Ba)， SMCP (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 7.70 × 10gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba)， atp1a4 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 1.23 × 10gydF4y2Ba−5gydF4y2Ba)， h1fnt (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 2.46 × 10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba)，意大利面条(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 1.41 × 10gydF4y2Ba−5gydF4y2Ba)， pgk2 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 1,84 × 10gydF4y2Ba−5gydF4y2Ba)， ropn1 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 6.09 × 10gydF4y2Ba−7gydF4y2Ba)， odf1 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 1.00 × 10gydF4y2Ba−5gydF4y2Ba)， spata6 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 8.43 × 10gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba)， tssk2 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 8.22 × 10gydF4y2Ba−5gydF4y2Ba)， cst13 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 1.80 × 10gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba)， crisp2 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 2.62 × 10gydF4y2Ba−7gydF4y2Ba)， ccin (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 5.45 × 10gydF4y2Ba−5gydF4y2Ba)， dbil5 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 4.53 × 10gydF4y2Ba−7gydF4y2Ba)， tcp11 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 6.34 × 10gydF4y2Ba−9gydF4y2Ba)， ube2j1 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 5.30 × 10gydF4y2Ba−7gydF4y2Ba)， dcun1d1 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 7.57 × 10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba)，以及DYNC1LI2 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.118)gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba精子细胞的相对靶向定量(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。gydF4y2BafgydF4y2Ba， PRM2蛋白Western blot分析(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 2.47 × 10gydF4y2Ba−7gydF4y2Ba)， pgk2 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.017)， spata6 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 2.06 × 10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba)， tssk2 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 6.99 × 10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba)， crisp2 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.047)， tcp11 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 5.92 × 10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba)， ube2j1 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.007)， dcun1d1 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 2.38 × 10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba)及DYNC1LI2 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 1.00)gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba精子。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。gydF4y2BaggydF4y2Ba，睾丸特异性表达下调蛋白在生殖细胞发育不同阶段聚集mRNA和蛋白表达模式的热图。在簇1和簇2中，mRNA水平在精母细胞或圆形精子细胞中达到峰值，而蛋白质水平在ESs中达到峰值。对于聚类3和4，所有mRNA表达水平在ESs中均达到峰值，这与观察到的蛋白质表达模式一致。gydF4y2BahgydF4y2Ba，睾丸特异性蛋白在核糖体中下调和上调差异表达蛋白中的分布gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2BaESs。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba富集GO是核糖体中睾丸特异性蛋白下调的术语gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2BaESs。gydF4y2BajgydF4y2Ba核糖体之间差异表达蛋白的重叠gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba在80S、核糖体之间的2-6和7+多体中存在差异基因gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2BaRNC-seq检测野生型睾丸。gydF4y2BakgydF4y2Ba， 80S mRNA水平热图，核糖体之间的2-6或7+多体gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2BaRNC-seq检测野生型睾丸。gydF4y2BalgydF4y2Ba，在精母细胞(左)和随后的精子细胞(右)中使用抗嘌呤霉素对新生肽进行Western印迹gydF4y2BaOgydF4y2Baβ-微管蛋白(β-Tubulin)作为对照。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，分析gydF4y2BaCcingydF4y2Ba，gydF4y2BaCrisp2gydF4y2Ba，gydF4y2BaCst13gydF4y2Ba，gydF4y2BaDbil5gydF4y2Ba，gydF4y2BaDcun1d1gydF4y2Ba，gydF4y2BaH1fntgydF4y2Ba，gydF4y2BaOdf1gydF4y2Ba，gydF4y2BaPgk2gydF4y2Ba，gydF4y2BaPrm2gydF4y2Ba，gydF4y2BaRopn1gydF4y2Ba，gydF4y2BaSpata6gydF4y2Ba，gydF4y2BaTcp11gydF4y2Ba，gydF4y2BaTssk2gydF4y2Ba，gydF4y2BaUbe2j1gydF4y2Ba，gydF4y2BaAtp1a4gydF4y2Ba，gydF4y2BaSmcpgydF4y2Ba，gydF4y2BaSpag4gydF4y2Ba而且gydF4y2BaDync1li2gydF4y2Ba所有多体体部分的mRNA水平。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。gydF4y2BangydF4y2Ba， 80年代差异蛋白质组学的翻译比，核糖体之间2-6或7+多体gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba和野生型睾丸。gydF4y2BaogydF4y2Ba，代入恒等式矩阵。矩阵中的每个条目表示mops完整数据集中对应的(原始密码子，目标氨基酸)对检测到的独立替换的数量。对数色条突出显示检测的动态范围。灰色方块表示从密码子到其同源氨基酸的替换，从停止密码子的替换，或通过我们的方法无法检测到的替换，因为它们与UniMod中的一个pms或工件难以区分(gydF4y2Bahttp://www.unimod.org/gydF4y2Ba)数据库。为gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，数据为均数±s.e.m。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用双尾学生的值来确定gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。gydF4y2BangydF4y2Ba值表示样本的数量。凝胶源数据见补充图1。gydF4y2Ba
图5肾脏和睾丸核糖体的Cryo-EM数据处理和分辨率评估。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba、人、小鼠、大鼠、果蝇RPL39和RPL39L的多序列比对gydF4y2BaC.elegansgydF4y2Ba和酵母。gydF4y2BabgydF4y2Ba肾核糖体代表性显微照片。gydF4y2BacgydF4y2Ba，肾核糖体冷冻电镜数据处理流程图。gydF4y2BadgydF4y2BaResMap方法估计肾核糖体终图局部分辨率变化。gydF4y2BaegydF4y2Ba，肾核糖体终图的金标准傅里叶壳相关(FSC)曲线显示FSC = 0.143时分辨率为2.82 Å。gydF4y2BafgydF4y2Ba，睾丸核糖体代表性显微照片。gydF4y2BaggydF4y2Ba，睾丸核糖体冷冻- em数据处理流程图。gydF4y2BahgydF4y2Ba，利用ResMap估计睾丸核糖体终图局部分辨率变化。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，睾丸核糖体终图的金标准傅里叶壳相关(FSC)曲线显示在FSC = 0.143时分辨率为3.03 Å。gydF4y2Ba
图6肾核糖体结构比较gydF4y2Ba核心gydF4y2Ba，睾丸核糖体gydF4y2Ba核心gydF4y2Ba睾丸核糖体gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba肾核糖体60S亚基的结构叠加gydF4y2Ba核心gydF4y2Ba(粉红色)，睾丸核糖体gydF4y2Ba核心gydF4y2Ba(灰色)，睾丸核糖体gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba(砖红色)。为了清晰起见，省略了40S核糖体。gydF4y2BacgydF4y2Ba肾核糖体RPL39近观gydF4y2Ba核心gydF4y2Ba(粉红色)，睾丸核糖体RPL39gydF4y2Ba核心gydF4y2Ba(灰色)和睾丸核糖体RPL39LgydF4y2Ba圣gydF4y2Ba(砖红色)。gydF4y2Bab, dgydF4y2Ba肾核糖体RPL39密度和睾丸核糖体RPL39和RPL39L密度(1.4级)。gydF4y2BafgydF4y2Ba肾核糖体RPL39的R28和R36侧链近观gydF4y2Ba核心gydF4y2Ba(粉红色)，睾丸核糖体RPL39的R28和R36gydF4y2Ba核心gydF4y2Ba(灰色)、睾丸核糖体RPL39L的Q28和M36gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba(砖红色)，表示侧链的方向。gydF4y2Bae, ggydF4y2Ba肾核糖体RPL39的R28和R36的密度近观gydF4y2Ba核心gydF4y2Ba（gydF4y2BaegydF4y2Ba）;睾丸核糖体RPL39的R28和R36的密度gydF4y2Ba核心gydF4y2Ba以及睾丸核糖体RPL39L的Q28和M36gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba（gydF4y2BaggydF4y2Ba)．gydF4y2BahgydF4y2Ba肾核糖体RPL39的R28和R36的近观gydF4y2Ba核心gydF4y2Ba(粉红色)，为清晰起见，省略了密度图。gydF4y2Ba我,我gydF4y2Ba睾丸核糖体RPL39的R28和R36的近景gydF4y2Ba核心gydF4y2Ba(灰色;gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)，以及睾丸核糖体RPL39L的Q28和M36gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba(砖红色;gydF4y2BajgydF4y2Ba)，为清晰起见，密度图省略。gydF4y2Ba
图7核糖体中下调蛋白的结构特征分析gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2BaESs。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba与未下调蛋白相比，下调蛋白在10-11、14-20和23-27氨基酸位置的螺旋比例更高。与未上调蛋白相比，上调蛋白在23 - 38个氨基酸位置上的螺旋百分比较低。gydF4y2BabgydF4y2Ba，基于AlphaFold蛋白质结构数据库的CCIN三维结构(gydF4y2Bahttps://alphafold.ebi.ac.ukgydF4y2Ba)， n端50个氨基酸以蓝色显示，c端半序列以灰色显示。gydF4y2BacgydF4y2Ba与无显著性蛋白和上调蛋白相比，下调蛋白在c端半段形成了更多的二硫键。gydF4y2BadgydF4y2Ba，基于AlphaFold蛋白质结构数据库的CST13三维结构(gydF4y2Bahttps://alphafold.ebi.ac.ukgydF4y2Ba)， n端50个氨基酸用蓝色标记，c端半序列用灰色标记，二硫键用红色标记。gydF4y2BaegydF4y2Ba，核糖体上调蛋白的氨基酸富集分析gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2BaESs。gydF4y2BafgydF4y2Ba、总硫醇含量(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.547)及谷胱甘肽(谷胱甘肽)(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 2.27 × 10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba)在核糖体中gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba野生型N2a细胞株。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。为gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba而且gydF4y2BafgydF4y2Ba，数据为均数±s.e.m。gydF4y2BaPgydF4y2Ba值是使用双面费雪精确检验确定的gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba；双尾学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba测试的gydF4y2BafgydF4y2Ba．gydF4y2BangydF4y2Ba值表示独立实验的数量。gydF4y2Ba
扩展数据图8核糖体的构造gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba敲除N2a细胞系。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， CRISPR-Cas9和sgRNA对抗原理图gydF4y2BaRpl39lgydF4y2Ba用于N2a细胞。gydF4y2BabgydF4y2Ba核糖体序列gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2BaCRISPR-Cas9生成的N2a细胞系。gydF4y2BacgydF4y2Ba，核糖体中核糖体轮廓的吸光度gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba野生型N2a细胞株。gydF4y2BadgydF4y2Ba， TCP11的验证(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.028)， dcun1d1 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.006)和DYNC1LI2 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.916)gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Bawestern blotting检测N2a细胞。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。gydF4y2BaegydF4y2Ba， GC-1核糖体和核糖体中RPL39和RPL39L蛋白表达水平的绝对定量gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba和野生型N2a核糖体(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.004,gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。gydF4y2BafgydF4y2Ba，量化gydF4y2BaRpl39gydF4y2Ba核糖体中的mRNAgydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba和野生型N2a细胞(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.034,gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。gydF4y2BaggydF4y2Ba，在N2a细胞系中使用抗嘌呤霉素对新生多肽进行Western印迹gydF4y2BaOgydF4y2Baβ-微管蛋白(β-Tubulin)作为对照。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。gydF4y2BahgydF4y2Ba，量化gydF4y2BaPrm2gydF4y2Ba，gydF4y2BaH1fntgydF4y2Ba，gydF4y2BaCcingydF4y2Ba,gydF4y2BaDync1li2gydF4y2Ba在细胞系和睾丸中。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。为gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba而且gydF4y2BahgydF4y2Ba，数据为均数±s.e.m。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用双尾学生的值来确定gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。gydF4y2BangydF4y2Ba值表示独立实验的数量。凝胶源数据见补充图1。gydF4y2Ba
扩展数据图9核糖体功能验证gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba在精子细胞和细胞系中。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， PRM2的稳定性(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 3.39 × 10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba)及DYNC1LI2 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.863)gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba并对野生型精子细胞进行环己亚胺追踪分析。各蛋白水平归一化至β-肌动蛋白，再归一化至时间点= 0 h。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。gydF4y2BabgydF4y2Ba，核糖体中H1FNT-HA的稳定性gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba用MG-132处理环己亚胺chase分析野生型N2a细胞。蛋白水平先归一化至eGFP，再归一化至时间点= 0 h (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.049,gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。gydF4y2BacgydF4y2Ba， Western blotting显示核糖体中LC3II/LC3I的相对比例gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba野生型N2a细胞(左，gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.100,gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)或与(对，gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.002,gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)转染H1FNT。H1FNT-HA在核糖体中的稳定性gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba环己亚胺chase分析与氯喹(CQ)处理的野生型N2a细胞。将蛋白水平归一化至eGFP，再归一化至时间点= 0 h (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.818,gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。gydF4y2BadgydF4y2Ba， PRM2-HA的稳定性(R28Q:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.021, rpl39l:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.004)， h1fnt-ha (r28q:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.006, rpl39l:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.001)， ccin-ha (r28q:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.044, rpl39l:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.021)， DYNC1LI2-HA (R28Q:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.208, rpl39l:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.362)gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba经环己亚胺追踪分析，N2a细胞系分别过表达RPL39、RPL39(R28Q)和RPL39L。将各蛋白水平归一化为eGFP，再归一化为时间点= 0 h。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。gydF4y2BaegydF4y2Ba， PERK蛋白western blotting分析未折叠蛋白反应信号通路(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.804)， eIF2α (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.619)，磷酸化的eIF2α (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.608)和ATF6α (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 2.07 × 10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba)以β-微管蛋白为加载对照，qPCRgydF4y2BaXbp1gydF4y2Ba（gydF4y2BaXbp1sgydF4y2Ba：gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.790,gydF4y2BaXbp1ugydF4y2Ba：gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.437,gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)以18S为内标进行剪接，HSP90B1的相对蛋白表达水平(FDR-调整)gydF4y2Ba问gydF4y2Ba= 0.002，折叠变化< 1.5，学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba-测试与BH FDR校正)和HSPA5 (FDR-调整gydF4y2Ba问gydF4y2Ba= 0.019，折叠变化< 1.5，学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba根据LC-MS/MS基于tmt的定量(补充表)进行BH FDR校正测试gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)和核糖体gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba精子。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。gydF4y2BafgydF4y2Ba、内源蛋白MOV10、GAPDH和β-微管蛋白在可溶性(gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba)及球团(gydF4y2BaPgydF4y2Ba)在核糖体中进行western blottinggydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba野生型N2a细胞。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。gydF4y2BaggydF4y2Ba， H1FNT-HA分布(R28Q:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.020, rpl39l:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.013)和DYNC1LI2-HA (R28Q:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.393, rpl39l:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.465)gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPgydF4y2Bawestern blotting的分数和蛋白表达水平如图所示gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba/gydF4y2BaPgydF4y2Ba核糖体的比例gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2BaN2a细胞系分别过表达RPL39、RPL39(R28Q)和RPL39L。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。gydF4y2BahgydF4y2Ba，核糖体中合成OAZ3蛋白的sds抗性测定gydF4y2Ba圣- / -gydF4y2Ba野生型N2a细胞。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，野生型N2a细胞中不同野生型和突变等位基因的比例，1gydF4y2Ba圣gydF4y2Bacas9编辑的N2a细胞，单克隆杂合gydF4y2BaRpl39gydF4y2Ba+/-gydF4y2BaN2a细胞系来源于1gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba一轮编辑，gydF4y2BaRpl39gydF4y2Ba+/-gydF4y2BaN2a细胞受2gydF4y2BandgydF4y2Ba用blasticidin和purromycin进行cas9 -编辑和选择4天，加或不加7天的培养，不加选择。未额外培养7天的也进行单细胞分选，建立单克隆细胞系。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。gydF4y2BajgydF4y2Ba， RPL39L-IRES-eGFP和强力霉素(Dox)诱导的rpl39过表达核糖体的形态gydF4y2Ba核心——/ YgydF4y2Ba在不同的时间范围内对GC-1细胞进行治疗。传代时按分裂比例校正细胞数。比例尺，20 μm。gydF4y2BakgydF4y2BaGC-1野生型细胞核糖体中RPL39和RPL39L水平的绝对定量，以及RPL39L- ires - egfp过表达核糖体gydF4y2Ba核心——/ YgydF4y2BaPRM诱导或不诱导RPL39表达的GC-1细胞。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。为gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2Ba我gydF4y2Ba而且gydF4y2BakgydF4y2Ba，数据为均数±s.e.m。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用双尾学生的值来确定gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。gydF4y2BangydF4y2Ba值表示独立实验的数量。凝胶源数据见补充图1。gydF4y2Ba
扩展数据图10在一系列稀释实验中，PRM观察到的轻肽和重肽的信号比与预期信号比之间的线性关系。gydF4y2Ba
在连续稀释实验中，PRM观察到的重轻多肽的信号比和预期的信号比呈良好的线性关系。gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充图1和补充表1 - 10的完整说明。gydF4y2Ba
补充表1gydF4y2Ba
80S单体中RPs的定量研究。gydF4y2Ba
补充表2gydF4y2Ba
不同核糖体中观察到的不同蛋白质gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba-敲除小鼠生殖细胞。gydF4y2Ba
补充表3gydF4y2Ba
本研究中的GO分析。gydF4y2Ba
补充表4gydF4y2Ba
生殖细胞发育不同阶段睾丸特异性基因的mRNA和蛋白表达水平。gydF4y2Ba
补充表5gydF4y2Ba
小鼠核糖体RNC-mRNA表达水平gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba淘汰赛睾丸。gydF4y2Ba
补充表6gydF4y2Ba
Cryo-EM数据收集和细化统计。gydF4y2Ba
补充表7gydF4y2Ba
在肾脏和睾丸核糖体中模拟亚基列表。gydF4y2Ba
补充表8gydF4y2Ba
小鼠核糖体中下调蛋白的结构特征分析gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba淘汰赛精子。gydF4y2Ba
补充表9gydF4y2Ba
本研究中使用的引物和肽序列。gydF4y2Ba
补充表10gydF4y2Ba
PRM从蛋白质定量测量中提取的离子色谱图。gydF4y2Ba
权利和权限gydF4y2Ba
根据与作者或其他权利持有人签订的出版协议，自然或其许可方(例如，社会或其他合作伙伴)对本文拥有排他性权利;作者对这篇文章接受的手稿版本的自我存档仅受此类出版协议的条款和适用法律的约束。gydF4y2Ba
关于本文gydF4y2Ba
引用本文gydF4y2Ba
李，H.，霍，Y.，他，X。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba男性生殖细胞特异性核糖体控制男性生育能力。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba(2022)。https://doi.org/10.1038/s41586-022-05508-0gydF4y2Ba
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