摘要gydF4y2Ba
植物激素信号通路在细胞表面模式识别受体和细胞内核苷酸结合富亮氨酸重复类免疫受体介导的病原体防御中具有重要作用gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(NLR)。病原体已经进化出了反防御策略，以操纵植物激素信号通路来抑制免疫和增强毒性gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．然而，关于植物先天免疫系统监测病原体干扰植物激素信号的研究还很少。胡椒(gydF4y2Ba辣椒gydF4y2BaNLR Tsw是一种识别番茄斑点枯萎病原芽孢病毒(TSWV)编码的效应子非结构蛋白NSs的基因，它含有一个异常大的富亮氨酸重复序列(LRR)结构域。结构建模预测了Tsw的LRR结构域与茉莉酸受体COI1、生长素受体TIR1和直尾金内酯受体伙伴MAX2之间的相似性。这表明NSs可以直接靶向激素受体信号促进感染，Tsw已经进化出类似于植物激素受体LRR的LRR来诱导免疫。在这里，我们发现NSs通过一个共同的阻遏剂tcp21与COI1, TIR1和MAX2相关联，tcp21直接与这些植物激素受体相互作用。NSs增强COI1、TIR1或MAX2与TCP21的相互作用，并阻断相应转录抑制因子的降解，从而使植物激素介导的宿主对病毒的免疫功能失效。Tsw也直接与TCP21相互作用，这种相互作用由病毒NSs增强。TCP21的下调降低了TSWV介导的对TSWV的防御。总之，我们的发现揭示了一种病原体效应物以TCP21为目标抑制植物激素受体功能，促进毒力，而植物NLR蛋白已经进化到识别这种干扰作为一种反毒力策略，从而激活免疫。gydF4y2Ba
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确认gydF4y2Ba
我们感谢J. Li的提供gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba突变体gydF4y2Bamax2-1gydF4y2Ba种子;谢、宋为gydF4y2Bacoi1-1gydF4y2Ba种子;D.杨为gydF4y2Batir1 /空军基地gydF4y2Ba种子;崔S.gydF4y2Batcp7/21gydF4y2Ba种子;H.赵gydF4y2Bab .灰质gydF4y2Ba应变B05.10;图里纳先生gydF4y2Bac .摘要gydF4y2BaPI 152225种子和NSs-RB-272构造;邓先生gydF4y2BaC.束状年gydF4y2Ba种子;S. WanggydF4y2Bac .年gydF4y2BaCM334种子;丁昕顺博士对手稿进行批判性阅读。国家自然科学基金(31925032,32220103008,31870143)，青年科技创新计划，333计划，江苏省农业科技自主创新基金(CX(22)2039)， s.p.d.k X.T. NLR工作资助。实验室由NSF-IOS-1354434和NSF-IOS-1339185支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。gydF4y2Ba
作者信息gydF4y2Ba
作者及隶属关系gydF4y2Ba
贡献gydF4y2Ba
J.C.和X.T.构思并概念化了这项研究。j.c.， Y.Z, X.L.和H.H.制作的材料用于本研究。J.C.和X.T.进行了结构建模分析。J.C.和Y.Z.进行Y2H筛选。J.C.和X.L.进行RT-qPCR并分析数据。j.c.， Z.C.和Y.D.进行了蓟马偏好试验。j.c.， Y.Z, H.H.和X.L.进行免疫共沉淀，western blots和GST下拉实验。T.Y.和S.H.进行SLC测定并分析数据。j.c.， H.C.和X.L.进行了BiFC检测和共聚焦显微镜并分析了数据。J.C.和C.W.进行了蛋白质降解实验。 Y.Z. and X.L. performed the jasmonic acid, auxin and strigolactone assays. H.C., X.Q. and M.F. contributed towards TSWV inoculation and accumulation assays. Y.Z. and X.L. performed VIGS assays. H.H. and X.L. performed the genetic analysis. J.C. performed statistical analysis. Z.M., J.L., M.Z., S.Y.H. and S.P.D.-K. analysed data, provided critical feedback and helped to shape the research. J.C. and X.T. wrote the original draft of the paper. S.P.D.-K. and X.T. reviewed and edited the paper with input from all authors.
相应的作者gydF4y2Ba
道德声明gydF4y2Ba
相互竞争的利益gydF4y2Ba
作者声明没有利益竞争。gydF4y2Ba
同行评审gydF4y2Ba
同行评审信息gydF4y2Ba
自然gydF4y2Ba感谢Kenichi Tsuda, Xiufang Xin和其他匿名审稿人对本工作的同行评审所做的贡献。gydF4y2Ba
额外的信息gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba
扩展的数据图形和表格gydF4y2Ba
Tsw含有一个异常大的LRR结构域，该结构域与JA、AUX和SL植物激素受体/受体伙伴的LRR结构域具有相似性。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，胡椒“PI152225”携带gydF4y2Ba天水围gydF4y2Ba（gydF4y2Ba+天水围gydF4y2Ba)对TSWV感染具有抗性，而“CM334”品种无gydF4y2Ba天水围gydF4y2Ba（gydF4y2Ba天水围gydF4y2Ba)表现出发育迟缓、叶片卷曲等典型症状。gydF4y2BabgydF4y2Ba， cDNA全长RT-PCR检测gydF4y2Ba天水围gydF4y2Ba来自两个独立的植物样本(巷1和巷2)。M，尺寸标记。gydF4y2BacgydF4y2Ba， Tsw蛋白的结构示意图，包含一个卷曲线圈(CC)，一个NB-ARC和一个超大的LRR结构域。作为比较，给出了cc型NLR Rx。LRR(896-2116氨基酸)中的植物激素受体样结构域(Tsw-PRL)由括号表示。gydF4y2BadgydF4y2Ba， Protein Homology/analogY Recognition Engine (PHYRE) Version 2检测到Tsw的超大LRR结构域与JA受体COI1、AUX受体TIR1和SL受体-伴侣MAX2的LRR结构域具有氨基酸序列和结构相似性。gydF4y2BaegydF4y2Ba、COI1 (PDB: 3OGM)、TIR1 (PDB: 2P1N)和MAX2 (PDB: 5HYW)三维晶体结构的折叠趋势比较。左边是COI1、TIR1和MAX2包含F-box和LRR结构域的描述结构。中间显示三个定向相同的植物激素受体/受体-伙伴的三维晶体结构，右边显示旋转180º的结构。gydF4y2BafgydF4y2Ba， COI1、tir1和MAX2的三维结构与PHYRE 2预测的Tsw-PRL模型结构(1567-2050 a.a.a .)的叠加。gydF4y2BaggydF4y2Ba结果表明，Tsw和NSs共表达可诱导小鼠超敏反应(HR)细胞死亡gydF4y2Ba烟草benthamianagydF4y2Ba植物的叶子。Tsw与pCambia2300S空向量(EV) (i)、NSs与EV (ii)、EV (iii)或Tsw与NSs (iv)共表达gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba通过农业渗透种植叶片。白光下3 dpi拍摄浸润叶片HR细胞死亡表型(WL;左)及紫外线(UV;右)。gydF4y2Ba
扩展数据图2gydF4y2Ba
TSWV感染或NSs过表达gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba影响JA、AUX和SL信号通路。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，分析已发表的转录组数据gydF4y2Ba50gydF4y2Ba结果表明，JA、AUX和SL反应基因大多下调gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba在9、12和15 dpi感染TSWV的植株。基因表达上调或下调(至少有两倍的差异)分别用红色和绿色表示。gydF4y2BabgydF4y2Ba-gydF4y2BadgydF4y2Ba， JA、AUX和SL反应基因的相对表达量gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba12 dpi感染TSWV的植株。数据以均值±s.e.m.表示;N = 3个生物独立的样本。gydF4y2BaegydF4y2Ba，中茉莉酸(JA)、吲哚-3-乙酸(IAA)和5-脱氧三甘醇(5-DS)含量gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba12 dpi感染TSWV的植株。的gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba以接种1×PBS缓冲液的植株为Mock。数据以平均值±s.e.m.表示;N = 3个生物独立的样本。gydF4y2BafgydF4y2Ba,转基因gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba通过RT-PCR筛选表达NSs(1 ~ 8)的株系。野生型(WT)和NSs转基因系2号和系3号的表型gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba植物显示在底部。gydF4y2BaggydF4y2Ba转NSs基因的植物对茉莉酸甲酯(MeJA)诱导的根系生长抑制的敏感性低于野生型植物。用MeJA处理NSs转基因株系#2(左)和#3(右)。这张照片是MeJA治疗后21天拍摄的。比例尺，1厘米。gydF4y2BahgydF4y2Ba，转基因WT和NSs中代表性JA反应基因的相对表达量gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba植物在0或100 μ M MeJA存在。数据以平均值±s.e.m.表示;N = 3个生物独立的样本。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，蓟马对WT和NSs转基因植物吸引的实验设计说明。NSs转基因植物被放置在一个孤立的盒子中，彼此交叉的两个角(i和iii)， WT植物被放置在另外两个角(ii和iv)。没有携带TSWV的西部蓟马被放置在盒子中央的培养皿中。在指定时间后，统计被WT和NSs转基因植物吸引的蓟马数量，如图所示。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba．gydF4y2BajgydF4y2BaNSs转基因植物对生长素类似物2,4- d诱导的根系生长抑制的敏感性低于野生型植物。照片拍摄于2,4- d处理后14天。比例尺，1厘米。gydF4y2BakgydF4y2Ba、添加或不添加1 μM rac-GR24的7日龄WT和NSs转基因拟南芥植株的初生根长度。数据以平均值±s.e.m表示;N = 12株。资料载于(gydF4y2BaB-e h和kgydF4y2Ba)，由双面学生分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及;gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值如图所示。实验重复了至少三次，得到了类似的结果。gydF4y2Ba
图3 NSs与AtCOI1、AtTIR1、AtMAX2或Tsw-PRL的相互作用gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba免疫共沉淀(Co-IP)分析NSs与AtCOI1/AtTIR1/AtMAX2相互作用。采用YFP-AtCOI1、YFP-AtTIR1和YFP-AtMAX2对NSs-FLAG进行Co-IPgydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba工厂。YFP作为对照。上方箭头为YFP-AtCOI1、YFP-AtTIR1和YFP-AtMAX2蛋白的条带;下箭头表示YFP蛋白的条带。用YFP和FLAG特异性抗体检测印迹。采用Ponceau S染色法评估样品装载量。gydF4y2BabgydF4y2Ba， NSs与AtCOI1/AtTIR1/AtMAX2相互作用的SLC分析gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba．clc - atcoi1、clc - attir1、clc - atmax2或cLUC控制向量与nLUC- nss或nLUC控制向量共表达gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物的叶子。在48 hpi检测荧光素酶活性。gydF4y2BacgydF4y2Ba， NSs与AtCOI1/AtTIR1/AtMAX2或Tsw-PRL相互作用的BiFC分析gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba．nYFP- atcoi1、nYFP- attir1、nYFP- atmax2、nYFP- tsw - prl或nYFP控制向量与cYFP- nss或cYFP控制向量共表达gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物的叶子。用共聚焦显微镜检查重建的YFP荧光信号，并在48 hpi下拍照。比例尺，50µm。gydF4y2BadgydF4y2Ba， NSs与核内AtCOI1/AtTIR1/AtMAX2相互作用。cYFP-NSs与nYFP-AtCOI1、nYFP-AtTIR1或nYFP-AtMAX2与核标记H2B-mCherry共表达gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物的叶子。白色箭头表示NSs、AtCOI1/AtTIR1/AtMAX2和H2B在细胞核中的共定位。比例尺，50µm。gydF4y2BaegydF4y2Ba， NSs与Tsw-PRL相互作用的Co-IP分析gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba．YFP-Tsw-PRL用于Co-IP NSs-FLAGgydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba工厂。YFP作为对照。用YFP和FLAG特异性抗体检测印迹。Ponceau S染色用于估计样品装载量。gydF4y2BafgydF4y2Ba、NSs与Tsw-PRL相互作用的SLC分析gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba．clc - tsw - prl或cLUC控制向量与nLUC- nss或nLUC控制向量共表达gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物的叶子。在48 hpi检测荧光素酶活性。gydF4y2BaggydF4y2BaNSs与AtCOI1、AtTIR1、AtMAX2或Tsw-PRL相互作用的Y2H分析。以含有DNA结合域(BD)的pGBKT7空载体和含有激活域(AD)的pGADT7空载体作为阴性对照。以BD-NSs和AD-NSs作为阳性对照。将与BD和AD衍生物共同转化的酵母分别在SD/-L-T(左)和SD/-L-T- h - a(右)脱落培养基上进行电泳和分析。实验重复了至少三次，得到了类似的结果。gydF4y2Ba
扩展数据图4酵母双杂交筛选发现AtTCP21是NSs、AtCOI1、AtTIR1、AtMAX2和Tsw-PRL的共同交互子。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba全长AtTCP7和AtTCP14与酵母中NSs的相互作用。AD, pGADT7向量。BD, pGBKT7向量。与BD和AD衍生物共同转化的酵母分别被置于SD/-L-T(左)和SD/-L-T- h - a(右)脱液培养基上。gydF4y2BabgydF4y2Ba以NSs为诱饵筛选Y2H文库时，发现AtTCP7和AtTCP14的数量和频率。gydF4y2BacgydF4y2Ba， NSs与24个TCP家族成员相互作用的Y2H分析。24个TCP家族成员的全长编码序列gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba将植物构建成AD载体，并与BD- nss或BD控制载体共同转化酵母，在SD/-L-T和SD/-L-T- h - a脱落培养基上观察其生长和相互作用。gydF4y2BadgydF4y2Ba， 24个TCP家族成员的系统发育树分析gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．系统发育树采用MEGA 7.0的邻居连接方法构建，分支上显示了bootstrap值(1000个重复)。gydF4y2BaegydF4y2BaY2H分析显示AtTCP7/14/17/21与AtCOI1/AtTIR1/AtMAX2或AtTCP7/14/17/21与NSs之间直接相互作用。SD/-L-T脱液介质的结果如图所示，SD/-L-T- h - a脱液介质的结果如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．gydF4y2BafgydF4y2Ba在酵母中测试了BD-AtCOI1、BD- f -box (AtCOI1)、BD- lrr (AtCOI1)或BD载体控制与AD- attcp21或AD载体控制的相互作用。gydF4y2BaggydF4y2Ba在酵母中测试了AD- attcp21、AD- attcp21(1-103)、AD- attcp21(104-240)、AD- attcp21(30-103)、AD- attcp21(30-136)、AD- attcp21(137-240)或AD载体控制与BD- atcoi1或BD载体控制的相互作用。atcp21的截断突变体示意图如图所示。gydF4y2BahgydF4y2Ba， NSs与AtTCP21相互作用的SLC分析gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba．clc - attcp21或cLUC与nLUC- nss或nLUC共表达gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物的叶子。在48 hpi检测荧光素酶活性。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba， Y2H分析AtTCP21与不同蛋白LRR结构域的相互作用。在酵母中测试BD- fbl6 - lrr、BD- fbl17 - lrr、BD- rpm1 - lrr、BD- hrt - lrr、BD- fls2 - lrr、BD- efr - lrr或BD载体控制与AD- attcp21或AD载体控制的相互作用。AD, pGADT7向量。BD, pGBKT7向量。FBL6和FBL17是两个F-box家族蛋白;RPM1和HRT是两个cc - nlr;FLS2和EFR是两个prr。将与BD和AD衍生物共转化的酵母分别在合成的双缺失培养基-Leu-Trp (SD/-L-T)和合成的四缺失培养基-Leu-Trp- his - ade (SD/-L-T- h - a)上进行电泳和检测。gydF4y2Ba
图5 TCP21对JA、AUX、SL反应基因表达的影响以及COI1/TIR1/MAX2与JAZ1/IAA8/SMXL6的相互作用。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，转基因的产生gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Baoverexpressing TCP21。利用HA特异性抗体(Top) Western blot分析了14株独立的TCP21转基因株系TCP21的积累。采用Ponceau S染色法评估样品装载量。转基因的表型gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba下图为8周龄时拍摄的过度表达TCP21-3×HA。左下为WT植物;中下、右下为TCP21转基因gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba第6和11行。gydF4y2BabgydF4y2Ba、WT和JA代表性反应基因的相对表达量gydF4y2BaAtTCP21gydF4y2Ba转基因gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba植物在0或100 μ M MeJA存在。数据以平均值±s.e.m表示;N = 3个生物独立的样本。gydF4y2BacgydF4y2Ba，表型gydF4y2Batcp7/21gydF4y2Ba突变和WT拟南芥植物。gydF4y2BadgydF4y2Ba-gydF4y2BafgydF4y2Ba中JA (d)、AUX (e)和SL (f)反应基因的相对表达量gydF4y2Batcp7/21gydF4y2Ba突变体。数据以平均值±s.e.m表示;N = 3个生物独立的样本。gydF4y2BaggydF4y2BaAtCOI1/AtTIR1/AtMAX2与AtJAZ1/AtIAA8/AtSMXL6之间的相互作用降低。实验示意图见左上角。nLUC-A和clc - b的共表达产生荧光素酶活性(用雷声表示)。A代表AtCOI1、AtTIR1或AtMAX2蛋白。B代表AtJAZ1、AtIAA8或AtSMXL6蛋白。用nLUC-AtCOI1和clc - atjaz1, nLUC-AtTIR1和clc - atiaa8，或nLUC-AtMAX2和clc - atsmxl6与AtTCP21或pCambia2300S空载体(EV)共表达gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物叶子(左下)。分别携带这些结构的农杆菌的浓度用于ODgydF4y2Ba600gydF4y2Ba= 1.0。荧光素酶活性在48 hpi下测定。处理叶片中的荧光素酶活性(集成光密度，IOD)被量化并显示在右下角。数据以平均值±s.e.m表示;N = 3个生物独立的样本。gydF4y2BahgydF4y2Ba， Western blot分析叶片中nLUC-AtCOI1和clc - atjaz1, nLUC-AtTIR1和clc - atiaa8gydF4y2BaggydF4y2Ba使用LUC和FLAG特异性抗体。由于cLUC-AtSMXL6的蛋白水平低于检测，所以这里不包括nLUC-AtMAX2和cLUC-AtSMXL6的分析数据。黑色、蓝色、灰色和棕色箭头分别为nLUC-AtCOI1、clc - atjaz1、nLUC-AtTIR1和clc - atiaa8蛋白的条带。采用Ponceau S染色法评估样品装载量。gydF4y2Ba我gydF4y2BaNbTCP21与NbCOI1、NbTIR1、NbMAX2、Tsw-PRL或NSs相互作用的Y2H分析。在酵母中检测AD-NbTCP21-1和AD-NbTCP21-2与BD-NbCOI1、BD-NbTIR1、BD-NbMAX2、BD-Tsw-PRL和BD-NSs的相互作用。资料载于(gydF4y2Bab, dgydF4y2Ba)，由双面学生分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及;gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值如图所示。实验重复了至少三次，得到了类似的结果。gydF4y2Ba
NSs增强了COI1/TIR1/MAX2受体/受体伴侣与TCP21的相互作用，并阻止JAZ1/IAA8/SMXL6转录抑制因子的降解。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba, NSsgydF4y2BaY30AgydF4y2Ba缺乏RNA沉默抑制活性能诱导HR细胞死亡gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba共表达Tsw的植物叶片。野生型NSs, NSsgydF4y2BaY30AgydF4y2Ba在16c转基因中，pCambia2300S空载体(EV)与GFP共表达gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物叶片和RNA沉默抑制活性的测定(上)。在手持紫外灯5 dpi下检测eGFP荧光。WT NSs, NSsgydF4y2BaY30AgydF4y2Ba在WT中，EV也与Tsw共表达gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba对植物叶片进行HR诱导活性测定(下)。在5 dpi处拍摄HR表型。gydF4y2BabgydF4y2Ba, NSsgydF4y2BaY30AgydF4y2Ba增强了AtCOI1/AtTIR1/AtMAX2与SLC检测的TCP21之间的相互作用gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba．在半片叶子上gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba在EV对照下，在植物的另外半叶中，与clc - tcp21共表达nLUC-AtCOI1、nLUC-AtTIR1或nLUC-MAX2gydF4y2Ban benthamianagydF4y2BaNSs存在时，nLUC-AtCOI1、nLUC-AtTIR1或nLUC-MAX2与clc - tcp21共表达。在48 hpi下测定并拍摄荧光素酶活性。gydF4y2BacgydF4y2Ba, NSsgydF4y2BaY30AgydF4y2Ba在冠状碱(COR)存在的情况下稳定AtCOI1和AtTCP21之间的相互作用gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba．实验设计原理图如图所示。nLUC-AtCOI1与clc - tcp21在DMSO、0.1µM COR、DMSO + NSs和0.1µM COR + NSs存在的植物叶片中共表达gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba．荧光素酶信号在48 hpi(中)进行检测和拍照。每种处理的荧光素酶活性的定量显示在右侧。数据以平均值±s.e.m表示;N = 3个生物独立的样本。小写字母a-d代表统计上不同的组(Tukey检验的单向方差分析，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05);确切的gydF4y2BaPgydF4y2Ba大于0.0001的值显示在源数据中。gydF4y2BadgydF4y2Ba， AtTCP21与NSs的联合作用gydF4y2BaY30AgydF4y2BaSLC分析AtCOI1/AtTIR1与AtJAZ1/AtIAA8相互作用gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba．nLUC-AtCOI1 (ODgydF4y2Ba600gydF4y2Ba= 1.0)， clc - atjaz1 (ODgydF4y2Ba600gydF4y2Ba= 1.0)和AtTCP21 (ODgydF4y2Ba600gydF4y2Ba= 0.1)或nlu - attir1 (OD .gydF4y2Ba600gydF4y2Ba= 1.0)， clc - atiaa8 (ODgydF4y2Ba600gydF4y2Ba= 1.0)和AtTCP21 (ODgydF4y2Ba600gydF4y2Ba= 0.1)与NSs共表达gydF4y2BaY30AgydF4y2Ba(ODgydF4y2Ba600gydF4y2Ba= 1.0)或pCambia2300S空向量(EV;ODgydF4y2Ba600gydF4y2Ba= 1.0) ingydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物的叶子。在48 hpi下测定叶片荧光素酶活性。荧光素酶活性被量化并显示在每个处理的右侧。数据以平均值±s.e.m表示;N = 3个生物独立的样本。数据由双面Student 's进行分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及;确切的gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值如图所示。gydF4y2BaegydF4y2Ba，在TCP21缺失的情况下，NSs不能增强AtCOI1(左)/AtTIR1(中)/AtMAX2(右)受体/受体伴侣与AtJAZ1/AtIAA8/AtSMXL6转录抑制子的相互作用。用纯化的HIS-FLAG-AtCOI1/HIS-FLAG-AtTIR1 /HIS-FLAG-AtMAX2 (FLAG-AtCOI1/FLAG-AtTIR1/FLAG-AtMAX2)在0.1µM COR、0.1µM 2,4- d或等效DMSO下拉纯化的HIS-MBP-AtJAZ1/HIS-MBP-AtIAA8/HIS-FLAG-AtSMXL6 (MBP-AtJAZ1/MBP-AtIAA8/FLAG-AtSMXL6)。不断增加HIS-NSs (NSs)的加入量。加GST或HIS-YFP (YFP)作为对照。用MBP、FLAG、NSs、GST和YFP特异性抗体检测印迹。将第一条通道下拉的HIS-MBP-JAZ1、HIS-MBP-IAA8或HIS-FLAG-AtSMXL6的能带强度设为1，量化其他通道的抑制因子退化情况。箭头为HIS-MBP-AtJAZ1蛋白条带(≈68 kDa)。gydF4y2BafgydF4y2BaTSWV NSs对转录抑制因子NbJAZ1(左)、NbIAA8(中)和NbSMXL6(右)降解的抑制作用gydF4y2BaNbTCP21-1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNbTCP21-2gydF4y2Ba（gydF4y2BaNbTCP21-1/2gydF4y2Ba)沉默gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物。NSs瞬时过表达gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物叶子沉默了gydF4y2BaNbTCP21-1/2gydF4y2Ba或者和gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba通过农业渗透控制植物叶片。在0.1µM COR、0.1µM 2,4 - d或0.1µM rac-GR24存在下，将每个处理的渗透叶片的蛋白提取物与纯化的HIS-MBP-NbJAZ1、HIS-MBP-NbIAA8或HIS-NbSMXL6蛋白混合，并测定其含量gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba在24℃下降解0-60分钟。用HIS特异性单克隆抗体检测印迹。将0 min时阻遏蛋白的数量设为1，量化其他通道阻遏蛋白的降解情况。实验重复了至少三次，得到了类似的结果。gydF4y2Ba
图7 JA/AUX/SL植物激素过表达或敲除/剔除的影响gydF4y2BaTCP21gydF4y2Ba的TSWV积累gydF4y2Ba烟草benthamianagydF4y2Ba胡椒和gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba植物的叶子。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， tswv接种表型gydF4y2Ban benthamianagydF4y2BaDMSO、MeJA、2,4- d或rac-GR24处理的植物。gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba分别喷洒DMSO、100µM MeJA、100µM 2,4- d和100µM rac-GR24。处理3 d后，将TSWV感染组织的新鲜汁液机械接种到激素处理过的叶片上。接种tswv后9 d，观察植株表型。gydF4y2BabgydF4y2Ba，分析了TSWV在全身性侵染叶片中的积累gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba分别用DMSO、MeJA、2,4- d和rac-GR24处理的植株，用TSWV N特异性抗体进行Western blot。Ponceau S染色用于估计样品负载。gydF4y2BacgydF4y2Ba，接种tswv的辣椒植株表型(-gydF4y2Ba天水围gydF4y2Ba)用DMSO、MeJA、2,4- d或rac-GR24处理。gydF4y2BaC.束状年gydF4y2Ba(-gydF4y2Ba天水围gydF4y2Ba)分别喷涂DMSO、100µM MeJA、100µM 2,4- d和100µM rac-GR24。处理3 d后，将TSWV感染组织的新鲜汁液机械接种到激素处理过的叶片上。接种tswv的植株在接种6 d后进行表型观察。gydF4y2BadgydF4y2Ba分析了TSWV在辣椒植株系统侵染叶中的积累情况gydF4y2Ba天水围gydF4y2Ba)分别用DMSO、MeJA、2,4- d和rac-GR24处理6 dpi，用TSWV N特异性抗体进行Western blot。肌动蛋白的免疫印迹分析用于估计样品的负载。**gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01;n，没有意义。数据由双面Student 's进行分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及;确切的gydF4y2BaPgydF4y2Ba值显示在源数据中。gydF4y2BaegydF4y2Ba野生型(WT)和TSWV感染表型gydF4y2BaAtTCP21gydF4y2Ba转基因拟南芥植物。感染植株的照片在10dpi下拍摄。gydF4y2BafgydF4y2Ba， WT和TSWV感染表型gydF4y2Batcp7/21gydF4y2Ba突变体gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba植物。感染植株的照片在12 dpi时拍摄。gydF4y2BaggydF4y2Ba，静音gydF4y2BaTCP21gydF4y2Ba在胡椒植物中(-gydF4y2Ba天水围gydF4y2Ba)增强对TSWV的抗性。将catcp21 - 1,3,4,7的cDNA片段分别融合200 bp (TRV-Ca . 7)gydF4y2BaTCP21-1/3/4/7gydF4y2Ba)被用来感染gydF4y2BaC.束状年gydF4y2Ba(-gydF4y2Ba天水围gydF4y2Ba)．接种tswv的表型gydF4y2BaC.束状年gydF4y2BaCa消音gydF4y2BaTCP21-1/3/4/7gydF4y2Ba以7 dpi拍摄(左)。TSWV在全身性侵染叶片中的积累gydF4y2BaC.束状年gydF4y2BaCa消音gydF4y2BaTCP21-1/3/4/7gydF4y2Ba在7 dpi时使用TSWV N特异性抗体进行免疫印迹分析(右)。肌动蛋白的免疫印迹分析用于估计样品负荷。**gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01。数据由双面Student 's进行分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及;确切的gydF4y2BaPgydF4y2Ba值显示在源数据中。gydF4y2BahgydF4y2Ba，表型gydF4y2Ba葡萄孢菌gydF4y2BaWT离体叶片感染病变(左);gydF4y2BaTCP21gydF4y2Ba转基因(中)和gydF4y2Batcp7/21gydF4y2Ba突变体(右)gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba接种48 h后种植叶片。gydF4y2Bab .灰质gydF4y2Ba对叶片病变进行量化，右侧显示。数据以平均值±s.e.m表示;N = 6个生物独立样本。小写字母a-c代表统计上不同的组(Tukey检验的单向方差分析，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05);确切的gydF4y2BaPgydF4y2Ba大于0.0001(调整后)的值显示在源数据中。在盒状图中，中心线代表中位数，盒边分隔上下四分位数，胡须表示最高和最低数据点。实验重复了至少三次，得到了类似的结果。gydF4y2Ba
扩展数据图8 CaTCP21与NSs、CaCOI1、CaTIR1、CaMAX2或Tsw-PRL相互作用的分析gydF4y2Ba
一个gydF4y2BaY2H检测CaTCP21-1 ~ - 7与NSs之间的相互作用。在酵母中测试AD-CaTCP21-1到AD-CaTCP21-7与BD-NSs的相互作用。将与BD和AD衍生物共同转化的酵母分别在SD/-L-T(左)和SD/-L-T- h - a(右)脱落培养基上进行电泳和分析。gydF4y2BabgydF4y2BaNSs-RB和NSs-RB能力测定gydF4y2BaY30AgydF4y2Ba突变体来抑制RNA沉默并诱导gydF4y2Ba天水围gydF4y2Ba-介导HR细胞死亡。野生型NSs, NSs- rb, NSs- rbgydF4y2BaY30AgydF4y2Ba突变体或pCambia2300S空载体(EV)在16c转基因中与GFP共表达gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物叶片和RNA沉默抑制活性的测定(上)。NSs-RB来自抗断TSWV 272分离株。在手持紫外灯5 dpi下检测eGFP荧光。每一个gydF4y2BaNSsgydF4y2Ba构念也与gydF4y2Ba天水围gydF4y2Ba在WTgydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba对植物叶片进行HR诱导活性测定(下)。在5 dpi处拍摄HR表型。gydF4y2BacgydF4y2Ba， CaTCP21-1与WT NSs或NSs- rb相互作用的BiFC分析。cYFP-NSs或cYFP-NSs- rb与nYFP-CaTCP21-1共表达gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba用BiFC对植物叶片进行分析。荧光信号在48 hpi下进行检测和拍照。白色箭头表示BiFC荧光信号。每张图像中的数字是显示蛋白质分布的扫描次数，相当于扫描总数中显示的图像。比例尺，50µm。左边量化各处理的相对荧光信号强度，右边显示。数据以平均值±s.e.m表示;N = 30张来自三个独立实验的独立扫描图。数据由双面Student 's进行分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及;gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值如图所示。gydF4y2BadgydF4y2BaY2H检测CaTCP21-1与CaCOI1、CaTIR1、CaMAX2、Tsw-PRL或NSs之间的相互作用。AD-CaTCP21-1与BD-CaCOI1、BD-CaTIR1、BD-CaMAX2、BD-Tsw-PRL和BD-NSs相互作用。BD pGBKT7;广告;pGADT7。CaTCP21-1与CaCOI1、CaTIR1、CaMAX2、Tsw-PRL或NSs在SD/-L-T脱落介质板上的相互作用结果如图所示，在SD/-L-T- h - a脱落介质板上的相互作用结果如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．gydF4y2BaegydF4y2Ba， CaTCP21-1与CaCOI1、CaTIR1或CaMAX2相互作用的BiFC分析gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba．农杆菌属(ODgydF4y2Ba600gydF4y2Ba= 1)分别携带cYFP- cacoi1、cYFP- catir1、cYFP- camax2或cYFP与农杆菌共表达(ODgydF4y2Ba600gydF4y2Ba= 1)携带nYFP- catcp21 -1或nYFPgydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物的叶子。用共聚焦显微镜检查重建的YFP荧光信号，并在48 hpi下拍照。比例尺，50µm。gydF4y2BafgydF4y2BanYFP-CaTCP21-1和cYFP-CaCOI1、cYFP-CaTIR1或cYFP-CaMAX2与核标记H2B-mCherry共表达gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物的叶子。白色箭头表示CaTCP21、CaCOI1/CaTIR1/CaMAX2和H2B在细胞核中的共定位。比例尺，50µm。gydF4y2Bag hgydF4y2Ba用纯化的GST-Tsw-PRL下拉纯化的HIS-FLAG-NbTCP21-1 (FLAG-NbTCP21-1)或HIS-FLAG-CaTCP21-1 (FLAG-CaTCP21-1)。用GST和FLAG特异性抗体检测印迹。实验重复了至少三次，得到了类似的结果。gydF4y2Ba
图9 TSWV感染或NSs对CaCO1/CaTIR1/CaMAX2与CaTCP21或Tsw-PRL与CaTCP21相互作用的影响gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba在模拟接种或TSWV感染中，CaTCP21-1与CaCOI1(左上)、CaTIR1(右上)、CaMAX2(左下)或Tsw-PRL(右下)相互作用的BiFC分析gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba工厂。农杆菌(指示ODgydF4y2Ba600gydF4y2Ba分别携带cYFP-CaCOI1、cYFP-CaTIR1、cYFP-CaMAX2或cYFP-Tsw-PRL的农杆菌与携带nYFP-CaTCP21-1的农杆菌共表达(提示ODgydF4y2Ba600gydF4y2Ba)gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba预感染TSWV或3天前接种1×PBS buffer (Mock)的叶片。在Zeiss 710共聚焦显微镜下观察BiFC荧光信号，并于浸润后2天(dpi)拍照。gydF4y2BabgydF4y2Ba在pCambia2300S空载体(EV)、NSs存在下，Tsw-PRL与CaTCP21-1相互作用的BiFC分析gydF4y2BaY30AgydF4y2Ba或NSs-RBgydF4y2BaY30AgydF4y2Ba．gydF4y2BacgydF4y2Ba，在EV或NSs存在时，tsw-PRL与CaTCP21-1相互作用的BiFC分析gydF4y2BaY30AgydF4y2Ba．gydF4y2Bad、egydF4y2BaCaTCP21-1与Tsw-PRL、CaTCP21-1与CaCOI1/CaTIR1相互作用的竞争性分析gydF4y2BaY30AgydF4y2Ba．在pCambia2300S空载体(EV)、Tsw-PRL、Tsw-PRL+EV或Tsw-PRL+NSs存在时，CaTCP21-1与CaCOI1/CaTIR1相互作用的BiFC分析gydF4y2BaY30AgydF4y2Ba在面板上显示gydF4y2BadgydF4y2Ba．EV、CaCOI1、CaCOI1 + EV、CaCOI1 + NSs存在时CaTCP21-1与Tsw-PRL相互作用的BiFC分析gydF4y2BaY30AgydF4y2Ba或EV, CaTIR1, CaTIR1 + EV, CaTIR1 + NSsgydF4y2BaY30AgydF4y2Ba在面板上显示gydF4y2BaegydF4y2Ba．荧光信号在48 hpi下进行检测和拍照。对于a-e，每张图像中的数字是显示蛋白质分布的扫描次数，相当于扫描总数中显示的图像。比例尺，50µm。左边量化各处理的相对荧光信号强度，右边显示。数据以平均值±s.e.m表示;N = 30个独立的扫描。资料载于(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)，由双面学生分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及;gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值如图所示。资料载于(gydF4y2Ba抵扣gydF4y2Ba)采用Tukey检验进行单因素方差分析;小写字母a, b和c代表统计上不同的组(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05);确切的gydF4y2BaPgydF4y2Ba大于0.0001(调整后)的值显示在源数据中。实验重复了三次，得到了相似的结果。gydF4y2Ba
扩展数据图10gydF4y2BaTCP21gydF4y2Ba是Tsw和NSs在gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba工厂和要求gydF4y2Ba天水围gydF4y2Ba-介导辣椒对TSWV感染的抗性。gydF4y2Ba
一个gydF4y2BaCaTCP21-1对Tsw和NSs共表达诱导HR细胞死亡的影响CaTCP21-1 (i)， Tsw (ii)， Tsw+CaTCP21-1 (iii)， Tsw+NSs+EV (iv)或Tsw+NSs+CaTCP21-1 (v)均表示为(co)gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba叶片通过农业渗透。在0-8 dpi监测HR，并在5 dpi时拍照。gydF4y2BabgydF4y2BaCaTCP3和CaTCP17对Tsw和NSs共表达诱导HR细胞死亡的影响数据以平均值±s.e.m表示;N = 6个生物独立样本。gydF4y2BacgydF4y2BaCaTCP21-1对Sw-5b NLR和NSm共表达诱导HR细胞死亡的影响在5 dpi处拍摄HR表型。在2 dpi时测量渗透叶片的离子泄漏量，如图所示。数据以平均值±s.e.m表示;N = 6个生物独立样本。gydF4y2BadgydF4y2Ba， trv介导的基因沉默示意图gydF4y2BaNbTCP21gydF4y2Ba在gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba工厂。TRV各携带300 bp cDNA片段gydF4y2BaNbTCP21-1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNbTCP21-2gydF4y2Ba(和-gydF4y2BaNbTCP21-1/2gydF4y2Ba)被用来感染gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba工厂。经TRV处理20 d后，上部新叶沉默gydF4y2BaTCP21gydF4y2Ba与Tsw和NSs共表达gydF4y2BaY30AgydF4y2Ba．从0-8 dpi监测HR的发生。gydF4y2BaegydF4y2Ba的表型gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba用TRV-处理过的植物gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba和和,gydF4y2BaNbTCP21-1/2gydF4y2Ba在20 dpi。gydF4y2BafgydF4y2Ba的相对RNA表达gydF4y2BaNbTCP21-1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNbTCP21-2gydF4y2Ba在gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba用TRV-处理过的植物gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba和和,gydF4y2BaNbTCP21-1/2gydF4y2Ba．数据以平均值±s.e.m表示;N = 3个独立的植物样本。gydF4y2BaggydF4y2Ba， TRV-中NSs与Tsw-PRL相互作用的BiFC分析gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba处理过的对照植物叶片或gydF4y2BaNbTCP21-1/2gydF4y2Ba沉默gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物的叶子。在农业浸润39 h后检测和拍摄BiFC荧光信号。gydF4y2BahgydF4y2Ba，静音gydF4y2BaNbTCP21-1/2gydF4y2Ba对Sw-5b NLR和NSm效应子诱导的HR无影响。Sw-5b和NSm通过农业渗透共表达gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba用TRV-处理过的植物gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba或者和gydF4y2BaNbTCP21-1/2gydF4y2Ba．在5 dpi时监测并拍摄浸润叶片的HR表型。在2 dpi时测量渗透叶片的离子泄漏量，如图所示。数据以平均值±s.e.m表示;N = 6个生物独立样本。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba辣椒“PI152225”表型沉默CagydF4y2BaTCP21-1/3/4/7gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba天水围gydF4y2Ba．携带GUS基因300 bp cDNA片段的TRV (TRV-gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba)， Tsw (TRV-gydF4y2Ba天水围gydF4y2Ba)或融合catcp21 - 1,3,4和7各200 bp的cDNA片段(TRV-Ca . 7)gydF4y2BaTCP21-1/3/4/7gydF4y2Ba)用于感染携带“PI152225”的辣椒gydF4y2Ba天水围gydF4y2Ba．用不同TRV结构处理的辣椒在30 dpi时拍摄表型。和- - - - - -gydF4y2Ba李gydF4y2Ba作为沉默的阳性对照(右)。gydF4y2Baj-lgydF4y2Ba， Ca的相对表达量gydF4y2BaTcp21-1， -3， -4， -7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba天水围gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba李gydF4y2BaTRV-处理后的辣椒基因gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba, TRV-CagydF4y2BaTCP21-1/3/4/7gydF4y2Ba(j)和富-gydF4y2Ba天水围gydF4y2Ba(k)或TRV-gydF4y2Ba李gydF4y2Ba(l).数据以平均值±s.e.m.表示;N = 3个生物独立的样本。资料载于(gydF4y2Bab, cgydF4y2Ba)采用Tukey检验进行单因素方差分析;小写字母a和b代表统计上不同的组(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。资料载于(gydF4y2BaF h j-lgydF4y2Ba)，由双面学生分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BaPgydF4y2Ba(gydF4y2BaB c jgydF4y2Ba)载于源数据;gydF4y2BaPgydF4y2Ba(gydF4y2BaF h k IgydF4y2Ba)见图。的箱形图中(gydF4y2BaB c hgydF4y2Ba)，中心线表示中位数，方框边分隔上下四分位数，胡须表示最高和最低数据点。gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
权利和权限gydF4y2Ba
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引用本文gydF4y2Ba
陈,J。,赵,Y。,罗,X。gydF4y2Baet al。gydF4y2BaNLR监测病原体干扰激素受体诱导免疫。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba(2022)。https://doi.org/10.1038/s41586-022-05529-9gydF4y2Ba
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