调节胰岛素丝氨酸以及脂质代谢开车周围神经病变gydF4y2Ba

探索肥胖和糖尿病如何影响丝氨酸、甘氨酸和一个碳(SGOC)新陈代谢,我们量化丝氨酸、甘氨酸和蛋氨酸在组织建立了小鼠模型的病态肥胖,胰岛素抵抗和高血糖症(缺少瘦素受体的。们注入了gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba老鼠在一个黑色Kaliss背景(noble -gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba))和比较的结果与野生型C57BL / 6 j控制。的gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba老鼠削减约30%的肝和肾丝氨酸水平相对于野生型小鼠(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),和更丰富的甘氨酸池减少30 - 50%在肝脏,肾脏,腹股沟白色脂肪组织(iWAT)和等离子体(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1得了gydF4y2Ba)。蛋氨酸与丝氨酸通过一个碳代谢,也降低了肝脏,iWAT和等离子体(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1 b, cgydF4y2Ba),这表明糖尿病丝氨酸和甘氨酸水平降低组织对葡萄糖和脂质体内平衡很重要。gydF4y2Ba

哺乳动物从饮食,获取丝氨酸从头合成的葡萄糖和通过甘氨酸和一个碳代谢,与肝脏和肾脏作为餐后NEAA新陈代谢(图的主要网站。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。为了更好地理解减少肝丝氨酸和甘氨酸的机械基础gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba老鼠,我们量化后与SGOC代谢相关基因的表达(图6小时快。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)。基因编码关键酶负责丝氨酸和一个碳单元分解代谢或处理显著调节gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba老鼠,包括丝氨酸脱水酶(gydF4y2BaSdsgydF4y2Ba),丝氨酸hydroxymethyltransferase 1 (gydF4y2BaShmt1gydF4y2Ba),gydF4y2BaShmt2gydF4y2Ba和10-formyltetrahydrofolate脱氢酶(gydF4y2BaAldh1l1gydF4y2Ba)。两个基因的表达编码组件的甘氨酸乳沟system-glycine脱羧酶(gydF4y2BaGldcgydF4y2Ba)和dihydrolipoamide脱氢酶(gydF4y2Ba‘gydF4y2Ba)——增加gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba肝脏,而3 -磷酸甘油酸脱氢酶的表达(gydF4y2BaPhgdhgydF4y2Ba)和methylenetetrahydrofolate脱氢酶2 (gydF4y2BaMthfd2gydF4y2Ba)均显著降低,表明新创丝氨酸合成糖尿病小鼠也可能有限。这些结果符合公司从人类糖尿病肝脏代谢造型转录数据gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba。肾脏是另一个中心SGOC新陈代谢gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba和肾脏的表达gydF4y2BaShmt1gydF4y2Ba和一些与一个碳代谢相关基因编码酶增加gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba老鼠(扩展数据图。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

生理和餐后氨基酸和葡萄糖的变化使代谢缺陷的诊断挑战。因此我们假设“丝氨酸耐量试验”(STT)可以更好地评估SGOC代谢在小鼠和识别那些高架丝氨酸处置。应用相似剂量使用在人类临床试验(ClinicalTrials.gov: NCT03062449)(400毫克公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}),我们口头管理丝氨酸overnight-fasted野生型小鼠和量化血浆丝氨酸药物动力学测量丝氨酸间隙的动力学,在大约2 h(回到基线水平扩展数据图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)。识别的主要途径参与丝氨酸处置,我们口头管理[U -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaCgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba)丝氨酸overnight-fasted野生型小鼠和量化下游代谢物的浓缩。我们观察到,葡萄糖被贴上一个类似的程度上为甘氨酸在整个测试(图。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba),(U -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaCgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba]serine-derived碳明显纳入肝甘氨酸丙酮酸和柠檬酸池(无花果。gydF4y2Ba1 e, fgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1 f, ggydF4y2Ba),表明肝醣类是丝氨酸处理在某些情况下的主要途径和链接胰岛素和胰高血糖素的调控,这都是升高的gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba老鼠(扩展数据图。gydF4y2Ba2 a - cgydF4y2Ba)。测试是否胰岛素抵抗影响丝氨酸吸收和处理,我们交付葡萄糖(2 g公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})和丝氨酸(400毫克公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})overnight-fasted野生型gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba老鼠。我们观察到显著减少STT曲线下面积(AUC)gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba老鼠(图。gydF4y2Ba1 g hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba),尽管高剂量服用。值得注意的是,急性丝氨酸挑战对循环的影响基本上没有甘氨酸浓度(扩展数据图。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba),尽管快速互变现象(无花果的证据。gydF4y2Ba1 d, egydF4y2Ba)。相反,没有STT AUC和野生型之间的差异gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba老鼠丝氨酸管理时没有葡萄糖(扩展数据图。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

以确定是否升高丝氨酸处理特定于缺少瘦素受体的。们注入了gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba老鼠或更通常归因于受损的胰岛素信号,我们对C57BL / 6 j小鼠与车辆或链脲霉素(STZ)诱导胰岛素缺乏,高血糖症和脂肪损失(扩展数据图。gydF4y2Ba2胃肠道gydF4y2Ba)。等离子体甘氨酸和支链氨基酸(但不是丝氨酸)改变后一周STZ治疗(扩展数据图。gydF4y2Ba2 jgydF4y2Ba)。两周后注入,合并施打葡萄糖和丝氨酸显示高架丝氨酸处置STZ-diabetic老鼠相对于控件(无花果。gydF4y2Ba1 i, jgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2 kgydF4y2Ba),这表明胰岛素抵抗或缺乏既能有助于降低糖尿病大鼠循环中丝氨酸。gydF4y2Ba

临床研究已经涉及丝氨酸缺乏监管的黄斑疾病和周围神经病变gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba}。考虑到受损的丝氨酸内稳态gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba老鼠,我们下一个确认异常丝氨酸代谢与周围神经病变在这个模型一致。Fourteen-week-oldgydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba老鼠表现出热、触觉痛觉减退以及减少运动神经传导速度(MNCV)(扩展数据图。gydF4y2Ba2 l-ngydF4y2Ba)。这些发现表明,异常的丝氨酸内稳态与糖尿病周围神经病变相关。gydF4y2Ba

丝氨酸和甘氨酸限制被广泛用于调节健康结果在小鼠和相对良好的几个月gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba}。模型的影响缺乏系统性丝氨酸食源性肥胖的上下文中,我们给老鼠喝低脂(10%千卡)(最晚完成日期)或高脂肪(脂肪60%千卡)(HFD)饮食和比较他们的表型白鼠isonitrogenous饮食缺乏丝氨酸和甘氨酸(SG SG HFD最晚完成日期或−−)(补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。−SG饮食有效减少循环和肝丝氨酸和甘氨酸含量在美联储但不是在禁食状态(无花果。gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba)。仅HFD肝脏甘氨酸水平降低,但程度低于膳食丝氨酸和甘氨酸撤军(扩展数据图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。其他丝氨酸和glycine-derived肝代谢产物,包括谷胱甘肽,没有强烈影响的限制(扩展数据图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。值得注意的是,体重增加造成HFD被限制饮食丝氨酸和甘氨酸减毒,而食物,热量和水的摄入量,热量吸收,和体育活动都不受影响(图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3碳氢键gydF4y2Ba)。使用回波磁共振成像(echoMRI),我们量化精益和脂肪质量在所有团体和观察到饮食丝氨酸限制显著降低脂肪质量但没有影响精益质量相对于HFD集团(无花果。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)。与肥胖的变化一致,我们发现HFD喂养增加,而丝氨酸和甘氨酸的限制减少,附睾的白色脂肪细胞大小(扩展数据图。gydF4y2Ba3我gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

如何喂养与−SG HFD影响葡萄糖体内平衡,我们使用标准、腹围和itt分析小鼠。而−SG HFD减肥胖、小鼠血糖和胰岛素不能容忍(图。gydF4y2Ba2 e, fgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3 j, kgydF4y2Ba),这表明丝氨酸和甘氨酸限制的减少肥胖不防止HFD-induced葡萄糖和胰岛素抵抗。测试是否改变了系统性的底物利用碳水化合物,脂类驾驶肥胖倾向的变化,我们把老鼠每18周的饮食消费代谢笼和量化呼吸交换比率(r)。而HFD改变r正如预期的那样,没有观察到改变饮食丝氨酸/甘氨酸限制(扩展数据图。gydF4y2Ba3 lgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

接下来,我们进行了宏基因组分析的粪便微生物群了解上面的饮食影响微生物组成和多样性,这与饮食,可以缓冲不足gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba。持续HFD或−SG HFD喂养降低系统α多样性相对于LFD-fed老鼠,而−SG最小的致命剂量喂食增加α多样性(图。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba)。相反,PERMANOVA测试Aitchison距离稳健主成分分析揭示了重要的beta-diversity−SG HFD-fed老鼠和其他群体之间的差异,突出这个低碳水化合物的不同效果,高脂肪、丝氨酸和glycine-restricted饮食粪便微生物(扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。此外,微生物菌株表达完整的日志比率丝氨酸生物合成和甘氨酸裂解途径是增加和减少,分别由−SG HFD(扩展数据图。gydF4y2Ba4 b, cgydF4y2Ba),这种饮食减少日志的比率菌株表达一个完整的脂肪酸合成途径(图。gydF4y2Ba2 hgydF4y2Ba)。列出关键的菌株表现出最强的改变扩展数据图。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba。值得注意的是,−SG最晚完成日期喂养没有以这种方式调节压力,可能是由于碳水化合物含量越高,这可能促进丝氨酸合成。gydF4y2Ba

接下来,直接调查丝氨酸缺乏如何影响肝脂肪生成,老鼠上述18周的饮食管理重水(DgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}为18 h O),脂质提取同位素浓缩的量化,摩尔丰富和合成gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba。限制饮食丝氨酸和甘氨酸强有力地减少肝大约70%的棕榈酸酯合成相对于serine-replete控制饮食(图。gydF4y2Ba2我gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。肝脏胆固醇合成增加在−SG HFD而HFD(扩展数据图。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)。与这些变化相一致,肝脏atp柠檬酸裂合酶的表达(ac)、乙酰辅酶a羧化酶(ACC2)和stearoyl-CoA desaturase (SCD1)强烈(约50%)减少了饮食丝氨酸限制,而胆固醇生物合成的酶的表达是不变或增加(扩展数据图。gydF4y2Ba5汉英gydF4y2Ba)。一种蛋白激酶磷酸化的变化在Ser473 Thr308与膳食脂肪和碳水化合物含量而不是丝氨酸和甘氨酸的水平,进一步表明,丝氨酸限制驱动器脂肪酸代谢的变化独立于胰岛素信号(扩展数据图。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

缺乏系统性的丝氨酸最近与各种神经退行性疾病gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}。糖尿病患者有高架丝氨酸处理因此可以更容易神经疾病让人想起serine-associated周围神经病变。确定长期、慢性丝氨酸缺乏足以驱动周围神经病变,我们喂老鼠控制或丝氨酸和glycine-free chow饮食(19.2%的能源来自脂肪)长达12个月。热响应的时间量化热透露进展痛觉减退后12个月的膳食干预(扩展数据图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba),与以前的观测一致gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba。在这个时间点我们也发现减少表皮内的神经纤维(IENF)密度爪子皮肤(扩展数据图。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba),它也是一个小感觉纤维变性的临床指标gydF4y2Ba^{29日gydF4y2Ba}。值得注意的是,老鼠−SG HFD仅仅三个月表现出显著的热痛觉减退(图。gydF4y2Ba2 jgydF4y2Ba),表明低系统性丝氨酸和HFD加快老鼠的周围神经病变的发病。gydF4y2Ba

丝氨酸是必不可少的规范化鞘脂类的生物合成,丰富的神经系统。当丝氨酸变得有限,丝氨酸palmitoyltransferase (SPT)包含了其他氨基酸,包括丙氨酸,形成非规范deoxysphingolipidsgydF4y2Ba^{30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba}。鉴于规范天然保湿因子的重要性和1-deoxy(二氢)神经酰胺在肥胖和神经病变,分别gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba},我们假设SPT抑制可能影响肥胖和神经病变表型观察到。因此我们管理myriocin(0.3毫克公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}每隔一天),SPT的抑制剂,或车辆老鼠超过6个月的饮食和量化的鞘脂类多样性和热传感。与先前的报告相一致gydF4y2Ba^32gydF4y2Bamyriocin治疗减毒HFD-induced体重增加不影响血浆丝氨酸和甘氨酸水平(扩展数据图。gydF4y2Ba六氟gydF4y2Ba)然而,myriocin也减轻热痛觉减退,老鼠−SG HFD(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba),这表明减少SPT活动减少serine-associated周围神经病变。gydF4y2Ba

为了更好的理解这个周围神经病变表型的代谢司机,我们下一个量化神经酰胺和deoxydihydroceramides (deoxyDHCer)在肝脏和坐骨神经。限制的丝氨酸和甘氨酸增加deoxyDHCer最晚完成日期和HFD设置和减少规范神经酰胺在HFD背景,而一般myriocin鞘脂类丰度的降低(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6胃肠道gydF4y2Ba)。相比之下,神经酰胺和1-deoxysphingolipid水平不变的或未与周围神经病变表型在坐骨神经,可能由于大量脂质沉积在髓(扩展数据图。gydF4y2Ba6小时,我gydF4y2Ba)。值得注意的是,丝氨酸限制在一个最小的致命剂量的背景没有诱导热痛觉减退后6个月(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba),这表明1-deoxysphingolipid积累本身是不足以推动这一表型和符合最近的报告gydF4y2BaSptlc1gydF4y2Ba^{C133WgydF4y2Ba}小鼠模型gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba。接下来,我们测量IENF密度、角膜神经密度,和组织脂质在一个单独的队列的最晚完成日期的老鼠,HFD, SG HFD或−−SG HFD + myriocin六个月。Myriocin减轻热痛觉减退的发生在老鼠−SG HFD(无花果。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba),这种治疗也保护小神经纤维密度的表皮和角膜(无花果。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7 a、bgydF4y2Ba)在不影响触觉传感或MNCV(扩展数据图。gydF4y2Ba7 c, dgydF4y2Ba),建议早发性表型是特定于小感觉纤维和1-deoxysphingolipids,鞘脂类代谢与其他节点gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba。老鼠−SG HFD展出增加肝1-deoxysphingolipids和鞘磷脂,而myriocin强烈鞘脂类的含量以及降低甘油三酯和diacylglycerides(扩展数据图。gydF4y2Ba7 egydF4y2Ba),进一步突出lipidome这个分子的多效性的影响gydF4y2Ba^{32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba}。最后,爪子在deoxyDHCer皮肤表现出显著增加,减少了myriocin治疗(图。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba),表明脂质微环境周围的小纤维可以影响感官功能。gydF4y2Ba

我们下一个评估抑制SPT活动是否会减轻神经病变gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba老鼠,增加循环deoxySA以及增加肝磷脂质和deoxyDHCer(扩展数据图。gydF4y2Ba8 a、bgydF4y2Ba)。一致的结果在−SG HFD食源性周围神经病变模型,管理myriocin在6周的年龄阻止发展为热痛觉减退和恢复触觉gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba老鼠(扩展数据图。gydF4y2Ba8 c, dgydF4y2Ba)。IENF密度也增加gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba老鼠给了8周myriocin(扩展数据图。gydF4y2Ba8 egydF4y2Ba)。尽管myriocin并不影响身体体重增加,高血糖症或血浆丝氨酸水平(扩展数据图。gydF4y2Ba8 f-hgydF4y2Ba),它强烈减少规范鞘脂类在肝脏但显示有限影响爪子皮肤1-deoxysphingolipids和神经酰胺(扩展数据图。gydF4y2Ba8 i ngydF4y2Ba)。因此,myriocin可能通过直接或间接的行为机制针对肝脏和其他组织,也占了其毒性gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

考虑到糖尿病小鼠慢性缺丝氨酸展出,我们下一个美联储gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba老鼠3% serine-enriched饮食开始在6周的年龄和量化神经病变表型。热感觉测量6、10、14周的年龄和触觉时牺牲,此时老鼠表现出升高血浆和肝丝氨酸,但不甘氨酸水平(无花果。gydF4y2Ba4 a、bgydF4y2Ba)。我们观察到没有改变体重略有增加,循环血糖水平在这个队列(扩展数据图。gydF4y2Ba9 a、bgydF4y2Ba)。然而,热和触觉痛觉减退都减少这serine-enriched饮食的老鼠(无花果。gydF4y2Ba4 c, dgydF4y2Ba)。值得注意的是,没有规范的鞘脂类的变化观察到整个组织,然而1-deoxysphingolipids强劲降低肝脏和爪子皮肤(无花果。gydF4y2Ba4 e, fgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9氟gydF4y2Ba)。总的来说,这些数据表明,补充的丝氨酸能减缓糖尿病周围神经病变的进展。gydF4y2Ba

在这里,我们描述如何直接或间接诱导慢性系统性丝氨酸缺乏改变脂质稳态和有助于糖尿病周围神经病变。调制dyslipidaemia myriocin或1-deoxysphingolipid与丝氨酸生物合成补充减轻热和触觉在肥胖糖尿病小鼠痛觉减退。这些结果强调丝氨酸缺乏如何协同dyslipidaemia改变神经在罕见的疾病表型上下文gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}和间接通过广泛,2型糖尿病等慢性疾病,表现为经历伴随疾病患者的一个子集。减少循环丝氨酸和甘氨酸在糖尿病小鼠可能由通量增加糖质新生,一个碳代谢,肾保留gydF4y2Ba^{18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}和/或处置acylglycinesgydF4y2Ba^37gydF4y2Ba,这也受到dyslipidaemiagydF4y2Ba^38gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

STT,类似于口服葡萄糖耐量试验(OGTT),可以确定病人表现出升高,餐后丝氨酸处理和可能特别容易感觉神经病变。循环正常化丝氨酸含量通过膳食补充延迟感觉神经病变的发生和进展gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba老鼠。事实上,丝氨酸和B族维生素的补充提高周围神经病变在一些临床前模型和各种神经退行性疾病的临床试验的重点gydF4y2Ba^{39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba}(ClinicalTrials.gov: NCT03062449)。我们的研究结果强调生理相关分子丝氨酸和甘氨酸内稳态之间的联系,鞘脂类代谢,糖尿病并发症。代谢和神经性表型糖尿病和肥胖小鼠模型的不同菌株基因型gydF4y2Ba^{42gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba}和C57BL6 / J小鼠代谢特别敏感HFD由于突变的后果gydF4y2Ba例数十分gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba和其他基因。然而,我们的数据在两种糖尿病gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba老鼠和C57BL / 6 j小鼠美联储−SG HFD证明缺丝氨酸结合dyslipidaemia可以驱动不同遗传背景的周围神经病变。gydF4y2Ba

几个关键问题仍然存在,包括为什么丝氨酸和甘氨酸不足会抑制肝脏中肝脂肪酸合成和基因表达。此外,多元化的鞘脂类物种和/或他们的mis-localization导致神经病变gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba,gydF4y2Ba47gydF4y2Ba,gydF4y2Ba48gydF4y2Ba}毒性,但其确切机制尚不清楚。我们开发和验证的膳食模式serine-associated感觉神经病变发展三个月的表型,这可能有助于了解神经毒性dyslipidaemia可以管理。不同的基因改变可能会影响循环丝氨酸和甘氨酸,包括常见的单核苷酸多态性和罕见的编码事件gydF4y2Ba^{25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba}引起的,或者这样的缺陷可以diabetes-induced重新在肝脏代谢。因此,改变鞘脂类的多样性和损害肝脏处理营养脂质过载的能力,缺乏系统性的丝氨酸作为修饰符出现的年龄,糖尿病危害神经病变。gydF4y2Ba

老鼠实验gydF4y2Ba

所有老鼠实验被批准,按照制度进行动物保健和使用委员会(IACUC)的加州大学圣迭戈索尔克生物研究所。老鼠住在同一个房间里确保暴露在相同的温度(21°C),湿度(环境湿度65%)和一个12 h:黑暗周期(06:00-18:00)。在无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,14 - 16-week-old C57BL / 6 j (JAX 000664)或商品gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba老鼠(JAX 000642), 10 - 12个月大的车辆,或者STZ-treated C57BL / 6 j (JAX 000664)小鼠禁食6小时前组织收集。动物与异氟烷麻醉,斩首,组织迅速收集使用Wollenberger夹pre-cooled液氮的温度和储存在−80°C到分析。无花果。gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba,8-week-old C57BL / 6 j (JAX 000664)与饮食从Envigo获得美联储。膳食补充表中详细列出成分gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。之间在饮食实验中,组织收集07:00-10:00 h,除非另有规定在美联储状态。从一个单独的群体的动物,血浆样本收集18周后膳食干预美联储(07:00-10:00 h)和禁食(18-h隔夜快)状态。在gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba小鼠实验,组织收集后6小时禁食。无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,8-week-old C57BL / 6 j (JAX 000664)与饮食从Envigo获得美联储。组织收集07:00-10:00 h之间发生。动物与异氟烷麻醉,斩首,组织迅速收集使用Wollenberger夹pre-cooled液氮的温度和储存在−80°C到分析。无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,6人,gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba老鼠(JAX 000642)控制或喂食serine-supplemented饮食(Envigo提供的)一段8周。组织收集发生在07:00-10:00 h除非另有规定。动物与异氟烷麻醉,斩首,迅速组织收集使用Wollenberger夹pre-cooled液氮的温度和储存在−80°C到分析。gydF4y2Ba

丝氨酸耐量试验gydF4y2Ba

年龄14 - 16-week-old野生型和商品gydF4y2Badb / dbgydF4y2Ba,10 - 12个月车辆和STZ-treated C57BL / 6 j (JAX 000664)小鼠禁食隔夜水随意提供访问。STT,动物的体重,和丝氨酸和/或葡萄糖通过口服接种剂量400毫克公斤填喂法gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}和2 g公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}分别用尾巴尖血液样本收集到EDTA-coated microvette管(Sarstedt)之前,和15、30、60、120和180分钟后口服填喂法。EDTA microvettes旋转2000gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 5分钟获得等离子体,和样品储存在−80°C到分析。血糖浓度和丝氨酸量化使用轮廓下glucometer(拜耳)、气相色谱-光谱法如下所述。血浆丝氨酸药物动力学测定为400毫克公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}剂量使用PK解算器gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

资格下游丝氨酸的命运,野生型小鼠禁食过夜,早上称重,[U -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaCgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba)丝氨酸管理通过口服剂量400毫克公斤填喂法gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba},组织收集、使用Wollenberger夹pre-cooled液氮的温度,前,和15、30、45、60岁和120分钟后口服填喂法,样本存储在−80°C到分析。gydF4y2Ba

血清胰岛素和胰高血糖素的测量gydF4y2Ba

商用工具被用来确定血清胰岛素(鼠标胰岛素ELISA 10-1247-01, Mercodia)和胰高糖素(胰高糖素ELISA 10-1271-01, Mercodia)后6小时快速在老鼠根据制造商的指示。gydF4y2Ba

脂肪生成DgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}O实验gydF4y2Ba

C57BL / 6 j小鼠喂食18周的饮食是腹腔内注射DgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}O(0.9%氯化钠)的剂量的0.027 ml / g体重饮用水取代6% DgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}一段~ 18 h O-enriched解决方案。早上(07:00-10:00 h)组织迅速收集使用Wollenberger夹pre-cooled液氮的温度和储存在−80°C到分析。gydF4y2Ba

血浆DgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}O浓缩决心使用deuterium-acetone交换协议(如前所述)gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba。总之,5µl等离子体与4µl孵化5%的乙腈溶液中丙酮和4µl 10 M氢氧化钠24 h。接下来,500毫克的钠gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba添加了600µl氯仿,vortex-mixed样品。2分钟后离心,享年3000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba80µl一式三份被转送到气相色谱分析-质谱法(gc - ms)瓶,和血浆DgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}O浓缩量化从外部标准曲线在一个安捷伦DB-35MS列(30 m×0.25毫米内直径×0.25μm,安捷伦J&W科学)安装在一个安捷伦7890 A气相色谱仪(GC)界面的安捷伦5975 C质谱仪以下温度程序:60°C初始,增加20°C mingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}到100°C,增加50°C分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}到220°C,保持1分钟。gydF4y2Ba

量化组织维gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}标签阿~ 20毫克的冰冻组织均质与250年µl−20°C甲醇,250µl冰冷的生理盐水和500µl−20°C氯仿与内部标准palmitate-d飙升gydF4y2Ba_{31日gydF4y2Ba}(剑桥同位素实验室,dlm - 215 - pk)和coprostanol(σ,7578)。5分钟后在4°C 21000旋转gydF4y2BaggydF4y2Ba、氯仿部分收集干,resuspended 500µl 2% HgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba在甲醇为2 h 50°C。接下来,100年µl饱和氯化钠和500µl己烷添加,vortex-mixed样品,和上己烷阶段收集和转移到真空瓶。脂肪酸甲酯分析使用一个选择名气列(100×0.25毫米内直径)安装在一个安捷伦7890 a GC界面的安捷伦5975 C使用以下温度程序女士:80°C的初始,增加20°C mingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}到170°C,增加1°C分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}204°C,那么20°C mingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}到250°C和坚持10分钟。isotopologue百分比分配每个脂肪酸和极性代谢物是天然丰度确定和纠正使用内部算法改编自前一个报告gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

GTT和ITT公司gydF4y2Ba

GTT和ITT C57BL / 6 j小鼠喂食18周的饮食是禁食一夜之间随意提供用水。早上动物称重和空腹血糖测定使用一个轮廓从尾巴流血glucometer(拜耳)。GTT的动物腹腔注射葡萄糖的丸一剂2 g公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}体重和血糖在15日确定30、60、120和180分钟post-injection。ITT公司,动物腹腔内注射胰岛素(100 IU ml的丸gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}Humulin胰岛素,礼来公司)的剂量0.5 IU公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}15岁,血糖是量化,30、60、90分钟post-injection如前所述gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

身体成分测定和系统性代谢率gydF4y2Ba

精益和脂肪质量测定使用EchoMRI 3-in-1仪器(定量核磁共振(qNMR)成像系统)。综合实验动物监测系统(蛤)(Oxymax,哥伦布仪器)被用来量化系统性代谢率分别住老鼠6天的时期。水,食物,和计算卡路里摄入量分别安置动物在6天当受到蛤。全身耗氧量(签证官gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}(VCO)和二氧化碳gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba})率归一化相应的全身重量,计算r VCO的比率gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}给签证官gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

量热法和热量吸收粪便炸弹gydF4y2Ba

约1克粪便干燥过夜,地面使用杵和臼。样本被重组成粉粒300µl ddHgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}O和体重。球被放在炸弹缸2000毫升ddH包围gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}O(帕尔6100补偿夹克量热计)。燃烧产生的热量是通过水温的变化来衡量的。量热计能量等效,W (Cal°CgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}),计算与标准化的苯甲酸。每个颗粒的最终能量计算如下:gydF4y2Ba

热量吸收被减去总能量计算卡路里摄入量(粪便热量提取)。gydF4y2Ba

微生物分析gydF4y2Ba

DNA提取10 - 30毫克的凳子使用该款PowerFecal DNA隔离设备(12830 - 50)。中提取DNA是量化使用Nanodrop (ThermoFisher科学)。全基因组测序原始数据上传到QiitagydF4y2Ba^53gydF4y2Ba之后,我们默认处理工作流。总之,原始读取适配器过滤使用自动检测的参数在20 fastp版本gydF4y2Ba^54gydF4y2Ba和主机(鼠标)过滤使用minimap2 2.17版gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba。由此产生的序列使用领结2 2.4.2版本保持一致gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba生命之网(WoL)参考数据库gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba通过网络生活的工具箱应用(gydF4y2Bahttps://github.com/qiyunzhu/woltkagydF4y2Ba);这一步中生成的表在属,物种,每基因组,每个基因表。每个基因组分析我们使用了表;α多样性我们移除任何低于1273062序列样本和样本beta-diversity分析我们稀薄相同的值。下游分析QIIME 2 2020.11版gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba。驴全球微生物群的改变,通过信仰的PDα多样性分析gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba和β多样性通过稳健的主成分分析(RPCA)gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba和产生的特徵距离进行评估通过置换多元方差分析(PERMANOVA)gydF4y2Ba^{61年gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

然后,我们设计了一个贝叶斯层次模型的微分丰富将饮食作为固定效应和笼型随机效应。我们作为一个负二项分布模型计算生成过程占overdispersion。由于微生物的稀疏数据,我们也占了零通胀分配每一个微生物的可能性未被注意的分开计数生成过程:gydF4y2Ba

我们写这个模型使用斯坦概率的编程语言gydF4y2Ba^{62年gydF4y2Ba}和适应模型使用捕鸟者(gydF4y2Bahttps://github.com/gibsramen/BIRDMAngydF4y2Ba)。占组合性,我们适合这个模型使用第一个微生物日志表中作为添加剂比例参考和日志褶皱变化转换成集中日志比坐标拟合后。我们使用以下作为目标参数的先验分布:gydF4y2Ba

在这gydF4y2Ba我gydF4y2Ba是样品,gydF4y2BajgydF4y2Ba的功能,gydF4y2BaygydF4y2Ba是微生物计数,gydF4y2BaθgydF4y2Ba非生物的指示为零,gydF4y2BaηgydF4y2Ba是计算的平均特性,gydF4y2BaxgydF4y2Ba协变量,gydF4y2BaβgydF4y2Ba回归系数的估计(log-fold变化),gydF4y2BaπgydF4y2Ba非生物的概率是零,gydF4y2BazgydF4y2Ba是笼中的标识符变量,gydF4y2BaugydF4y2Ba笼子里的随机效应,gydF4y2BaϕgydF4y2Ba是overdispersion参数。为了比较功能变化与应变水平微分丰度比较基因组学相关通路完整性的方法。首先,每个基因组通过MetaCyc评估gydF4y2Ba^{63年gydF4y2Ba}通路完整性,这一比例从0到1,通过映射特征基因反应最后通路。那时每个通路相关的斯皮尔曼等级相关的β微分丰度决定从上面的模型。丝氨酸生物合成、甘氨酸乳沟和脂肪酸合成途径是贝塔显著相关。来验证这些相关性,日志的比例和大量的基因组的完整路径(完整性= 1)与那些没有(完整性< 1)治疗组之间进行评估。gydF4y2Ba

行为分析gydF4y2Ba

热的感觉gydF4y2Ba

小感觉C纤维函数量化的行为反应加热使用热痛觉过敏试验设备(UARD)如前所述gydF4y2Ba^{64年gydF4y2Ba}。总之,仪器表面是热身到30°C,和动物被放置在单个测试室测试前20 - 30分钟。四个独立反应延迟进行测量,最后一式三份的意思是代表每个动物的反应延迟。所有测量都是编码一个观察者不知道动物的治疗组。gydF4y2Ba

触觉gydF4y2Ba

动物被放置在冯·弗雷站和允许适应20 - 30分钟。使用手册•冯•弗雷细丝的范围:2.44,2.83,3.22,3.61,3.84,4.08,4.31,4.56,4.74 (Kare卡尔玛)。测试开始3.84丝和压力是重复五次。如果观察积极回应,下加权序列中的灯丝使用。在消极反应的情况下,上级应用加权灯丝。所有测量都是编码一个观察者不知道动物的治疗组。gydF4y2Ba

神经传导速度gydF4y2Ba

运动神经传导的量化在麻醉小鼠使用EZ麻醉Versaflex系统(布伦特里科学、z - 7150)。总之,轻度麻醉小鼠转移到热垫与通过面罩麻醉维持。两个录音铂电极之间插入动物的第二,第三,第四个脚趾,接地电极到脖子的皮肤。PowerLab刺激了200 mv, 50-µs方波刺激每2 s。附近的刺激电极插入在脚踝跟腱,随后到臀部的切迹,和M波记录。之间的延迟跟腱和切迹是用来计算神经传导速度所描述gydF4y2Ba^{64年gydF4y2Ba}。所有测量都是编码一个观察者不知道动物的治疗组。gydF4y2Ba

角膜共焦成像gydF4y2Ba

角膜神经麻醉小鼠进行量化(使用EZ麻醉Versaflex系统,布伦特里科学、z - 7150)与罗斯托克角膜模块使用视网膜层析x射线摄影机3(海德堡工程)配备Tomocap(海德堡工程,0220 - 001)如前所述gydF4y2Ba^{64年gydF4y2Ba}。总之,轻度麻醉小鼠转移到小动物平台通过面罩麻醉维持。四十顺序统一收集和放大和大小的图像包含sub-basal丛神经的识别。ImageJ软件(ImageJ 1.53 e Java 1.8.0_172)被用来量化角膜神经区域在每个图像,用数据作为像素/形象。所有测量都是编码一个观察者不知道动物和图像的治疗组。gydF4y2Ba

表皮神经支配gydF4y2Ba

量化执行表皮神经支配的爪子pan-neuronal蛋白质PGP9.5由疣状皮肤样本,详细如前所述gydF4y2Ba^{64年gydF4y2Ba}。总之,爪子皮肤样品收集到4%多聚甲醛缓冲(热科学、J19943-K2)。使用anti-PGP9.5抗体进行染色的表皮神经(ProteinTech, 14730 - 1 - ap;1:50 0稀释)。使用40×光学显微镜的放大倍数,PGP9.5-positive概要文件存在于表皮的数量计算,皮肤部分的长度计算,和IENF剖面密度表示为毫米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。所有测量都是编码一个观察者意识到幻灯片的治疗组。gydF4y2Ba

代谢物提取和量化gydF4y2Ba

等离子体极性代谢物提取从3µl等离子体与一个已知数量的上升gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC -和gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN-labelled标准(剑桥同位素实验室、msk - a2 - 1.2)。组织代谢物提取进行了描述gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba。总之,~ 20毫克组织均质2分钟用Precellys珠子500µl−20°C甲醇,400µl冰冷的生理盐水和100µl冰水和上升gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC /gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN极性代谢物标准(剑桥同位素实验室、msk - a2 - 1.2), 20 pmol sphinganine-d7(阿凡提极性脂质,860658),2 pmol deoxysphinganine-d3(阿凡提极性脂质,860474),100年pmolgydF4y2Ba^13gydF4y2BaC-dihydroceramide-d7(阿凡提极性脂质,330726),200 pmol CgydF4y2Ba_15gydF4y2Ba-ceramide-d7(阿凡提极性脂质,860681),10 pmol d18:1-d7 glucosylsphingosine(阿凡提极性脂质,860695),100 pmol d18:1-d7/15:0葡糖神经酰胺(阿凡提极性脂质,330729),100 pmol d18:1-d7/15:0 lactosylceramide(阿凡提极性脂质,330727),200 pmol sphingosine-d7(阿凡提极性脂质,860657),和200 pmol d18:1/18:1-d9鞘磷脂(阿凡提极性脂质,791649)。识别1-deoxydihydroceramides确认通过保留时间的匹配和分析m18:0/24:1 deoxyDHCer(阿凡提极性脂质,860464)和m18:0/16:0 deoxyDHCer(两代情极性脂质,860462)标准,和正常化1-deoxydihydroceramides完成了13 c-dihydroceramide-d7标准。组织匀浆整除50µl被确定使用BCA蛋白质测定蛋白质含量(λ生物技术,G1002)。剩下的匀浆被转移到一个2毫升埃普多夫管和1毫升−20°C氯仿是补充道。样本vortex-mixed 5分钟和旋转下来5分钟4°C,享年15000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba。有机相的收集和2μl甲酸是添加到剩下的极性相re-extracted 1毫升−20°C氯仿。结合有机阶段干和缓冲的颗粒在100年resuspendedμl含100%甲醇,1毫米甲酸铵和0.2%甲酸。数据代表了离子计数规范化职业专用内部标准和组织蛋白质含量,与堆叠情节代表acyl-chain分布。gydF4y2Ba

气相色谱分析-质谱法gydF4y2Ba

量化的极性代谢物衍生化后确定为2% (w / v) methoxyamine盐酸盐(热科学)吡啶(37°C 60分钟)和gydF4y2BaNgydF4y2Ba-tertbutyldimethylsilyl -gydF4y2BaNgydF4y2Ba-methyltrifluoroacetamide (MTBSTFA)为1%gydF4y2Ba叔gydF4y2Ba-butyldimethylchlorosilane (tBDMS) (Regis技术)(30分钟37°C)。极地衍生品,并用gc - ms分析了使用DB-35MS列(30米×0.25毫米内直径×0.25μm,安捷伦J&W科学)安装在一个安捷伦7890 a气相色谱仪界面的安捷伦5975 C质谱仪如前所述gydF4y2Ba^{65年gydF4y2Ba}。血浆葡萄糖浓缩决心使用丙酸酐衍生如前所述gydF4y2Ba^{66年gydF4y2Ba}。天然同位素丰度是纠正使用内部脚本gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

鞘脂类目标量化gydF4y2Ba

鞘脂类代谢产物的定量确定使用三重四极液相色谱-光谱法平台(安捷伦6460)。鞘脂类物种分离C8柱(光谱3μm C8SR 150×3毫米内径,Peeke科学)如前所述gydF4y2Ba^{67年gydF4y2Ba}。流动相是由100% HPLC-grade水含有2毫米甲酸和甲酸铵和0.2%移动B阶段由100%甲醇含0.2%甲酸和甲酸铵1毫米。流量为0.5毫升分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。梯度洗脱程序包括以下资料:0分钟,82% B;3分钟,82% B;4分钟,90% B, 18分钟,99% B;25分钟,99%,27分钟,82% B, 30分钟,82% B列re-equilibration之后每个样本和持续了10分钟。毛细管电压设置为3.5 kV,干燥气体温度为350°C,干燥气体流速是10分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}60 psi,喷雾器的压力。鞘脂类物种进行分析通过选择性反应监测(SRM)从前体转变为产品离子相关的碰撞能量优化和fragmentor电压(补充表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba)。量化的鞘脂类物种使用停在氘标准执行。gydF4y2Ba

高分辨率质/女士极性代谢物gydF4y2Ba

与800年10 - 20毫克的冰冻组织提取µl−20°C 5:3:2乙腈:甲醇:水解决方案与一个已知浓度的戊氨酸峰值内部标准使用Precellys进化均质器(贝尔坦公司技术)gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}。蛋白质提取后,50-µl整除被量化使用BCA蛋白质化验(λ生物技术,G1002),剩下的提取是21000年为10分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C。然后将上清液转移到一个玻璃小瓶,和色谱分离和复合识别执行使用Q Exactive Orbitrap女士击败Flex二进制UHPLC系统(ThermoFisher科学)在iHILIC - (P)经典,150毫米到2.1毫米,5毫米粒子,200 - (Hilicon)列在45°C。使用梯度色谱进行20 mM碳酸铵,pH值调整到9.4与0.1%氢氧化铵(25%)解决方案(流动相)和100%乙腈(流动相B),最小流量为0.2毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。液相色谱梯度从20%到80跑线性B从2到17分钟然后从20到80% B从17到18分钟然后保持在80% B从18到25分钟。gydF4y2Ba

高分辨率质/女士的脂质gydF4y2Ba

肝脏样本提取400年µl−20°C甲醇使用Precellys演化均质器(贝尔坦公司技术)中掺入EquiSPLASH标签标准(两代情极性脂质,330731)和戊氨酸。提取后,50µl整除被量化使用BCA蛋白质蛋白质含量测定(λ生物技术,G1002),和其余提取增加了400µl−20°C氯仿和400µl冰冷的水。涡流5分钟后,样本将在4°C 15000 5分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba,收集有机相。剩余两毫升甲酸被添加到极地阶段是re-extracted 400µl−20°C氯仿,样本vortex-mixed,如上所述。结合有机阶段干和异丙醇的颗粒在100年resuspendedμl。gydF4y2Ba

色谱分离和脂质进行物种鉴定使用Q Exactive orbitrap质谱仪击败Flex二进制UHPLC系统(热科学)配备一个Accucore C30, 150×2.1毫米,2.6µm粒子(热)列在40°C。5毫升的样品注入。色谱法进行使用梯度40:6 0 v / v的水:乙腈与10毫米甲酸铵和0.1%甲酸(流动相)和10:90 v / v乙腈:propan-2-ol 10毫米甲酸铵和0.1%甲酸(流动相B),最小流量为0.2毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。液相色谱梯度从30%到43% B从3 - 8分钟,然后从43%到50% B从8 - 9分钟,然后从9到18分钟50 - 90% B,然后从18-26分钟B 90 - 99%,然后99% B从分钟26 - 30日举行,然后返回30% B进一步在6分钟,4分钟。gydF4y2Ba

脂质分析使用喷雾电压3.2 kV积极模式。尾气流是1任意单位,辅助气体流量2任意单位和鞘气流40任意单位,毛细管温度为325°C。全质谱(扫描范围200 - 2000gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba与10)是用于在70000分辨率gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba自动增益控制和最大注入100毫秒的时间。数据依赖一份(6)模式在17500分辨率与自动增益控制设置为10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba最大使用注射50毫秒的时间。数据分析使用EI-Maven软件和峰值归一化阿凡提EquiSPLASH内部标准。脂质物种特定片段用于识别和量化了在补充表中gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

等离子体sphingoid基地萃取、水解和质分析gydF4y2Ba

等离子体鞘脂类和少量修改加工如前所述gydF4y2Ba^{69年gydF4y2Ba}。总之,50µl等离子体和0.5毫升的甲醇和上升与内部标准,sphinganine-d7, sphingosine-d7 deoxysphinganine-d3(两代情脂质)。样本放置在1 h在37°C的混合机,离心机,享年2800岁gydF4y2BaggydF4y2Ba收集的上清液和酸水解一夜之间在65°C 75µl methanolic盐酸(1 n HCl, 10 m HgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}O在甲醇)。接下来,100年µl 10 M KOH加入中和。625µl氯仿,2 n NH 100µlgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba添加了哦,500µl碱性水,样品vortex-mixed和离心5分钟,享年16000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba。较低的有机相被三次碱性水和空气下干燥。质分析安捷伦6460调质/女士。代谢物分离实现了C18柱(卢娜100×2.1毫米,3µm Phenomenex)。流动相的组成比例的比例甲醇:水和移动B阶段由100%甲醇0.1%甲酸5毫米甲酸铵加入两个移动阶段。持有40%的梯度洗脱程序由B 0.5分钟,线性B / 15分钟提高到100%,并维持了9分钟,其次是re-equilibration 10分钟的初始条件。毛细管电压设置为3.5 kV,干燥气体温度为350°C,干燥气体流速是10分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}60 psi,喷雾器的压力。Sphingoid基地分析SRM的从前体过渡到产品离子碰撞能量优化和fragmentor电压有关gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba。Sphingoid基地被量化的内部标准已知浓度的上升。gydF4y2Ba

丝氨酸脱水酶活力测定gydF4y2Ba

冰冻的肝脏和肾脏样本中提取一个包含50 mM KH的冰冷的缓冲区gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba,1毫米NagydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}EDTA, 1毫米德勤,pH值8.0使用玻璃均质器。最大酶活力测定使用coupled-enzyme反应和乳酸脱氢酶(σ10127230001)的200毫米丝氨酸,NADH 0.25毫米,0.17毫米磷酸吡哆醛和1毫米德勤为3分钟。组织匀浆蛋白量化后来决定用BCA蛋白质化验(λ生物技术,G1002)和最大酶活性表现在国际单位(U)每毫克的蛋白质。gydF4y2Ba

基因表达分析gydF4y2Ba

RNA提取~ 20毫克的肝组织使用Direct-Zol RNA工具包(Direct-Zol RNA Miniprep +工具包,Zymo研究)根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸的合成进行了使用iScript逆转录Supermix为rt - pcr (iScript逆转录Supermix, Bio-Rad)根据制造商的指示使用以下协议:5分钟25°C, 20分钟46°C, 1分钟95°C。PCR反应是使用96孔板在一个应用生物系统公司ViiA 7实时PCR系统使用以下参数:20年代95°C, 40 95°C的周期为1 s, 20年代和60°C。的最后一卷(10µl) PCR SYBR-Green反应包括5µl快速SYBR-Green大师混合(应用生物系统公司),2µl cDNA、1 5µlµM正向和反向引物,和1µl的水。gydF4y2Ba

引物如下使用。18岁前锋:AGTCCCTGCCCTTTGTACACA, 18岁相反:CGATCCGAGGGCCTCACTA;gydF4y2BaAcc1gydF4y2Ba转发:AATGAACGTGCAATCCGATTTG,gydF4y2BaAcc1gydF4y2Ba反向:ACTCCACATTTGCGTAATTGTTG;gydF4y2BaAcc2gydF4y2Ba转发:CGCTCACCAACAGTAAGGTGG,gydF4y2BaAcc2gydF4y2Ba反向:GCTTGGCAGGGAGTTCCTC;gydF4y2Ba中国国际皮革展gydF4y2Ba转发:AATCCTGGCTAAAACCTCGCC,gydF4y2Ba中国国际皮革展gydF4y2Ba反向:GCATAGATGCACACGTAGAACT;肌动蛋白转发:GGCTGTATTCCCTCCATCG,肌动蛋白逆转:CCAGTTGGTAACAATGCCATGT;gydF4y2BaAldh1l1gydF4y2Ba转发:AGCCACCTATGAGGGCATTC,gydF4y2BaAldh1l1gydF4y2Ba反向:TGAGTGTCGAGTTGAAAAACGTC;gydF4y2BaAldh1l2gydF4y2Ba转发:ACCAGCCGGGTTTATTTCAAA,gydF4y2BaAldh1l2gydF4y2Ba反向:ACTCCCACTACTCGGTGGC;gydF4y2BaDgat1gydF4y2Ba转发:CTGATCCTGAGTAATGCAAGGTT,gydF4y2BaDgat1gydF4y2Ba反向:TGGATGCAATAATCACGCATGG;gydF4y2BaDgat2gydF4y2Ba转发:GCGCTACTTCCGAGACTACTT,gydF4y2BaDgat2gydF4y2Ba反向:GGGCCTTATGCCAGGAAACT;gydF4y2BaDhcr7gydF4y2Ba转发:AGGCTGGATCTCAAGGACAAT,gydF4y2BaDhcr7gydF4y2Ba反向:GCCAGACTAGCATGGCCTG;gydF4y2BaDhcr24gydF4y2Ba转发:CTCTGGGTGCGAGTGAAGG,gydF4y2BaDhcr24gydF4y2Ba反向:TTCCCGGACCTGTTTCTGGAT;gydF4y2Ba‘gydF4y2Ba转发:AGCTGGAGTCGTGTGTACC,gydF4y2Ba‘gydF4y2Ba反向:GAACCTATCACTGTCACGTCA;gydF4y2BaFasngydF4y2Ba转发:GGAGGTGGTGATAGCCGGTAT,gydF4y2BaFasngydF4y2Ba反向:TGGGTAATCCATAGAGCCCAG;gydF4y2BaFdft1gydF4y2Ba转发:GTTTGAAGACCCCATAGTTGGTG,gydF4y2BaFdft1gydF4y2Ba反向:CACATCTACGTTCTCTGGCTTAG;gydF4y2BaFdpsgydF4y2Ba转发:GGAGGTCCTAGAGTACAATGCC,gydF4y2BaFdpsgydF4y2Ba反向:AAGCCTGGAGCAGTTCTACAC;gydF4y2BaGgps1gydF4y2Ba转发:TTCACAGGCATTTAATCACTGGC,gydF4y2BaGgps1gydF4y2Ba反向:ACCACGTCGGAGCTTTGAAC;gydF4y2BaGldcgydF4y2Ba转发:CTCCTGCCCAGACACGAT,gydF4y2BaGldcgydF4y2Ba反向:GGGACCGTCTTCTCGATGAG;gydF4y2BaGpat1gydF4y2Ba转发:CTTGGCCGATGTAAACACACC,gydF4y2BaGpat1gydF4y2Ba反向:CTTCCGGCTCATAAGGCTCTC;gydF4y2BaGpat4gydF4y2Ba转发:TCAAAGAAATTCGTCGAAGTGGT,gydF4y2BaGpat4gydF4y2Ba反向:CCTTTCCGGCAAAAGTAGAAGAT;gydF4y2BaHmgcs1gydF4y2Ba转发:AACTGGTGCAGAAATCTCTAGC,gydF4y2BaHmgcs1gydF4y2Ba反向:GGTTGAATAGCTCAGAACTAGCC;gydF4y2BaHmgcrgydF4y2Ba转发:AGCTTGCCCGAATTGTATGTG,gydF4y2BaHmgcrgydF4y2Ba反向:TCTGTTGTGAACCATGTGACTTC;gydF4y2BaLssgydF4y2Ba转发:TCGTGGGGGACCCTATAAAAC,gydF4y2BaLssgydF4y2Ba反向:CGTCCTCCGCTTGATAATAAGTC;gydF4y2BaMthfd1gydF4y2Ba转发:CTCCTGTCCCAAGTGACATTG,gydF4y2BaMthfd1gydF4y2Ba反向:TAGCCTTCGTTTCCCCGTACA;gydF4y2BaMthfd2gydF4y2Ba转发:AGTGCGAAATGAAGCCGTTG,gydF4y2BaMthfd2gydF4y2Ba反向:GACTGGCGGGATTGTCACC;gydF4y2BaMthfd1lgydF4y2Ba转发:GCATGGCCTTACCCTTCAGAT,gydF4y2BaMthfd1lgydF4y2Ba反向:GTACGAGCTTCCCCAGATTGA;gydF4y2BaMthfd2lgydF4y2Ba转发:AAGGACGTTGATGGATTTCACAT,gydF4y2BaMthfd2lgydF4y2Ba反向:GATGATTTCCCAAACGGCACT;gydF4y2BaMthfrgydF4y2Ba转发:AGATGAGGCGCAGAATGGAC,gydF4y2BaMthfrgydF4y2Ba反向:CATCCGGTCAAACCTGGAGAT;gydF4y2Ba地铁gydF4y2Ba转发:TCCTCCTCGGCCTATCTTTATTT,gydF4y2Ba地铁gydF4y2Ba反向:GGTCCGAATGAGACACGCT;gydF4y2BaMvkgydF4y2Ba转发:GGTGTGGTCGGAACTTCCC,gydF4y2BaMvkgydF4y2Ba反向:CCTTGAGCGGGTTGGAGAC;gydF4y2BaMvdgydF4y2Ba转发:ATGGCCTCAGAAAAGCCTCAG,gydF4y2BaMvdgydF4y2Ba反向:TGGTCGTTTTTAGCTGGTCCT;gydF4y2BaPmvkgydF4y2Ba转发:CCTATGGGGCTGTGATACAGA,gydF4y2BaPmvkgydF4y2Ba反向:TCTCCGTGGTTCTCAATGACC;gydF4y2BaPsatgydF4y2Ba转发:CAGTGGAGCGCCAGAATAGAA,gydF4y2BaPsatgydF4y2Ba反向:CCTGTGCCCCTTCAAGGA;gydF4y2BaPsphgydF4y2Ba转发:TGAGTACGCAGGTTTTGATGAG,gydF4y2BaPsphgydF4y2Ba反向:TGAGTACGCAGGTTTTGATGAG;gydF4y2BaPhgdhgydF4y2Ba转发:ATGGCCTTCGCAAATCTGC,gydF4y2BaPhgdhgydF4y2Ba反向:AGTTCAGCTATCAGCTCCTCC;gydF4y2BaScd1gydF4y2Ba转发:TTCTTGCGATACACTCTGGTGC,gydF4y2BaScd2gydF4y2Ba反向:CGGGATTGAATGTTCTTGTCGT;gydF4y2BaScd2gydF4y2Ba转发:GATCTCTGGCGCTTACTCAGC,gydF4y2BaScd2gydF4y2Ba反向:CTCCCCAGTGGTGAGAACTC;gydF4y2BaSdsgydF4y2Ba转发:GAAGACCCCACTTCGTGACAG,gydF4y2BaSdsgydF4y2Ba反向:TCTTGCAGAGATGCCCAATGC;gydF4y2BaShmt1gydF4y2Ba转发:CAGGGCTCTGCTTGATGCAC,gydF4y2BaShmt1gydF4y2Ba反向:CGTAACGCGCTCTTGTCAC;gydF4y2BaShmt2gydF4y2Ba转发:TGGCAAGAGATACTACGGAGG,gydF4y2BaShmt2gydF4y2Ba反向:AGATCCGCTTGACATCAGACA;gydF4y2BaSqlegydF4y2Ba转发:ATAAGAAATGCGGGGATGTCAC,gydF4y2BaSqlegydF4y2Ba反向:ATATCCGAGAAGGCAGCGAAC;gydF4y2BaSrebp1agydF4y2Ba转发:TAGTCCGAAGCCGGGTGGGCGCCGG,gydF4y2BaSrebp1agydF4y2Ba反向:GATGTCGTTCAAAACCGCTGTGTGTC;gydF4y2BaSrebp1cgydF4y2Ba转发:AAGCAAATCACTGAAGGACCTGG,gydF4y2BaSrebp1cgydF4y2Ba反向:AAAGACAAGCTACTCTGGGAG;gydF4y2BaSrebp2gydF4y2Ba转发:GGATCCTCCCAAAGAAGGAG,gydF4y2BaSrebp2gydF4y2Ba反向:TTCCTCAGAACGCCAGACTT;gydF4y2BaTymsgydF4y2Ba转发:GGAAGGGTGTTTTGGAGGAGT,gydF4y2BaTymsgydF4y2Ba反向:GCTGTCCAGAAAATCTCGGGA。gydF4y2Ba

西方墨点法gydF4y2Ba

比较组织蛋白质含量,~ 20毫克组织均质里帕缓冲区中补充了5毫米EDTA溶液(热科学),蛋白酶抑制剂鸡尾酒(完成,罗氏公司)和磷酸酶抑制剂(PhosSTOP,罗氏),和放在冰30分钟。组织溶解产物离心机在13000年gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟4°C,上层清液储存在−80°C。匀浆蛋白质含量是决定使用bicinchoninic酸测定(热科学)。蛋白质样品准备在Laemmli缓冲区(NuPAGE摩门教的样品缓冲,生活技术),并运行一个4 - 15%预制凝胶(Mini-PROTEAN TGX, Bio-Rad) 2 h恒定100 V和转移polyvinylidenedifluoride (PVDF)膜2 h恒定250毫安ice-chilled转移槽。膜被5%的牛奶和孵化一夜之间在4°C主要抗体ac(13390细胞信号,1:1,000)、ACC(3662细胞信号,下),p-AKT Ser473(9271细胞信号,1:1,000)p-AKT Ser308(9275细胞信号,1:1,000),一种蛋白激酶(75692细胞信号,1:1,000)SCD1(2794细胞信号,1:1,000)GAPDH(5174细胞信号,1:4,000)和vinculin(4650细胞信号,1:1,000)。与TBS-T洗涤后,膜被孵化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体(7074细胞信号,1:5,000)1 h与增强化学发光液在室温和孵化(西方发射极耦合逻辑清晰衬底,Bio-Rad) 5分钟。微量化进行了使用图像实验室软件(Bio-Rad)。对于分子量标记的原始扫描,见补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

数据表示为均值±s.e.m。除非另有规定。与棱镜进行统计分析软件(GraphPad棱镜设备上装)使用双面的独立gydF4y2BatgydF4y2Ba以及比较两组、单因子变异数分析与费舍尔的最小显著差事后测试比较两组以上,双向方差分析与费舍尔的最小显著差事后测试比较双重研究设计,和PERMANOVA分析探索RPCA情节。对于所有的测试,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05被认为是显著的。手稿中所有数据点代表个体生物复制。没有统计方法被用来预先确定样本容量。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

进一步研究信息设计是可用的gydF4y2Ba自然投资组合报告总结gydF4y2Ba与这篇文章有关。gydF4y2Ba