摘要gydF4y2Ba
转录增强子元件负责协调基因表达的时间和空间控制，这对发育过程中编程细胞身份至关重要gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．在这里，我们描述了一种新的增强子元素，它对调控的表达很重要gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba在淋巴内皮细胞中。这种进化上保守的增强子与关键的淋巴转录调控因子结合，包括GATA2, FOXC2, NFATC1和PROX1。对增强子进行基因组编辑以去除围绕gata2结合位点的5个核苷酸，导致纯合子突变小鼠因严重的淋巴血管缺陷而围产期死亡。增强子突变小鼠的淋巴内皮细胞表现出淋巴内皮细胞特征基因的表达减少和造血内皮特征基因的表达增加，并获得了生成造血细胞的能力。这些数据不仅揭示了一个重要的转录增强子元素的调节gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba表达与淋巴内皮细胞的身份一致，但也证明淋巴内皮具有出血性能力，通常被抑制gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
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在当前研究过程中产生的数据集和材料可根据合理要求从通讯作者(N.L.H.)处获得。GATA2 ChIP-seq数据已存入欧洲核苷酸档案，编号为登录号gydF4y2BaPRJEB9436gydF4y2Ba．PROX1, FOXC2和NFATC1 ChIP-seq和human LEC和BEC RNA-seq数据已提交到Gene Expression Omnibus (GEO)，注册号为登录号gydF4y2BaGSE129634gydF4y2Ba．小鼠LEC (op9前或op9后)RNA-seq和小鼠LEC和BEC微阵列数据已提交给GEO，注册号为登录号gydF4y2BaGSE184046gydF4y2Ba．用于GSEA的HE和E RNA-seq数据(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)在一项已发表的研究中生成gydF4y2Ba31gydF4y2Ba并从GEO数据库中根据登录号获得gydF4y2BaGSE103813gydF4y2Ba．gydF4y2Ba源数据gydF4y2Ba提供了这篇论文。gydF4y2Ba
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确认gydF4y2Ba
我们感谢南南大学核心动物设施的工作人员在畜牧业和D. Lawrence在初步生物信息学分析方面的协助。这项研究利用了澳大利亚表型组学网络组织病理学和器官病理学服务(墨尔本大学)和南澳大利亚基因组编辑服务(阿德莱德大学)。共聚焦显微镜和流式细胞仪在德盟成像和流式细胞仪设备(UniSA)进行。这项工作得到了NHMRC(1061365和1146706到N.L.H.和H.S.S.)和ARC (DP210103351到N.L.H.)的资助。K.K.和V.P.得到了瓦伦堡奖学金(2017.0144)、Vetenskapsådet (VR-MH-2016-01437)和Kjell和Märta Beijer基金会的支持。P.V.得到了Maddie Riewoldt 's Vision (MRV0017)的奖学金支持。nl.h.获得了ARC未来奖学金(FT130101254)的支持。H.S.S.得到了NHMRC的主要研究奖学金(1023059)和澳大利亚癌症委员会的“战胜癌症项目”的支持，该项目代表其捐助者和南澳大利亚州政府通过卫生部。gydF4y2Ba
作者信息gydF4y2Ba
作者及隶属关系gydF4y2Ba
贡献gydF4y2Ba
j.k.， H.S.S.和N.L.H.构想了这项研究。p.v.， J.K.和A.O.进行造血实验。V.P.和K.K.设计，生产和评估转基因斑马鱼。S.G.P.和P.Q.T.为设计和生成转基因和基因组编辑小鼠提供建议。C.B.分析了小鼠表型。W.M.产生并提供了gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba+/gydF4y2BaGFP-CregydF4y2Ba胚胎。J.K.进行ChIP、ChIP -seq和RNA-seq实验，评估小鼠淋巴表型。J.k, j.t, l.a.m。A.W.S.分析了生物信息学数据。胚胎造血分析方面的建议。J.K.和N.L.H.写了手稿。所有作者编辑并批准了手稿。gydF4y2Ba
相应的作者gydF4y2Ba
道德声明gydF4y2Ba
相互竞争的利益gydF4y2Ba
作者声明没有利益竞争。gydF4y2Ba
同行评审gydF4y2Ba
同行评审信息gydF4y2Ba
自然gydF4y2Ba感谢Hanna Mikkola和其他匿名审稿人对这项工作的同行评审所做的贡献。gydF4y2Ba同行评审报告gydF4y2Ba是可用的。gydF4y2Ba
额外的信息gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba
扩展的数据图形和表格gydF4y2Ba
扩展数据图1gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba−11kb增强子在淋巴内皮细胞中驱动报告基因表达，在瓣膜中高水平表达。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， hLECs中的ChIP显示GATA2, FOXC2, NFATC1和PROX1在PROX1−11 kb增强子和启动子区域结合。数据为独立实验，当n > 2时用均值±SEM表示。gydF4y2BabgydF4y2Ba，用于生成稳定的转基因报告小鼠的结构示意图。gydF4y2BacgydF4y2BaCRISPR-Cas9介导的基因缺失策略gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba−11 kb元素。靶向GATA2结合位点(下划线)的引导RNA序列，导致5 bp缺失。gydF4y2BadgydF4y2Ba， CRISPR-Cas9介导的缺失系列。gydF4y2BaegydF4y2Ba小鼠胚胎的免疫荧光分析gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba−11 kb增强器驱动gydF4y2BalacZgydF4y2Ba记者转基因。E11.5的横切面显示PROX1中检测到β-半乳糖苷酶活性gydF4y2Ba+gydF4y2Ba内皮细胞沿主静脉排列(箭头)。颈静脉区E12.5和E14.5的冠状切面显示淋巴静脉瓣膜(箭头)中有高水平的报告基因活性，而PROX1中没有检测到报告基因表达gydF4y2Ba+gydF4y2BaE14.5肝细胞。gydF4y2BafgydF4y2Ba，转基因小鼠幼崽出生后第4天组织的X-gal染色。β-半乳糖苷酶活性存在于肺、真皮、胸导管和肠系膜淋巴血管。在出生后早期的淋巴管系统中，报告细胞的活性局限于较大的收集血管，而在成年期用全装X-gal染色分析的组织中的淋巴管中未观察到。黑色箭头表示阀门;左侧(LS);右侧(RS)。gydF4y2BaggydF4y2Ba,gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba−11 kb增强子驱动报告基因在静脉和心脏瓣膜中的表达。转基因小鼠胚胎E18.5的横切面显示静脉瓣膜(箭头)、半月瓣膜和房室瓣膜的报告活性。比例尺，100µm (gydF4y2Bae, ggydF4y2Ba)， 200µm (gydF4y2BafgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
扩展数据图2增强子驱动的报告细胞在斑马鱼中的活性。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，受精后5天(dpf)斑马鱼报告线gydF4y2Ba−2.1gydF4y2Bakb prox1agydF4y2Ba和鼠标gydF4y2Ba−11gydF4y2Bakb Prox1gydF4y2Ba增强子元素在面部淋巴内皮(箭头)中驱动绿色荧光蛋白(青色)的表达，包括面部瓣膜(箭头)的重叠表达gydF4y2BaTg(−5.2 lyve1b DsRed2):gydF4y2Banz101gydF4y2Ba或gydF4y2BaTgBAC (prox1a: KalTA4-4xUAS-ADV.E1b TagRFP):gydF4y2Banim5gydF4y2Ba(红色)。gydF4y2BabgydF4y2Ba在5dpf的两种增强子报告系中，内皮GFP信号(青色)局限于面部的淋巴管，表现为缺乏与GFP共表达gydF4y2BaTg (kdr-l ras-cherry):gydF4y2Bas916gydF4y2Ba图示原发头窦静脉内皮(洋红色)。面部非内皮细胞表达的其他区域似乎被这两种增强子异位诱导。gydF4y2BacgydF4y2Ba受精后54小时，面部淋巴细胞开始发芽后，在来自两个静脉龛的淋巴祖细胞中观察到小鼠增强子驱动的GFP(青色)与lyve1b共表达，这两个静脉龛分别是共同的主静脉淋巴血管母细胞(CCV-L，箭头)和初级头窦淋巴血管母细胞(PHS-LP，箭头)。星号表示在基础小灵通中共表达。比例尺，50µm。gydF4y2Ba
图3水肿和淋巴血管缺损在缺失1068 bp或5 bp的突变胚胎中相似gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba−11 kb增强器。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，侧面图显示增强子突变体与野生型窝伴相比颈静脉水肿。gydF4y2BabgydF4y2BaE14.5为突变型和野生型。箭头指示皮下水肿。纯合子E14.5中有17%(6/35)出现水肿gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba−11 kbgydF4y2BaΔ5 /Δ5gydF4y2Ba胚胎和11.7%(7/60)的E14.5杂合子gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba−11 kbgydF4y2Ba+ /Δ5gydF4y2Ba胚胎。gydF4y2BacgydF4y2Ba，与野生型窝伴相比，突变胚在无明显水肿的情况下表现出颈静脉淋巴囊增大和真皮淋巴管扩张(箭头)。gydF4y2BadgydF4y2Ba图中E17.5胚胎对皮肤和肠系膜进行全身免疫染色。gydF4y2Ba2 f, ggydF4y2Ba．显示用于染色的真皮区域。腋窝区域血管充血(箭头)。比例尺，400µm。gydF4y2Ba
扩展数据图4gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba−11 kb增强子控制淋巴内皮细胞Prox1 mRNA水平。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，gydF4y2BaProx1gydF4y2BaE18.5真皮初级LECs和BECs的mRNA水平。数据代表每个基因型的单个窝(5-7个胚胎)，用平均值±SD表示(每窝n = 3个重复)。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba从各基因型胚胎中分离的肝脏中E18.5的mRNA水平。数据以均数±标准差表示，未配对双尾gydF4y2BatgydF4y2Ba测试时不进行多次比较调整。gydF4y2BacgydF4y2BaE14.5的胚胎肝脏切片免疫染色显示PROX1水平无差异(红色)。gydF4y2BadgydF4y2Ba，减少gydF4y2BaProx1gydF4y2BaLECs中的mRNA (*gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.02310)则伴随还原性gydF4y2BaFlt4gydF4y2Ba（*gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.01706)，增加gydF4y2BaCD34gydF4y2Ba表达式(*gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.01705)。数据表示来自三个独立窝儿的LECs的平均表达，用均值±SEM表示。，未配对的双尾gydF4y2BatgydF4y2Ba测试时不进行多次比较调整。gydF4y2BaegydF4y2BaE14.5胚胎冠状切片免疫染色显示，突变胚胎淋巴静脉瓣膜(箭头)中PROX1(品红)、LYVE1(黄色)和VEGFR3(青色)水平较野生型窝伴降低。gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BaRunx1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGata2gydF4y2Ba原发性真皮LECs和BECs在E18.5分离的mRNA水平。数据表示三个独立凋落叶的平均表达，用平均值±SEM表示。＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0101，普通的一方差分析与Dunnett的多重比较(其中误差条不显示n = 2)。比例尺，100µm (gydF4y2Bac、egydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
图5淋巴内皮细胞的转录组分析表明增强子突变LECs的身份向血液内皮细胞的身份转移。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，从E14.5突变型和野生型胚胎分离的LECs的RNA-seq分析中的差异基因表达。所选基因按照野生型的表达水平排序(从高到低，从左到右)，突出显示LEC鉴定(红色)和BEC鉴定(蓝色)的标记。gydF4y2BabgydF4y2Ba热图将E14.5 LEC和BEC RNA的微阵列分析与RNA-seq数据进行比较，显示增强子突变体LECs中上调的基因与BECs中高水平表达的基因相关，反之亦然。绿条表示突变型与野生型中LEC向BEC转变的正相关基因。Fisher精确检验显示微阵列和RNA-seq结果之间的相关性显著，双尾p值< 0.0001。gydF4y2Ba
扩展数据图6删除GATA位点可使PROX1、FOXC2和NFATC1与gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba−11 kb增强器。gydF4y2Ba
一个gydF4y2BaChIP分析显示，当GATA2位点缺失时，从E17.5突变胚胎中分离出的初级LECs与IgG对照相比没有富集。gydF4y2BabgydF4y2Ba，模型提出GATA2作为一个关键因素在gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba−11 kb增强子，促进负责驱动的转录成分的招募gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba在LECs中的表达。gydF4y2BacgydF4y2Ba，相互作用频率的量化gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba−11 kb增强器gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba培养的人LEC中的启动子。染色体构象和捕获(3C)分析的近端区域gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba与BAC对照相比，该基因的锚片段(包含启动子)、片段X(包含增强子)和片段XII的相互作用频率增加。数据以平均值±SD表示，n = 3。引物序列和定量可在源数据扩展数据图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
扩展数据图7颈静脉淋巴囊内的细胞簇gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba增强子突变小鼠表达一系列造血和内皮标志物。gydF4y2Ba
一个gydF4y2BaE14.5突变胚的冠状切片显示，PROX1+ LYVE1+ CD31+VECAD+淋巴内皮细胞成簇出芽的细胞具有异质性，RUNX1、cKIT、CD45、GATA2和CD34均呈不同程度的阳性。在E14.5分析的15个胚胎中有7个观察到的聚类数据具有代表性。gydF4y2BabgydF4y2Ba在E14.5时，野生型胚胎的颈静脉淋巴囊中也观察到罕见的小簇细胞出芽。RUNX1、cKIT和CD45均为阳性。CD45+ VECAD+ PROX1+细胞(箭头)。数据代表两个独立的胚胎。JLS，颈静脉淋巴囊。比例尺，50µm。gydF4y2Ba
扩展数据图8用于淋巴和造血内皮细胞分类和表征的门控策略。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba将野生型(+/+)或纯合突变型(Δ/Δ) E14.5胚按指示解剖，取肝、肺、心和胸腺。将来自一窝的6-8个躯干混合消化，以产生单细胞悬液。F480+ Lin+耗竭后，将经FACS分类的CD45-LYVE1+VECAD+细胞用细胞因子镀于OP9饲养层7天。在转录组分析的情况下(扩展数据图。gydF4y2Ba5 a、bgydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)，每个基因型的一半细胞进行RNA处理(OP9前)，另一半细胞在OP9上生长，然后分选纯化LYVE1+VECAD+细胞(OP9后)。对于甲基纤维素菌落测定，所有CD45+细胞均采用从OP9共培养物中纯化的FACS，镀入Methocult并培养9-14天(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．菌落被枚举并收获用于FACS分析(图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．gydF4y2BabgydF4y2Ba， 14天后产生的菌落的FACS分析显示增强子突变体和野生型LEC衍生菌落之间的差异和重叠。维恩图显示各基因型CD45+细胞中CD41、CD16/32和cKIT阳性的百分比。数据代表5个独立实验。gydF4y2BacgydF4y2Ba，来自野生型和增强子突变体的甲基纤维素菌落具有复制能力。菌落在初始电镀14天后收获，在Methocult™中重复，并在第8天进行评估。增强子突变菌落的细胞增殖增强。数据代表三个独立的实验。比例尺，200µm。gydF4y2Ba
图9淋巴内皮细胞产生的造血集落表达源自卵黄囊的红髓祖细胞的特征标记。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba从甲基纤维素培养物中收获CD45阳性的细胞，用一系列造血标志物抗体染色评估。野生型和增强子突变型LECs的菌落包括CD41、CD16/32和cKIT阳性的细胞群，以及分析的其他标记阴性的细胞群，除了在两个窝中观察到的少量Gr1+细胞群(D/D窝a;c)。gydF4y2BabgydF4y2Ba，从E14.5分离的野生型和突变型LECs的RNA-seq数据的多维标度(MDS)图。虽然两种基因型在与OP9细胞共培养前表现出相似性，但RNA序列分析显示，与OP9培养后增强子突变体LECs相比，野生型的转录组反应不同。gydF4y2BacgydF4y2Ba，比较野生型和增强子突变体LEC在op9培养前后的RNA水平(以每百万读取数表示)，显示在op9培养前后RNA水平增加gydF4y2BaItga2bgydF4y2Ba两种基因型的转录本，与FACS分析中观察到的CD41水平一致。的表达gydF4y2Ba工具包gydF4y2Ba增强子突变体LEC升高而野生型降低，这也反映在cKIT水平的FACS分析中，而gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba都减少了gydF4y2BaRunx1gydF4y2Ba增强子突变细胞中水平升高。gydF4y2Ba
扩展数据图10转录组分析显示gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba−11 kb增强子导致向造血内皮细胞特性转变。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，在op9前后共培养E14.5分离的突变型和野生型LECs之间差异表达的基因RNA-seq分析。热图显示了基因集富集分析(GSEA)中识别的基因的相对表达。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba．gydF4y2BabgydF4y2Ba对野生型E14.5、E16.5和E18.5真皮LEC和BEC的RNA进行芯片分析，发现LECs比BECs表达更高水平的造血和造血内皮基因。基因表达热图，突出选择的基因。造血基因标记为橙色，而黑色标记为内皮基因。这些数据表明，LECs有望获得造血内皮细胞的身份。gydF4y2Ba
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卡赞瓦德尔，J.， Venugopal, P.， Oszmiana, A.。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba一个gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba增强剂在淋巴管系统中抑制造血。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba(2023)。https://doi.org/10.1038/s41586-022-05650-9gydF4y2Ba
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