摘要gydF4y2Ba
脊椎动物身体表现为节段性组织，最明显的是脊柱和周围神经的周期性组织。当含有骨骼肌和椎骨前体的体块有节奏地从体块前体中胚层生成时，这种异聚体组织首先实现。然后，体细胞被细分为前腔室和后腔室，这对于椎体的形成和周围神经系统的节段模式至关重要gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．这一关键的体细胞细分是如何建立的仍然不清楚。在这里，我们介绍了人体多能干细胞的三维培养系统，称为类体细胞和类节段细胞，它们概括了具有前后同一性的类体细胞结构的形成。我们确定了分割时钟在将时间节律性转换为前后体细胞隔室的空间规律性方面的关键功能。我们展示了分割基因的初始“盐和胡椒”表达gydF4y2BaMESP2gydF4y2Ba在新形成的节段中，通过活跃的细胞分选机制转化为前后相同的隔室。我们的研究表明，参与躯体发生的主要模式模块，包括时钟和波前，前后极性模式和躯体上皮化，可以在我们的体外系统中分离并独立运作。一起，我们定义了一个框架的对称性打破过程，启动了somite极性模式。我们的工作为解码躯体发生的一般原理和推进人类发展的知识提供了一个平台。gydF4y2Ba
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scRNA-seq数据已存入NCBI基因表达Omnibus (GEO;gydF4y2BaGSE195467gydF4y2Ba)．大量RNA-seq数据已存入GEO (gydF4y2BaGSE220634gydF4y2Ba)．的gydF4y2Ba智人gydF4y2Ba(人类)基因组组装(GRCh38)来自NCBI assembly (gydF4y2BaGCF_000001405.26gydF4y2Ba)．小鼠胚胎scRNA-seq数据来自GEO (gydF4y2BaGSE114186gydF4y2Ba)．iPS细胞的RNA-seq数据来自GEO (gydF4y2BaGSE164874gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba源数据gydF4y2Ba提供了这篇论文。gydF4y2Ba
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scRNA-seq分析代码可在GitHub (gydF4y2Bahttps://github.com/PourquieLab/Miao_Djeffal_2022.gitgydF4y2Ba)．定量图像分析代码可在GitHub (gydF4y2Bahttps://github.com/desimonea/MiaoSomitogenesis2022gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
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确认gydF4y2Ba
我们感谢N. Perrimon实验室的S. G. Tattikota对scRNA-seq实验的帮助;哈佛医学院生物聚合物设施的成员，提供了10倍基因组铬控制器仪器和测序咨询;布里格姆妇女医院神经技术工作室的工作人员提供显微镜访问和数据采集和数据分析咨询;哈佛神经生物学成像设施的工作人员获得FV1000共聚焦显微镜(NINDS P30核心中心拨款NS072030);以及S. Megason阅读手稿。Pourquié实验室的研究是由美国国立卫生研究院(5R01HD085121)资助的。Y.D.由研究基金会Médicale (FRM) PLP2020100012456赞助。gydF4y2Ba
作者信息gydF4y2Ba
作者及隶属关系gydF4y2Ba
贡献gydF4y2Ba
Y.M.设计、执行和分析了大部分的生物实验。Y.D.分析了scRNA-seq数据;A.D.S.开发了代码，并用z.l和S.D.T.进行了定量图像分析;K.Z.进行RNA-seq样本制备和数据分析。J.G.L.和A.S.在L.M.S.S.的帮助下进行了胚胎实验和分析;z.l使用A.D.S.和S.D.T.进行单细胞跟踪图像分析;J.R.和O.A.T.参与了scRNA-seq实验。a.s.， a.m.， P.R.和m.d.c。对数据分析或实验有贡献。y.m.， Y.D.和O.P.根据所有作者的意见撰写了手稿。 O.P. supervised the study.
相应的作者gydF4y2Ba
道德声明gydF4y2Ba
相互竞争的利益gydF4y2Ba
O.P.是Anagenesis生物技术公司的科学创始人。其他作者宣称没有利益竞争。gydF4y2Ba
同行评审gydF4y2Ba
同行评审信息gydF4y2Ba
自然gydF4y2Ba感谢Jesse Veenvliet和其他匿名审稿人对这项工作的同行评审所做的贡献。gydF4y2Ba同行评审报告gydF4y2Ba是可用的。gydF4y2Ba
额外的信息gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba
扩展的数据图形和表格gydF4y2Ba
扩展数据图1 Somitoid模型的特征。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， H2B-mCherry在一个扩散的梭状体中的时间推移共聚焦图像。gydF4y2BabgydF4y2Ba， HES7/MESP2双报告细胞系的设计说明。gydF4y2BacgydF4y2Ba，左为HES7波延时共焦图像;右，HES7报告基因在两个不同区域的时间分布，用蓝色和橙色框表示。gydF4y2BadgydF4y2Ba，左图为各个体细胞中所有莲座的投影面积的箱形图。右，每个Somitoid (n = 20个Somitoid)的中位玫瑰丛面积图。红色条形表示四分位范围的中位数。gydF4y2BaegydF4y2Ba，相关分析(n = 20个Somitoids;在整个茎状体区和中间蔷薇丛区之间(左);整个穗状体面积和总莲座数之间(右)。gydF4y2BafgydF4y2Ba，单个莲座(上)和整个Somitoids(下)的形状描述符。n = 1,957个莲座，来自20个Somitoids。gydF4y2Bag hgydF4y2Ba，共聚焦切片，从底部(z = 0µm)到莲座顶部，120 h，层粘连蛋白染色(gydF4y2BaggydF4y2Ba)和n -钙粘蛋白(gydF4y2BahgydF4y2Ba) (n = 2 Somitoids)。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，培养于明胶(n = 5个Somitoids)或层粘连蛋白(n = 5个Somitoids)涂有层粘连蛋白表面的块状细胞的代表性图像。gydF4y2BajgydF4y2Ba，悬浮液培养的体细胞体三维重建图像(左;n = 2胞状体)和共聚焦切片(右)，层粘连蛋白染色。gydF4y2BakgydF4y2Ba，主成分分析使用相同的RNA测序数据集如图所示。gydF4y2Ba1 hgydF4y2Ba．gydF4y2BalgydF4y2Ba，用5µM Blebbistatin处理的120 h pax3报告的Somitoids(左)和对照(右)的共聚焦图像。在盒须图中，中间铰链对应于中位数，上下铰链分别对应于第一和第三四分位数，上下须分别对应于最小值和最大值。比例尺代表500µm (a, c, i, l)， 50µm (g, h)和100µm (j)。gydF4y2Ba
扩展数据图2躯体类的前后模式。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， HES7/MESP2/UNCX三报告细胞系的设计说明。gydF4y2BabgydF4y2Ba，中圈的mCherry或YFP平均强度与大圈的比值(n = 8个Somitoids，柱状图表示中位数)。gydF4y2BacgydF4y2Ba，通过RNA测序测定流式细胞术分离的细胞片段中所选极性基因的归一化RNA计数(n = 3个独立实验，每个n中有96个Somitoids)。左侧为mCherry荧光前10%的细胞(洋红色)，右侧为YFP荧光前10%的细胞(黄色)。DESeq2用Wald检验(双面检验)将这四个基因鉴定为差异表达基因。gydF4y2BadgydF4y2Ba， HES7报告者的时间图(平均值±s.d。，n= 3 Somitoids) and images of an UNCX and MESP2 reporting Somitoid treated with 50 µM DAPT added at 48 h.egydF4y2Ba50µM DAPT处理48小时以来pax3报告的Somitoids(左)和对照(右)的宽视场图像。gydF4y2BafgydF4y2Ba， UNCX和MESP2的最大z投影共聚焦图像显示，在48小时内用10µM ROCKi(左)或5µM Blebbistatin(右)处理了Somitoids。gydF4y2BaggydF4y2Ba，左为120 h WT (n = 6次实验)、HES7-null (n = 6次实验)、MESP2-null (n = 5次实验)中流式细胞术表征的uncx阳性细胞百分比;数据以平均值±s.d表示。，one-way ANOVA, compared with WT, P = 0.89 (HES7-null); 2.49e-10 (MESP2-null). Right, images of MESP2 and UNCX reporters in HES7-null Somitoids, and UNCX reporter in MESP2-null Somitoids.hgydF4y2Ba，流式细胞仪分析120 h的UNCX-YFP(对照、WT、HES7-null和MESP2-null细胞系)，去除碎片和双偶。对照为亲本NCRM1细胞系。直方图中红色虚线右侧的分数被定义为yfp阳性。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba， MESP2-mCherry Somitoids 72 h去碎片和孪晶后的流式细胞术分析散点图(上)和直方图(下)。gydF4y2BajgydF4y2Ba， MESP2报告器在Somitoid中的延时图像。gydF4y2BakgydF4y2Ba，锯齿状体同一区域H2B-GFP的延时最大z投影共聚焦图像，如图所示。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba．gydF4y2BalgydF4y2Ba， MESP2高细胞的细胞轨迹叠加在MESP2报告细胞图像上。橙色轮廓代表正在形成的mesp2低区域。gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，一旦形成玫瑰花结，空间自相关(只有MESP2信号，只有UNCX信号或它们结合在一起)(来自n = 3 Somitoids的代表性例子)。gydF4y2BangydF4y2Ba，空间自相关分析的附加例子和MESP2/UNCX双报告Somitoid随时间的自相关槽的横坐标位置(插图)。gydF4y2BaogydF4y2Ba，均方位移(n = 3,422个来自2个Somitoids的轨迹)的时间图(平均值±95%CI)。gydF4y2BapgydF4y2Ba，个体细胞中MESP2报告基因归一化时间谱的附加示例(上;n =一个Somitoid的52个细胞)，72 h和84 h时MESP2强度的相关性分析(下;f检验，单侧，去除计算马氏距离确定的3个异常值后，P = 4.67e-14，见方法，用洋红色叉标记)。在72小时内，根据所追踪细胞的相对MESP2强度对时间剖面进行着色，在整个时间窗口内，较高的50%为洋红色，较低的50%为青色。gydF4y2Ba问gydF4y2Ba72 h和84 h跟踪细胞的周围MESP2强度(方法)(n = 98个细胞来自两个躯体类;未配对的双尾gydF4y2BatgydF4y2Ba以及)。两个时间点的细胞根据72 h时的相对MESP2强度进行分组，左侧低50%(青色)，右侧高50%(洋红色)。gydF4y2BargydF4y2Ba，左，从正确(橙色)或错误(绿色)区域开始的细胞中MESP2强度的时间剖面(方法)。右，起始正确或错误的细胞结束时间点MESP2强度。n = 98个来自两个体细胞的细胞;未配对的双尾gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba，左，从正确(橙色)或错误(绿色)区域开始的细胞位移的时间剖面(方法)。对，单元格的结束时间点位移，开始正确或错误。n = 98个来自两个体细胞的细胞;未配对的双尾gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BatgydF4y2Ba，粒子图像的速度场(箭头)和相应的散度(热图)在一个附加的Somitoid上的速度分析(左)和覆盖在MESP2报告图像上的正散度区域(右;黄色的轮廓)。gydF4y2BaugydF4y2Ba，茎突分化时间轴上MESP2表达和模式形成过程的总结。gydF4y2BavgydF4y2Ba，在mesp2 -高(n = 8个来自3个实验的重新聚集体)和mesp2 -低(n = 6个来自3个实验的重新聚集体)的重新聚集体中UNCX报告子的定量。gydF4y2Ba2 l-ngydF4y2Ba，成对双面gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。在所有的盒须图中，中心表示中位数，上界表示第75百分位，下界表示第25百分位。胡须的最大值和最小值表示最极端的非异常值数据点。异常值定义为大于上界或小于下界且小于四分位范围1.5倍的数据点。比例尺代表500µm (b, d, f, g, j)， 200µm (e, t)和100µm (k, l)。gydF4y2Ba
图3细胞分选和扰动过程中的差异基因表达。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，所选粘附蛋白在72 h时MESP2-low细胞与MESP2-high细胞之间，或在120 h时MESP2-high细胞与UNCX细胞之间的表达折叠变化图(每个时间点n = 3个独立实验，每个n中有96个Somitoids)。所绘基因为72 h时MESP2-low细胞与MESP2-high细胞之间差异表达的钙粘蛋白和原钙粘蛋白编码基因。虚线(暗红色)表示log2倍的变化值−0.58和0.58。误差条表示来自模型(DESeq2)的对数折叠变化的估计标准误差，表示为条的中心。折叠变化大于1.5(高于或低于虚线)和padj < 0.05(由Deseq2使用双侧Wald检验估计)的基因被认为是差异表达，并被染成黄色(在MESP2低细胞中上调)或品红(在MESP2高细胞中上调)。120 h时MESP2-high细胞和UNCX细胞对比显示的蓝色基因是非差异表达基因。各基因的确切P值见补充表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．gydF4y2BabgydF4y2Ba，在mesp2 -高和mesp2 -低细胞组分中编码粘附蛋白的所选基因在72 h时的归一化RNA计数(每个时间点n = 3个独立实验，每个n有96个Somitoids;DESeq2双侧Wald检验)。左边显示的是前10% mCherry荧光细胞(洋红色)，右边显示的是前10% YFP荧光细胞(黄色)。gydF4y2BacgydF4y2Ba， MESP2-low细胞与MESP2-high细胞之间72小时，或MESP2-high细胞与UNCX细胞之间120小时所选Ephrin蛋白编码基因的表达折叠变化图(每个时间点n = 3个独立实验，每个n中有96个Somitoids)。误差条表示模型(DESeq2)对数折叠变化的估计标准误差，表示为条的中心。折叠变化大于1.5(高于或低于虚线)和padj < 0.05(由Deseq2使用双侧Wald检验估计)的基因被认为是差异表达，并被染成黄色(在MESP2低细胞中上调)或品红(在MESP2高细胞中上调)。120 h时MESP2-high细胞和UNCX细胞对比显示的蓝色基因是非差异表达基因。各基因的确切P值见补充表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．gydF4y2BadgydF4y2Ba， 72 h时mesp2高和mesp2低细胞部分中编码Ephrin蛋白的基因归一化RNA计数(每个时间点n = 3个独立实验，每个n有96个Somitoids;DESeq2双侧Wald检验)。gydF4y2BaegydF4y2Ba， MESP2-low细胞与MESP2-high细胞之间72小时，或MESP2-high细胞与UNCX细胞之间120小时所选细胞骨架调节蛋白的表达折叠变化图(每个时间点n = 3个独立实验，每个n中有96个Somitoids)。误差条表示来自模型(DESeq2)的对数折叠变化的估计标准误差，表示为条的中心。折叠变化大于1.5(高于或低于虚线)和padj < 0.05(由Deseq2使用双侧Wald检验估计)的基因被认为是差异表达，并被染成黄色(在MESP2低细胞中上调)或品红(在MESP2高细胞中上调)。120 h时MESP2-high细胞和UNCX细胞对比显示的蓝色基因是非差异表达基因。各基因的确切P值见补充表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．使用Deseq2进行差异基因表达分析后，将mesp2高表达组和mesp2低表达组的差异表达基因(72 h)进行KEGG功能分析。绘制的42个基因代表了那些出现在KEGG通路“hsa04810”(调节肌动蛋白细胞骨架)中的基因。gydF4y2BafgydF4y2Ba， HES7和MESP2报告者的Kymograph来自于强力霉素添加48小时诱导的过表达Tiam1的Somitoid的中心线扫描。gydF4y2BaggydF4y2Ba， 120 h对照中流式细胞仪检测的uncx阳性细胞的百分比，48 h多西环素诱导的Somitoids过表达Tiam1。柱状表示中位数。未配对的双尾gydF4y2BatgydF4y2Ba-test n = 6个来自2个独立实验的副本，每个副本中有12-18个Somitoids。gydF4y2BahgydF4y2Ba(左)120 h时MESP2/ uncx报告的Somitoid的最大z投影共聚焦图像，48 h时多西环素诱导过表达Tiam1。右，MESP2和UNCX信号的空间自相关分析(每个条件n = 3个Somitoids)。所有比例尺代表500µm。gydF4y2Ba
图4分段样模型的特征。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba，分段型模型的延时亮场图像。一个前;P,后。gydF4y2BacgydF4y2Ba，每个Segmentoid中的莲座数(n = 40 Segmentoids)，柱状表示中位数。gydF4y2BadgydF4y2Ba，左为节段状花序中莲座的投影面积(20个节段状花序中有345个莲座)。红色条形表示四分位范围的中位数。右，节段状花序中莲座的形状描述符(20个节段状花序中n = 345个莲座)。中间铰链对应于中位数，上下铰链分别对应于第一和第三四分位数，上下须分别对应于最小值和最大值。gydF4y2BaegydF4y2Ba，代表性的类器官亮场和DAPI图像，不含Matrigel，添加10%的层粘连蛋白，并嵌入1%的Matrigel(每种条件下n>10个Segmentoids)。gydF4y2BafgydF4y2Ba，悬浮液(n = 3次实验)或嵌入Matrigel (1%， 5%， n = 3次实验)的类器官长度;10%， n = 5次实验)。每个实验中的单个结构长度被绘制在左侧。每个实验的中位数长度在右侧用红色条表示中位数，与无Matrigel条件相比，普通单向方差分析P = 0.26(1%)， 0.0023(5%)， 0.00014(10%)。gydF4y2BaggydF4y2Ba，不同条件下1轴以上结构的百分比，红色条表示中位数。与无Matrigel条件比较，P>0.999(1%)， = 0.0154(5%)， 0.0205(10%)。gydF4y2BahgydF4y2Ba(左)PAX3-YFP报告(上)和PAX3-YFP与H2B-mCherry(下)合并在一个Segmentoid中(下)的延时最大z投影共焦图像。右，PAX3报告器(上)、H2B(中)和合并通道(下)在同一个Segmentoid中的kymographs。节段状突在每个时间点都与后尖对齐。比例尺代表200µm (a, b, h)和100µm (e)。gydF4y2Ba
图5 TBXT和SOX2在段状体中的表达。gydF4y2Ba
TBXT和SOX2 24 h免疫染色共聚焦图像(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)， 48小时(gydF4y2BabgydF4y2Ba)， 72小时(gydF4y2BacgydF4y2Ba)， 96小时(gydF4y2BadgydF4y2Ba)，及120小时(gydF4y2BaegydF4y2Ba)的分段样模型。代表性的最大z投影图像显示从gydF4y2BabgydF4y2Ba-gydF4y2BaegydF4y2Ba．48 h, n = 3节段状;72 h, n = 11节段状;96 h, n = 17节段状;120 h, n = 21节段样，其中7节段样仍有明显的TBXT和SOX2双正极。一个前;P,后。比例尺(a, b)在相应放大视图中分别代表100µm和20µm;比例尺(c, d, e)代表100µm。gydF4y2Ba
图6段状模型的scRNA-seq。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，在分段样模型的不同时间点用莱顿聚类识别的细胞类型比例。gydF4y2BabgydF4y2Ba， UMAP上的速度流图，经过微分动力学校正后，再现了不同时间点细胞类型的轨迹。gydF4y2BacgydF4y2Ba，特征基因表达趋势(Log2/归一化)向体作为特定终端群体。gydF4y2Ba
图7 Segmentoid和Somitoid模型的scRNA-seq。gydF4y2Ba
一个gydF4y2BaUMAP包埋的细胞合并从两个模型(19,551个细胞)着色的细胞类型与莱顿聚类。gydF4y2BabgydF4y2Ba，两种模型中细胞类型簇中所选基因的点图。gydF4y2BacgydF4y2Ba，机器学习分类先前的E9.5小鼠胚胎数据集。gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba，体外模型与小鼠E9.5细胞类型比较的分类器分析。在小鼠群簇上训练的k-NN分类器用于预测体外人体模型的身份。gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba，细胞类型(f)和时间点(g)比较Somitoids和Segmentoids的分类器分析。gydF4y2BahgydF4y2Ba，三个数据集中所选基因的平均表达热图。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，上，体细胞亚簇突出表达TBX18(左)和UNCX(右)的细胞;下图为节段类(左)和体细胞类(右)表达TBX18、UNCX或两者表达的细胞数量。gydF4y2BajgydF4y2Ba，gydF4y2Bak, lgydF4y2Ba，分段样模型各时间点hox家族基因表达点图(gydF4y2BajgydF4y2Ba)、Somitoid模型(gydF4y2BakgydF4y2Ba)，以及节段状细胞(gydF4y2BalgydF4y2Ba)．每个聚类的平均表达量为每个基因的比例。gydF4y2Ba
扩展数据图8前后模式和分割时钟。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba， HES7 (a)和MESP2 (b)的时间自相关报告了单个WT分段类的振荡。三角形表示自相关峰值，而自相关峰值又表示振荡周期。gydF4y2BacgydF4y2Ba，合并的最大z投影共聚焦图像与UNCX报告，DAPI和Phalloidin染色(n>10个Segmentoids)。gydF4y2BadgydF4y2Ba，前后轴各节段莲座数分布。分段定义为该UNCX分条的后边界到下一个后边界的后边界。沿AP轴观察到的最大莲座数被用来表示整个段(n = 24个节段)。gydF4y2BaegydF4y2Ba，内侧轴各节段莲座数分布(左;n = 25 Segmentoids)。数据是根据相对AP位置在分段状(右)重新分组。gydF4y2BafgydF4y2Ba在同一个HES7-null segment toid中，pseudoHES7, UNCX和MESP2的报告者的Kymographs。gydF4y2BaggydF4y2Ba，从后端(P)到前端(A)沿120小时HES7-null(左)和WT(右)节段状突(每种情况n>10节段状突)的宽视场图像和报告者强度图。gydF4y2BahgydF4y2Ba，在HES7-null Segmentoid中，MESP2报告器的时间推移，最大z投影共聚焦图像。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba， WT和HES7-null段状体中MESP2/UNCX信号的平均向列阶随时间的变化(mean±s.d;n = 7 WT Segmentoids和n = 6 HES7-null Segmentoids)。统计采用Wilcoxon秩和检验(双侧)和gydF4y2BaPgydF4y2Ba-value显示。gydF4y2BajgydF4y2Ba， Somitoid和Segmentoid中HES7-null表型的总结。所有比例尺代表100µm。gydF4y2Ba
图9前后模式和细胞分选。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，报告了根据HES7振荡相位排列的形成段的动态(n = 6个节段，2个节段)。数据以平均值±s.d表示。gydF4y2BabgydF4y2Ba，盐皮特阶段一段中MESP2报告细胞和H2B-GFP的代表图像。gydF4y2BacgydF4y2Ba，左为MESP2报告者在图中同一段状体上的延时最大z投影共聚焦图像。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba．右图为形成段中MESP2强度的时间剖面，用青色标出。绿色实线框表示相应的时间点。gydF4y2BadgydF4y2Ba， MESP2和UNCX报告器的空间自相关分析(均值±s.e.m)在一个发展段(n =来自2个分段类的6个分段)中作为时间函数的代表性例子。gydF4y2BaegydF4y2Ba， mesp2高细胞的细胞跟踪示例。相同颜色的点表示相同的细胞，橙色的轮廓表示形成段。gydF4y2BafgydF4y2Ba，从节段后部开始的有迹的MESP2-high细胞的运动分类(n = 111个细胞，来自5个节段样的10个节段)。gydF4y2BaggydF4y2Ba，粒子图像的速度场(箭头)和相应的散度(热图)的附加示例，速度分析和正散度区域覆盖在MESP2报告图像上。gydF4y2BahgydF4y2Ba，多西环素72 h诱导的段状过表达Tiam1中HES7/UNCX(绿色)和MESP2(洋红色)合并的kymographs以及HES7和MESP2振荡的其他例子。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba， 120 h后端(P)到前端(A)的报告细胞强度宽视场图像和曲线图，72 h时多西环素添加诱导过表达Tiam1(左;n>10 Segmentoids)或用10µM ROCKi处理(右;n > 10 Segmentoids)。所有比例尺代表100µm。gydF4y2Ba
扩展数据图10胚胎用Mesp2 HCR探针染色。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，小鼠胚胎最大z投影共聚焦合并图像gydF4y2BaMesp2gydF4y2BaHCR探针(青色)和DAPI(品红)。gydF4y2BabgydF4y2Ba， a中虚线框所示区域的放大视图。gydF4y2BacgydF4y2Ba，另外染色的半胚对gydF4y2BaMESP2gydF4y2BaHCR探针(红色)和DAPI(青色)。gydF4y2BadgydF4y2Ba，量化方案。gydF4y2BaegydF4y2Ba，高像素分数的前后部分gydF4y2BaMESP2gydF4y2Ba0和45分钟的条带。配对t检验，双面检验。gydF4y2BafgydF4y2Ba的前/后部分像素值的标准差gydF4y2BaMESP2gydF4y2Ba0和45分钟的条带。配对t检验，双面检验。10个胚胎中有3个在Time 0捕获了宽带阶段的峰值gydF4y2BaMESP2gydF4y2Ba表达式，用准则表示该表达式域大致占据了整个段和gydF4y2BaMESP2gydF4y2Ba总强度在45 min时无显著增加。比例尺代表100µm (a, d)和20µm (b);100µm和20µm对应的放大视图(c)。gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充表1gydF4y2Ba
茎突分化过程中的差异基因表达。采用Wald检验(双面假设检验)比较类体细胞(48 h、66 h和120 h)和iPS细胞之间的基因表达。此表显示了比较中差异表达基因的列表(折叠变化> 1.5和gydF4y2BaPgydF4y2Ba邻接的gydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba
补充表2gydF4y2Ba
MESP2-和uncx阳性细胞在120 h类胞体中的差异基因表达。通过RNA-seq测定，在120 h类胞体中，与前10%的mCherry (MESP2)细胞相比，facs筛选的前10% YFP (UNCX)荧光细胞的差异表达基因。采用Wald检验(双侧)，基因与gydF4y2BaPgydF4y2Ba邻接的gydF4y2Ba< 0.05和loggydF4y2Ba2gydF4y2Ba[fold change] > 0.58 (fold change > 1.5)被认为是差异表达。利用上述阈值标准，在YFP细胞中共发现233个基因，其中上调基因70个，下调基因163个。gydF4y2Ba
补充表3gydF4y2Ba
MESP2基因表达差异gydF4y2Ba高gydF4y2Ba和MESP2gydF4y2Ba低gydF4y2Ba72 h的细胞。通过RNA-seq测定，在72 h的类体细胞中，与前10% mCherry (MESP2)细胞相比，facs分选的底部10% mCherry (MESP2)荧光细胞的差异表达基因。采用Wald检验(双侧)，基因与gydF4y2BaPgydF4y2Ba邻接的gydF4y2Ba< 0.05和loggydF4y2Ba2gydF4y2Ba[fold change] > 0.58 (fold change > 1.5)被认为是差异表达。利用上述阈值标准，共发现1981个基因存在差异表达。其中，在mCherry中有1321个基因上调，660个基因下调gydF4y2Ba低gydF4y2Ba细胞。gydF4y2Ba
补充视频1gydF4y2Ba
Somitoid亮场视频。在laminin -521涂层的表面上传播的锥体的延时亮场视频。每24.6分钟采集一次图像，视频以12帧/秒的速度播放。gydF4y2Ba
补充视频2gydF4y2Ba
HES7和MESP2呈报告状。时间推移共聚焦视频显示一个瘤样体HES7(绿色火蓝)和MESP2(洋红色)表达。每15.78分钟采集一次图像，视频以15帧/秒的速度播放。gydF4y2Ba
补充视频3gydF4y2Ba
假hes7和MESP2报告子位于hes7缺失的胞突中。延时共聚焦视频显示hes7缺失的梭状体报告假hes7(绿色火蓝)和MESP2(洋红色)表达。每27分钟采集一次图像，视频以12帧/秒的速度播放。gydF4y2Ba
补充视频4gydF4y2Ba
MESP2和UNCX报告在一个somitoid。时间推移共聚焦视频显示一个子突MESP2(洋红色)和UNCX(黄色)表达。每19.8分钟采集一次图像，视频以15帧/秒的速度播放。gydF4y2Ba
补充视频5gydF4y2Ba
MESP2和H2B报告瘤突。延时最大gydF4y2BazgydF4y2Ba-投影共聚焦视频的somitoid报告MESP2表达(火;左)和H2B(灰色;右)。图像每6分钟采集一次，视频以20fps播放。gydF4y2Ba
补充视频6gydF4y2Ba
跟踪MESP2gydF4y2Ba高gydF4y2Ba体细胞中的细胞。延时最大gydF4y2BazgydF4y2Ba-投影共焦视频的一个somitoid报告的表达MESP2。橙色轮廓大致表示未来的MESP2gydF4y2Ba低gydF4y2Ba集群。这些点都代表MESP2gydF4y2Ba高gydF4y2Ba细胞，在橙色区域按时间排序。每5分钟采集一次图像，视频以6帧/秒的速度播放。gydF4y2Ba
补充视频7gydF4y2Ba
段状亮场视频。10% Matrigel中分段状体的延时亮场视频。每19.8分钟采集一次图像，视频以15帧/秒的速度播放。gydF4y2Ba
补充视频8gydF4y2Ba
HES7, MESP2和UNCX以段状报告。延时最大gydF4y2BazgydF4y2Ba-投影共聚焦视频显示节段状突HES7(绿火蓝)、MESP2(洋红色)和UNCX(绿火蓝)表达。每18分钟采集一次图像，视频以15帧/秒的速度播放。gydF4y2Ba
补充视频9gydF4y2Ba
假hes7, MESP2和UNCX报告子在HES7-null段状体中。延时最大gydF4y2BazgydF4y2Ba-投影共聚焦视频的hes7 -空节段报告假hes7(绿火蓝)，MESP2(洋红色)和UNCX(绿火蓝)表达。每18分钟采集一次图像，视频以15帧/秒的速度播放。gydF4y2Ba
补充视频10gydF4y2Ba
HES7, MESP2和UNCX以较高分辨率的段状报告。延时最大z投影共焦视频，报告了HES7/UNCX(左)，MESP2(中)和合并信号(HES7/UNCX，绿色火蓝;MESP2,红色)。视频开始于分化的第4天(96小时)，记为时间0。青色的盒子大致勾勒出一个成形段。图像每6分钟采集一次，视频以15帧/秒播放。gydF4y2Ba
补充视频11gydF4y2Ba
跟踪MESP2gydF4y2Ba高gydF4y2Ba节段状细胞。延时最大gydF4y2BazgydF4y2Ba报告MESP2表达的节段状体的共聚焦视频。右侧红色轮廓近似表示同一成形段，圆点均表示MESP2gydF4y2Ba高gydF4y2Ba细胞。黄色、蓝色、红色和青色细胞开始于该节段的后部，并被分选为前部的MESP2gydF4y2Ba高gydF4y2Ba时间的间隔。洋红色细胞移动到前MESP2gydF4y2Ba高gydF4y2Ba下一段车厢。图像每6分钟采集一次，视频以6帧/秒播放。gydF4y2Ba
补充视频12gydF4y2Ba
HES7, MESP2和UNCX报告在段状与gydF4y2BaTiam1gydF4y2Ba超表达。延时最大gydF4y2BazgydF4y2BaHES7/UNCX(绿色火蓝)和MESP2(洋红色)的共聚焦视频报告节段样过表达gydF4y2BaTiam1gydF4y2Ba加强力霉素72 h诱导。视频开始于84小时，每18.6分钟采集一次图像。视频以12帧/秒播放。gydF4y2Ba
权利和权限gydF4y2Ba
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苗，Y.，杰弗尔，Y.，德西蒙，A。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba体外人体细胞发生的重建与解构。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba(2022)。https://doi.org/10.1038/s41586-022-05655-4gydF4y2Ba
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发表gydF4y2Ba：gydF4y2Ba
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