DNA修复NPAS4-NuA4复杂的夫妇突触活动gydF4y2Ba

感官体验对适当的神经细胞成熟和电路可塑性至关重要gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。信号级联由experience-driven神经元活动高潮的感应控制多样化的过程,如基因项目树突和突触增长,突触消除,抑制神经传递的招聘,适应的髓鞘形成gydF4y2Ba^{6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}。然而,神经活动也威胁到基因组的完整性postmitotic神经元必须挺过一个生物体的生命周期。例如,加强代谢需求上升时期活动可能会增加氧化损伤积极基因组的转录区域gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba。Activity-induced转录本身对基因组稳定性进一步威胁,因为它与感应重复的DNA双链断裂(双边带)监管元素,比如stimulus-inducible基因的启动子gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba}。尽管转录DNA断裂的耦合是观察到的细胞类型,这个过程神经元长期面临特殊的挑战,它不能使用replication-dependent DNA修复途径和拥有有限的再生机制来取代受损的细胞gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba。积累神经元基因组DNA损伤是神经退行性疾病的基本特性和生物的老化gydF4y2Ba^{12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13克ydF4y2Ba}。因此,理解神经元的策略使用预防和修复损伤可能直接翻译人类长寿和衰老疗法。到目前为止,没有任何的例子neuronal-specific修理机械,减轻基因组不稳定的风险在加剧活动。通过调查活动依赖性转录项目特定神经元的特性,我们发现一个生化耦合神经元活动通过未知形式的DNA修复NuA4染色质remodeller-DNA维修复杂,组装在诱导neuronal-specific NPAS4转录因子。gydF4y2Ba

与大多数activity-inducible转录因子,广泛表达和引起的各种刺激,NPAS4选择性地表达在神经元膜depolarization-induced钙信号gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba。理解这个因素的函数,这是专门适应神经元活动,我们试图净化NPAS4-containing蛋白复合物从成年小鼠大脑。我们推断NPAS4可能组装成一个multisubunit复杂,扩大生化活动激活神经元。使用凝胶排阻层析法和non-denaturing凝胶电泳,我们观察到NPAS4驻留在高分子量约MDa的复杂。NPAS4的预测大小与异质二聚体伙伴(ARNT1和ARNT2)大约是175 kDa,这一发现表明,NPAS4与多个未知蛋白质伙伴(扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

促进这个假定的NPAS4复杂的净化,我们生成的gydF4y2BaNpas4-Flag-HAgydF4y2Ba和gydF4y2BaArnt2-Flag-HAgydF4y2Ba敲入小鼠行表位标记的国旗和血凝素(HA)的羧基末端追加到NPAS4 ARNT2。在纯合子敲入小鼠,我们验证正确的标签和验证重叠基因插入内源性组织化学染色NPAS4 ARNT2和HA抗原决定基(无花果。gydF4y2Ba1 a, bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1 b, cgydF4y2Ba)。我们还表明,野生型和标记NPAS4-Flag-HA (NPAS4-FH)表现出相似的表达水平和感应动力学(扩展数据图。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)。产生高水平的生化净化所需NPAS4,我们刺激海马的神经元gydF4y2BaNpas4-FHgydF4y2Ba老鼠通过低剂量的注射海人酸(KA),一个同步去偏光海马神经元谷氨酸受体激动剂。然后我们immunopurified NPAS4使用anti-Flag抗体和质谱(图执行。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)。质谱数据显示NPAS4和所有报告单元之间的相互作用的一个染色质修饰符,NuA4复杂,估计的大小大约是1.0 - -1.3的MDa(无花果。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba和补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

我们首先证明co-immunoprecipitation NPAS4之间和几个NuA4子单元(TRRAP EP400和DMAP1)在视觉皮层使用曝光作为生理刺激诱导神经元活动(扩展数据图。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)。我们进一步通过免疫沉淀反应NPAS4或组件特征这一复杂的NuA4复杂,TIP60(也称为KAT5),其次是免疫印迹和质谱分析。这些实验证实,之间的交互NPAS4 NuA4复杂是互惠的。此外,NPAS4-ARNT2二聚体是最丰富的转录因子与大脑中的NuA4有关。此外,一个新的子单元的复杂,特征蛋白质ETL4不善,被确定(扩展数据无花果。gydF4y2Ba1 g-jgydF4y2Ba和gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba和补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。我们观察到的几个单元NuA4刺激前复杂的相互作用,这表明NPAS4感应后,NPAS4-ARNT二聚体加入一个预先存在的复杂的(扩展数据图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)。然而,我们不能排除这种可能性,其他子单元与,或转录后修饰被添加到NuA4复杂的活动。NPAS4是主要的诱导成分复杂的RNA水平(扩展数据图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)。无论是相关蛋白质NPAS3还是另一个activity-inducible因素,安全系数,co-immunoprecipitated NuA4组件在大脑中。这个结果强调了特异性的NPAS4-NuA4交互(扩展数据图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)。此外,NPAS4,但不是其他activity-inducible转录因子,如安全系数和EGR1,与异源表达系统中组件NuA4 (HEK293T细胞)(扩展数据图。gydF4y2Ba2 d, egydF4y2Ba)。在人类和小鼠细胞,表达这些新19扶少团团员NPAS4浓缩在大脑与其他神经元细胞类型gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2 f, ggydF4y2Ba)。这一结果表明大脑内,NPAS4-NuA4复杂的神经元中具体的函数。gydF4y2Ba

确定NPAS4和NuA4硝唑在染色质,我们急忙逃走gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba获得的地图NPAS4-NuA4基因组绑定在刺激海马核分离小鼠注射低剂量的KA(无花果。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba和补充表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。我们确认的特异性NPAS4急忙逃走信号通过执行NPAS4急忙逃走在核孤立如果大脑(没有NPAS4表示)和核独立于大脑的刺激gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba基因敲除小鼠。这个实验生成的列表10225年高信任度NPAS4-binding网站(无花果。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3得了gydF4y2Ba)。这些结合位点高度与NPAS4信号与测序(ChIP-seq)和染色质免疫沉淀反应化验显示浓缩的E-box和bHLH-PAS绑定图案(扩展数据图。gydF4y2Ba3 d, egydF4y2Ba)。NPAS4,其合作伙伴ARNT2 NuA4组件EP400和新发现的NuA4亚基ETL4也硝唑在基因组刺激神经元(无花果。gydF4y2Ba1比gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3 f, ggydF4y2Ba)。此外,绑定NPAS4和ETL4基因组高度诱导NPAS4地点(无花果。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)。相比之下,EP400出席NPAS4-binding网站之前刺激,这表明它可能是保留在这些网站缺乏NPAS4由于NuA4绑定到乙酰化组蛋白的能力gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba或由EP400 NuA4-independent绑定(无花果。gydF4y2Ba1 f, ggydF4y2Ba)。然而,更多EP400急忙逃走信号观察到NPAS4网站缺乏安全系数比匡威(即安全系数的网站,但没有NPAS4)。这个结果表明NPAS4的特异性和EP400 co-binding而不是一个一般的招聘的EP400 activity-inducible转录因子(扩展数据图。gydF4y2Ba3 h,我gydF4y2Ba)。总之,我们的生化证据和基因组的绑定化验确定neuronal-specific形式NuA4复杂组装NPAS4在多个脑区活动依赖性的方式。gydF4y2Ba

我们下一个调查的功能NPAS4-NuA4复杂的大脑中。研究使用酵母、果蝇和non-neuronal细胞有两个活动归因于NuA4复杂:(1)控制通过染色质转录调控gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}和(2)协调修复DNA的双边带gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}。因此我们认为NPAS4的可能性,通过招聘NuA4,可能有两种用途。NPAS4的先前的研究表明,NPAS4-NuA4复杂可能在活动依赖性基因调控中起中心作用gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba}。此外,双边带修复NuA4的作用表明,NPAS4可能有一个之前从未描述的功能神经元活动依赖性DNA修复启动子和增强子。我们检查了这两个函数的NPAS4-NuA4扰乱NPAS4或者TIP60, NuA4组蛋白乙酰转移酶的组成部分(参考文献。gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba})。gydF4y2Ba

确定NPAS4 NuA4协调活动依赖性转录,我们注入gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}或gydF4y2BaTip60gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}小鼠病毒表达Cre-mCherry或recombination-deficient版本的Cre(ΔCre-GFP)侧海马的单方面解除gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba或gydF4y2BaTip60gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4得了gydF4y2Ba)。注意,损耗的gydF4y2BaTip60gydF4y2Ba不损害NPAS4感应(扩展数据图。gydF4y2Ba4 d, egydF4y2Ba)。我们服用低剂量的KA的神经元激活所有类出现在海马体中,收集核6 h后捕获最大感应NPAS4目标基因gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba和执行single-nucleus RNA-sequencing (snRNA-seq)(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4外:我gydF4y2Ba)。在这两个gydF4y2BaTip60gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}和gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}数据集,我们确定了10个主要细胞类型,包括5个神经元亚型(齿状回、CA1、CA3、菌丝层和抑制),和多个non-neuronal细胞类型。我们使用一个嵌套PCR策略作为一个额外的步骤在图书馆准备放大病毒记录。这个步骤使我们感染状况分配给每个原子核Cre-infected (cKO)ΔCre-infected(野生型)或未感染(无花果。gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba)。在这两个数据集,在每个神经元集群,细胞subclustered根据感染状况与ΔCre相比(Cre)。这种效果并不是由病毒成绩单(方法)的表达,而是反映了Cre-infected细胞无法充分诱导活动依赖性NPAS4或TIP60损耗后的基因。gydF4y2Ba

我们确定了差异表达基因(gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba;消极的褶皱变化(Cre /ΔCre);调整gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)在每个主要神经元亚型和我们的分析集中在表达下调的基因更有可能直接目标的复杂。在每个神经元亚型基因表达下调由于gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba删除后也显著下调gydF4y2BaTip60gydF4y2Ba相应的细胞群gydF4y2BaTip60gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}数据集,产生相同的结果(图相互比较。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。除了捕获已知NPAS4目标基因等gydF4y2BaNptx2gydF4y2Ba,gydF4y2BaPlk2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba脑源性神经营养因子gydF4y2Ba1766年,我们发现新目标的NPAS4海马细胞类型特异的表达模式和定义(补充表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。在小鼠神经元的主要的文化,我们独立消息来源的证实,NuA4复杂的组件,NPAS4, TIP60 EP400,每个规范相同的诱导转录计划(扩展数据图。gydF4y2Ba6 a - cgydF4y2Ba)。进一步确证NPAS4-NuA4交互的重要性对于基因活化,截短形式的NPAS4不强烈的表达与NuA4(扩展数据图。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)的能力明显受损NPAS4激活其目标在荧光素酶结合位点记者化验(扩展数据图。gydF4y2Ba6 d, egydF4y2Ba)。在一起,这些发现提供证据表明NPAS4和NuA4不仅是神经元活动依赖性的关键调节基因转录也激活基因表达作为一个功能单位。gydF4y2Ba

最后测试确认NPAS4和NuA4函数在一起作为一个复杂的神经元,我们问TIP60是否有相同的作用,激活神经元电路作为NPAS4观察。兴奋CA1锥体神经元NPAS4的关键功能是调解招聘体细胞抑制海马锥体神经元反应神经元的活动gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}。我们因此稀疏的CA1区注入gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}和gydF4y2BaTip60gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}老鼠的腺相关病毒(AAV)编码Cre-mCherry和执行同步录音诱发抑制性突触后电流(万能)从邻近的野生型(Cre-mCherrygydF4y2Ba^{- - - - - -gydF4y2Ba})和cKO (Cre-mCherrygydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)在急性海马锥体神经元片(无花果。gydF4y2Ba2 d, egydF4y2Ba)。轴突内的地层pyramidale与所需的最小强度刺激产生万能野生型和cKO神经元。删除NPAS4或TIP60显著降低依赖性活动体抑制引起的低剂量KA刺激。相比之下,没有观察到Cre-infected和未感染的细胞之间的差异在saline-injected控制动物(图。gydF4y2Ba2 f, ggydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba外:我6gydF4y2Ba)。在一起,这些实验表明,NPAS4-NuA4复杂组装在协调诱导基因转录激活神经元和动态重组刺激大脑的神经回路。gydF4y2Ba

NuA4在双边带的保守功能修复gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}促使我们去下一个调查NPAS4的可能性,通过融入NuA4复杂,可能扮演一个以前从未发现过的DNA损伤作用控制神经元。值得注意的是,stimulus-dependent基因诱导神经元的建议导致双边带,这可能是由拓扑异构酶的酶,如TOP2B暂停RNA聚合酶II是释放到生产伸长gydF4y2Ba^{3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba}。然而,双边带的程度发生在体内神经活动和神经元的机制,可能使用修复这些优惠和减轻累积损伤仍不清楚。我们建议成立一个复杂NPAS4和NuA4之间可能代表一个神经元的机制有效地驱动activity-induced转录反应同时维持基因组稳定的下游神经元活动(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。我们试图确定基因组位点进行破坏和修复反应活动。我们还研究了这些地区是否NPAS4-NuA4和测试的目标是否扰乱NPAS4-NuA4损害DNA修复这些网站。gydF4y2Ba

我们与测序分析用于transposase-accessible染色质(ATAC-seq)组蛋白的化学修饰,急忙逃走H3K27ac确定本构和activity-responsive基因组监管元素的景观在海马体。我们定义管理元素的基因组区域与一个ATAC-seq或H3K27ac急忙逃走的高峰,以后称为“监管所有元素”。我们进一步明确“activity-inducible监管元素”网站,表现出动态增加ATAC-seq信号(双重的增加;调整gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)和/或增加H3K27ac急忙逃走信号(增长了1.5倍;调整gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)经过2小时的低剂量KA刺激(扩展数据图。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BacgydF4y2Ba和补充表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。在这个数据集,我们分类NPAS4-bound元素与我们列出的那些重叠的NPAS4峰值。我们第一次被问及神经刺激体内导致染色质的DNA损伤特征,尤其是在受NPAS4-NuA4元素。我们执行ChIP-seq DNA有关的组蛋白修饰γH2AX(组蛋白磷酸化Ser139 H2AX)如果和刺激神经元(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7 d, egydF4y2Ba)。刺激后,我们观察到增加γH2AX水平NPAS4-bound网站,网站的最大信号和可诱导性的最高四分位数NPAS4绑定(图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)。值得注意的是,我们观察到一个更大的提高在γH2AX水平在NPAS4-bound元素刺激后,在我们的景观activity-inducible元素(图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba,对吧)。因此,我们主要关注这些activity-inducible监管元素之间的关系最好,因为他们似乎捕捉activity-induced转录,NPAS4-NuA4绑定和DNA损伤。gydF4y2Ba

接下来,我们直接映射双边带体内使用暂停休息原位结扎和测序(sBLISS-seq) sequencing-based方法确定双边带通过结扎DNA测序DNA适配器上自由结束gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba。经过验证的能力sBLISS-seq捕捉CRISPR-Cas9-induced双边带(扩展数据图。gydF4y2Ba7 f-hgydF4y2Ba),我们异形的双边带的景观出现在成年人的海马在基底条件或刺激。在平行,我们执行RNA-seq在同一样品检查如何双边带与转录动力学(无花果。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)。我们首先检查基本特征这些跨基因组DNA断裂的时间点。正如之前报道的gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba,我们观察到的最大sBLISS-seq信号最高度表达基因的启动子(扩展数据图。gydF4y2Ba7 i (kgydF4y2Ba)。还有sBLISS-seq信号之间的显著相关性和γH2AX ChIP-seq信号刺激后在2 h。这个结果提供了一个独立的损害这些网站(扩展数据图。gydF4y2Ba7 lgydF4y2Ba)。主题丰富的统计定义山峰重现sBLISS-seq信号包括一些活动依赖性转录因子如ATF1、EGR NPAS4-ARNT,这表明这些优惠的一个子集是由转录诱导下游神经元活动增加(扩展数据图。gydF4y2Ba7米gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

我们下一个检查神经刺激如何影响双边带的景观。尽管神经活动并未改变sBLISS-seq信号(双边带)的总体布局整个基因组(扩展数据图。gydF4y2Ba7我gydF4y2Ba(调整后),我们发现1581年监管元素gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.1),显著增加在双边带信号(图2 h后刺激。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba)。activity-inducible元素显示增加了双边带信号刺激后,在与non-inducible元素(扩展数据图。gydF4y2Ba7 ngydF4y2Ba)。此外,69%的元素有显著增加双边带信号刺激后在2 h的最高四分位数NPAS4急忙逃走的信号,和NPAS4-bound activity-inducible监管元素显示最重要的双边带信号刺激后的增加(图gydF4y2Ba3 e, fgydF4y2Ba)。我们证实了这些发现使用互补分析(END-seq)gydF4y2Ba^{31日gydF4y2Ba}映射双边带在初级小鼠皮层神经元在0 h或2 h后刺激55毫米氯化钾。提高灵敏度,我们执行这些化验依托泊苷的存在,产生的双边带那块re-ligation拓扑异构酶的酶。之前报道gydF4y2Ba^{31日gydF4y2Ba}我们观察到浓缩END-seq信号CTCF-bound地点(扩展数据图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。符合我们从海马体sBLISS-seq数据,END-seq结果显示增加stimulus-dependent DNA断裂NPAS4-bound地点在初级神经元(扩展数据图。gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba)。值得注意的是,双方的整体水平和可诱导性sBLISS-seq和END-seq信号高的网站有一个峰值急忙逃走NPAS4但不是依赖性活动的因素比匡威(扩展数据图”丛书。gydF4y2Ba8我gydF4y2Ba)。在一起,我们的独立的DNA损伤的措施γH2AX ChIP-seq, sBLISS-seq和END-seq证明NPAS4优先结合网站接受activity-inducible DNA破坏神经元。gydF4y2Ba

我们下一个被问及这些受损的元素,尤其是那些受NPAS4-NuA4也进行修复。为此,我们研究了双边带的水平在第三次点,10 h后KA刺激,推理的一个子集网站可能会返回对基线双边带信号activity-induced转录消退。因此我们使用RNA-seq从相同的组织收集的数据集sBLISS-seq活动依赖性转录的数据集来确定样本回到基线。主成分分析(PCA)和RNA-seq层次聚类样本的数据显示两个集群10 h时间点。一个集群显示activity-inducible基因表达水平显著低于2 h的时间点(称为“不活跃”),而其他10 h集群保持较高水平的诱导基因(称为“仍然活跃”)(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9 a、bgydF4y2Ba)。PCA sBLISS-seq数据也表明,这些样品中聚集接近如果样品(扩展数据图。gydF4y2Ba9 cgydF4y2Ba)。值得注意的是,我们观察到如果和10 h中样本之间的分离,这表明样本中回到基线状态,而不是没有最初刺激。10 h样本中,双边带信号在activity-inducible监管元素显著降低相对于2 h时间点。这一结果表明,正在进行修复,解决双边带与转录活性下降。增加在DNA断裂信号2 h后刺激,加上10 h,减少最为明显,activity-inducible监管元素NPAS4绑定(图的最高水平。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9 d, egydF4y2Ba)。我们证实NPAS4-bound网站进行活跃的DNA修复DNA通过检查地图出版synthesis-dependent修复人类神经元(SAR-seq)gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba。尽管这种方法没有专门检测双边带修复,它捕获的新核苷酸进入修复DNA链,从而出现nonhomologous加入结束gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba。我们观察到浓缩SAR-seq信号NPAS4-bound地点和更高水平的修复(SAR-seq信号)gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba在NPAS4-bound网站相对于FOS-bound网站(扩展数据图。gydF4y2Ba9 fgydF4y2Ba)。进一步探讨修复机制在NPAS4-bound网站,我们执行急忙逃走的组件MRE11-RAD50-NBS1 (MRN)复杂。这个复杂的双边带的早期应答网站,在加工中扮演一个重要部分破碎的结束并启动多个DNA修复途径gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba。我们检查MRE11亚基,介导的致命的拓扑异构酶裂解产品gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba并作为双边带修复整个基因组的标志gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba,RAD50便于装配的复杂和强化的核酸内切酶活动MRE11 (ref。gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba)。验证后的特异性MRE11急忙逃走信号使用gydF4y2BaMre11gydF4y2BacKO老鼠(扩展数据图。gydF4y2Ba10 a, bgydF4y2Ba),我们观察到一个强大的依赖性活动co-localization MRE11和RAD50 NPAS4-bound元素并不是由非特异性免疫球蛋白绑定,组蛋白乙酰化或染色质可访问性(图。gydF4y2Ba4 c, dgydF4y2Ba无花果和扩展数据。gydF4y2Ba10氟gydF4y2Ba和gydF4y2Ba11 a, bgydF4y2Ba)。值得注意的是,MRE11也出席NPAS4-bound元素缺乏刺激的情况下,这表明它可能是刺激后保留这些网站或者与其他修复启动因素。这些发现从多个独立化验表明,NPAS4-NuA4-bound网站热点的DNA损伤和修复激活神经元。gydF4y2Ba

鉴于其目标网站的损害,我们下一个被问及NPAS4-NuA4刺激修复在这些网站的招聘额外双边带修理机械的基因组。通过执行急忙逃走NuA4组件EP400 MRE11,我们观察到损耗NPAS4导致显著减少蛋白质的绑定NPAS4-NuA4网站(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba11个碳氢键gydF4y2Ba)。尽管MRE11显著降低,这不是完全废除,这表明MRE11可能有额外的锁定机制,如直接互动与自由双边带结束或协会与转录机器gydF4y2Ba^{33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}。如果NPAS4-NuA4刺激修复,NPAS4-NuA4子单元的损耗会导致双边带增加神经元。为了测试这个预测,我们注入gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}小鼠Cre-expressing或者ΔCre-expressing装甲防护,孤立的原子核(0,2到10 h后刺激和sBLISS-seq执行。NPAS4短期耗尽后,双边带activity-inducible监管元素的数量增加2和10 h后刺激。这个结果表明NPAS4呈现神经元的损失无法有效地修复这些transcription-coupled优惠(无花果。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)。我们还观察到的数量的增加优惠刺激之前,这可能反映了累积修复以前刺激(图中特异表达的影响。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba12个模拟gydF4y2Ba)。争端解决机构增加NPAS4-depleted核activity-inducible地点后没有观察到Cre表达野生型神经元(扩展数据图。gydF4y2Ba12 bgydF4y2Ba)。值得注意的是,删除NPAS4或NuA4组件TIP60也导致显著增加全基因组双边带没有观察到在野生型小鼠和不是一个次要的后果增加细胞凋亡gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba或gydF4y2BaTip60gydF4y2BacKO细胞(图。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba12 dgydF4y2Ba)。这增加了双边带的程度,整个基因组部分可能是由于神经元特异表达抑制NPAS4-NuA4造成破坏。然而,我们不能排除的可能性表达Cre,此前据报道导致脱靶基因组DNA断裂gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba,NPAS4有明显影响,TIP60突变体由于广泛提供修复的信号。gydF4y2Ba

神经元的一个独特的特征是他们长postmitotic寿命,提供充足的时间未解决的DNA断裂和突变的积累。我们想知道NPAS4-bound元素的重复激活可以使这些网站增加突变负荷在老化。评估突变负荷在NPAS4-bound元素,我们使用fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)隔离NeuN-expressing原子核从年轻的海马体(3个月),中年(12个月)老(汽车个月大)小鼠和提取神经元DNA(图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba13 a、bgydF4y2Ba)。然后我们进行有针对性的扩增子测序为敏感突变检测gydF4y2Ba^38gydF4y2BaNPAS4-bound元素与负控制元素(也就是说,网站没有NPAS4绑定,称为NPAS4-unbound)。公司独特的分子标识符(umi)在启用PCR扩增检测突变归因于一个等位基因模板而不包括基础变化引起的测序错误gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba13 cgydF4y2Ba)。我们首先验证这种技术来检测突变的能力介绍CRISPR-Cas9-induced减少网站的神经元(扩展数据图。gydF4y2Ba13 dgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

我们下一个定义一个脆弱的网站,进行小组日常减免或修复(γH2AX水平评估和/或MRE11绑定),NPAS4-NuA4绑定。我们将这个数据集与一组元素,不共享这些签名的伤害和不受NPAS4-NuA4,但匹配的诱导H3K27ac水平,诱导染色质可访问性和在/ GC(扩展数据图的内容。gydF4y2Ba13 e, fgydF4y2Ba)。年龄组之间的差异的代表性目标站点放大在我们的分析,这可能显示不同的基线率突变频率,我们归一化每个站点的突变率突变频率的中位数相同的站点在年轻的动物。值得注意的是,网站不受NPAS4突变积累随着年龄的增长,显示出一个大约两个增加12个月。相比之下,我们的小组NPAS4-bound网站似乎没有突变的频率随着年龄的增加(图gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)。这些数据表明,NPAS4-NuA4-bound网站相对防止额外的突变积累在生物的衰老。这些差异并不是由于异常高的速度突变的网站,当我们观察到更高的单核苷酸变异和插入和删除事件NPAS4-bound网站相对于non-bound网站在年轻的动物(扩展数据图。gydF4y2Ba13克gydF4y2Ba)。这些结果进一步证实,NPAS4-NuA4是针对脆弱的网站和提高的可能性NPAS4-NuA4复杂可能需要作为一个额外的保护层循环这些破碎的网站。gydF4y2Ba

我们的数据表明,中断NPAS4-NuA4函数导致依赖性活动基因表达失调,增加DNA断裂activity-regulated启动子和增强子,本地化的保护修复受损机器和缺陷锥体神经元体抑制。因此,我们推断,最终会破坏NPAS4-NuA4复杂广泛,长期后果作为动物的年龄。这些变化可能包括有害影响基因组的完整性,兴奋性和抑制性的平衡和生物的寿命。值得注意的是,我们观察到损失的神经因素大大雄性和雌性老鼠的寿命缩短,导致平均寿命12和11个月,分别(无花果。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba)。这个结果证实一个独立的结果gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba脱线gydF4y2Ba^39gydF4y2Ba和明确表明了对寿命的影响小鼠的两性(扩展数据图。gydF4y2Ba13小时,我gydF4y2Ba)。生殖系的寿命减少gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba基因敲除小鼠是由于大脑中专门NPAS4的损失是由我们snRNA-seq数据证明NPAS4高度特定的神经元(扩展数据图。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)。此外,老鼠gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba删除在前脑gydF4y2BaCamk2agydF4y2Ba表达兴奋性神经元也降低了寿命(扩展数据图。gydF4y2Ba13 jgydF4y2Ba)。然而,我们不能排除的瞬时表达的可能性gydF4y2BaNpas4gydF4y2Banon-neuronal细胞有助于长寿表型。在一起,这些数据增加的可能性NPAS4-NuA4的保护作用在促进双边带修复有助于确保转录的长期忠诚对刺激的反应和适当的抑制控制的大脑可能是至关重要的正常寿命。gydF4y2Ba

的程度不同的细胞在体内专门化其DNA修复机制了解甚少。新出现的证据表明,神经元不断修复DNA基因组中选择地点gydF4y2Ba^{32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba},但是修复的优先目标的机制仍不清楚。这可能是由于部分地破坏网站的异质性造成的大量的神经元细胞类型不同细胞类型特异的转录活动模式和项目。使用新的小鼠模型的组合、生物化学、单细胞基因组学和电生理学,我们发现了一个专门的神经的NuA4复杂形式组装在NPAS4激活神经元细胞类型特异的诱导转录调节和抑制DNA损伤。我们的研究表明,神经元已经进化出一个特定的染色质调节机制,夫妻突触活动基因组保存。这种机制可以减少累积的损伤在关键监管元素在每个神经元细胞类型和安装适当的保持能力对环境因素的反应。gydF4y2Ba

机制,导致双边带的形成和修复NPAS4-bound地点仍有待阐明。正如前面建议gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba,这些优惠可能源自pre-bound拓扑异构酶酶你修改下游神经元的活动。此外,双边带可能形成的过程中解决dna rna混合动力车(R-loops)或释放停滞转录复合物发生之前迅速诱导静止的监管元素。值得注意的是,NuA4已经绑定R-loops报道gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba,这表明R-loop形成可能导致DNA损伤和修复活动依赖性监管元素。神经系统以外的研究表明,RNA本身可以通过服务促进修复这些转录区域作为模板代替postmitotic细胞的姐妹染色单体gydF4y2Ba^{42gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba}。虽然可能规范nonhomologous结束加入途径调解争端解决机构的维修在激活神经元,NPAS4-NuA4可能涉及到多个修复途径。未来的研究神经元探针的精确机制用来修复activity-induced损伤,包括那些由NPAS4-NuA4,将调查的重要领域。gydF4y2Ba

这项工作提供了一个示例染色质机械专业的大脑和增加了的神经外遗传性特征经常在神经发育和神经退行性疾病特异表达。几个组件NPAS4-NuA4 (gydF4y2BaEp400gydF4y2Ba,gydF4y2BaTrrapgydF4y2Ba,gydF4y2BaActl6bgydF4y2Ba和gydF4y2BaTip60gydF4y2Ba)在神经发育突变和自闭症谱系障碍gydF4y2Ba^{44gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba}。我们发现神经活动之间的联系和DNA修复由NPAS4-NuA4表明,损害依赖性活动监管元素可能是一个神经功能障碍在这些疾病的来源。gydF4y2Ba

失去了在生物基因组完整性是老化的一个特点gydF4y2Ba^{12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13克ydF4y2Ba},并且能够有效地修复双边带与寿命延长哺乳动物的进化gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba。然而,仍然未知的神经活动如何影响基因组稳定性随着年龄的增长和对细胞和生物的寿命。维持神经元活力随着时间的推移,似乎需要小心平衡的兴奋和抑制的适当比例gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba。除了NPAS4在DNA修复的作用,抑制复合损失的gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba基因敲除小鼠可能影响他们的寿命缩短。随着时间的推移,受损NPAS4-NuA4信号可能会破坏一个关键监管反馈回路中删除NPAS4影响基因的表达,调节招聘体细胞的抑制,进而导致过度兴奋,进一步威胁到基因组的稳定性。未来实验,分离的角色NPAS4转录和维修需要理解这两个过程的相对贡献在神经细胞和有机体的寿命。鉴于NPAS4-NuA4 neuronal-specific表达模式,在人类的大脑是守恒的,在神经元受到周期性activity-induced DNA断裂在许多年里,NPAS4-NuA4信号轴也可以作为一个重要的入口点理解认知和感觉处理的故障在人类衰老和神经退行性疾病。gydF4y2Ba

实验模型gydF4y2Ba

小鼠模型gydF4y2Ba

动物使用批准,由哈佛大学制度动物保健和使用委员会和哈佛比较医学中心。以下使用鼠标线:野生型C57 / BL6(杰克逊实验室,000664);gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba14gydF4y2Ba};gydF4y2BaNpas4 -gydF4y2Ba基因敲除gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba;gydF4y2BaTip60gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba49gydF4y2Ba};gydF4y2BaNpas4-Flag-HAgydF4y2Ba(手稿);gydF4y2BaArnt2-Flag-HAgydF4y2Ba(手稿),gydF4y2BaTip60-H3FgydF4y2Ba^50gydF4y2Ba;gydF4y2BaMre11gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba51gydF4y2Ba,gydF4y2Ba52gydF4y2Ba};gydF4y2BaB6; 129 - gt (ROSA) 26 sor < tm5 CAG-Sun1 / sfGFP Nat > / JgydF4y2Ba(杰克逊实验室,021039)gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba;和gydF4y2BaB6.Cg-Tg (Camk2a-cre) T29-1Stl / JgydF4y2Ba(杰克逊实验室,005329)gydF4y2Ba^54gydF4y2Ba。老鼠被安置在温度和湿度环境中使用通风microisolator笼子。老鼠在一个标准的12 h光暗周期,与随意提供食物和水。男性和女性同窝出生仔畜老鼠中使用类似的比例,分为实验组和对照组的实验。没有统计方法被用来预先确定样本大小。动物生物化学和基因组实验,收集整个手稿在4 - 6周的年龄。生理学实验中,动物解剖和修补24 (P24) P28产后的一天。老化实验,动物被收集在3 - 4个月、12个月和汽车几个月的年龄。动物年龄和性别是详细的细节在每个协议。gydF4y2Ba

一代的gydF4y2BaNpas4-Flag-HAgydF4y2Ba和gydF4y2BaArnt2-Flag-HAgydF4y2Ba敲入小鼠行gydF4y2Ba

受精卵注入哈佛大学基因组进行修改设施依照他们的实践和指导原则。指导RNA序列接近的3′末端gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba和gydF4y2BaArnt2gydF4y2Ba位点选择基于预测切削效率和较低的脱靶效应。NPAS4指导RNA序列(5′-cacagacttattcaaaacgt-3′)和ARNT2 (5′-gagtagcttcaggcaaagcc-3′)被克隆到一个包含引导序列上游tracrRNA FUGW骨干(5′-gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtggtgcttttttt-3′)。为体外转录生成模板,使用这些FUGW PCR进行质粒将一个T7启动子使用以下引物:gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba转发(F): 5′-taatacgactcactataggcacagacttattcaaaacgtgttttagag-3′;gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba反向(R): 5′-aaaaaaagcaccaccgactcgg-3′;gydF4y2BaArnt2gydF4y2BaF: 5′-taatacgactcactataggagtagcttcaggcaaagcc-3′;和gydF4y2BaArnt2gydF4y2BaR: 5′-aaaaaaagcaccaccgactcgg-3′。gydF4y2Ba

PCR产品DNA凝胶上验证,以确保一个单一产品和使用试剂盒纯化PCR清理设备。体外转录(溶)使用400 ng纯化RNA模板执行16 h在37°C使用Megascript短记录诊断工具包(热费希尔,AM1354)。使用MEGAclear转录RNA进行清理清理工具(Ambion AM190)。最后,RNA的大小和质量评估通过运行200 ng此种凝胶纯化产品的10%。HDR模板被命令200个基点,从IDT单链片剂,75个基点的同源性的网站。CRISPR指导RNA, Cas9 RNA和片剂捐赠者模板被注入混合背景DBA / C57BL6小鼠受精卵根据哈佛基因组的指导方针和程序修改工具。DNA创始人和FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba后代筛选利用Sanger测序,以确保适当的插入的标记和DNA侧翼地区没有发生突变。gydF4y2BaNpas4-Flag-HAgydF4y2Ba和gydF4y2BaArnt2-Flag-HAgydF4y2Ba老鼠被随后backcrossed C57BL6 / J小鼠和可按照客户要求定制。gydF4y2Ba

老鼠神经元文化gydF4y2Ba

胚胎皮质胚胎16.5天(-17)从5 - 6混合胚胎切割性和合并为一个复制的文化。木瓜蛋白酶(Sigma-Aldrich, 10108014001)被用来分离组织通过一个10分钟孵化在37°C。消化是终止的卵类粘蛋白(胰蛋白酶抑制剂,沃辛顿)。消化组织通过P1000吸管轻轻磨碎释放细胞和通过一个40µm过滤器。神经元是镀上与保利预涂在一夜之间——细胞培养盘子gydF4y2BadgydF4y2Ba赖氨酸(20µg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)和层粘连蛋白(4µg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)。神经元生长在neurobasal介质(Gibco)包含B27补充(2%)、penicillin-streptomycin (50 U mlgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba青霉素和50 U mlgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba链霉素)和glutaMAX(1毫米)。神经元生长在孵化器维持在37°C公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba浓度为5%。收集神经元在体外7天为所有实验(DIV),和新鲜的培养基在3 - 4添加DIV(总量50%),除非另有指示。独立复制生成的准备主要培养的胚胎切割池在不同的日子在文化和维护7 DIV。镀RNA-seq实验,细胞的密度每厘米156250个细胞gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba(每个)150万个神经元在6-well文化菜肴。荧光素酶检测,细胞被镀的密度210526厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba(400000细胞/)24-well文化菜肴。去偏光神经元,神经元接受55毫米氯化钾。治疗与不同的刺激(扩展数据图。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba),7 DIV神经元接受50µM NMDA ng或50毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba脑源性神经营养因子。螯合钙,神经元使用5毫米EGTA 15分钟前刺激与55毫米氯化钾溶液。gydF4y2Ba

实验程序gydF4y2Ba

集合时间点gydF4y2Ba

在癫痫发作被诱导实验,KA(5 - 8毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba(电生理学)或12 - 15毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba(基因表达,急忙逃走,sBLISS-seq和免疫沉淀反应)(Sigma-Aldrich K0250)腹腔注射。基因组层面分析小鼠安乐死2 6到10 h后注入,表示,基于以前的工作表明,即早期基因转录因子和延迟反应基因计划在2和6 h后诱导刺激开始,分别gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}。如果或基底时间点表明小鼠注射生理盐水控制和被切割和并行处理刺激组织。在CA1锥体神经元电生理实验,小鼠死亡18 - 24 h后注射KA水平较低,允许足够的时间NPAS4的表达,其关联依赖性活动目标基因和潜在的突触的执行监管。蛋白质组学分析,老鼠被杀后3小时以内NPAS4注入允许足够的时间来生产和相关的蛋白质复合体的组装。gydF4y2Ba

Stereotaxically引导手术gydF4y2Ba

基因组分析,包括snRNA-seq,急忙逃走,sBLISS-seq P21-P24gydF4y2BaTip60gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}和gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}老鼠被吸入异氟烷麻醉(感应3 - 5%,1 - 3%维护)和定位在一个立体定位框架(科夫)鼠标的温度保持在37°C加热垫。所有手术都是根据协议执行批准的哈佛大学动物保健和常务委员会依照联邦指导方针。皮草在头皮上被使用剃须刀和消毒三种betadine交替洗和70%的乙醇。海马体的基因化验需要广泛的感染,钻是一个磨孔通过上面的骷髅海马体,和一个玻璃吸管充满AAV降低海马的中部地区,使广泛的感染的各种条件(medial-lateral:±2.5;前后:−2.5;dorsal-ventral:−2.5)。AAV (1000 nl,稀释到1.0×10gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba基因组拷贝/毫升)在150 nl分钟注射gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba和吸管替代了5分钟完成后的病毒注入允许病毒蔓延。所有的动物被给予术后镇痛(buprenophine缓释配方,1毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)依照制度动物保健和使用委员会的协议。对于需要稀疏的电生理检测感染海马的CA1区,好小白鼠注射如上所述,但是玻璃针尖端位置在不同坐标限制感染CA1 (medial-lateral:±3.4;前后:−2.9;dorsal-ventral:−2.8),病毒注入的滴定度较低(1.0×10gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba基因组拷贝/毫升)。gydF4y2Ba

急性切片制备gydF4y2Ba

横向海马切片准备gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}和gydF4y2BaTip60gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}岁的C57BL / 6小鼠P21-P28。异氟烷用于使麻醉动物,大脑很快被删除,沿着中线一分为二的,放在冰冷的choline-containing人工脑脊液(choline-ACSF)包含(毫米):110 choline-Cl 25 NaHCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba1.25不gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba2.5氯化钾7 MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba0.5,25葡萄糖,CaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba3.1、11.6抗坏血酸和丙酮酸。Choline-ACSF平衡与95%阿gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和5%的公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。这两个脑半球被转移到一个包含冰冷的choline-ACSF切片室,和300 -μm厚片被削减使用徕卡VT1200S vibratome。片被转移到控股室充满ACSF饱和O为95%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和5%的公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和包含(毫米):127氯化钠,25 NaHCOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba1.25不gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba2.5氯化钾2 CaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba1 MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和25个葡萄糖。片在34°C孵化为30分钟,然后平衡至室温录音前20分钟。所有记录都在室温下进行,并在6小时内完成片的准备。这项工作是用来识别片稀疏感染与Cre-mCherry CA1锥体层,和片> 30%感染CA1锥体神经元没有用于录音。片也被丢弃如果Cre-mCherry表达式CA3或齿状回中可观察到的地区。gydF4y2Ba

电生理学gydF4y2Ba

CA1锥体神经元与红外可视化微分干涉对比显微镜进行全细胞电压钳记录。相邻的未感染和Cre-mCherry-infected神经元被确定使用这项工作由一个发光二极管。神经元对所有实验−举行70 mV。记录硼硅玻璃制成的吸量管(打开2和4之间的电阻MΩ)充满了一个内部解决方案包含(毫米):147中海,NagydF4y2Ba_2gydF4y2Ba磷酸肌酸,10玫瑰,2 MgATP 0.3 NagydF4y2Ba_2gydF4y2Ba三磷酸鸟苷,2 EGTA和5 qx - 314 (Sigma-Aldrich)。内部解决方案是准备在单个批处理,与渗透性调整到290 mOsm CsOH重蒸馏的水和pH值调整到7.3,并储存在−20°C。记录万能,抑制电流通过浴应用药物隔离10µM (gydF4y2BaRgydF4y2Bacpp (Tocris生物科学)和10µM NBQX二钠盐(Tocris生物科学)。细胞外的刺激perisomatic抑制轴突是通过使用一个同心双极电极(FHC)放置在层的中心pyramidale和在100 - 200年μm外侧的一对voltage-clamped细胞。刺激强度使用所需的最小刺激产生一个可靠的IPSC在两个神经元。gydF4y2Ba

电生理数据采集和分析gydF4y2Ba

录音是使用Multiclamp 700 b放大器(轴突仪器),过滤3千赫和采样10 kHz。数据分析与MatLab编写的定制软件。实验丢弃如果保持电流低于600−pA或串联电阻大于25 MΩ。跨同时记录单元串联电阻是每一对在25%以内。在室温下进行录音(19°C)。万能的振幅计算平均振幅0.5女士之前2女士之后的峰值电流。无符号级的突触电流显示清晰。gydF4y2Ba

组织学gydF4y2Ba

男性和女性在平等的比例。小鼠腹腔内注射麻醉的10毫克毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba氯胺酮和1毫克毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba甲苯噻嗪。麻醉后,小鼠灌注transcardially至少10毫升的冰冷的PBS,其次是至少20毫升的4%多聚甲醛(PFA) PBS。大脑被移除,放置在4% PFA在4°C 24 h,紧随其后的是三个连续洗冷PBS。大脑被转移到cryoprotection蔗糖为30%,并在4°C的环境,直到组织平衡并沉没。大脑被嵌入在NEG-50冰冻切片中储存在−80°C到分组(30μm厚)在低温恒温器(徕卡CM1950)。部分存储在PBS在4°C到进一步使用。permeabilized,免疫组织化学,部分被孵化PBS中含0.1% Triton x - 100和5%正常山羊血清(屏蔽解决方案)在室温下1 h。下面列出主要抗体染色(稀释)进行一夜之间在4°C (16 h)温和的颤抖。部分被洗了三次5分钟每个在PBS含有0.1% Triton x - 100。二次抗体染色是由稀释一个Alexa萤石dye-conjugated二级抗体(生命技术; rat Alexa Fluor 555 (A21434), rabbit Alexa Fluor 647 (A31573); 1:250) and incubating slices for 2 h at room temperature. Sections were then washed again three times for 5 min each in PBS containing 0.1% Triton X-100, and then mounted in DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech) and imaged on a slide-scanning microscope (Olympus VS120, VS ASW-FL). Antibodies were diluted in blocking solution as follows: rat anti-HA (Sigma-Aldrich, ROAHAHA; 1:250); rabbit anti-NPAS4 (in house; 1:1,000)^14gydF4y2Ba;兔子anti-ARNT2(房子;1:1,000)gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba;兔子anti-KAT5 (TIP60) (10827 - 1 - ap Proteintech;摘要);兔子anti-cleaved caspase-3(细胞信号技术,9664年代;1:1,000)。gydF4y2Ba

NPAS4-NuA4复合物的免疫沉淀反应gydF4y2Ba

隔离与NPAS4相关蛋白复合物,8 - 12海马分离得到6gydF4y2BaNpas4-Flag-HAgydF4y2Ba和gydF4y2BaArnt2-Flag-HAgydF4y2Ba小鼠注射15毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2BaKA (Sigma-Aldrich K0250)诱导高水平的NPAS4表达式。男性和女性在平等的比例合并复制样品。野生型老鼠相同的年龄和性别分布并行处理作为控制。海马区域被解剖后3小时注射KA允许足够的时间NPAS4表达式和组装成潜在的复合物。海马是收集和dounced 20×10毫升NE1缓冲区(20毫米消息灵通的pH值7.9,10毫米氯化钾,MgCl 3毫米gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,0.1% EDTA Triton和0.1毫米)含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)和磷酸酶抑制剂鸡尾酒2和3 (Sigma-Aldrich P5726和P0044)。细胞核被释放到10分钟的孵化NE1缓冲区,然后由温柔的颗粒状离心(1000 - 1500年gydF4y2BaggydF4y2Ba)。核丸resuspended 1核体积NE1缓冲包装。促进释放chromatin-associated蛋白质、核孵化了30分钟在4°C benzonase核酸内切酶(Sigma-Aldrich、E1014 > 25 KU(1每1000万核µl)其次是氯化钠的添加最后一个300毫米的浓度。后高速离心除去不溶性物质,溶解产物实现最终的盐浓度被稀释的200毫米。事先批准非特异性相互作用,溶解产物孵化为30分钟在4°C 50µl ms-IgG-coated琼脂糖珠(Sigma-Aldrich A0919)。事先批准后,溶解产物是孵化为1.5 h和60µl anti-M2-Flag树脂(Sigma-Aldrich A2220) / 1毫升的稀释溶解产物。样本洗4×NE1缓冲区包含250毫米氯化钠5分钟的旋转在4°C。NPAS4-interacting或ARNT2-interacting蛋白质竞争性筛选了在50 - 100平方米树脂通过孵化µlµg 500毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba3×标志肽(Sigma-Aldrich F4799)稀释在NE1缓冲区在室温下30分钟。质谱分析,筛选了蛋白质与三氯乙酸沉淀。复制图所示。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba由3个独立的8 - 12老鼠从野生型或收集池gydF4y2BaNpas4-FHgydF4y2Ba线条和处理在不同的日子。验证免疫沉淀反应化验使用gydF4y2BaNpas4-Flag-HAgydF4y2Ba老鼠或gydF4y2BaTip60-H3FgydF4y2Ba老鼠是通过免疫印迹分析在相同条件下进行如上所述。为验证实验老鼠视觉皮层光刺激后,20 V1皮层海马是孤立的gydF4y2BaNpas4-Flag-HAgydF4y2Ba或野生型控制。老鼠被安置在黑暗中1星期后跟2 h的光刺激。数据扩展数据图所示。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

隔离高分子量复合物包含完整NPAS4-NuA4质谱,8 - 10 6周gydF4y2BaNpas4-Flag-HAgydF4y2Ba,gydF4y2BaTip60-H3FgydF4y2Ba和野生型控制老鼠注射KA和解剖2 h后注入。男性和女性在平等的比例合并复制样品。复制由独立的8 - 10老鼠池运行在独立的梯度和天。两个进行复制。全前脑-海马和纹状体,被剁碎,转移NE1缓冲区,和核溶解产物是如上所述。大约6毫升梯度是准备使用BIOCOMP梯度大师108(科学服务)使用的长10 - 40%甘油梯度SW41贝克曼转子。样品浓度归一化2毫克毫升左右gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba,1毫升加载的10 - 40%甘油梯度。样本为16 h 37000 r.p.m离心机。在4°C。收集一毫升分数在4°C。分数是运行在sds - page凝胶NuA4评估分数包含组件的复杂。从分数1 - 3免疫沉淀反应分析被执行,这包含大多数TRRAP和EP400溶解产物。从分数事先批准非特异性相互作用,溶解产物孵化了30分钟在4°C 100µl ms-IgG-coated琼脂糖珠(Sigma-Aldrich A0919)。事先批准后,溶解产物为1.5 h和100µl孵化anti-M2-Flag树脂(每1毫升Sigma-Aldrich A2220)分数。样本NE1包含4×250毫米生理盐水冲洗5分钟旋转在4°C。相互作用的蛋白质被筛选了500年M2树脂通过孵化µg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba3×标志肽(Sigma-Aldrich F4799)。洗出液从免疫沉淀反应化验进行分数1 - 3池有足够的材料质谱分析,筛选了蛋白质与三氯乙酸沉淀。gydF4y2Ba

在HEK293T细胞免疫沉淀反应的NPAS4截断突变体gydF4y2Ba

质粒(与哥伦比亚大学启动子FUW)包含序列Flag-HA-tagged”丛书,小君,EGR1 NPAS4或各种截短形式的NPAS4(补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)被CaCl HEK293T细胞中表达gydF4y2Ba_2gydF4y2Babbs转染(2μg DNA, 6×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞)。HEK293T细胞获得热费希尔科学(50188404 fp)。HEK293T细胞没有认证或检测支原体。除了核GFP-FH控制样本,GFP-IRES-NPAS4可视化表达的质粒转染效率。Flag-HA标签附加到氨基酸的NPAS4标记差异最小的可访问性NPAS4变体c端尽头截断。收集的细胞被轻轻刮进冰冷的PBS含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)和被温柔的离心(2000颗粒状gydF4y2BaggydF4y2Ba)。细胞核被孤立,国旗免疫沉淀反应进行如上所述。第二次免疫沉淀反应步骤使用HA是由收集国旗肽洗出液,增加体积为1毫升NE1缓冲区,添加50μl anti-HA树脂(圣克鲁斯生物技术、sc - 7392 AC),轻轻旋转在4°C 1.5 h。样本洗4×NE1缓冲区包含250毫米氯化钠5分钟的旋转在4°C。蛋白质被孵化筛选了树脂与HA肽(热费希尔26184)稀释NE1缓冲区在室温下为30分钟。筛选了与三氯乙酸沉淀蛋白质质谱分析。复制由独立转染文化和免疫沉淀反应化验进行单独的天。gydF4y2Ba

凝胶排阻层析法和蓝色本机凝胶gydF4y2Ba

全细胞溶解产物(Triton x - 100 2%, 50毫米三,150毫米氯化钠和1毫米EDTA)从海马组织或海马和纹状体组织是分次使用400小时1分馏器设置为0.5毫升分gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。缓冲区的列和分馏器由20毫米Tris-HCl pH值7.4,100毫米氯化钠,MgCl EDTA 1毫米,3毫米gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和特里同0.02%。每个收集17分数组成的6毫升,分裂到8 - 16个被加载到本地和分数Novex NuPAGE 4 - 16%凝胶(热费希尔,BN1002BOX)估计的近似大小NPAS4-containing蛋白复合物。本地页面标记(1µl;表达载体,LC0725)被用来估计大小的复合物。蛋白质被转移到PVDF膜和免疫印迹NPAS4(1:1,000)使用内部抗体。gydF4y2Ba

免疫印迹gydF4y2Ba

全细胞或核提取物主要神经元或脑组织被解决在3 - 8% Tris-acetate凝胶(热费希尔,EA0375BOX)或10% Tris-glycine凝胶和转移到硝化纤维膜。一夜之间,膜被孵化在以下主要抗体:EP400(架a300型Bethyl实验室- 541 a;Abcam Ab5201;Abcam, 70301;1:1,000);DMAP1(细胞信号技术,13326;圣克鲁斯,sc - 373949;1:50 0或1:1,000);TRRAP (Bethyl a301 - 132 a;1:50 0或1:1,000); ARNT2 (in house; 1:1,000)^28gydF4y2Ba;1:1,000 NPAS4(房子)gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba;安全系数(在房子;1:1,000);β-tubulin3 (Covance, mms - 435 p;1:5,000);GAPDH (Sigma-Aldrich G9545;1:5,000);组蛋白H3 (Abcam, 1791;1:10,000);NPAS3(来自美国麦克奈特的礼物; 1:1,000)^55gydF4y2Ba;和HA(细胞信号技术,C29F4;1:1,000)。洗后,膜与二次孵化抗体共轭IRdye 700或800,使用LiCOR奥德赛仪器成像。gydF4y2Ba

质谱分析gydF4y2Ba

样本处理根据标准程序的近代质谱设备(哈佛大学)。患者蛋白质与50 mM孵化包含12.5 ngµl碳酸氢铵溶液gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba修改sequencing-grade胰蛋白酶(Promega)在4°C 45分钟。删除多余的胰蛋白酶溶液后,样品被放置在37°C在50 mM碳酸氢铵溶液。肽通过移除碳酸氢铵恢复解决方案,随后在50%乙腈和1%甲酸清洗脱水。gydF4y2Ba

慢病毒生产gydF4y2Ba

生成慢病毒成分表达式构造,21日英国石油公司目标序列的委员会(Sigma-Aldrich) subcloned FUW向量U6启动子的下游。以下序列使用:控制/新成分(5′-gcgcgatagcgctaataattt-3′);gydF4y2BaNpas4gydF4y2BashRNA-1 (5′-ggttgaccctgataattta-3′);gydF4y2BaTip60gydF4y2BashRNA-1 TRCN0000039299 (5′-cctcctatcctaccgaagtta-3′);gydF4y2BaTip60gydF4y2BashRNA-2 TRCN0000039300 (5′-cggagtatgactgcaaaggtt-3′);gydF4y2BaEp400gydF4y2BashRNA-1 TRCN0000109315 (5′-ccgtgaacattagctttgatt-3′);和gydF4y2BaEp400gydF4y2BashRNA-2 TRCN0000305480 (5′-gtcgtcagaaggccttatatg-3′)。gydF4y2Ba

生成LentiCRISPR构造用于测试sBLISS-seq在培养的神经元,以下指导序列克隆到LentiCRISPRv2GFP (Addgene, 82416)使用上市引物序列:(1)gydF4y2BaScg2gydF4y2Ba5′-cggcccgagccctcactca-3′:底漆F: 5′-caccgcggcccgagccctcactcag-3′;底漆R: 5′-aaacctgagtgagggctcgggccgc-3′;(2)gydF4y2BaInhbagydF4y2Ba增强器5′-gagcagccactagcgaaccc-3′:底漆F: 5′-caccggagcagccactagcgaaccc-3′;底漆R: 5′-aaacgggttcgctagtggctgctcc-3′;(3)gydF4y2Ba脑源性神经营养因子gydF4y2Ba5′-tgatagtggaaattgcatg-3′:底漆F: 5′-caccgtgatagtggaaattgcatgg-3′;底漆R: 5′-aaacccatgcaatttccactatcac-3′;(4)gydF4y2Ba”丛书gydF4y2Ba5′-gcgcggtcactgctcgttc-3′:底漆F: 5′-caccggcgcggtcactgctcgttcg-3′;底漆R: 5′-aaaccgaacgagcagtgaccgcgc-3′。gydF4y2Ba

生产慢病毒NPAS4 shRNA-mediated损耗,EP400 TIP60在原代神经元培养或表达LentiCRISPR构造,10µg慢病毒质粒转染到HEK293T细胞随着第三代包装质粒pMDL(5µg), RSV(2.5µg), VSVG(2.5µg)。LentiCRISPR池,2.5µg LentiCRISPRgydF4y2Ba”丛书gydF4y2BagRNA, LentiCRISPRgydF4y2BaScg2gydF4y2BagRNA, LentiCRISPRgydF4y2Ba脑源性神经营养因子gydF4y2BagRNA和LentiCRISPRgydF4y2BaNptx2gydF4y2BagRNA转染,总共10µg的质粒。在转染后12到16小时,转染中换取新鲜培养基,上层清液含有病毒转染48 h后收集。的成分结构,上层清液含有病毒颗粒的转染HEK293T细胞汇集,10 - 15的盘子和病毒粒子被高速离心(25000 r.p.m孤立。90分钟)。颗粒状病毒resuspended一夜之间在100 - 150年在4°Cµl 1×PBS。LentiCRISPR结构,上层清液含有病毒颗粒的转染HEK293T细胞10的盘子收集。粒子被添加沉淀1体积的4×挂钩方案(40% PEG - 8000 1×1.2 M氯化钠PBS pH值7.4)3卷的病毒上清液和存储1 h在4°C。孵化后的挂钩和病毒混合,粒子被离心沉淀,享年1500岁gydF4y2BaggydF4y2Ba45分钟。颗粒状病毒是500年在4°C resuspended隔夜µl 1×PBS。单个病毒滴定度,实现所需的最少的病毒感染约85 - 100%,作为评估GFP花期,决心为每个慢病毒(1 - 10µl每150万个神经元的成分结构,和60µl每150万个神经元LentiCRISPR构造)。神经元DIV shRNA 3日被感染病毒和收集7点DIV RNA-seq分析。神经元与LentiCRISPR DIV 2日被感染病毒和收集7点DIV sBLISS-seq分析。gydF4y2Ba

AAV骨干都是由使用标准的克隆和分子生物学技术。AAV2/9准备在波士顿儿童医院病毒核心。gydF4y2Ba

神经细胞转染和荧光素酶记者化验gydF4y2Ba

荧光素酶诱导被定位NPAS4监管目标增强荧光素酶基因的上游。序列在荧光素酶测试记者化验的基础上选择NPAS4绑定的力量培养神经元如前所述gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba。高亲和性NPAS4网站包括地区从100强中选择高信任度NPAS4-binding峰值。区域扩增小鼠基因组DNA和subcloned菌进行入pGL4.11向量使用标准的吉布森组装。引物序列见下文。gydF4y2Ba

进行荧光素酶化验,400000小鼠海马神经元被镀上24-well文化菜肴和转染质粒用Lipofectamine 2000(英杰公司)根据制造商的协议。5 DIV,神经元与1µg总DNA转染450 ng的萤火虫荧光素酶组成的记者在pGL4.11 DNA, 50 ng pGL4.74 renilla荧光素酶记者DNA (Promega)和500 ng NPAS4超表达结构。Lipofectamine(2µl,英杰公司)是用于每个1µg的DNA。DNA-lipofectamine复合物添加一滴一滴地为2 h,神经元和孵化后转染介质条件神经介质所取代。神经元沉默DIV 6日一夜之间通过添加1µM TTX (Abcam ab120055)和100年µM AP5(热费舍尔,01-061-0)。7点DIV,神经元被收集。总之,神经元洗2×PBS和细胞溶解通过添加500µl被动裂解缓冲(Dual-Luciferase记者分析系统、Promega E1910)。接下来,20μl每个溶菌产物被添加到一个好配角的白色聚苯乙烯96 -好试验板(康宁)。荧光素酶检测试剂二世(LARII)和Stop &如果试剂(Dual-luciferase试验系统,Promega)添加到神经细胞溶解产物,和荧光素酶/ renilla测量是用协同4混合标(BioTek)。gydF4y2Ba

控制变化的转染效率和细胞溶解产物生成,荧光素酶/ renilla比率首次计算出每个独立转染。荧光素酶活性(荧光素酶/ renilla)当时规范化荧光素酶活动的平均价值在核GFP-expressing控制样品收集在同一天同一文化。数据收集从至少三个独立的初级神经元文化生成在分开的日子里,除了峰1 npas4_1 - 699(来自两个独立实验)。对于每个实验文化,两到四个独立的井被转染。所有实验数据从每个独立转染显示。误差在±s.e.m。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用双尾值计算,未配对gydF4y2BatgydF4y2Ba测试使用棱镜(v.8.4.2)。Benjamini-Hochberg修正多重假设检验在R (v.3.6.1)执行。gydF4y2Ba

引物用上市的基因位点克隆进pGL4.11下面列出:gydF4y2Ba

峰1:染色体5:103753620 - 103754119gydF4y2Ba

F: 5′-ggaaacagtgtctcacacaacctgcagggtttctgggcactttcaaaact-3′gydF4y2Ba

R: 5′-caatgccaactgttactagctggcgcgcccgggcaccgggggcagccgggcgag-3′gydF4y2Ba

峰2:染色体7:112679812 - 112680311gydF4y2Ba

F: 5′-ggaaacagtgtctcacacaacctgcaggagcggccccgccgccct-3′gydF4y2Ba

R: 5′-caatgccaactgttactagctggcgcgccttttttggggtcctcctggg-3′gydF4y2Ba

3:峰值染色体8:84197485 - 84197984gydF4y2Ba

F: 5′-ggaaacagtgtctcacacaacctgcaggtgcctgctcgcttgttttacctcc-3′gydF4y2Ba

R: 5′-caatgccaactgttactagctggcgcgcctaccagggcgctgttggggtgggtg-3′gydF4y2Ba

4:峰值染色体1:118,825,347 - 118825846gydF4y2Ba

F: 5“-ggaaacagtgtctcacacaacctgcagggcaggttgatttggtaggaa-3”gydF4y2Ba

R: 5′-caatgccaactgttactagctggcgcgccgtgcaaggagagccgcgggcg-3′gydF4y2Ba

峰5:染色体2:94243619 - 94244238gydF4y2Ba

F: 5′-ggaaacagtgtctcacacaacctgcagggcgggtgtgcaacgggcagagag-3′gydF4y2Ba

R: 5′-caatgccaactgttactagctggcgcgcctcatgtcccacccctaggcttcctc-3′gydF4y2Ba

峰6:染色体12:104415550 - 104416049gydF4y2Ba

F: 5′-agtgtctcacacaacctgcaggcactgcagccagcgtccaccatgctt-3′gydF4y2Ba

R: 5′-aactgttactagctggcgcgcccgactccatctttgacaaaag-3′gydF4y2Ba

验证的定量逆转录聚合酶链反应gydF4y2Ba

RNA提取使用试剂盒RNeasy微工具包(试剂盒,74004),和等量的RNA (100 - 200 ng)所有样本转化为互补使用高容量cDNA工具包(热费舍尔,4368813)根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸是由至少三倍稀释之前运行标准定量PCR (qPCR)与反转录方法使用Sybr绿色主人混合。qPCR进行技术使用QuantStudio 3 qPCR机一式三份(应用生物系统公司)。为每个qPCR目标基因表达规范化看家基因gydF4y2BaGapdhgydF4y2Ba或gydF4y2BaTubb3gydF4y2Ba表示。以下引物被用来增强感兴趣的基因集。gydF4y2Ba

引物组:gydF4y2Ba

GapdhgydF4y2BaF: 5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′gydF4y2Ba

GapdhgydF4y2BaR: 5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′gydF4y2Ba

Tubb3gydF4y2BaF: 5′-TAGACCCCAGCGGCAACTAT-3′gydF4y2Ba

Tubb3gydF4y2BaR: 5′-GTTCCAGGTTCCAAGTCCACC-3′gydF4y2Ba

S100bgydF4y2BaF: 5′-TGGTTGCCCTCATTGATGTCT-3′gydF4y2Ba

S100bgydF4y2BaR: 5′-CCCATCCCCATCTTCGTCC-3′gydF4y2Ba

MoggydF4y2BaF: 5′-ACCTCTACCGAAATGGCAAGG-3′gydF4y2Ba

MoggydF4y2BaR: 5′-TCACGTTCTGAATCCTAAGGGT-3′gydF4y2Ba

Aldh1l1gydF4y2BaF: 5′-CAGGAGGTTTACTGCCAGCTA-3′gydF4y2Ba

Aldh1l1gydF4y2BaR: 5′-CACGTTGAGTTCTGCACCCA-3′gydF4y2Ba

PdgfragydF4y2BaF: 5′-AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC-3′gydF4y2Ba

PdgfragydF4y2BaR: 5′-GTCCCTCCACGGTACTCCT-3′gydF4y2Ba

GfapgydF4y2BaF: 5′-CGGAGACGCATCACCTCTG-3′gydF4y2Ba

GfapgydF4y2BaR: 5′-AGGGAGTGGAGGAGTCATTCG-3′gydF4y2Ba

Grin1gydF4y2BaF: 5′-AGAGCCCGACCCTAAAAAGAA-3′gydF4y2Ba

Grin1gydF4y2BaR: 5′-CCCTCCTCCCTCTCAATAGC-3′gydF4y2Ba

Rbfox3gydF4y2BaF: 5′-ATCGTAGAGGGACGGAAAATTGA-3′gydF4y2Ba

Rbfox3gydF4y2BaR: 5′-GTTCCCAGGCTTCTTATTGGTC-3′gydF4y2Ba

Grin2bgydF4y2BaF: 5′-GCCATGAACGAGACTGACCC-3′gydF4y2Ba

Grin2bgydF4y2BaR: 5′-GCTTCCTGGTCCGTGTCATC-3′gydF4y2Ba

Synapsin1gydF4y2BaF: 5′-AGCTCAACAAATCCCAGTCTCT-3′gydF4y2Ba

Synapsin1gydF4y2BaR: 5′-CGGATGGTCTCAGCTTTCAC-3′gydF4y2Ba

Npas4gydF4y2BaF: 5′-ACCTAGCCCTACTGGACGTT-3′gydF4y2Ba

Npas4gydF4y2BaR: 5′-CGGGGTGTAGCAGTCCATAC-3′gydF4y2Ba

Tip60gydF4y2BaF: 5′-GTCACCCGGATGAAGAACAT-3′gydF4y2Ba

Tip60gydF4y2BaR: 5′-GGAAACACTTGGCCAGAAGA-3′gydF4y2Ba

Ep400gydF4y2BaF: 5′-CAGCTCCTCCTAAGCCACAG-3′gydF4y2Ba

Ep400gydF4y2BaR: 5′-CCTCTTGAAGCTTTGGCAAC-3′gydF4y2Ba

流式细胞仪染色和排序神经元细胞核DNA隔离gydF4y2Ba

神经元细胞核DNA进行排序隔离,切割海马组织放置在1毫升的缓冲区HB (0.25 M蔗糖,25毫米氯化钾,MgCl 5毫米gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,20毫米Tricine-KOH, pH值7.8,德勤1毫米,0.15毫米精胺和亚精胺)和dounced 5×0.5毫米松与紧杵杵和10×。IGEPAL ca - 630(5%, 32µl)添加之前douncing又紧杵5 - 8倍。细胞核悬挂在HB 40-µm过滤器的过滤。细胞核被离心500然后颗粒状gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟和400年resuspendedµl流式细胞仪块/污点缓冲区(1% BSA, 0.05% IGEPAL ca - 630, 3毫米MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在1×PBS)。核与温柔孵化15分钟旋转在4°C。这个阻塞步骤后,核是颗粒状和resuspended在流式细胞仪块/污点缓冲区包含1:1,000稀释的鼠标anti-NeuN-Alexa488(微孔,MAB377X cloneA60)。设置盖茨,同形像控制鼠标IgG-Alexa488(生活技术,MA518167)作为消极的控制以及一个清白的样本。在抗体混合样本孵化1 h和温柔的旋转在4°C。核与流式细胞仪块/污点洗1×缓冲区,和DRAQ5核染料(Abcam ab108410)添加排序前(1:50 0)。NeuN high-expressing核是分开NeuN使用索尼SH800 low-expressing核。核排序直接到ATL裂解缓冲QIAamp DNA微工具包中提供。DNA提取使用QIAamp DNA微工具包(试剂盒,56304)根据制造商的协议和存储在−80°C到扩增子库的准备。流式细胞仪分析在控制数据显示整个手稿进行了使用FlowJo (10.0.8rl)。gydF4y2Ba

流式细胞仪分选AAV-infected神经元细胞核急忙逃走gydF4y2Ba

切割海马组织检查下荧光检测范围GFP(ΔCre)或mCherry (Cre)。未受感染的组织,或在极少数情况下显示感染的荧光团在一个半球,被丢弃。海马被放置在0.5毫升的缓冲区HB (0.25 M蔗糖,25毫米氯化钾,MgCl 5毫米gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,20毫米Tricine-KOH, pH值7.8,德勤1毫米,0.15毫米精胺和亚精胺)和dounced 5×0.5毫米松与紧杵杵和10×。IGEPAL ca - 630(5%, 32µl)添加在douncing紧杵5 - 8次通过40-µm过滤器和过滤。DRAQ5核染料(Abcam ab108410)添加(1:50 0)和核表达mCherry或索尼SH800 GFP是排序。-盖茨决定使用未受感染的组织。核收集1毫升急忙逃走包含2毫米EDTA清洗缓冲。流式细胞仪分析在控制数据显示整个手稿进行了使用FlowJo (10.0.8rl)。gydF4y2Ba

RNA-seq图书馆准备gydF4y2Ba

神经元控制shRNA病毒感染或病毒攻击gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba,gydF4y2BaEP400gydF4y2Ba或gydF4y2BaTip60gydF4y2Ba洗两次了PBS立即去除死细胞和刮成试剂盒。在海马体搭配sBLISS-seq野生型次microdissected组织当时flash冻结和解冻的试剂盒。RNA提取使用RNAeasy工具包(试剂盒)根据制造商的指示。总RNA (1000 ng)是用于生成库后核糖体RNA损耗(NEBNext E6310X)根据制造商的指示(NEBNext E7420)。为培养神经元,读取85个基点上生成一个Illumina公司NextSeq 500,随后分析了与我们的标准化RNA-seq数据分析管道(下图)。野生型次样本,40 bp paired-end读取得到的Illumina公司NextSeq 500。gydF4y2Ba

ATAC-seq图书馆准备gydF4y2Ba

为ATAC-seq库生成的海马神经元亚型体内,gydF4y2BaCamkIIagydF4y2Ba表达CA1锥体神经元被隔绝gydF4y2BaCamk2agydF4y2Ba^CregydF4y2Ba;Sun1gydF4y2Ba^{fl / +gydF4y2Ba}老鼠使用完整的方法gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba。总之,海马在缓冲区HB (dounced 15×0.25 M蔗糖,25毫米氯化钾,MgCl 5毫米gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,20毫米Tricine-KOH, pH值7.8,德勤1毫米,0.15毫米精胺和亚精胺0.5毫米)释放核。细胞核被旋转通过纯化iodixanol梯度在10000gydF4y2BaggydF4y2Ba(见描述核隔离在急忙逃走的实验)。核核膜上表达SUN1-GFP Cre-dependent的方式被孵化孤立的核悬挂10μg anti-GFP抗体(表达载体,G10362) 30分钟在4°C。Antibody-coated核随后被孵化与磁性蛋白质G Dynabeads(热费希尔)。核隔离和计算后,大约30000 - 40000核条件在L1 resuspended裂解缓冲(100毫米HEPES-NaOH pH值7.5,280毫米氯化钠,EGTA 2毫米,2毫米EDTA,特里同x - 100 0.5%,甘油NP-40 1%和20%),其次是5分钟孵化在L2裂解缓冲(10毫米Tris-HCl pH值8.0,200毫米氯化钠)和5分钟孵化ATAC裂解缓冲(10毫米Tris-HCl pH值7.4,10毫米氯化钠,MgCl 3毫米gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和0.1% IGEPAL ca - 630)。gydF4y2Ba

细胞核被调换使用Nextera DNA库准备工具包(Illumina公司,fc - 121 - 1030)如前所述gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba。进行换位为30分钟37°C。转置从单个样本纯化DNA片段,第8 - 11独立编码和放大周期。ATAC-seq库选择碎片从200到1000个基点的凝胶电泳和测序Illumina公司NextSeq 500与75 bp单头读取。gydF4y2Ba

急忙逃走gydF4y2Ba

急忙逃走实验如前所述gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba。NuA4组件的映射4-6-week-old野生型小鼠(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),复制由池4 - 5小鼠分别处理。看到补充表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba复制数据。男性和女性在平等的比例合并复制样品。总之,新鲜的海马组织汇集从4 - 5老鼠放入5毫升的缓冲区HB (0.25 M蔗糖,25毫米氯化钾,MgCl 5毫米gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,20毫米Tricine-KOH, pH值7.8,德勤1毫米,0.15毫米精胺和亚精胺)和dounced 15×0.5毫米的杵。IGEPAL ca - 630(5%, 320µl)添加之前douncing杵5次,样品是透过40-µm过滤器变成15毫升锥形管集合。5毫升的工作解决方案(iodixanol 50%,氯化钾25毫米,5毫米MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba7.8,Tricine-KOH 20毫米,pH值,补充蛋白酶抑制剂,德勤,精胺和亚精胺)添加到样本。均质组织之上轻轻添加2毫升30/40% iodixanol层。样本离心机,享年10000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba18分钟,1毫升的原子核收集30/40% iodixanol接口。核数和均匀分布在以下数量:如果和刺激条件”丛书(房子),H3K27ac (Abcam ab4729): 75000核;NPAS4(房子),EP400(架a300型Bethyl实验室- 541 a;Abcam Ab5201) ARNT2(房子),RAD50(罗福斯生物制品,nb100 - 154): 1000000核;MRE11(罗福斯生物制品,nb100 - 142), CTCF(活动主题,61311),ETL4 (Bethyl实验室、a304 - 928 a): 500000核。的样品FACS-isolatedgydF4y2BaNpas4gydF4y2BacKO老鼠,MRE11和EP400急忙逃走了100000核。复制的感染,FACS-sorted样品由独立池两到三只老鼠。gydF4y2Ba

相同数量的核之间如果(PBS-injected老鼠)和刺激条件(2 h KA-injected老鼠)整除进1毫升急忙逃走洗缓冲区(20毫米消息灵通的pH值7.5,150毫米氯化钠,Tween-20 0.2%, 1毫克毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}BSA、丁酸钠10毫米和0.5毫米亚精胺与蛋白酶抑制剂补充)。磁concanavalin-A (ConA)珠子(刘海实验室),洗急忙逃走绑定缓冲(20毫米HEPES-KOH pH值7.9,10毫米氯化钾,CaCl 1毫米gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和1毫米MnClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)被添加到每个样本结合细胞核。ConA-bead-bound一夜之间,细胞核被孵化在4°C洗缓冲区(20毫米消息灵通的pH值7.5,150毫米氯化钠,Tween-20 0.2%, 1毫克毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}BSA, 0.1% Triton x - 100, 2毫米EDTA, 10毫米丁酸钠和0.5毫米亚精胺与蛋白酶抑制剂补充)包含上述1:50稀释的抗体。gydF4y2Ba

与抗体隔夜孵化后,ConA-bead-bound核与急忙逃走的抗体洗缓冲和resuspended急忙逃走Triton-wash缓冲区(急忙逃走洗缓冲补充Triton x - 100)为0.1%。Protein-A-MNase添加在最后700 ng毫升的浓度gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在4°C,样本孵化1 h。ConA-bead-bound核下洗两次,急忙逃走Triton-wash缓冲区和100年resuspendedμl急忙逃走Triton-wash缓冲区。之后的3μl CaCl 100毫米gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在冰上,样本孵化了30分钟。停止MNase反应,2×100μl停止缓冲(340毫米氯化钠20毫米EDTA 4毫米EGTA, 0.04% Triton x - 100 pg 20毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}酵母在DNA和0.1μg毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}核糖核酸酶A)被添加到每个样本在孵化前20分钟的37°C。孵化后,一块磁铁是用来捕捉Con-A-beads,上层清液含有DNA片段protein-A-MNase发布的收集。2毫升10% SDS和2μl 20毫克gydF4y2Ba^{l−1gydF4y2Ba}蛋白酶K被添加到上层的其次是孵化65°C与温柔的摇晃1 h。使用标准phenol-chloroform提取乙醇沉淀沉淀DNA。gydF4y2Ba

从沉淀DNA测序库生成暂停在TE缓冲(如前所述)gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba,用以下的变化:快速T4 DNA连接酶(酶)被用来执行适配器连接到end-repaired和A-tailed DNA。适配器二聚体被从扩增库使用菌进行1.1×AMPure比XP珠子。急忙逃走库测序在Illumina公司NextSeq 500使用40-bp paired-end读取。gydF4y2Ba

ChIP-seqgydF4y2Ba

ChIP-seq,复制由四到五池老鼠进行独立的日子。ChIP-seq NPAS4从海马组织,从15个老鼠dounced海马5毫升1×PBS含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏,11836153001)。甲醛(1%)被添加到组织匀浆和孵化10分钟在室温下,紧随其后的是0.125米的甘氨酸在室温下为5分钟。γH2AX的芯片gydF4y2BaCamk2agydF4y2Ba表达CA1锥体神经元,细胞核被隔绝gydF4y2BaCamk2agydF4y2Ba^cregydF4y2Ba;Sun1gydF4y2Ba^{fl / +gydF4y2Ba}老鼠使用完整的方法gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba(有关详细信息,请参阅ATAC-seq图书馆准备部分核隔离)。隔离后,核与附加珠子与1%的甲醛交联1毫升1×PBS在室温下10分钟。交联就熄了的0.125米甘氨酸在室温下为5分钟。交联核冻结并存储在−80°C在继续之前的协议下面。gydF4y2Ba

原子核释放组织了10分钟孵化裂解缓冲1(两)(100毫米HEPES-NaOH pH值7.5,280毫米氯化钠,EDTA 2毫米,2毫米EGTA,特里同x - 100 0.5%,甘油NP-40 1%和20%)之后,洗在缓冲区包含10毫米Tris-HCl pH值8.0,氯化钠和200毫米。染色质是剪使用Bioruptor (Diagenode)高功率模式与30年代40-42周期脉冲声波降解法缓冲区(10毫米Tris-HCl pH值8.0,100毫米氯化钠,EDTA 1毫米,0.5毫米EGTA,脱氧胆酸盐钠0.1%和0.5%gydF4y2BaNgydF4y2Ba-lauroylsarcosine)。gydF4y2Ba

声波降解法后,1.5毫升的染色质从海马组织(约60µg)补充1% Triton和孵化一夜之间在4°C 4µg NPAS4(房子)耦合到15µl蛋白质Dynabeads(表达载体,10001 d)。γH2AX芯片,1.5毫升的染色质释放约100000纯化细胞核是孵化2µl反γH2AX (Abcam ab2893)耦合到15µl Dynabeads蛋白质。珠子在0.5毫升以下顺序洗两次缓冲区:低盐缓冲(20毫米三pH值8,150毫米氯化钠,2毫米EDTA, 1% Triton x - 100和0.1% SDS),高盐缓冲(20毫米三pH值8,500毫米氯化钠,2毫米EDTA, 1% Triton x - 100和0.1% SDS),氯化锂洗缓冲区(10毫米三羟甲基氨基甲烷pH值8液,1毫米EDTA, NP-40 1%, 250毫米氯化锂和钠脱氧胆酸盐1%),其次是用1毫升的TE缓冲。Protein-DNA复合物被孵化筛选了掉珠子200μl TE + 1% SDS 30分钟在65°C。DNA交联被孵化了一夜之间在65°C。第二天,RNA和蛋白质被消化掉的10μg核糖核酸酶A和5 - 7μl蛋白酶K(新英格兰生物学实验室,P8107S)。DNA是由标准phenol-chloroform提取纯化。ChIP-seq库生成使用一个鼓掌超低V2工具包(Nugen, 0344 - 32)根据制造商的指示和PCR扩增为13 - 16周期,这取决于抗体。图书馆质量评估使用安捷伦2100生物分析仪(安捷伦科技)。读(75个基点)是使用一个生成Illumina公司NextSeq 500。gydF4y2Ba

snRNA-seqgydF4y2Ba

分离海马核,我们把瞬间冷冻海马组织0.5毫升的缓冲区HB (0.25 M蔗糖,25毫米氯化钾,MgCl 5毫米gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,20毫米Tricine-KOH, pH值7.8,德勤1毫米,0.15毫米精胺和亚精胺)和dounced 5×0.5毫米松与紧杵杵和10×。IGEPAL ca - 630(5%, 32µl)添加在douncing紧杵5 - 8次通过40-µm过滤器和过滤到一个15毫升锥形管集合。缓冲HB(3.5毫升)和5毫升工作方案(iodixanol 50%,氯化钾25毫米,5毫米MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba7.8,Tricine-KOH 20毫米,pH值,补充蛋白酶抑制剂,德勤,精胺和亚精胺)补充道。均质组织之上轻轻1毫升30% iodixanol之上的一层1毫升40% iodixanol从工作的解决方案(稀释)。样本离心机,享年10000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba18分钟,70µl的原子核收集30/40% iodixanol接口。每个样本的整除与锥虫蓝孵化,使用标准的血球计和核数。gydF4y2Ba

snRNA-seq使用10倍基因组学进行铬单细胞工具包(v.3)。每个反应巷满载着10000核从一个海马半球(感染Cre-mCherry或ΔCre-GFP)从一个鼠标。互补脱氧核糖核酸扩增和图书馆准备进行后续步骤根据制造商的协议(10倍基因组学)。样本测序使用Illumina公司NextSeq 500年28日英国石油公司(R1), 56个基点(R2)和8个基点(索引)。gydF4y2Ba

促进病毒的检测记录,剩余2µl UMI-barcoded cDNA是放大在一个单独的组pcr增加大量的UMI-labelled病毒记录。自定义引物被用来放大mCherry或者GFP记录出现在编码cDNA库。嵌套PCR策略使用Q5高保真酶被用来减少非特异性产物,与正向引物在第二反应也添加序列Illumina公司Read2 (R2)放大产品(引物:GFP放大1:5′-CGCCGACCACTACCAGCAGAACACC-3′;GFP放大2:5′-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTgctgganttcgtgaccgccgcc-3′;mCherry放大1:5′- CACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACC-3′;mCherry放大2:5′-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTgcgccgagggccgccactcc-3′)。PCR产品分离后的第一和第二步骤嵌套PCR与SPRIselect试剂使用0.6×大小选择。最终产品从嵌套PCR 1:10稀释,然后放入一个示例使用示例索引索引PCR引物和铬i7样本分度盘,所述的10倍基因组学图书馆准备协议。这些病毒转录sample-indexed飙升到测序运行用于相应的互补脱氧核糖核酸数据库。我们的最终数据集包括两个独立的收集的32418个核gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}老鼠和三个独立收集的44511个核gydF4y2BaTip60gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}老鼠。最终,我们发现12963 Cre-infected和8845ΔCre-infected核gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}snRNA-seq数据集,以及13536 Cre-infected和13461ΔCre-infected核gydF4y2BaTip60gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}数据集(扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

sBLISS-seq培养神经元和孤立的海马核gydF4y2Ba

核孤立、固定和适配器结扎gydF4y2Ba

sBLISS-seq进行培养的神经元细胞核或核分离海马组织根据先前描述的协议gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba。复制由个人为野生型小鼠时间进程。Cre和ΔCre数据集,一个复制的一个受感染的半球从一个鼠标。样本配对,这样2 h KA_CRE1和2 h KA_ΔCre1来自相同的老鼠。对于sBLISS-seq上执行gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba或gydF4y2BaTip60gydF4y2Ba野生型或cKO核感染装甲防护、海马组织解剖并迅速检查下荧光检测范围GFP(ΔCre)或mCherry (Cre)。未受感染的组织,或在极少数情况下显示感染的荧光团在一个半球,被丢弃。AAV-infected海马,组织没有排序,以减少压力可以诱发异位的核DNA断裂。未感染的海马核用于野生型sBLISS-seq次课程中,海马是切割和加工如下所述。gydF4y2Ba

为sBLISS-seq过程海马组织,海马被放置在1毫升的缓冲区HB (0.25 M蔗糖,25毫米氯化钾,MgCl 5毫米gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,20毫米Tricine-KOH, pH值7.8,德勤1毫米,0.15毫米精胺和亚精胺)和dounced 5×0.5毫米松与紧杵杵和10×。IGEPAL ca - 630(5%, 32µl)添加在douncing紧杵5 - 8次通过40-µm过滤器和过滤。保护DNA减免协议的其余部分,细胞核被固定为2% PFA(电子显微镜科学,15710)淬火与125毫米甘氨酸紧随其后。500年离心法在轻轻固定核颗粒状gydF4y2BaggydF4y2Ba。删除多余的碎片和髓鞘,固定核运行通过修改iodixanol梯度。颗粒状核resuspended iodixanol 1毫升的22%,100µl 43% iodixanol之上。核离心机在1500gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟的埃普多夫斗摆动转子离心5804 r。核(100µl)结算43/22%接口,收集和转移到蛋白质Low-Bind管。核与冰冷的PBS洗一次加1% BSA与冰冷的1×2洗PBS紧随其后。固定核数(715000核野生型次课程,大约250000个核gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}和野生型CreΔCre数据集,和大约100000核gydF4y2BaTip60gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}Cre和ΔCre数据集)和被转移到新的管开始适配器结扎。gydF4y2Ba

注意,野生型时间进程在两批样品进行刺激时间点跨越这两个批次。我们观察一批效果处理的样品,这是计算删除(见sBLISS-seq样本的分析)。的批处理相关样品补充表中列出gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。还请注意,野生型样品时间进程包括激增2%人类HEK293T细胞表达减少guide-RNA-induced网站。激增正常化并不是表现在最后数据处理由于低表达的指导和低覆盖率减少读取的网站/样品。gydF4y2Ba

从培养分离核神经元镀在6-well菜Cas9控制实验中,神经元与冰冷的PBS洗清除残骸和1毫升的HB,和32µl 5% IGEPAL ca - 630添加到每个。细胞培养10分钟在HB温柔旋转在4°C去除由温柔的抓取和转移到埃普多夫管。原子核从培养神经元是固定的2% PFA(电子显微镜科学,15710)其次是淬火与125毫米甘氨酸和轻轻颗粒状离心法在500年gydF4y2BaggydF4y2Ba。上述梯度是省略了由于缺乏碎片和髓鞘神经文化。核与冰冷的PBS洗一次加1% BSA与冰冷的1×2洗PBS紧随其后。约1×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba培养核被用于体外CRISPR-Cas9数据集。gydF4y2Ba

固定核孵化1 h在LB2 37°C(10毫米Tris-HCl, 150毫米氯化钠和0.3% SDS)。原子核在CutSmart洗两次洗缓冲区(1×CutSmart(新英格兰生物学实验室,B7204)和0.1% Triton x - 100)。在室温下,原子核钝化使用快速削弱工具包(新英格兰生物学实验室,E1201) 1 h。后两个洗CutSmart洗缓冲区,适配器被绑定到免费使用T4 DNA以完整的核DNA连接酶(5 U mlgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba;热费希尔科学、EL0011)。结扎反应进行了约18 h全能料理机在16°C。第二天,核与CutSmart洗两次清洗缓冲和孵化一夜之间100年µl DNA提取缓冲(10毫米Tris-HCl, 100毫米氯化钠,10毫米EDTA和0.5% SDS)包含10µl蛋白酶K(20毫克毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba;新英格兰生物学实验室)。DNA提取使用标准phenol-chloroform超纯的提取和在18µl resuspended DNase / RNase-free水随后的碎片。gydF4y2Ba

DNA碎片,早期诊断和库生产gydF4y2Ba

体外和野生型时间课程样本使用Bioruptor支离破碎,30年代,60年代,高强度,35 - 40周期。由于有限的输入CreΔCre样本,我们发现使用酶碎片保存DNA片段比声波降解法。因此,所有样本海马组织分散使用内Fragmentase 40 - 50分钟在37°C。这种治疗导致400 - 800 bp大小的碎片,平均库大小约650个基点。碎片和清理后,100 ng(培养神经元样本),200 ng(野生型时间课程样本)或35 ng (Cre和ΔCre样本)进行反向转录MegaClear诊断工具包(热费希尔,AMB13345)。图书馆从早期产品生产没有偏离协议如前所述gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba。总之,模板DNA被孵化溶产品2μl DNaseI(热费希尔,AM2222) 15分钟,和RNA是纯化使用RNAXP干净的珠子。RA3中适配器(/ 5拉普/ TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG / 3 spc3 /)使用T4结扎在RNA RNA连接酶2,截断(新英格兰生物学实验室,M0242L)。RNA被反向转录使用反向引物RTP (5′-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′)和一个上标IV逆转录酶工具包(热费舍尔,18090200)。最后,DNA被放大使用NEBNext超二世Q5大师混合(新英格兰生物学实验室,M0544L) 8 50μl的反应。图书馆是测序用单头75个基点读取Illumina公司NextSeq 500。gydF4y2Ba

END-seqgydF4y2Ba

文化小鼠皮层神经元END-seq被感染的新成分慢病毒DIV 3日7日之前收集DIV。复制由文化上生成独立的日子。为END-seq分离培养小鼠皮层神经元,木瓜蛋白酶(卫氏生化,LK003178)溶解在TrypLE表达酶解决方案在37°C 20分钟前样本集合。培养基轻轻吸气,细胞被轻轻洗一次与PBS 37°C。木瓜蛋白酶解(500µl)被添加到每个神经元在6-well盘子和孵化的37°C 1分钟。木瓜蛋白酶的解决方案是使用吸管,和500年µl研碎的解决方案(与新鲜培养基补充溶解DNase)补充道。细胞与大孔吸管轻轻磨碎5—10次,转移到锥形管和颗粒状。细胞被轻轻resuspended冰冷的PBS中含0.1% BSA和0.5毫米EDTA计数。细胞被存储在冰而整除很快使用血球计算。接下来,150万个神经元为每个实验条件被添加到一个新的锥形管和颗粒状。 Cells were then embedded in agarose plugs using a CHEF Mammalian Genomic DNA Plug kit (Bio-Rad, 1703591) and processed for END-seq as previously described^{32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba58gydF4y2Ba}。实验组连续处理,收集细胞在一个治疗组和嵌入在琼脂糖插头之前收集在未来治疗组细胞减少overdigestion细胞分裂之间的样品和减少时间和嵌入在琼脂糖。我们观察到更好的信噪比和依托泊苷(50µM)细胞治疗。依托泊苷被加入到细胞收集和前6小时50µM包含在所有的解决方案应用于细胞直到嵌入琼脂糖。gydF4y2Ba

扩增子PCR测序(SiMSen-seq)gydF4y2Ba

选择站点进行突变分析gydF4y2Ba

选择网站检查期间为突变负荷老化,宇宙可能的网站检查是由所有访问地区的联盟gydF4y2BaCamkIIagydF4y2Ba表达神经元(主要在CA1海马区细胞类;在我们完整的定义gydF4y2BaCamkIIagydF4y2Ba数据集)和所有地区,在海马H3K27ac细胞核。这生成一组179841个可能的地区,我们认为windows 500个基点的这些山峰的中心。我们计算ATAC-seq规范化阅读强度,H3K27ac急忙逃走,γH2AX ChIP-seq使用函数DeSeq2计数(dds,规范化= TRUE)gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba每一种可能的地区在所有条件。我们还为NPAS4提取规范化信号强度和MRE11使用荷马(荷马/ 4.9)annotatePeaks急忙逃走。pl函数默认正常化1000万测序读。最后,我们决定区域重叠NPAS4和/或MRE11峰值至少1 bp。这些网站被认为是“绑定”。gydF4y2Ba

使用前面提到的地区,我们选择网站查询基于以下标准:(1)最高的网站受NPAS4和MRE11规范化NPAS4信号;(2)网站受NPAS4和MRE11显示增加γH2AX ChIP-seq信号后神经元激活。我们还包括一组站点没有重叠NPAS4或MRE11高峰,作为一个群体的GC含量没有显著差异,染色质易访问性或H3K27ac水平。然而,我们注意到在我们最后的选址,有些网站没有这些条件相匹配的有效放大在我们的分析,因此排除了由于技术因素。最后一组的网站化验补充表中被发现gydF4y2Ba5gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

引物设计使用自定义脚本调用Primer3,与来自Primer3格式gydF4y2Bahttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/input-help.htmlgydF4y2Ba。以下序列附加到正向引物的5′端GGACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNATGGGAAAGAGTGTCC,其中12 Ns随机核苷酸组成一个UMI代表。以下序列附加到反向引物的5′端GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT。引物序列的扩增子有针对性的补充表中可以找到gydF4y2Ba5gydF4y2Ba。引物被命令200点或4海里Ultramers踊跃参与。gydF4y2Ba

生产有针对性的扩增子库gydF4y2Ba

扩增子库生成使用先前描述的协议gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba与一些细微的修改。对所有样本,感兴趣的网站被分成15个引物池集(见补充表gydF4y2Ba5gydF4y2Ba底漆池)。对于每个引物池,20 - 30 ng的DNA分离FACS-isolated NeuNgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba核是第一次放大Phusion热起动II高保真DNA聚合酶(热费希尔,f - 549 l)附加UMI序列DNA模板。每个引物的最终浓度的反应是40 nM。聚合酶链反应参数对这些4周期如下:98°C, 30年代;4周期98°C, 10 s, 62°C, 6分钟72°C, 30年代;其次是65°C 15分钟;95°C, 15分钟。在65°C孵化,孵化的PCR反应终止与10µl蛋白酶(Sigma-Aldrich p5147 - 100毫克;使用0.06的最终浓度µgµlgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)。对于每个引物池,10µl初始产品下一个放大使用Phusion热起动II高保真DNA聚合酶用以下参数:98°C, 3分钟;2-35周期98°C, 10 s 80°C, 1 s;72°C, 30年代;76°C, 30年代。所有与增加0.2°CgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。重复反应进行每个引物池增加UMI抽样的多样性在最后的库。样本size-selected包括产品在长度约275 - 650个基点。分析了使用Debarcer v.0.3.1 (gydF4y2Bahttps://github.com/oicr-gsi/debarcer/releases/tag/v0.3.1gydF4y2Ba)gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

寿命分析和组织NPAS4击倒队列的集合gydF4y2Ba

Npas4gydF4y2Ba野生型或敲除的同胞被安置在符合协议批准的哈佛大学动物保健常务委员会。同窝出生被安置在一起,由训练有素的技术人员监控整体健康。任何不良动物或那些显示健康状况不佳是安乐死在数据收集和审查。动物被用于组织收集的目的最终收集日期前被审查的最终寿命分析。由于COVID-19关闭强加的限制,最后研究了2020年3月,当所有剩余动物解剖。出于这个原因,的寿命gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba野生型的同胞不去完成。生存曲线的意义决定使用一个log-rank (Mantel-Cox)和Gehan-Wilcoxon-Breslow使用棱镜(v.8.4.2)软件测试。gydF4y2Ba

量化和统计分析gydF4y2Ba

统计分析和样本大小的决心gydF4y2Ba

每个实验的统计分析中详细图传说。电生理检测盲法的方式进行,这样条件(saline-injected与KA-injected)分析完成后才显示。统计方法是不习惯预先确定样本大小,但复制数字通常坚持编码协会的指导方针gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba。样本随机化不执行。所有统计分析了棱镜(v.8.4.2)或R (v.3.6.1)。为多个假设修正扩展数据无花果所示。gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba和gydF4y2Ba13 bgydF4y2Ba,gydF4y2BaPgydF4y2Ba值获得使用棱镜(v.8.4.2)纠正使用padjust()函数R (v.3.6.1)在基地。gydF4y2Ba

肽定量质谱gydF4y2Ba

质谱和肽进行了量化的标准实践近代生物质谱设备,哈佛医学院。数据收集使用LTQ Orbitrap Velos精英离子阱质谱仪(热费希尔科学)。简言之,程序Sequest(热费希尔科学)被用来比较多肽和蛋白质数据库获得分散的模式。数据被过滤肽错误发现率1%和2%之间(罗斯福)和数据库包括了版本的所有序列。一式三份NPAS4 immunoprecipitation-mass谱实验从海马组织执行。重复实验进行高分子量分数使用NPAS4-Flag-HA和TIP30-H3-Flag皮质溶解产物。所有质谱肽计数实验提供了补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。3.6.1 (R)包磨边机gydF4y2Ba^{61年gydF4y2Ba}(edgeR_3.28.1; limma_3.42.2)是用于识别蛋白质显著富集NPAS4或TIP60免疫沉淀物样本相对于野生型样品,没有表达Flag-tagged蛋白质。蛋白质被识别至少2/3的复制被包含在刨边机分析。肽在NPAS4发现野生型控制样品和不严格或TIP60样本(即与M2树脂相关背景)被移除之前运行磨边机glmFit()和glmLRT()函数。gydF4y2Ba

测序和比对gydF4y2Ba

所有实验测序Illumina公司NextSeq 500 (Illumina公司Next-Seq控制软件v.4.0.2)。测序数据中提供补充信息表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。单头读取(75个基点)获得ATAC-seq, ChIP-seq, RNA-seq(培养神经元)和sBLISS-seq。Paired-end读取(40 bp)所有急忙逃走的实验中,均获得snRNA-seq实验和海马KA时间进程RNA-seq实验。单头读取(162个基点)获得扩增子库用于突变分析。gydF4y2Ba

ATAC-seq和ChIP-seq样本(即NPAS4芯片和γH2AX芯片),质量调整的执行顺序读取trimmomatic / 0.36 (ref。gydF4y2Ba^{62年gydF4y2Ba}使用以下命令:java jar trimmomatic - 0.33。jar SE线程1 -phred33 [FASTQ_FILE] ILLUMINACLIP: [ADAPTER_FILE]: 2:30:10领先:5落后:5 SLIDINGWINDOW: 4:20 MINLEN: 35。Nextera适配器指定ATAC-seq, TruSeq适配器被指定为ChIP-seq样本。样本随后使用领结mm10基因组排列对齐软件(vbowtie2/2.2.9)非常敏感的设置。读取映射到线粒体基因组被移除。重复的读取是标有皮卡德/ 2.8.0命令java jar皮卡德/ picard-2.8.0美元。jar MarkDuplicates REMOVE_DUPLICATES = false。重复使用samtools随后被删除/ 1.3.1 samtools视图- b - f 1796。gydF4y2Ba

急忙逃走样品,质量读执行削减使用trimmomatic / 0.36使用以下命令:java jar trimmomatic - 0.33。jar PE -phred33 [FASTQ_FILE] ILLUMINACLIP: / n / app / trimmomatic / 0.36 / bin /适配器/ TruSeq3-PE。费尔南多-阿隆索:2:15:4:4:真正的领导:20后:20 SLIDINGWINDOW: 15 MINLEN: 25。根据管道和适配器进一步削减脚本(kseq_test)如前所述gydF4y2Ba^{63年gydF4y2Ba}。Paired-end读取映射到鼠标基因组使用下面的命令:bowtie2/2.2.9 bowtie2——当地very-sensitive-local——no-unal - x mm10——燕尾——没有混合——no-discordant phred33我10 - x 700。酵母在读取映射使用以下命令:bowtie2——当地very-sensitive-local——no-unal - x sacCer3 no-dovetail没有重叠,没有混合——no-discordant phred33我10 - x 700。阅读深度(归一化到100万)或峰值(1)标准化规范化bedgraph Spike_in_Calibration_v2文件创建使用自定义脚本修改。csh如前所述gydF4y2Ba^{63年gydF4y2Ba}。最后,bedGraphToBigWig (ucsc-tools / 363)是用于生成大佬文件从阅读深度规范化bedgraph文件。文件上显示的IGV浏览器显示读取depth-normalized要人。映射sBLISS-seq样本根据执行先前描述的协议gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba。管道从git克隆,克隆的映射gydF4y2Bahttps://github.com/BiCroLab/blissNP.gitgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

为扩增子库分析,适配器对NeuN污染是一个严重的问题gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba排序的数据集。样本因此修剪与以下修剪命令删除这些适配器:java jar trimmomatic - 0.33。jar SE线程1 -phred33 [FASTQ_FILE] ILLUMINACLIP: [ADAPTER_FILE]: 2:30:10领先:5落后:5 SLIDINGWINDOW: 15 MINLEN: 120。FASTQ文件只包含修剪,adapter-removed读取基因表达提供了综合(GEO)提交。满FASTQ文件将根据要求提供。使用默认参数映射使用BWA进行概述在包Debarcer v.0.3.1 (gydF4y2Bahttps://github.com/oicr-gsi/debarcer/releases/tag/v0.3.1gydF4y2Ba)gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

END-seq读取被对齐参考基因组mm10使用subread (v.1.5.1)参数subread-align 1 - t - t 6 - m 3。Samtools (v.1.13)功能,markdup用于创建索引和索引是本文件删除了重复的读取。文件downsampled最低数量的读入任何样本内复制,和标记目录编译使用makeTagDirectory荷马(v.4.9)命令。标记目录是用于生成聚合情节集中在各种使用荷马annotatePeaks基因感兴趣的网站。造10000嘘50 pl与参数。对于统计测试,信号提取窗口内的基因组使用荷马annotatePeaks感兴趣的网站。pl参数造500。gydF4y2Ba

SAR-seq分析gydF4y2Ba

先前发表的gydF4y2Ba^32gydF4y2BaSAR-seq数据集从GEO数据库下载,加入号码gydF4y2BaGSE167259gydF4y2Ba。三个复制中执行的SAR-seq iNeurons (postmitotic glutamatergic神经元来自诱导多能干细胞)检索(gydF4y2BaGSM5100400gydF4y2Ba,gydF4y2BaGSM5100401gydF4y2Ba和gydF4y2BaGSM5100402gydF4y2Ba)。标记目录是用于生成聚合情节集中在各种使用荷马annotatePeaks基因感兴趣的网站。造10000嘘50 pl与参数。对于统计测试,信号提取窗口内的基因组网站使用“annotatePeaks荷马的兴趣。pl 500年造的参数。站点列表生成的老鼠(mm10)被取消在人类与人类SAR-seq hg19使用数据,使用UCSC基因组浏览器liftOver工具。与不重叠的信号来生成网站NPAS4”丛书,NPAS4和安全系数峰会都扩展为1 kb。NPAS4-bound网站(FOS)提交生成使用bedtools / 2.27.1相交床- v选项来生成峰没有NPAS4,反之亦然。gydF4y2Ba

有重大影响的可视化gydF4y2Ba

为ATAC-seq生成大佬文件,ChIP-seq急忙逃走的数据集,所有对齐bam文件为每个复制给定试验条件的汇集和转换为床上格式bedtools / 2.27.1 bamtobed。ATAC-seq和ChIP-seq数据,75个基点读取3′方向扩大到200个基点(平均片段长度ChIP-seq和ATAC-seq实验以生物分析仪)与bedtools污水命令使用以下参数:0 - r 125 - l - s。sBLISS-seq库,映射管道生成一个碱基对削减网站。因此,对于可视化的目的,读取扩展75个基点的3′方向匹配最初的阅读顺序。Mm10黑名单地区被过滤掉使用以下命令:bedops -not-element-of 1 (BLACKLIST_BED)gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba。过滤床文件转换为coverageBED格式使用bedtools genomecov命令使用以下选项:剂量[NORM_FACTOR每个库规模为20米读取芯片,ATAC 20米,10米sBLISS-seq,急忙逃走)和1米bg。最后,bedGraphToBigWig (ucsc-tools / 363)被用来生成有重大影响的文件显示在浏览器使用IGV浏览器追踪整个手稿。gydF4y2Ba

大部分基因表达体外RNA-seq RNA-seq量化gydF4y2Ba

featureCounts包gydF4y2Ba^{64年gydF4y2Ba}被用来计算读入培养神经元RNA-seq数据使用一个自定义过滤注释文件(gencode.v17.annotation。gtffiltered for feature_type=“gene”, gene_type=“protein_coding” and gene_status=“KNOWN”) to obtain read counts along genes for each sample. For differential gene expression analysis, read count tables were TMM-normalized using the EdgeR software analysis package^{61年gydF4y2Ba}。没有任何基因表达在至少三个样本TMM-normalized CPM > 1被进一步分析。轰,limma (edgeR_3.28.1; limma_3.42.2)分析软件包被用来量化(要求FDR-corrected基因差异表达gydF4y2Ba问gydF4y2Ba< 0.01)。RNA-seq配对样本的分析,匹配sBLISS-seq DeSeq2包是用于生成规范化。运行标准DeSeq2管道后,归一化计算生成函数项(dds,规范化= TRUE)gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

基因本体论富集分析gydF4y2Ba

基因本体论(去)富集分析使用gProfiler2 R (v.0.2.0)gydF4y2Ba^{65年gydF4y2Ba},自定义背景expression-filtered来自所有scRNA-seq神经元细胞类型的基因数据集在这个手稿和罗斯福< 0.05。选择去显示在扩展数据图。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba和丰富的完整列表为每个细胞类型和数据集可以补充表中找到gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

snRNA-seq分析gydF4y2Ba

FASTQ文件使用标准bcl2fastq管道Illumina公司创建的。为每一个核基因表达表条形码生成使用CellRanger 3.0.0管道设计的10倍基因组学。样本去复用,所有gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}或gydF4y2BaTip60gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}样本合并使用CellRanger aggr函数使用默认参数。数据集被加载到R和分析使用修(v.3)gydF4y2Ba^{66年gydF4y2Ba}和Monocle3gydF4y2Ba^{67年gydF4y2Ba}包。核被移除的数据集是否包含少于500检测到基因,显示超过5%的读取映射到线粒体基因或RNA计数检测水平大于2个标准差的平均值高于他们指定的细胞类型(这可能反映出紧身衣和多胎)。消除潜在的数据集的对比更严格的方式,我们在R DoubletFinder包使用,评估条形码的数据集是最可能基于转录相似性对比不同的集群gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}。估计我们使用默认参数和紧身上衣的7%基于指导从10 x基因组铬单细胞3′试剂盒v3用户指南和核的数量在每个反应的车道。gydF4y2Ba

所有核在gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}或gydF4y2BaTip60gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}样品被认为是一起聚类和降维。2000强变量在核基因被确定使用修的(v.3) FindVariableFeatures函数,是用来执行使用RunPCA函数PCA(使用默认参数)。共享近邻图构建使用FindNeighbors函数(考虑到前30名主成分)和聚类被分配使用FindClusters函数(决议gydF4y2BangydF4y2Ba= 0.02)。下面的标记基因用于细胞类型分配给校长十集群标识:pan-neuronal (gydF4y2BaRbfox3gydF4y2Ba);pan-excitatory神经元(gydF4y2BaSlc17a7gydF4y2Ba);pan-inhibitory神经元(gydF4y2BaGad2gydF4y2Ba);兴奋齿状回神经元(gydF4y2BaProx1gydF4y2Ba和gydF4y2BaC1ql2gydF4y2Ba);兴奋性神经元CA3 (gydF4y2BaCpne4gydF4y2Ba和gydF4y2BaSpock1gydF4y2Ba);兴奋性神经元CA1 (gydF4y2BaMpped1gydF4y2Ba);神经元兴奋性菌丝层(gydF4y2BaTshz2gydF4y2Ba);少突胶质细胞(gydF4y2BaMoggydF4y2Ba和gydF4y2Ba玛格gydF4y2Ba);少突细胞前体细胞(gydF4y2BaPdgfragydF4y2Ba);星形胶质细胞(gydF4y2BaGfapgydF4y2Ba);小胶质细胞(gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba和gydF4y2BaC1qcgydF4y2Ba);和内皮细胞(gydF4y2BaCldn5gydF4y2Ba)(扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。分配每个核感染状况,我们设置一个阈值检测超过8 mCherry或GFP记录在一个给定的核,它代表一个拐点的比率高于背景检测这些成绩单/核的分布,基于已知的和反映预期的感染模式取向AAV2/9病毒用于这些实验。微分CreΔCre-infected细胞之间的基因表达分析在每个集群进行使用Wilcoxon rank-sum测试使用FindMarkers函数(logfc.threshold = 0.25),和重要的基因被定义为那些有一个调整gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01。热图生成使用自定义函数写在r .小提琴情节生成使用修VlnPlot函数使用默认参数。gydF4y2Ba

我们注意到,在这两个数据集,在每个神经元集群,根据感染细胞subclustered状态(Cre与ΔCre),这种效果并没有受到病毒转录的表达式,因为所有病毒特性从基因表达矩阵中删除。这可能subclustering反映了Cre-infected细胞无法完全耗尽后产生依赖性活动的基因gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba或gydF4y2BaTip60gydF4y2Ba。在刺激后6 h,这些activity-induced基因中最高度表达基因和神经细胞类型不同,因此在很大程度上造成了主成分降维使用的程控集群。我们使用两个独立的分析软件包,修拉(v.3)和Monocle3,打电话和只考虑重要基因的差异表达基因(调整gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)分析。尽管我们发现基因调节和急性后表达下调gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba或gydF4y2BaTip60gydF4y2Ba损耗,我们关注下游分析表达下调的基因更有可能直接被这个复杂的激活。假定的目标基因的差别,以确保我们的观察对这些不仅仅是由于更高的表达或基因的检测ΔCre-infected组织,我们随机抽样从顶尖的10%的最高表达基因(占目标基因高表达整体)和计算ΔCre - Cre组随机选择的基因差异。我们执行10000次迭代分析,使用随机生成一个样本分布差异的基因。实际观察到的差异(使用NPAS4-NuA4目标基因中确定每个神经元亚型)远远超出这个分布(扩展数据图。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

一般来说,NPAS4诱发细胞类型特异的效应不同组pan-neuronal和基因。许多目标被发现普遍2或3细胞类型,和大约10%的目标是特定于一个细胞类。广泛地说,所有NPAS4目标基因的集合丰富的基因功能信息粘附,细胞间信号和轴突引导,以及一组不同的metabotropic ionotropic神经递质受体亚基。除了捕获已知NPAS4目标基因等gydF4y2BaNptx2gydF4y2Ba,gydF4y2BaPlk2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba脑源性神经营养因子gydF4y2Ba1766年,我们发现潜在的新目标NPAS4海马体的分析(补充表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

ATAC-seq ChIP-seq峰打电话gydF4y2Ba

ATAC-seq丰富峰值测定使用MACS2 (v.2.1.1)参数转变100 - p e-5——nolambda keep-dup——slocal 10000,如前所述gydF4y2Ba^{56gydF4y2Ba,gydF4y2Ba69年gydF4y2Ba}。ATAC-seq山峰从个人黑名单地区被如前所述gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba。sBLISS-seq山峰UMI减少床上被称为文件单切的网站被延长的长度测序读(75个基点)。山峰被称为使用MACS2 (v.2.1.1)使用以下参数:峰值MACS2 callpeak——nomodel keep-dup床- p - g毫米1 e-5——格式。可再生的山峰被认为是那些重叠5 8中复制。峰映射到线粒体基因组被移除。最终峰值集扩展500 bp的最大sBLISS-seq峰会上的高峰。峰呼吁芯片样品进行使用MACS2 (macs2/2.1.1)gydF4y2Ba^{70年gydF4y2Ba}使用以下命令macs2 callpeak - t实验(bam) - c(输入bam) - f - p - g的bam毫米1 e-5。gydF4y2Ba

急忙逃走峰打电话gydF4y2Ba

所有调用都使用SEACR_1.1.sh峰值gydF4y2Ba^{71年gydF4y2Ba}。”丛书,H3K27ac CTCF和RAD50急忙逃走数据集,峰值呼吁个人复制使用激增规范化bedgraph文件执行基于片段1 - 1000 bp的长度与以下命令:SEACR_1.1。sh(目标bedgraph][控制bedgraph]规范严格。配对控制样品(免疫球蛋白或敲除控制)补充表中列出gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。确定可再生的峰值集,SEACR山峰中发现3的3 H3K27ac复制(0和2 h KA刺激),3的3”丛书(0和2 h KA刺激),复制3的3 CTCF复制(0和2 h KA刺激),3的3 RAD50复制(0 h)和3的4 RAD50复制(2 h KA刺激)交叉使用bedtools / 2.27.1相交的床。高峰在150年英国石油公司合并。NPAS4、ARNT2 EP400, MRE11 ETL4急忙逃走数据集,峰值呼吁个人使用SEACR_1.1进行复制。sh (ref。gydF4y2Ba^{71年gydF4y2Ba})使用激增规范化bedgraph文件基于片段1 - 1000 bp的长度与以下命令:SEACR_1.1。sh(目标bedgraph][控制bedgraph]规范放松。配对控制样品(免疫球蛋白或敲除控制)补充表中列出gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。确定可再生的峰值集,SEACR山峰中发现4的5 NPAS4复制(2 h KA刺激),3的3 NPAS4复制(0 h KA刺激),两块ARNT2复制(2 h KA刺激),两块EP400复制(0和2 h KA刺激;Abcam抗体),两块MRE11复制(0和2 h KA刺激),两块ETL4复制(0 h KA刺激)和3的4 ETL4复制(2 h KA刺激)交叉使用bedtools / 2.27.1相交的床。高峰在150年英国石油公司合并。最后,急忙逃走信号的最大值在100 bp windows为每个峰值计算从激增规范化权贵文件使用自定义脚本。”丛书、ARNT2 EP400, ETL4 MRE11,最后呼吁延长峰值200个基点上游和下游从这个峰maxima生成500个基点峰要求每个因素和时间点。Mm10列入黑名单的地区gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba被过滤掉使用以下命令:bedops / 2.4.30 -not-element-of 1 [BLACKLIST_BED]。NPAS4山峰被扩展到1 kb,作为上述信息我们发现最大的浓缩(CAGATG)主题和bHLH-PAS主题(CGTG)从峰值最大值1 kb地区扩展。在修订过程中,一个额外的三个复制NPAS4急忙逃走被添加为确认最初的五个复制。这些额外NPAS4急忙逃走复制可以要人GEO提交文件和原始FASTQ文件但没有用于NPAS4峰的分析调用。gydF4y2Ba

峰注释和主题的发现gydF4y2Ba

峰注释作为增强剂,促进剂或其他确定使用annotatePeaks.pl荷马(v.4.9)功能。NPAS4峰值注释进行区域扩展1 kb的峰值最大,随着这些地区最丰富NPAS4图案。安全系数峰值注释进行区域扩展从峰值最大值500个基点。积极监管元素被定义为可再生的ATAC-seq联盟(3的3复制)和H3K27ac山峰(3 3复制)扩展500个基点从监管的最大ATAC-seq信号元素。增强剂被定义为基因间的联盟和intronic结合位点注释。找到丰富图案,每个峰值提取序列潜在使用bedtools / 2.27.1 getfasta命令。相同长度的序列(1000个基点NPAS4和MRE11 sBLISS-seq 500个基点)处理使用Meme-ChIP (gydF4y2Bahttps://meme-suite.org/meme/tools/meme-chipgydF4y2Ba)gydF4y2Ba^{72年gydF4y2Ba}和测试的主题背景(HOCOMOCO v11)意义的报道gydF4y2BaEgydF4y2Ba价值。gydF4y2Ba

峰重叠gydF4y2Ba

确定NPAS4重叠和附加因素,NPAS4峰会被扩展为1 kb。峰重叠测定使用bedtools / 2.27.1相交床允许至少1 bp重叠。生成网站NPAS4不重叠的信号和安全系数,NPAS4和安全系数峰会都扩展为1 kb。NPAS4-bound网站(FOS)提交生成使用bedtools / 2.27.1相交床- v选项来生成峰没有NPAS4,反之亦然。gydF4y2Ba

代的固定线路情节和总情节gydF4y2Ba

固定线路图生成使用荷马(v4.9) annotatePeaks。pl (PEAK_BED) mm10 - d [INPUT_TAG_DIRS]造2000 -ghist嘘25 -noann -nogene。固定线情节从标签生成目录包含合并bam信息复制。总情节生成使用荷马(v4.9) annotatePeaks。除非另有pl函数使用默认参数嘘25日指出的传奇。信号强度是绘制使用自定义脚本R (3.6.1)。总情节显示平均信号在复制s.e.m.绘制。总情节的统计分析,提取信号的所有复制整个窗口中指定图使用荷马(v4.9) ' s annotatePeaks传说。pl (PEAK_BED) mm10 - d (INPUT_TAG_DIRS)与标准化1000万读荷马的默认阅读深度。信号平均在所有复制,Wilcoxon rank-sum测试被用来比较不同条件之间的平均信号在指定的窗口。gydF4y2Ba

海马体神经元监管环境的识别gydF4y2Ba

定义一组监管元素在海马神经元组织样本,我们使用ATAC-seq (gydF4y2BaCamkIIagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba海马神经元),加上积极的组蛋白修饰H3K27ac急忙逃走,描述本构和activity-responsive基因组监管海马的景观元素。我们在基底异形海马组织状态和2 h后的神经元活动同步感应低剂量KA管理。可再生的ATAC-seq山峰被定义为MACS2山峰中确定所有3 3复制/时间点。网站如果和刺激样本连接和合并生成所有可能的列表ATAC-seq山峰在任何刺激条件。可再生的H3K27ac山峰被定义为SEACR山峰中确定所有3 3复制/时间点。网站如果和刺激样本连接和合并生成所有可能的列表H3K27ac山峰在任何刺激条件。最后的景观元素包含179841个元素,定义为可再生的联盟ATAC-seq和H3K27ac峰急忙逃走,ATAC-seq数据集在所有时间点后删除mm10黑名单地区。注意,删除黑名单进行H3K27ac和ATAC-seq网站的结合。产生相同大小的区域,我们确定最大ATAC-seq信号在每个监管元素和扩展这个最大的地区500个基点染色质易访问性峰会。gydF4y2Ba

发现诱导ATAC-seq H3K27ac山峰,我们进行了一次微分表达式分析使用DeSeq2 (v.DESeq2_1.26.0)gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba地区,非零项的至少两个样品。我们定义“诱导元素”在这个设置为这些网站展示增加ATAC信号(双重的增加;调整gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05 DeSeq2;gydF4y2BaPgydF4y2Ba价值观决定了测试的褶皱变化阈值2)和/或增加H3K27ac急忙逃走信号(增长了1.5倍;调整gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05 DeSeq2;gydF4y2BaPgydF4y2Ba价值观决定了测试的褶皱变化阈值1.5)刺激后(11114网站)。监管元素提供了补充表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。注意,没有达到阈值的元素截止至少两个非零项的样品将不会被包括在各自DeSeq2分析选项卡在这个表。gydF4y2Ba

急忙逃走和sBLISS-seq信号的量化基因调控元素gydF4y2Ba

量化转录因子结合强度、软件包荷马(v4.9)首先用于创建标记目录复制每个因素对于一个给定的时间点与命令makeTagDirectory(输入床或BAM)。sBLISS-seq样品、床文件来自先前描述的管道gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba扩大,这样每个UMI在每个位置是单独计算。sBLISS-seq样本,len 0标记添加到创建标记目录占这一事实sBLISS-seq映射生成床上单碱基对减少网站的文件。信号提取/套监管区域使用以下命令:annotatePeaks。pl(床文件)mm10造-noann。转录因子(NPAS4 MRE11、ETL4 EP400,安全系数和RAD50),信号read-depth-normalized使用荷马(v4.9)的默认正常化1000万读。绘制各种基因的信号特性的函数NPAS4绑定力量,我们排在所有监管元素数据集的定义(见上图179841 ATAC / H3K27ac海马体中的元素)根据NPAS4 IgG-normalized急忙逃走信号和区域分割成四分位数在此基础上排名。我们确定NPAS4-normalized信号在每个站点的基础上除以总信号NPAS4急忙逃走(合并NPAS4复制1 - 5)的总信号免疫球蛋白(合并复制f)在任何给定的网站在我们的监管环境。NPAS4第四季度(高)确定网站的网站SEACR-defined峰的重叠NPAS4,最高四分位数的NPAS4 IgG-normalized急忙逃走的信号。NPAS4 Q1(低)网站没有SEACR-defined高峰,在最低四分位数的NPAS4 IgG-normalized急忙逃走的信号。gydF4y2Ba

比较γH2AX, ATAC-seq、H3K27ac MRE11和sBLISS-seq信号在179841中定义的集合我们的监管环境在时间点和条件(例如,不同基因型),提取原始读计数用荷马(v4.9) annotatePeaks。pl函数使用下面的命令:annotatePeaks。pl(床文件)mm10造给-noann -noadj。sBLISS-seq信号,len 0参数只包含量化减少站点结束(1 bp)和防止阅读转变基于估计片段大小。原始信号计数在运行前r .进口DeSeq2 (v.1.26.0),较低的地区数量被排除在外:ATAC-seq, H3K27acγH2AX,我们需要非零项至少在两个样本。sBLISS-seq(野生型时间进程和Cre和ΔCre数据集),这比ATAC-seq稀疏的,H3K27ac急忙逃走,γH2AX,我们只消除零计数所有的地区样本。DeSeq2-normalized计数使用DeSeq2函数生成计数(dds,规范化= TRUE)gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba我们的监管区域设置在所有条件(0和2 h ATAC KA, H3K27acγH2AX和0,2、10 h sBLISS-seq KA)。我们为众多的野生型观测到批处理的效果时间样本。样本来自所有时间点都包含在每一批。然而,去除这些影响计算,我们在DeSeq2包括批处理设计使用下面的命令:DESeqDataSetFromMatrix(设计~ Seq_Batch +条件)。此外,当出口标准化方面,我们使用了limma (3.42.2) limma:: removeBatchEffect(计数(dds对象,规范化= TRUE)。批次处理样品补充表中可以找到gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。信号计数的箱线图绘制ATAC-seq纸,H3K27ac,γH2AX和野生型sBLISS-seq时间课程是基于DeSeq2-normalized值平均在所有复制对于一个给定的高峰。gydF4y2Ba

处理的CreΔCre数据集,DeSeq2正常化计数进行在每个基因型(即原始计数Cre与ΔCre数据集gydF4y2BaNpas4gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}从Cre独立规范化和ΔCre野生型数据集)。我们选择这个设计,因为这些实验进行单独的时候和比较了Cre和ΔCre之间在每个基因型而不是在基因型。占变化sBLISS-seq数据集产生很低的细胞数量Cre与ΔCre数据集,复制受感染动物组成的独立并不平均每个峰上,而是所有复制信息保留在策划信号(无花果。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba12个模拟gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

量化独特的整个基因组gydF4y2Ba

输入读取整个基因组比较优惠,downsampled最低数量的读取了所有样品相比(NPAS4 Cre和ΔCre以及野生型Cre和ΔCre: 21036891读;TIP60 Cre与ΔCre 14262877读)。然后我们每个样本中量化的umi总数,绘制在图。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba12 egydF4y2Ba。注意,我们量化信号在不同监管元素显示在所有其他人物,曾经DESeq2-normalized计数,我们没有downsample输入运行DESeq2前。DESeq2算法占测序深度的差异规范化管道。gydF4y2Ba

量化的突变积累gydF4y2Ba

Debarcer输出(bamPositionComposition)表得到的包Debarcer_v.0.3.1 (gydF4y2Bahttps://github.com/oicr-gsi/debarcer/releases/tag/v0.3.1gydF4y2Ba)gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba。这些表文档共识十家庭数量(即十组读取相同的UMI所有十读取显示相同的基本变化(或缺乏))在给定的扩增子为每个基地。这些表的总数也算UMI家庭匹配参考基因组或显示变化的参考。包括一个给定的扩增子在我们的分析中,我们要求一致的平均数量十家庭所有基地扩增子> 100。引物信息池和扩增子包括在最终的分析中,看到补充表gydF4y2Ba5gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

在R使用脚本,我们计算一个给定的扩增子的突变频率总计从参考和基础变化的总和除以总数基地评估的扩增子(也就是说,共识深度的和十个家庭在所有基地在我们的表)。第一个22个碱基的序列,其中包含的区域底漆放大免疫印迹,被排除在分析避免错误在底漆生产复杂的结果。这个计算了单个突变率为给定的扩增子在一个给定的样本。总变异率包括插入和删除和单核苷酸的变化。计算选择点突变的频率,我们统计的总数选择变化(C > / (G > T)除以总数量的扩增子中给定的基地。因为它是不可能知道链发生了突变,互补碱基变化倒塌成一个单一的类别(例如,C > T结合G >)。插入和删除频率也计算作为一个单独的类别。我们也计算每个扩增子规范化突变率我们每个动物的总变异率除以平均总突变频率在年轻的老鼠。梯度样品老化,野生型老鼠岁3个月大的时候被认为是年轻,12个月大的时候被认为是中年和汽车个月大的时候被认为是老了。极端异常点的归一化突变频率和非规范化频率必须执行哪些操作是删除所有样品使用溃败的测试在0.1%信心(无花果。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba13克gydF4y2Ba)。离群值去除突变和统计测试样本在棱镜(v.8.4.2)。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

进一步研究信息设计是可用的gydF4y2Ba自然投资组合报告总结gydF4y2Ba与这篇文章有关。gydF4y2Ba