微生物源性3-IAA对胰腺癌化疗疗效的影响gydF4y2Ba

多化疗，无论是5-氟尿嘧啶(5-FU)，伊立替康和奥沙利铂联合亚叶酸(FOLFIRINOX)，或吉西他滨和钠-紫杉醇(GnP)，都被认为是转移性PDAC (mPDAC)患者的标准护理。gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}．然而，只有不到一半的患者对这种疗法有反应，而那些没有反应的患者(NR患者)会遭受疼痛，最终在几周内死亡gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba}．PDAC的基因改变不能很好地解释对治疗有反应的患者(应答者(R)患者)和NR患者之间的差异gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba}这使得环境因素——包括肠道微生物群——成为化疗疗效的潜在介质。因此，迫切需要确定可能解释R患者和NR患者之间差异的环境因素，以便为未来的治疗开发新的概念。gydF4y2Ba

肠道菌群已被证明可诱导黑色素瘤患者对免疫治疗产生反应，并可由饮食习惯调节gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba}．在罕见的长期存活的局部PDAC患者中，细菌可以从肠道转移到肿瘤中并控制抗肿瘤免疫激活gydF4y2Ba^{11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}．然而，大多数患有侵袭性免疫治疗耐药mPDAC的患者采用多化疗治疗，目前尚不清楚微生物群或饮食习惯是否以及如何影响其疗效gydF4y2Ba^{1克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

我们招募了30例mPDAC患者，其中23例未接受抗生素治疗，并提供了足够的样本材料，以便在化疗开始前分析肠道菌群(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．该队列的患者主要根据放射反应分为R和NR患者，在疾病稳定或CT扫描缺失的情况下，根据无进展生存期(PFS)和血清肿瘤标志物的降低(见gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba有关详细标准)。R病人(gydF4y2BangydF4y2Ba= 11)的平均PFS为40.9周，显著高于NR患者12.8周的PFS (gydF4y2BangydF4y2Ba= 12)， R患者的总生存期为51.9周，NR患者的总生存期为26.4周。gydF4y2Ba1 b, cgydF4y2Ba)．R患者的微生物区系与NR患者的微生物区系截然不同。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1 d-fgydF4y2Ba)．为了研究微生物群与化疗反应之间的潜在因果关系，我们将前10例招募的R和NR患者的微生物群转移到gnotobio小鼠中，然后原位注射gydF4y2BaPdx1gydF4y2Bacre LSL -gydF4y2Ba喀斯特gydF4y2Ba^{G12DgydF4y2Ba}LSL -gydF4y2BaTrp53gydF4y2Ba^{R172H / +gydF4y2Ba}(KPC)胰腺癌细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba2模拟gydF4y2Ba)．值得注意的是，两组(R和NR)均有4例患者接受FOLFIRINOX治疗，1例患者接受GnP治疗。无论最初的供体治疗方法如何，在化疗(5-FU、伊立替康和奥沙利铂;FIRINOX)(无花果。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)．考虑到肠道细菌可能会转移到PDAC肿瘤中gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba，我们接下来通过16S rRNA测序分析了瘤内细菌。我们只能在12个肿瘤中检测到2个肿瘤内细菌(扩展数据图)。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)，因此假设对化疗的反应是通过循环微生物群衍生的代谢物间接控制的。gydF4y2Ba

为了解决这一问题，我们分析了R和NR患者的血清以及匹配的定殖gnotobio小鼠，并使用液相色谱-质谱联用技术进行了靶向代谢组学筛选。我们发现，与NR患者相比，R中色氨酸代谢物3-IAA是最显著富集的代谢物(图2)。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)．与此一致，与NR菌群相比，用R定殖的gnotobiomice血清中也富集了3-IAA(图2)。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了确定R患者中哪些肠道细菌可以促进3-IAA的产生，我们分析了常见的产生3-IAA的细菌菌株的丰度gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba与NR患者相比，R患者的微生物区系中存在显著差异。在分析的15个3-IAA生产者中，我们发现gydF4y2Ba脆弱拟杆菌gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba叫多形拟杆菌gydF4y2Ba在R患者中增加，并证实其体外产生3-IAA的能力(扩展数据图)。gydF4y2Ba2 h,我gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

接下来，我们想知道是否可以通过调节饮食中色氨酸(3-IAA的前体)的浓度来改变小鼠血清中3-IAA的水平，从而影响化疗的疗效。gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba)．因为色氨酸会损害抗肿瘤免疫反应的发展，从而促进肿瘤的生长gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}在美国，我们首先测试了不同长度的饮食干预。14天的色氨酸暴露促进肿瘤生长，而仅4天的治疗期是不够的(扩展数据图。gydF4y2Ba2 j, kgydF4y2Ba)．因此，我们决定在接下来的实验中选择4 - 5天的干预，以避免促肿瘤作用gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

其次，我们观察到4天的高色氨酸饮食已经足以增加R菌群定植的gnotobio小鼠血清中3-IAA的浓度(图2)。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)．此外，当这种饮食干预与FIRINOX相结合时，我们观察到肿瘤重量下降(图2)。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)．此外，3-IAA血清水平与肿瘤重量呈负相关(图。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)．值得注意的是，这些色氨酸介导的效应——即3-IAA浓度的增加和肿瘤重量的降低——在nr微生物定植的小鼠中消失了(扩展数据图)。gydF4y2Ba2 l, mgydF4y2Ba)．这些数据表明，高色氨酸饮食的影响是由3-IAA介导的，但我们不能排除在这组实验中观察到的反应增加的其他机制。因此，我们直接在特异性病原体无(SPF)小鼠中补充3-IAA，并发现我们的干预足以达到在R菌群定植的小鼠中测量到的浓度，并且不仅在SPF小鼠中，而且在nr定植的gnotobiomice中提高化疗的疗效(图。gydF4y2Ba1 hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3得了gydF4y2Ba)．我们还测试了其他微生物调节的代谢物，这些代谢物与不同的胃肠道癌症有关，如次生胆汁酸脱氧胆酸(DCA)和原发性胆汁酸糖胆酸(GCA)。gydF4y2Ba^{18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba}．此外，我们选择测试在R患者或R-微生物定植的gnotobio小鼠中增加的另外两种代代物，即吲哚衍生物吲哚-3-丙酸(IPA)和马尿酸与FIRINOX联合使用。这些代谢物都没有导致与3-IAA相似的功效(扩展数据图。gydF4y2Ba3 d, egydF4y2Ba)．总之，这些数据表明，在对化疗有反应的人和小鼠血清中，微生物源性色氨酸代谢物3-IAA增加，并且3-IAA的水平可以通过膳食干预色氨酸来调节。此外，3-IAA使即使是化疗耐药的PDAC也容易受到治疗。gydF4y2Ba

微生物群衍生的代谢物，特别是色氨酸代谢物，在形成先天免疫和适应性免疫中起着至关重要的作用gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba这反过来又在决定PDAC的化疗疗效和预后方面起着重要作用gydF4y2Ba^{11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba}．因此，我们决定在未接受化疗或经过治疗的R或nr微生物定殖的gnotobio小鼠中分析肿瘤浸润的免疫细胞。我们持续观察到CD8频率的增加gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba化疗后，与nr -微生物定植的小鼠相比，R-的T细胞和中性粒细胞减少。当比较未处理的小鼠时，我们没有观察到肿瘤浸润免疫细胞的任何变化(扩展数据图。gydF4y2Ba4 a、bgydF4y2Ba)．CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba当T细胞被肠道菌群激活时，可以诱导PDAC的退化gydF4y2Ba^{11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}．然而，消耗CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba或者两者都是CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在接受标准或高色氨酸饮食的r -微生物定植小鼠中，通过抗体治疗的T细胞并没有降低化疗的疗效(扩展数据图)。gydF4y2Ba5模拟gydF4y2Ba)．类似地，CD4细胞衰竭gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞并没有降低SPF小鼠中3-IAA和FIRINOX的疗效(扩展数据图。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)．因此，3-IAA的作用似乎不依赖于T细胞的存在。gydF4y2Ba

中性粒细胞在PDAC中高度丰富，低中性粒细胞计数(中性粒细胞减少)与mPDAC的良好预后相关gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba．3-IAA对具有高浓度髓过氧化物酶(MPO)的细胞具有特异性毒性，这是中性粒细胞的标志gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba．在机理上，MPO可以氧化3-IAA，诱导3-亚甲基-2-恶吲哚(MOI)等有毒产物。gydF4y2Ba^{24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba}．与此相一致，我们发现用3-IAA和FIRINOX培养骨髓来源的中性粒细胞，而不是T细胞(中性粒细胞的MPO水平高于T细胞)导致细胞存活率降低(扩展数据图)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．此外，将MPO添加到骨髓来源的中性粒细胞培养物中或使用具有较高内源性MPO水平的未成熟中性粒细胞(前中性粒细胞)(参考文献)。gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)增加了3-IAA和FIRINOX的毒性(扩展数据图。gydF4y2Ba6 c, dgydF4y2Ba)．相比之下，IPA在体外诱导中性粒细胞死亡方面并没有增加FIRINOX的疗效(扩展数据图)。gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba)．中性粒细胞对3-IAA和FIRINOX反应的进一步表征表明，治疗诱导了中性粒细胞脱颗粒，这被测量为MPO的释放和坏死，但不会导致中性粒细胞细胞外陷阱(NETs)或细胞凋亡的形成(扩展数据图)。gydF4y2Ba6 f-hgydF4y2Ba)．接下来，我们想知道这些结果是否也在体内重现。3-IAA和FIRINOX的联合使用降低了SPF小鼠肿瘤和脾脏中中性粒细胞的频率和数量。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6我gydF4y2Ba)．值得注意的是，仅3-IAA处理并不是这样(扩展数据图。gydF4y2Ba6 jgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

鉴于中性粒细胞来源的MPO在毒性3-IAA产物的释放中起着至关重要的作用，我们想知道这是否可以解释3-IAA和FIRINOX对肿瘤生长的疗效增强。为了解决这个问题，我们建立了野生型或野生型骨髓嵌合体gydF4y2BaMpogydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}老鼠。正如预期的那样，用FIRINOX和3-IAA治疗可导致中性粒细胞减少，并在野生型重组小鼠中显示出协同作用(图2)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．然而，在小鼠中，用gydF4y2BaMpogydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}在骨髓中，添加3-IAA并没有导致更小的肿瘤(图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)，提示MPO对3-IAA和FIRINOX的疗效至关重要。进一步支持MPO的作用，与单独使用FIRINOX相比，3-IAA和FIRINOX治疗野生型SPF小鼠的肿瘤中3-IAA氧化产物MOI增加(扩展数据图)。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)．此外，MOI水平在肿瘤中显著降低gydF4y2BaMpogydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}骨髓重建小鼠(扩展数据图。gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

最后，考虑到芳基烃受体(AhR)的关键作用gydF4y2Ba）gydF4y2Ba作为3-IAA和其他吲哚的细胞内受体gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba，我们想知道gydF4y2BaAhrgydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}骨髓重建小鼠对3-IAA和FIRINOX具有抗性。肿瘤的大小gydF4y2BaAhrgydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}3-IAA和FIRINOX治疗后，骨髓重建小鼠的肿瘤减少程度与野生型重建小鼠相同(图2)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)，反对AhR在调节3-IAA和FIRINOX治疗效果中的作用。此外，AhR在癌细胞中也是可有可无的gydF4y2BaAhrgydF4y2Ba-敲低的KPC细胞在体内对3-IAA和FIRINOX处理有反应(扩展数据图。gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

这些数据表明，3-IAA和FIRINOX的疗效是由免疫细胞来源的MPO授权的，而不是通过AhR信号。gydF4y2Ba

MPO氧化3-IAA可诱导培养中性粒细胞产生ROSgydF4y2Ba^23gydF4y2Ba和ROS是化疗诱导细胞死亡的主要介质gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba．因此，我们假设3-IAA和FIRINOX在MPO存在下的疗效是由ROS介导的。为了解决这一问题，我们用增加3-IAA、3-IAA和中性粒细胞剂量或3-IAA和MPO剂量的方法培养小鼠和人PDAC细胞，同时或不加化疗。3-IAA直接以剂量依赖的方式增加ROS。中性粒细胞或MPO的添加进一步增强了癌细胞中ROS的积累，MPO的添加降低了小鼠和人PDAC细胞系的活力(扩展数据图)。gydF4y2Ba7 d-kgydF4y2Ba)．值得注意的是，直接添加3-IAA氧化产物MOI也增加了FIRINOX在小鼠和人PDAC细胞中的功效(扩展数据图)。gydF4y2Ba7 l, mgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

此外，为了测试3-IAA和FIRINOX处理对体内ROS诱导的影响，我们分别用3-IAA和FIRINOX或单独用FIRINOX处理SPF小鼠。根据我们的体外数据，3-IAA和FIRINOX治疗诱导了高氧化应激，通过流式细胞术测量为癌细胞中的ROS，或在整个肿瘤组织学染色中测量为硝基酪氨酸。gydF4y2Ba7 n, ogydF4y2Ba)．进一步加强ROS生成和3-IAA氧化之间的联系，我们观察到3-IAA和FIRINOX处理癌细胞后的ROS水平大大降低gydF4y2BaMpogydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}与野生型骨髓重建小鼠相比，流式细胞术(扩展数据图;gydF4y2Ba7 pgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

然后，我们想知道在3-IAA-和firinox治疗的肿瘤中，哪些氧化应激相关途径参与了ROS的积累。为此，我们分析了mRNA测序数据中已知的ros产生酶或ros降解酶的表达，将3-IAA和FIRINOX治疗小鼠的肿瘤与单独FIRINOX治疗小鼠的肿瘤进行比较(延长数据图)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．我们发现ros降解酶谷胱甘肽过氧化物酶3 (GPX3)和谷胱甘肽过氧化物酶7 (GPX7)在体内被下调，3- iaa、FIRINOX和MPO在体外KPC细胞中导致GPX3和GPX7类似下调(延伸数据图)。gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba)．击倒的gydF4y2BaGpx3gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGpx7gydF4y2Ba在用FIRINOX治疗后，足以增加癌细胞中ROS的积累，并增加癌细胞对FIRINOX的易感性，其程度与3-IAA和FIRINOX相似(扩展数据图。gydF4y2Ba8 c, dgydF4y2Ba)．值得注意的是，击倒gydF4y2BaGpx3gydF4y2Ba足以在体内建立对FIRINOX的敏感性(扩展数据图。gydF4y2Ba8 egydF4y2Ba)．最后，我们可以证明，ROS积累对于3-IAA和FIRINOX的疗效至关重要，因为使用ROS清除剂治疗gydF4y2BaNgydF4y2Ba-乙酰半胱氨酸(NAC)在r -微生物定殖(即高3- iaa)小鼠中取消了FIRINOX的功效(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

接下来，我们想知道对高水平ROS的分子反应是什么。为了解决这一问题，我们对分离自SPF小鼠的肿瘤进行了靶向蛋白筛选和mRNA测序，这些小鼠分别接受3-IAA和FIRINOX或单独的FIRINOX治疗。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．自噬是从3-IAA和FIRINOX治疗的小鼠分离的肿瘤中下调的主要途径之一(扩展数据图。gydF4y2Ba8 f, ggydF4y2Ba及补充表格gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba)．值得注意的是，自噬是PDAC增殖和茁壮成长的必要代谢程序gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba．接下来，我们发现3-IAA和FIRINOX治疗SPF小鼠分离出的肿瘤中，自噬底物LC3B减少，p62/SQSTM增加(图2)。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8 hgydF4y2Ba)．与此一致，来自r -微生物定殖小鼠(高3-IAA)的肿瘤与来自nr定殖小鼠(低3-IAA)的肿瘤相比，LC3B丰度降低，p62/SQSTM1丰度增加(扩展数据图)。gydF4y2Ba8 i, jgydF4y2Ba)．在3-IAA和FIRINOX治疗的小鼠中，LC3B和p62/SQSTM的变化伴随着肿瘤细胞增殖的下降，以Ki67的表达来衡量(图2)。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)．然而，我们没有观察到凋亡细胞数量的变化，通过cleaved caspase-3测量。gydF4y2Ba8 kgydF4y2Ba)，迟至治疗后三天。为了测试自噬下调是否是解释3-IAA和FIRINOX协同作用的重要下游机制，还是仅仅与观察到的癌细胞增殖减少有关，我们在体内建立了功能增加和功能丧失实验。首先，我们观察到用海藻糖二糖处理gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba通过自噬报告细胞中GFP/RFP比值的降低来测量，使自噬活性正常化gydF4y2Ba^31gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8 lgydF4y2Ba)．其次，海藻糖足以完全逆转3-IAA和FIRINOX的治疗效果，类似于ROS清除剂NAC(图2)。gydF4y2Ba3 e, fgydF4y2Ba)．第三，用自噬阻断剂羟氯喹治疗NR-微生物定植小鼠(低3-IAA)致敏的肿瘤到FIRINOX治疗(图。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)．最后，通过强力霉素诱导的显性阴性ATG4B蛋白(mSt-ATG4B)抑制癌细胞的自噬gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba与未经强力霉素处理的对照细胞(mSt)或mSt- atg4b细胞相比，增加了SPF小鼠对FIRINOX治疗的敏感性(扩展数据图)。gydF4y2Ba8米gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

总的来说，这些数据表明，在FIRINOX治疗过程中，当3-IAA和MPO存在时，ROS的积累增加，癌细胞的应激适应能力受损(即自噬下调)，最终导致肿瘤细胞增殖能力下降。gydF4y2Ba

为了进一步研究3-IAA的潜在治疗意义，我们测试了重复应用3-IAA和FIRINOX对小鼠生存的影响，对其他癌症实体的治疗以及3-IAA与不同化疗组合(即GnP)的疗效。3-IAA和FIRINOX联合使用最多3个周期(但都不是单独使用)，显著增加了原位PDAC的生存时间(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．值得注意的是，3-IAA在治疗皮下结直肠(MC38)或肺(LLC)肿瘤时也与FIRINOX协同作用(扩展数据图)。gydF4y2Ba9 a、bgydF4y2Ba)，也与正位PDAC中的GnP协同作用(扩展数据图。gydF4y2Ba9 cgydF4y2Ba)．这些发现强调了3-IAA在癌症治疗中的潜在作用。gydF4y2Ba

最后，我们想评估我们的发现在人类中的相关性。我们观察到对化疗有反应的患者中性粒细胞减少率较高，这与我们的小鼠数据和已知的中性粒细胞减少与PDAC预后之间的关联一致gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba9 dgydF4y2Ba)．值得注意的是，化疗后中性粒细胞水平下降，但淋巴细胞或单核细胞没有下降，与3-IAA血清浓度相关，这与他们不同水平的MPO所预期的一致(图。gydF4y2Ba4罪犯gydF4y2Ba)．此外，我们观察到3-IAA血清浓度与PFS或总生存率显著相关(汉堡队列;扩展数据表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)，而继发性胆汁酸DCA则不存在。gydF4y2Ba4 f, ggydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9 egydF4y2Ba)．我们在路德维希-马克西米利安大学(LMU)医院的第二组mPDAC患者队列中验证了这些发现(慕尼黑队列;扩展数据表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba4 h,我gydF4y2Ba)．患者特异性(年龄、性别和体重)和肿瘤特异性(肿瘤大小和肿瘤标记物)变量均与PFS显著相关，这反映了其他临床可评估标志物在先验预测化疗反应方面的缺失价值。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9 fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

总之，我们的研究结果确定了微生物源性代谢物3-IAA是PDAC对化疗反应的关键放大器。当3-IAA和MPO在FIRINOX治疗过程中高浓度存在时，ROS的积累增加，癌细胞的应激适应能力受损，最终导致PDAC细胞增殖能力下降。尽管分析的患者数量有限(汉堡队列)gydF4y2BangydF4y2Ba= 23人，其中21人有可用血清样本;慕尼黑队列gydF4y2BangydF4y2Ba= 24)，我们观察到化疗期间(汉堡队列)甚至化疗开始前(慕尼黑队列)测量的3-IAA血清浓度与PFS或总生存期之间存在很强的相关性。gydF4y2Ba

这些数据为开展旨在通过直接治疗或饮食干预提高化疗期间3-IAA血清浓度的临床试验奠定了早期前提，最终甚至提高PDAC NR患者的生存期。通过特定饲粮提高3-IAA底物色氨酸是很容易实现的;然而，这种方法受到菌群组成的影响，正如研究结果所表明的，饮食干预后，3-IAA血清浓度仅在r -菌群定植的小鼠中增加。因此，当有可能在良好的生产规范标准条件下生产3-IAA时，直接用3-IAA处理将是理想的，特别是考虑到它能够绕过不希望的微生物群的存在，正如我们在小鼠中用NR微生物群定殖的实验所显示的那样。gydF4y2Ba

在计划未来的临床试验之前，重要的是要考虑到，在没有化疗的情况下，吲哚或其他色氨酸代谢物可以通过PDAC中的AhR损害抗肿瘤免疫反应的发展gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba．然而，我们的数据显示，4 - 5天不进行化疗的3-IAA治疗不足以影响肿瘤的生长，仅在联合化疗时通过ahr独立机制降低肿瘤的生长。然而，在进行任何介入性研究之前，还需要更多的观察性研究。gydF4y2Ba

另一种方法是粪便微生物移植，目前正在试验用于治疗癌症患者gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba}，可能足以增加3-IAA的血清浓度，并相应地增加对化疗的反应，正如我们使用10个不同人类捐赠者的粪便进行的gnotobiomice实验所示。我们的研究表明gydF4y2Bab . fragilisgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba亚种gydF4y2Ba在R患者的菌群中富集，并能够产生3-IAA。然而，考虑到大量在分类上不同的细菌种类能够产生3-IAA，需要更大规模的研究来揭示这些细菌是否确实负责R患者中3-IAA的产生(参考文献)。gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba})．这些研究有助于缩小未来粪便微生物移植研究的供体选择范围。gydF4y2Ba

在通过3-IAA和FIRINOX治疗对肿瘤大小产生影响的同时，我们还观察到PDAC小鼠模型中中性粒细胞的减少。在患有PDAC的患者中，我们在Hamburg队列中观察到化疗期间中性粒细胞的减少与3-IAA的血清浓度呈正相关。这些数据表明，与小鼠一样，3-IAA也可促进人类中性粒细胞减少症的发展。然而，考虑到其他因素也可导致中性粒细胞减少，如化疗代谢改变、化疗药物排泄受阻或化疗剂量不同gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba在美国，需要针对这一特定方面的研究来确定3-IAA与人类中性粒细胞减少症之间是否存在因果关系。此外，由于中性粒细胞水平在许多癌症类型中是生存的关键预测因素，对其他癌症中所述机制的研究可能是有必要的gydF4y2Ba^{33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

我们的发现有可能对PDAC和其他癌症类型(如结直肠癌)的治疗产生变革性的影响，特别是对接受基于firinox的治疗方案的患者。此外，我们的发现将引发研究的发展，以解决微生物源代谢产物对ros自噬轴的影响，以响应化疗治疗。gydF4y2Ba

患者与人体材料gydF4y2Ba

被诊断为mPDAC并计划使用GnP或FOLFIRINOX治疗的患者被纳入研究(gydF4y2BangydF4y2Ba= 30)。经汉堡伦理委员会(Ethikkommission der Ärztekammer Hamburg, Germany)批准，从所有患者获得知情同意。在治疗的前三个月接受抗生素治疗、治疗前未排便、未开始化疗或患有COVID-19的患者被排除在分析之外(gydF4y2BangydF4y2Ba= 7)。在化疗开始前使用家庭取样试剂盒(OMNIgene, Gut OMR-200)收集粪便进行散弹式宏基因组测序。测序后排除了一个样本，原因是样管过载导致固定不成功，微生物区系表现有限。因此，微生物群分析的最终队列包含22例患者。R和NR患者的分类主要基于肿瘤缩小至少25%，这是通过将治疗开始前的时间点与当地放射科医生评估的一线治疗期间显示最佳反应的时间点进行比较，CT扫描中原发肿瘤和最大转移的减少来计算的(通常认为20 - 30%的变化在CT反应评估中是显著的)gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba)．在疾病稳定或缺失CT扫描的情况下，PFS超过140天的标准(真实世界FOLFIRINOX和GnP队列的中位数PFS)gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba)或血清肿瘤标志物下降至少40%(姑息性PDAC治疗的预后截止gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba)。用于功能实验的粪便收集在不含任何添加剂的试管中，直接运输到实验室，随后用20%甘油(Teknova, G1723)稀释，并在−80°C下冷冻。为了保存大部分供体微生物群用于功能实验，从厕所到冰柜的最大允许周转时间为4小时。化疗第3或第4周期抽血，与磷酸盐缓冲盐水(PBS) 1比1混合，梯度离心分离血浆。慕尼黑队列的血清材料在化疗开始前采集，并按照当地标准进行处理。经慕尼黑伦理委员会批准，所有患者均知情同意(项目编号:284-10)。gydF4y2Ba

动物模型gydF4y2Ba

本研究中使用的所有小鼠均具有C57BL/6基因背景。所有小鼠均按照机构审查委员会“Behörde für Soziales, Familie, Gesundheit und Verbraucherschutz”(德国汉堡)使用。将小鼠置于SPF级或无菌条件下，环境温度为20±2℃，湿度为55±10%，暗光循环12 h。年龄和性别相匹配的4到16周大的幼崽大部分被使用。gydF4y2BaMpogydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}用于建立骨髓嵌合体的骨髓由S. Baldus和M. Mollenhauer提供。gydF4y2BaAhrgydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}用于建立骨髓嵌合体的骨髓由C. Esser提供。gydF4y2Ba

为了定植人类微生物群，将粪便解冻，用脑心灌注肉汤(BHI)清洗，并在BHI中稀释。将200微升的悬浮液口服给关在隔离笼中的无菌小鼠一次。2 - 4周后，肿瘤实验开始。gydF4y2Ba

在小型先导实验的基础上计算样本量，并在治疗开始前对小鼠进行随机化。由于复杂的治疗计划，治疗小鼠的人没有失明。原位PDAC模型为5 × 10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba-10 × 10gydF4y2Ba^4gydF4y2BaKpc, 2 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2BaHy19636, 1 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2BamSt- atg4b /mSt或1 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba以1:1的PBS和Matrigel (Corning, 356231)混合物原位注射敲除的KPC (AhR, GPX，打乱对照)细胞。除非另有指示，否则在注射肿瘤细胞后第20天评估肿瘤重量。皮下肿瘤生长2.5 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Balc - gfp或1 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaMC38细胞被皮下注射到侧翼。皮下肿瘤生长每隔一天用卡尺测量一次。注射肿瘤细胞后第17天评估肿瘤重量。活动实验小鼠皮下肿瘤的最大允许直径为1.5厘米，并且没有超过限制。gydF4y2Ba

对于骨髓嵌合体，受体小鼠在骨髓移植前24小时接受9.6 Gy (BioBEAM 2000)照射。一天后，1 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba-4 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba从野生型中分离的骨髓细胞，gydF4y2BaAhrgydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}或gydF4y2BaMpogydF4y2Ba^{- / -gydF4y2Ba}小鼠经静脉注射转移。转移后3 - 4周，原位注射癌细胞并按如下所述进行治疗。通过对肿瘤浸润免疫细胞的定量PCR (qPCR)验证成功植入。gydF4y2Ba

在指定的时间点(通常是癌细胞注射后第11天)开始腹腔内化疗。奥沙利铂(雅阁)5 mg kggydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}，伊立替康(雅阁)20 mg kggydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}5-FU(美达克)50 mg kggydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}是否像其他研究中描述的那样用于FIRINOX治疗gydF4y2Ba^{38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba}．未使用叶酸和吉西他滨(Hexal) 120 mg kggydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}nab-紫杉醇(Celgene) 30 mg kggydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}用于GnP处理。从化疗前一天开始，每3天单独使用200 μg抗cd8抗体克隆53-6.7 (BioXcell, BE0004)或联合200 μg抗cd4抗体克隆GK1.5 (BioXcell, BE0003)治疗可实现T细胞的清除。对照组小鼠以相似的浓度和间隔用相应的同型对照克隆2A3 (BioXcell, BE0089)处理。自噬诱导是用两次海藻糖(Sigma, T9449)在3 g kg浓度的ip注射实现的gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}化疗的前一天和当天。同样，60毫克千克gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在化疗前一天和化疗当天分别注射PBS溶解的氯喹(Sigma, C6628)。gydF4y2Ba

3-IAA (500 mg kggydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})，除另有指示外，每天用PBS溶解的吲哚乙酸钠盐(Sigma, I5148)口服灌胃，连续5天(化疗前2天至化疗后2天)。吲哚-3-丙酸;Sigma, 57400)， GCA (Sigma, G2878)，马尿酸(Sigma, 112003)和DCA (Sigma, 30960)溶解于PBS中的1 M NaOH中，并使用1 M HCl将ph调整为7.4。以500mg kg的浓度连续灌胃5天gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(3-IPA，马尿酸)或250毫克千克gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}每个(GCA和DCA)。NAC (Sigma, a7250)在任意浓度为1 g l的饮用水中施用5天gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

在化疗前3天开始调整饮食色氨酸，直到治疗后1天。在一项实验中，色氨酸调制总共应用了14天。标准日粮(2.3 g kggydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}色氨酸;Altromin, 1320)改为无色氨酸的合成结晶AA (0 g kggydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}；S9336-E701)高色氨酸饲料或结晶AA色氨酸(12 g kg)gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}；ssnif, S5714-E711)饮食。随后，饮食改回标准饮食。gydF4y2Ba

饲粮中多西环素(Sigma, D9891)剂量为625 mg kggydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}从癌细胞注射后第5天或第8天开始，总共持续7天。随后，饮食改回标准饮食。gydF4y2Ba

为了测量血清代谢物，在实验结束或指定时间点抽血。血液凝固30分钟后离心(1000gydF4y2BaggydF4y2Ba)，其后10分钟。稀释血清，并按具体章节所述使用。gydF4y2Ba

DNA提取和鸟枪宏基因组学gydF4y2Ba

DNA提取时，样品用ZymoBIOMICS 96 MagBead DNA试剂盒(zyymo Research, D4302)分离，用zyymo DNA Clean和concentrizer -5 (zyymo Research, D4004)纯化。文库用NEBnext Ultra II DNA文库准备试剂盒for Illumina (New England Biolabs, E7645)制备，总DNA 150 ng，大小选择400-500 bp, 4× PCR循环。gydF4y2Ba

对于散弹宏基因组学，Illumina文库制备使用NEBNext Ultra II FS DNA文库准备试剂盒(New England Biolabs, E7805)。库的制备是根据制造商的说明进行的。使用AMPure XP珠(Beckman Coulter, A63882)进行大小选择，使用Illumina公司的NEBNext Multiplex寡核苷酸(New England Biolabs, E7335)进行7次PCR富集，然后进行Illumina NovaSeq (2 × 150 bp)测序。gydF4y2Ba

对于生物信息学分析，原始reads被修剪为低质量，并用bbduk对phix174和人类hg19基因组进行过滤(参考文献)。gydF4y2Ba^40gydF4y2Ba)．为了进行物种分类分析，所有文库都与统一人类胃肠道基因组集(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4,644)使用BBMap(参考。gydF4y2Ba^{41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba})．定位率归一化为每百万转录本(TPM)，基因组覆盖率(基因组宽度)小于10%的基因组被认为在样本中不普遍。数据以宏基因组操作分类单位(OTUs)总结为biom格式，并用phyloseq和LEfSe进行分析(参考文献)。gydF4y2Ba^{43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba})．使用HUMAnN3进行了物种水平的功能分析，也使用了人类微生物组的990万个基因综合参考目录gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

菌株和分离gydF4y2Ba

叫多形拟杆菌gydF4y2Ba2079年(DSM),gydF4y2Bab . fragilisgydF4y2Ba(DSM 2151)及gydF4y2Ba普氏菌coprigydF4y2Ba(DSM 18205)来自德国微生物和细胞培养集(DSMZ)。为了分离细菌，将冷冻在甘油中的粪便样本解冻，并在BHI血液琼脂板(5%去纤维羊血和维生素K)上进行厌氧稀释gydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba})补充万古霉素。琼脂板在37℃培养箱中培养2天后，将单个菌落采摘到96孔板中的BHI-S培养基中，进一步培养24 h。用特异性引物PCR筛选得到的细菌培养物gydF4y2Ba亚种gydF4y2Ba（gydF4y2Bab .θgydF4y2BaF 5 ' -GAGGGTGTCGTATTTCCGAAGG-3 ' R 5 ' - gttccctgatccagtgtgttg -3 ')或gydF4y2Bab . fragilisgydF4y2Ba（gydF4y2Bab .碎片弹gydF4y2Baf5 ' -aatgattccgcatggtttca-3 ' r 5 ' -attttgggattagcatacgg-3 ')。在琼脂板上传代pcr阳性孔以获得纯培养物并通过Sanger测序进一步确认其身份后，将得到的菌株保存在BHI-S中，直到进一步使用。所有菌株在添加10%胎牛血清(FBS)和维生素K的BHI肉汤中进行厌氧培养和维持gydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}(BHI-S)。gydF4y2Ba

细菌上清液的提取gydF4y2Ba

添加1%色氨酸的BHI-S培养基从完全生长的隔夜细菌培养物(1:50比例)中接种，厌氧培养至指数期早期。培养物从厌氧室中取出，以4,700转/分(4,816gydF4y2BaggydF4y2Ba)室温5分钟。去除上清液，并立即在−20°C冷冻。gydF4y2Ba

16S rRNA测序gydF4y2Ba

使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen, 69504)从肿瘤中提取DNA。用蛋白酶K在ATL缓冲液中在56°C下消化约10 mg组织1小时。之后，样品按照制造商的规程进行处理。在样品提取过程中加入空白提取对照。gydF4y2Ba

根据先前的报道，使用引物对27F-338R双条形码方法扩增16S rRNA基因的可变区域V1和V2gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba．对于肿瘤，使用3.5µl DNA进行扩增，PCR产物使用琼脂糖凝胶电泳进行验证。最终PCR产物使用SequalPrep归一化板试剂盒(Thermo Fisher Scientific, A1051001)进行归一化，在Illumina MiSeq v3 2×300bp (Illumina)上进行等量混合和测序。测序后的解复用基于条形码序列中0错配。数据处理使用DADA2进行gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba大数据集工作流程(gydF4y2Bahttps://benjjneb.github.io/dada2/bigdata.htmlgydF4y2Ba；V1-V2区域调整的工作流程可以在这里找到:gydF4y2Bahttps://github.com/mruehlemann/ikmb_amplicon_processing/blob/master/dada2_16S_workflow.RgydF4y2Ba)，形成扩增子序列变异(ASVs)丰富表。使用DADA2中提供的贝叶斯分类器和核糖体数据库项目(RDP)版本16版本对asv进行了分类注释。不能划分为属级的序列被归类为尽可能精细的分类学分类。gydF4y2Ba

代谢组学的屏幕gydF4y2Ba

我们使用超高压液相色谱-串联质谱(UPLC-MS /MS)在正电离和负电离模式下获取数据，从而对630种代谢物进行识别和定量。血浆样品使用MxP Quant 500试剂盒(Biocrates)根据制造商的说明进行处理。简单地说，将10µl血浆样品、校准标准品和对照品转移到含有内标的过滤器上进行内标校准。过滤器使用压力管汇(Waters)在氮气流下干燥。样品用衍生化试剂异氰酸苯酯孵育60 min。在氮气下干燥后，用5 mmol l提取分析物gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}进一步稀释洗脱液进行UPLC-MS /MS分析。有针对性的分析涵盖630种代谢物(gydF4y2Bahttps://biocrates.com/mxp-quant-500-kit/gydF4y2Ba)经UPLC分离和流动注射分析(FIA)后，用MS/MS检测。每次测量需要进行两次UPLC测试和三次FIA测试，以覆盖所有代谢物。所有分析均在ACQUITY UPLC i级系统(Waters)上进行，该系统与Xevo TQ-S质谱仪(Waters)耦合。采用C18 lc色谱柱(Biocrates)，以0.2%甲酸水溶液和0.2%甲酸乙腈为洗脱体系进行反相色谱分离。FIA的溶剂是甲醇，由套件制造商提供一种改进剂。UPLC-MS /MS结果的数据分析基于7点曲线或一点校准和内部标准归一化。低于较低阈值的值被设置为零。浓度数据使用MetaboAnalyst v.5进行分析。浓度在分析和原始前进行对数转换gydF4y2BaPgydF4y2Ba值和日志gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}-变换后的折叠变化值如图所示。gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba．gydF4y2Ba

3-IAA和DCA CLIAgydF4y2Ba

为了量化3-IAA或DCA血清浓度，用PBS和化学发光免疫试验(CLIA)将小鼠或人血清稀释1至10 (Abbexa, 3-IAA abx190011;DCA 258844)根据制造商的协议进行。为了检测培养物中的3-IAA，上清液按上述方法处理后直接用于检测。使用flustar Omega (BMG Labtech)检测化学发光，每个孔采样1秒，每次试验分别调整增益3,400至4,000。浓度用提供的标准进行测定，用Prism 8.4.0进行插值。gydF4y2Ba

肿瘤组织中3-IAA和MOI的测定gydF4y2Ba

将冷冻的肿瘤组织与1:1-3的冰冷甲醇混合，并使用均质器(Precyllys 24 touch)以5,500 rpm的速度使用0.4 mm的珠子均质2 × 30秒。萃取物离心(10,000gydF4y2BaggydF4y2Ba上清液用于LC-MS /MS分析。反相色谱采用联苯固定相(Raptor biphenyl (Restek)，尺寸:50 mm × 2.1 mm ID;粒径:2.7 μ m)洗脱液A:水+ 0.1%甲酸+ 5mm醋酸铵，洗脱液B:甲醇+ 0.1%甲酸+ 5mm醋酸铵。流速设置为0.5 ml / min。从95%洗脱液A开始洗脱，在0.5 min内线性下降至75%。在回到初始条件之前，该组合物保持4分钟。注入体积为2µl，柱温为55℃。采用MRM (multiple reaction monitoring)模式检测3-IAA和MOI。电喷雾正电离后监测到以下转变:3-IAA:gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba176.2 > 103.0;gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba176.2 > 130.2;我:gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba148.1 > 120.2;gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba148.1 > 130.2;gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba148.1 > 133.1。定量是根据标准曲线进行的。gydF4y2Ba

免疫细胞分离及流式细胞术gydF4y2Ba

肿瘤被切成相似大小的小块。用冷PBS冲洗肿瘤，用RPMI (Sigma, 61870044)补充10% FBS (Gibco, 10500064)， 2.5 mg ml消化gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}胶原酶D (Roche, 11088866001)和0.2 mg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}DNase l (Roche, 11284932001)在37°C连续摇动35分钟。之后，悬浮液通过40 μ m细胞过滤器过滤，并用冷PBS淬灭。随后，免疫细胞或肿瘤细胞用Fc阻断染色和活/死染色(赛默飞世尔科学公司L34957和L10119)在黑暗中染色30分钟。然后清洗细胞，用指示的流式细胞仪抗体染色，再次在黑暗中孵育30分钟。流式细胞仪在Fortessa流式细胞仪(BD)上进行。为了评估免疫细胞的细胞因子谱，用50 ng ml重新刺激T细胞gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}PMA, 500 ng mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}离子霉素1µg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}brefeldin A在37°C下进行3小时。表面染色后，使用eBioscience Foxp3细胞内染色试剂盒(00-5523-00)对细胞进行固定和渗透。使用以下细胞内抗体:IFNγ(1:200稀释)和TNF(1:40稀释)。使用以下表面抗体对淋巴细胞(CD3(1:300稀释)、CD4(1:500稀释)、CD8(1:400稀释)、CD19(1:100稀释)、CD44(1:500稀释)、PD-1(1:40稀释)、NK1.1(1:40稀释)或髓系细胞(CD11b(1:80稀释)、CD11c(1:300稀释)、CD45(1:80稀释)、Ly6G(1:80稀释)、Ly6C(1:600稀释)、Ly6B(1:200稀释)、CD115(1:300稀释)、F4/80(1:60稀释)、MHCll(1:60稀释)进行分类。上皮癌细胞用EPCAM抗体(1:200稀释)染色。Ly6B染色采用山羊抗大鼠IgG抗体(1:400稀释)。流式细胞仪使用2500 ~ 5000个珠(Spherotec, ACBP 100-10)计数细胞。根据制造商的方案，使用PI/Annexin V染色评估体外中性粒细胞的生存能力。经上述组织消化后，测定体内免疫细胞中ROS的表达。然后，ROS染料CellROX (Thermo Fisher Scientific, C10422)以1:10 00稀释与流式细胞仪抗体平行染色。 Software analysis and histogram generation was carried out using FlowJo v.10.

细胞培养gydF4y2Ba

KPC细胞来源于Ximbio，目录号153474;Hy19636_GLRM报告细胞和mSt- atg4b /mSt细胞由A. Kimmelman提供gydF4y2Ba^31gydF4y2Ba；MC38和LLC-GFP (ATCC)细胞由A. Giannou提供;MIA PaCa-2、BxPC-3、T3M-4细胞(均为ATCC)由C. Güngör提供。所有细胞支原体污染检测均为阴性。细胞在37°C和5% CO的标准条件下保存gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}并定期进行目视检查。细胞在DMEM GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific, 10566016)中培养，补充青霉素和链霉素(Gibco, 15140122)和10% FBS (Gibco, 10500064)。在体外实验中，癌细胞在96孔板中以每孔5000 - 10,000个细胞被镀。除了中性粒细胞共培养、gpx敲低细胞处理或与MPO共同处理的实验外，允许细胞过夜播种。随后，开始使用指定化合物和治疗时间进行治疗。3-IAA或3-IPA (3-IPA, Sigma, 57400;3-IAA, Sigma, I3750)溶解于PBS中的1 M NaOH中，ph调整为7.4，根据需要使用1 M HCl或DMSO。NAC在PBS中稀释，并以1 mM的浓度使用。HgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}OgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}(Sigma, H1009)在400 μ M浓度下使用。gydF4y2Ba

根据制造商的方案，使用MTT或MTS试验(Abcam, ab201191和ab197010)评估肿瘤细胞的活力和增殖。使用flustar Omega (BMG Labtech)评估吸光度。在其他实验中，使用SYTOX (Thermo Fisher Scientific, S34857)， PI (Biolegend, 421301)和2500 - 5000计数珠(Spherotec, ACBP 100-10)作为参考，流式细胞术评估了活性。同时，根据制造商的方案，使用CellROX (Thermo Fisher Scientific, C10422)测量细胞内ROS，并通过流式细胞仪进行评估。gydF4y2Ba

中性粒细胞或T细胞从健康小鼠的骨髓或脾脏中分离，并使用荧光激活细胞分选(FACS)进行分类，如LY6GgydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞受体)和βgydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba或CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba,分别。在96孔板中以每孔20,000-50,000的浓度播种细胞。中性粒细胞或T细胞的活力在实验指定时间采用SYTOX(赛默飞世尔科学公司，S34857)或PI/Annexin V染色(Biolegend公司，640914)的流式细胞术进行评估。在一些实验中，200 mU mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}MPO或400 mU mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}添加MPO (Merck, 475911)或指示浓度的MOI (Sigma, 493397)。通过MPO的释放来评估中性粒细胞的脱粒情况。共1 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba中性粒细胞按上述方法采用流式细胞仪进行分类。中性粒细胞在HBSS中孵育(Gibco, 14065-56)和指定的治疗，或gydF4y2BaNgydF4y2Ba-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP;加入Merck, F3506)作为阳性对照。孵育30分钟后，使用MPO活性测定试剂盒(Abcam, ab105136)根据制造商的方案测定MPO活性。中性粒细胞的NET形成与指示化合物或100 nM phorbol-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA;Merck, 524400)作为阳性对照。流式细胞术检测NETs为sytox阳性细胞。gydF4y2Ba

中性粒细胞前经流式细胞仪(流式细胞仪)分类(谱系阴性(CD3,NK1.1,CD19,B220)gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba, CD115gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba, Ly6BgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba, Ly6GgydF4y2Ba^{int-lowgydF4y2Ba})，如上文所述gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba在96孔板中以每孔2万到5万的密度培养。应用指示处理，流式细胞仪PI染色评估生存能力。gydF4y2Ba

MPO活性gydF4y2Ba

肿瘤内或骨髓来源的中性粒细胞(LY6GgydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)或前中性粒细胞(世系阴性(CD3,NK1.1,CD19,B220)gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba, CD115gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba, Ly6BgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba, Ly6GgydF4y2Ba^{int-lowgydF4y2Ba})以FACS分类。根据制造商的方案(Abcam, ab219925)，共处理了50,000个细胞，使用MPO活性测定试剂盒进行MPO活性测定。荧光分析使用flustar Omega (BMG Labtech)。MPO活度根据制造商协议建议的标准曲线计算。gydF4y2Ba

蛋白质的屏幕gydF4y2Ba

每组3只小鼠的肿瘤组织汇总，使用scioExtract buffer (Sciomics)提取蛋白质。用scioDye 2 (Sciomics)在调整后的蛋白质浓度下标记样品2小时。参考样品用scioDye 1标记(Sciomics)。2 h后停止反应，用PBS交换缓冲液。所有标记的蛋白质样品保存在−20°C直到使用。样本采用基于scioDiscover抗体微阵列(Sciomics)的参考设计的双色方法进行分析。这些阵列在Hybstation 4800 (Tecan)上用scioBlock (Sciomics)进行阻塞，然后使用双色方法与参考样品进行竞争性孵育。孵育3 h后，用1× PBSTT彻底清洗载玻片，0.1× PBS清水冲洗，氮气干燥。使用Powerscanner (Tecan)进行滑片扫描，仪器激光功率恒定，PMT设置不变。用GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices)进行斑点分割。 Acquired raw data were analysed using the (LIMMA) package of R-Bioconductor after uploading the median signal intensities. For normalization, a specialized invariant Lowess method was applied. Downregulated proteins (M-value of < −0.35) or upregulated proteins (>0.35) in the 3-IAA and FIRINOX sample were uploaded to the STING database (https://string-db.org/cgi/input.plgydF4y2Ba)．采用标准管道进行KEGG富集分析。只有错误发现率(FDR) < 0.05的通路被认为具有统计学意义。gydF4y2Ba

RNA提取和mRNA测序gydF4y2Ba

新鲜冷冻肿瘤组织用TRIzol试剂(赛默飞世尔科学公司，15596018)裂解，RNA用氯仿-异丙醇法提取。用聚t寡聚附着磁珠从总RNA中纯化mRNA。裂解后，使用随机六聚体引物合成第一链cDNA，然后合成第二链cDNA。经端修、a尾、转接器结扎、尺寸选择、扩增纯化后，文库制备完成。用Qubit和qPCR对文库进行定量，并用Bioanalyzer进行大小分布检测。定量文库在Illumina平台上测序，每个样本至少有6000万次读取。gydF4y2Ba

用fastp (v0.20.1)处理序列读取，从序列读取的3 '端删除测序适配器序列和低质量(Phred质量评分低于15)序列。然后，使用STAR将读取数据对齐到鼠标参考程序集(GRCm39.104)gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba．用DESeq2评估差异表达(参考文献)。gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba)．如果对应的绝对对数，则认为该基因表达差异显著gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}-转换折叠变化(log2FC)不小于0.6，此外，FDR不超过0.1的值。使用fgsea对自噬反应组通路(R-HSA-9612973)进行基因集富集分析(GSEA) (v.4.1)gydF4y2Ba^49gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

qPCRgydF4y2Ba

根据制造商的方案，使用Trizol试剂(Invitrogen,15596018)和总RNA提取试剂盒(Qiagen, 74004/74104)从细胞系中提取总RNA。高容量cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific, 4368813)用于cDNA合成。引物和探针均购自应用生物系统公司。小鼠引物和探针是:gydF4y2BaGpx3gydF4y2Ba(Mm00492427_m1),gydF4y2BaGpx7gydF4y2Ba(Mm00481133),gydF4y2BaAhrgydF4y2Ba(Mm00478932_m1)。qPCR使用TaqMan Master Mix (Thermo Fisher Scientific, 4369016)在StepOne Plus系统(Applied Biosystems)上进行。每次试验使用40到44个周期，技术上使用双重复或三重复。如果技术重复的三个值中至少有两个是不可检测的，则认为该表达不可检测。相对表达式归一化为gydF4y2BaGapdhgydF4y2Ba(Mm99999915_g1)。gydF4y2Ba

shRNAs的慢病毒转移gydF4y2Ba

在人U6启动子(MISSION pLKO.1-puro)的控制下，表达短发夹rna (shRNAs)的慢病毒载体直接针对小鼠gydF4y2BaGpx3gydF4y2Ba(TRCN000076539),鼠标gydF4y2BaGpx7gydF4y2Ba(TRCN0000076563)和鼠标gydF4y2BaAhrgydF4y2Ba(TRCN0000218025)和非靶向对照shRNA (SHC002，打乱)从Sigma-Aldrich中获得。慢病毒粒子的产生已在其他地方详细描述过gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba，并可在网上(gydF4y2Bahttp://www.LentiGO-Vectors.degydF4y2Ba)．对于KPC细胞与hiv -1衍生的慢病毒载体的转导，2.5 × 10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba细胞镀于0.5 ml含8 μg ml的培养基中gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}24孔板每孔聚苯乙烯。接种后，添加10 μl VSV-G伪分型、非浓缩慢病毒颗粒可使shrna和嘌呤霉素耐药基因稳定整合到细胞基因组中。为了提高自旋接种的转导率，将平板在1000下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba25℃保温1小时。1 μg ml成功转导细胞的选择gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在转导后4天开始在培养基中加入嘌呤霉素。gydF4y2Ba

免疫组化和定量gydF4y2Ba

使用ASP300S脱水机(徕卡)和EG1160组织包埋系统(徕卡)将组织固定在4%福尔马林PBS中，并在石蜡中包埋。石蜡切片(2µm)切割后H&E染色或进行免疫组化处理:脱蜡后，内源过氧化物酶(PBS中3%过氧化氢)失活后，使用Ventana Benchmark XT机(Ventana)进行抗体特异性热介导抗原提取。切片被阻塞(10% FCS在PBS中)，然后用抗lc3b抗体(1:400稀释，赛默飞世尔科学，PA1-46286)孵育;抗硝基酪氨酸抗体(1:100稀释，赛默飞世尔科学，A-21285);抗cc3抗体(1:100稀释，细胞信号，9661);p62/SQSTM1(1:500稀释，赛默飞世尔科学公司，PA5-20839);抗ki67抗体(1:100稀释，Abcam, 15580)。特异性结合检测采用Ultra View Universal DAB detection Kit (Ventana, Roche)，包含二抗、DAB染色和苏木精反染试剂。使用NanoZoomer 2.0-HT (Hamamatsu Photonics)扫描幻灯片，并使用Fiji拍摄代表性图像。gydF4y2Ba

LC3B、Ki67、硝基酪氨酸和CC3采用盲法定量。使用ImageJ v.2.1.0/1.53c检测阳性细胞，并根据各自抗体的染色强度调整阈值，并对所有使用相同染色分析的肿瘤保持阈值。每个样品3 ~ 5个场，每250 ~ 500 × 500 μm场(10× ~ 40×倍率)计数阳性细胞数。gydF4y2Ba

宽视野显微镜gydF4y2Ba

为了可视化Hy19636_GLRM PDAC细胞的GFP-LC3-RFP报告信号表达，将组织固定在2% PFA溶液中，4°C过夜，在含有30%蔗糖的PBS中孵育，并在干冰上嵌入Tissue-Tek OCT化合物(Sakura Finetek)。为了进一步分析，采用了7 μm切片。使用THUNDER Imager 3D活细胞和3D细胞培养(徕卡微系统)进行宽视野成像，并配备40× 1.10 NA水浸泡物镜。首先使用阳性对照组织优化LED功率和曝光时间以及其他系统特定设置，并在不同组的图像采集之间保持不变，以提供最佳的可比性。对于每个组织切片，平均随机选择5个感兴趣的区域并成像用于后续定量分析。使用ImageJ成像软件进行文件导航、色彩平衡调整和图像分析。GFP和RFP采用ImageJ v.2.1.0/1.53c进行定量。每个肿瘤至少5个区域的每个各自信号的平均荧光强度在每张幻灯片上确定。gydF4y2Ba

图形抽象gydF4y2Ba

数字gydF4y2Ba1gydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba2 a, dgydF4y2Ba和图中的小图标。gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba是由BioRender.com创建的。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

除另有说明外，所有统计分析均使用GraphPad Prism 9.3.1进行。采用Shapiro-Wilk或Kolmogorov-Smirnov检验正态性和对数正态性。如果没有给出正态性，则进行非参数检验。如无特殊说明，测试为双面进行，结果显著(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值会显示出来。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然组合报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba