细菌细胞壁和外膜生物合成的协调gydF4y2Ba

革兰氏阴性菌中磷脂、PG和LPS的生物合成途径依赖于共享的前体池(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．因此，必须平衡每个途径的通量，以防止单一途径过度消耗基本前体gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba}．LPS生物合成需要UDP-gydF4y2BaNgydF4y2Ba-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)和酰基- acp分子，也分别用于PG和磷脂的生物合成gydF4y2Ba^{6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}．此外，过量的LPS会导致内膜中LPS中间体的毒性积累gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba．因此，必须严格调节通过LPS途径的通量。gydF4y2Ba

肠杆菌等gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba通过调节所参与酶的蛋白水解来控制LPS的合成，gydF4y2Ba电子商务gydF4y2BaLpxC，作者:FtsHgydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba}．先前对LpxC的研究gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba（gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba而LpxC)则不被蛋白水解gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba．因此，n端he标记gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC (H -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC)在一个gydF4y2BaftsHgydF4y2Ba-deletion mutant(扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．因此，LPS在gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba似乎是通过一种不同于肠杆菌的机制来调节的。gydF4y2Ba

H -的过量生产gydF4y2Ba电子商务gydF4y2BaLpxC而不是H -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC抑制生长gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba和增加细胞水平的LPS(扩展数据图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，暗示gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC在gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba细胞通过一种机制对抗无效gydF4y2Ba电子商务gydF4y2BaLpxC。为了确定可能的调节因素，H -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC或H -gydF4y2Ba电子商务gydF4y2BaLpxC是在gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba亲和纯化后确定相互作用伙伴。gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA和PA4701是唯一富集H -的蛋白gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC而不是H -gydF4y2Ba电子商务gydF4y2Ba补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．PA4701是一种非必需蛋白(扩展数据图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)功能未知，而gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA是PG合成过程中必不可少的酶gydF4y2Ba^{11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3 b, cgydF4y2Ba)．我们关注的是gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba不均匀,gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC相互作用，并用体内拉下实验与H -进行验证gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC和n - terminalflags -taggedgydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba色差(F -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba不均匀;扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．值得注意的是，当LpxC抑制剂ir -090处理细胞时，共纯化增强，这表明药物结合的LpxC酶可能对MurA具有更大的亲和力(扩展数据图)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．纯化His-taggedgydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba色差(H -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba不均匀;扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)也被Flag-tagged特意拉下了gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC (F -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC)使用anti-Flag树脂，表明相互作用是直接的(扩展数据图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)．纯化F -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC和H -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA分别或以掺入或不掺入ir -090的1:1混合物进行尺寸排除色谱(SEC)。在混合样品中，以F -异二聚体对应的体积洗脱了大量蛋白质gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC和H -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba色差(图gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．与下拉实验一致，将异源二聚体组分重新应用于SEC色谱柱表明，在ir -090存在的情况下，复合物保持最稳定。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．值得注意的是,H -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA刺激F -的酶活性gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC(无花果。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．这种刺激是特定于gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA为H -的加成gydF4y2Ba电子商务gydF4y2BaMurA没有效果(图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．我们的结论是gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA是一种直接的特异性激活剂gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba体外LpxC。gydF4y2Ba

我们认为如果gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA是一种必需的激活剂gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC在gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba细胞,然后gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA缺失应导致类似于两种必需酶同时失活的表型。用MurA抑制剂磷霉素处理的细胞具有PG合成抑制表型，包括膜泡的形成和溶解gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba3 d-fgydF4y2Ba)．然而，细胞耗尽gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba相反，MurA采用了放大的卵形(扩展数据图。gydF4y2Ba3 e, fgydF4y2Ba)．这种表型类似于用ir -090和磷霉素处理的细胞(扩展数据图)。gydF4y2Ba3 d-fgydF4y2Ba)，暗示gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA耗竭损害PG和LPS的合成。因此,gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA的损耗降低了LPS水平，而通路中下一个酶的损耗，gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurB，没有(扩展数据图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba3 b, cgydF4y2Ba)，反而导致了类似于磷霉素治疗后的终末表型(扩展数据图。gydF4y2Ba3 d-fgydF4y2Ba)．我们的结论是gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA是正常细胞水平的LPS生物合成所必需的。gydF4y2Ba

野生型(WT)生产过剩gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA并没有像预期的那样增加LPS水平gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．我们怀疑这一结果可能是由于酶活性gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA与LPS途径竞争UDP-GlcNAc(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)从而防止失控的LPS合成。或者，一个特定的MurA构象gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba可能是激活剂，它可能不会产生足够的水平来刺激LPS的合成gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba色差超表达。这些情景预测了催化不活跃或构象圈闭的生产过剩gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA变异应该会导致致命水平的LPS产生。因此我们搜索了toxic这个词gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba不均匀变异。gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba用编码诱变PagydF4y2Ba不均匀gydF4y2Ba在异丙基的控制下-β-gydF4y2BadgydF4y2Ba-硫半乳糖苷(IPTG)调控启动子。所得到的文库与诱导剂一起在液体培养基中培养。从培养上清中纯化引起裂解的质粒gydF4y2Ba不均匀gydF4y2Ba对导致iptg依赖生长缺陷的基因进行测序。gydF4y2Ba

23有毒gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA变体(指定gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA*)被识别(图;gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．它们的生长抑制活性被通常致命浓度的ir -090缓解，这表明它们过度激活gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．氨基酸在gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA*变体映射在酶的活性位点周围gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)，并包括与磷酸烯醇丙酮酸底物形成共价中间体的催化半胱氨酸残基(C117)gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba．一个子集gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA*变体被纯化(扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，并发现它们的酶活性显著降低，同时保留了激活纯化的能力gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba6 c, dgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

等价于C117S的替换gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA已在其他正交物中被很好地表征，其中它已被证明能将酶困在与其产物结合的封闭构象中gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}．因此，我们选择研究在体内激活的潜力gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC由gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba色差(C117S)。LpxC底物(UDP-3-gydF4y2BaOgydF4y2Ba-（gydF4y2BaRgydF4y2Ba3-hydroxydecanoyl) -gydF4y2BaNgydF4y2Ba-乙酰氨基葡萄糖胺)和产物(UDP-3-gydF4y2BaOgydF4y2Ba-（gydF4y2BaRgydF4y2Ba-3-羟基癸基)-葡萄糖胺)从过度生产的细胞中提取并定量gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba色差(WT)或gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba色差(C117S)。的gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba在细胞过度生产时，LpxC产物/底物比没有变化gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba相对于空矢量控制的MurA(WT)(图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．然而，生产过剩gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA(C117S)导致了100倍的增加gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC产物/底物比和增加的LPS水平，表明该变体是一种有效的激活剂gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC在体内(图;gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．因此，我们得出结论:gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba色差激活gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC在细胞中，但只有催化活性gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba由于MurA变体无法与LPS合成途径竞争UDP-GlcNAc，当它们过量产生时，会促进LPS合成的毒性水平。gydF4y2Ba

为了进一步描述之间的相互作用gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC和gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA，我们在寻找无毒的衍生物gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA(C117S)，理由是有些无法结合gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC。F -流感幸存者gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba从诱变质粒中选择MurA(C117S)产物，然后采用免疫印迹法筛选产生稳定的全长F -的分离株gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba色差(C117S)。这个过程确定了gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba色差(C117S / G58D)gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba色差(C117S / E406K)。我们证实，当过量生产到类似的水平时，这两个变种都没有毒性gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba色差(C117S)(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．接下来我们提纯H -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA(G58D)和H -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA(E406K)变体具有完整的活性位点(扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．两者都保留了MurA活动(扩展数据图。gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba)，且与遗传结果一致，均未激活F -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC体外培养(图;gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．然而，值得注意的是H -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA(G58D)不能与F -结合gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC, H -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA(E406K)表现出与H -相似的结合活性gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA(WT)(扩展数据图。gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba)．因此，G58D的改变削弱了的能力gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA绑定gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC，而E406K取代似乎破坏了复杂形成后的激活机制。残基G58和E406均位于该结构的同一表面上gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA结构，表明这面包括gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Balpxc结合接口(图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

迄今为止的结果表明gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA可能具有两种基本功能:PG合成和激活gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC。这个模型预测了催化活性的变体gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA无法激活gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC不能与Pa互补gydF4y2Ba不均匀gydF4y2Ba缺失，但仍然能够补充催化死亡gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA变体，保留其gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC激活函数。为了验证这一预测，PagydF4y2Ba不均匀gydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba被归入PgydF4y2Ba_{虫胶gydF4y2Ba}对照和原生等位基因被删除或转换为PagydF4y2Ba不均匀gydF4y2Ba^{C117SgydF4y2Ba}．然后我们引入一个含或不含Pa的质粒gydF4y2Ba不均匀gydF4y2Ba^{G58DgydF4y2Ba}由阿拉伯糖诱导启动子(PgydF4y2Ba_aragydF4y2Ba)．正如所料,gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA(WT)耗竭导致任何Δ的严重生长缺陷gydF4y2Ba不均匀gydF4y2Ba或者爸爸gydF4y2Ba不均匀gydF4y2Ba^{C117SgydF4y2Ba}背景(扩展数据图。gydF4y2Ba8 dgydF4y2Ba)．然而，值得注意的是gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA(G58D)得以恢复增长gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA(WT)在PagydF4y2Ba不均匀gydF4y2Ba^{C117SgydF4y2Ba}等位基因，而不是gydF4y2Ba不均匀gydF4y2Ba删除(扩展数据图。gydF4y2Ba8 dgydF4y2Ba)．因此，我们得出结论gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba的LpxC激活函数gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA是必不可少的，与它的催化活性可分离。gydF4y2Ba

为了研究LpxC-MurA调控相互作用的守恒性，我们使用了进化共变分析gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba．然而，由于这两种酶在整个革兰氏阴性细菌中都是保守的，但只有一个子集可能相互作用，我们无法可靠地检测LpxC和MurA之间共变的残基，除非首先知道这两种蛋白质的哪个区域相互作用;被分析的基因组之间的非相互作用对产生了太多的“噪音”，无法检测到明确的相互作用特征。因此，我们用AlphaFold对LpxC-MurA复合体的结构进行了建模gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba的高置信结构gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba村拉之间却没有对应gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba蛋白(无花果。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9 a、bgydF4y2Ba)．的G58和E406残基gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA涉嫌gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC结合和/或激活位于建模的相互作用界面(图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)，支持了结构预测的准确性。以该模型为指导，对来自8302个变形菌基因组的LpxC-MurA对进行了预测相互作用界面残基的进化共变分析。然后，每个LpxC-MurA对被分配一个“相互作用得分”，作为两个蛋白质预测相互作用的强度的指示(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2BaLpxC-MurA对如预期的那样具有较高的相互作用得分，来自其他伪单胞菌纲和其他γ变形菌纲(包括Legionalles, Xanthomonadales和Oceanospirillales目)的相互作用得分也较高。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．此外，在红螺杆菌(Rhodospirillales)的一个亚群中也观察到较高的相互作用分数，这是阿尔法变形菌门的一个目，与红螺杆菌高度不同gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．根据相互作用得分的分布，我们估计48%的γ -变形菌门和35%的α -变形菌门编码能够相互作用的LpxC-MurA对(扩展数据图)。gydF4y2Ba9 egydF4y2Ba)．为了研究共变分析的准确性，另外三对相互作用得分较高的LpxC-MurA对(gydF4y2BaMagnetospirillum kuznetsoviigydF4y2Ba，gydF4y2BaXanthomonadalesgydF4y2Ba种虫害和gydF4y2Ba嗜肺性军团菌gydF4y2Ba)和两对相互作用得分低的LpxC-MurA对(gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba鲍曼不动杆菌gydF4y2Ba)进行纯化(扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，并在体外测试了它们相互作用的能力。只有那些相互作用得分高的配对被观察到相互作用(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．此外,gydF4y2Ba退伍军人gydF4y2BaLpxC (gydF4y2BaLpngydF4y2BaLpxC)，但并非如此gydF4y2Ba电子商务gydF4y2BaLpxC在其同源MurA存在的情况下，在体外表现出增加的活性(扩展数据图)。gydF4y2Ba9 f, ggydF4y2Ba)．因此，我们得出结论，来自多种变形菌门的LpxC和MurA相互作用，这表明PG和LPS生物发生途径之间的调控联系在多种革兰氏阴性细菌中是保守的。gydF4y2Ba

LPS生物合成途径与磷脂和PG生物合成途径共享关键前体(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．在gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba和其他肠杆菌，需要通过脂多糖和磷脂生物合成途径平衡消耗酰基- acp分子已被充分证明gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba}．相比之下，很少有人知道UDP-GlcNAc的利用是如何通过LPS和PG生物合成途径协调以允许均匀的细胞包膜扩张。我们建议gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Balpxc激活功能gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA的作用是限制LPS的生物合成，使其不能超过PG的生物合成。的过表达支持了该模型gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA(WT)能够与LPS合成途径竞争UDP-GlcNAc，对细胞活力没有影响(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．催化无活性变体的过表达gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba然而，MurA(C117S)导致的不平衡激活gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC在体内，导致细胞死亡(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．通过限制催化活性gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC来gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA水平，失控的LPS生物合成是不可能的。另一方面，MurA被下游PG前体UDP-MurNAc反馈抑制gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba．在PG前体合成通量过高的条件下，UDP-MurNAc会积累，从而与MurA结合并将其锁定为类似于MurA的封闭构象gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba色差(C117S)gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba}．因此，当PG生物合成速度超过LPS生物合成时，MurA将受到反馈抑制，在不影响其激活能力的情况下降低其催化活性gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC刺激LPS生物合成并重新平衡通路。gydF4y2Ba

在肠杆菌中，LpxC被FtsH蛋白水解，FtsH又被至少两个附属蛋白:LapB和YejM调节gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}．虽然FtsH是广泛保守的，但LapB和YejM只在变形菌基因组的一个子集中被观察到。相比之下，LpxC和MurA在变形杆菌中几乎普遍保守。我们的计算分析表明，大量的γ -变形菌门和α -变形菌门通过MurA的激活控制LpxC。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．为什么细菌通过LPS生物合成途径使用不同的策略来调节通量尚不清楚。然而，我们认为这可能反映了它们环境生态位的差异。例如,gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba优先利用三羧酸而不是碳水化合物作为碳源gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba．因此，活性糖如UDP-GlcNAc可能更限制gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba比起爱吃糖的人gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba使LpxC的调控集中在UDP-GlcNAc的适当分区上。如果未来的研究发现其他生物中LpxC调控的其他未知策略，也不足为奇。gydF4y2Ba

总之，我们的工作已经确定了一种以前未知的和意想不到的调节相互作用，涉及到两层不同的革兰氏阴性细胞包膜的产生。除了揭示一种协调细胞壁和OM生物发生的潜在机制外，这些发现也对抗生素的开发具有意义。MurA是抗生素磷霉素的靶点，LpxC是几项药物发现活动的主题，这些活动已经产生了具有强大抗菌活性的抑制剂gydF4y2Ba^{11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba}．这里发现的这些酶之间的联系表明，有可能开发双靶向药物，改变MurA和LpxC活性，同时破坏PG和OM的组装来杀死gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba并/或使其对其他抗生素敏感，这些抗生素由于其包膜的屏障功能而失效。这些发现也提高了一种可能性，即参与不同细胞包膜组分生物发生的酶之间有更多的调节相互作用有待发现。gydF4y2Ba

培养基，菌株和质粒gydF4y2Ba

结果表明，细胞在LB(1%色氨酸，0.5%酵母提取物，0.5% NaCl)或微量M9培养基中生长gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba补充0.2%氨基酸和0.2%葡萄糖。使用以下浓度的抗生素:氯霉素，25 μg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}；卡那霉素25 μg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}；庆大霉素，30 μg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}（gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba)或15 μg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}（gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba）;卡本西林，200 μg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}（gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba)或50 μg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}（gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba)．本研究中使用的质粒列在补充表中gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．本研究使用的菌株列在补充表中gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．所有gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba报道实验中使用的菌株是PAO1的衍生物。本研究使用的引物列在补充表中gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．除非另有说明，聚合酶链式反应(PCR)使用Q5聚合酶(NEB M0492L)进行克隆，GoTaq绿色DNA聚合酶(Promega M7123)进行诊断，均按照制造商的说明进行。质粒DNA和PCR片段分别使用PurePlasmid miniprep试剂盒(CW Biosciences CW0500M)或DNA cleanup试剂盒(CW Biosciences CW2301M)进行纯化。关于菌株和质粒结构的详细信息可以在gydF4y2Ba补充信息gydF4y2Ba．实验所用样本量未采用统计学方法，但样本量符合现场标准。gydF4y2Ba

毒性分离gydF4y2Ba不均匀gydF4y2Ba等位基因gydF4y2Ba

等位基因的gydF4y2Ba不均匀gydF4y2Ba如前所述，当过度表达时是有毒的gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba稍作改动。首先,gydF4y2Ba不均匀gydF4y2Ba用Taq聚合酶(NEB M0267L)从纯化的pKH37质粒中分离15/76引物，进行PCR诱变。由此产生的五种物质每一种都含有500纳克gydF4y2Ba色差*gydF4y2Ba然后分别使用Q5聚合酶(NEB M0492L)作为大型引物，在50 μ l反应中扩增50 ng pKH37，并设置如下热循环器:1)95°C 3 min;2) 95°C 50 s;3) 60°C 50 s;4) 72℃保温10分钟;5)重复步骤2-4，共25个循环。随后在每个反应中加入20单位的DpnI (NEB R0176L)，并允许在37°C下消化未扩增的DNA 1.5小时。使用0.025- m混合纤维素酯膜(Millipore VSWP02500)在milliq水上漂浮20分钟，对每个反应进行滴析。然后将每个12µl的透析产物分别转化为100µl的neb -5 α electrocompetentgydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(NEB C2989K)，在SOC菌体培养基(NEB B9020S)中回收，将菌体镀在添加庆大霉素的LB琼脂上，筛选出转化菌。从五个文库中分别提取了大约100万个菌群，并使用PurePlasmid miniprep试剂盒(CW Biosciences CW0500M)对pKH37衍生物进行纯化。gydF4y2Ba

PAO1在25 ml LB中生长，37°C过夜，12000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟，再悬于等体积的300mm蔗糖中。离心和重悬步骤总共重复了四次洗涤。最后在12000度离心后gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟后，细胞颗粒以原来体积的1/20重悬。1.2µg的pkh37衍生文库分别转化为150µl的电活性PAO1。转化反应在37°C的LB中恢复1 h，通过将生长产物镀在添加30µg ml的LB琼脂上选择转化产物gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}庆大霉素。每个库中大约有1-2百万个菌落被分别汇集起来。gydF4y2Ba

鉴定含有毒性等位基因的pKH37变异gydF4y2Ba不均匀gydF4y2Ba，每个PAO1 × pKH37*库被稀释到光密度为600 nm (ODgydF4y2Ba_{600海里gydF4y2Ba}) 0.01的3毫升LB补充30 μ g mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}庆大霉素，37°C生长2 h 45 min。将IPTG添加到每个培养物中，最终浓度为1 mM，并在37°C下继续孵育2小时。然后对每种培养物进行21,130离心gydF4y2BaggydF4y2Ba使用DNA清理试剂盒(CW Biosciences CW2301M)分别从2.5 ml上清液中纯化每个文库中释放的DNA。随后将纯化的DNA重新转化为上述制备的PAO1电活性细胞，并将产物镀于添加庆大霉素的LB琼脂上选择转化子。然后将得到的菌落贴在添加庆大霉素和不添加1mm IPTG的LB琼脂板上，在37℃下生长一夜。的gydF4y2Ba不均匀gydF4y2Baiptg敏感菌株编码的等位基因采用引物对15/76进行Sanger测序。gydF4y2Ba

MurA(C117S)失毒变异的分离gydF4y2Ba

pKH100通过传代进行诱变gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba应变XL1-red。将pKH100转化为XL1-red，并接种5个不同的培养物，每个培养物使用4个独特的转化子。传播过夜后，质粒使用PurePlasmid miniprep试剂盒(CW Biosciences CW0500M)纯化，创建5个pKH100*文库。PAO1在25 ml LB中生长，37°C过夜，12000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟，再悬于等体积的300mm蔗糖中。离心和重悬步骤总共重复了四次洗涤。最后在12000度离心后gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟后，细胞颗粒以原来体积的1/20重悬。每个pKH100*的1.2µg量分别转化为150µl电控PAO1。转化反应在37°C的LB中恢复1 h，通过将生长产物镀在添加庆大霉素的LB琼脂上选择转化产物。每个文库中大约有100 - 1000万个菌落分别汇集，并在−80°C的LB + 10%二甲亚砜(DMSO)中存储。gydF4y2Ba

PAO1 × pKH100*文库镀于添加30µg ml的LB琼脂上gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}庆大霉素和1mm IPTG，只允许生长大约0.3% - 1%的菌落形成单位。从每个池中分别对17或18个iptg抗性菌种进行条带纯化，在LB中生长并在log中期诱导1 h后，用western blot方法检测F-MurA (C117S)*的表达水平和分子量。仅对表达水平和分子量与F-MurA (C117S)一致的分离株进行Sanger测序，引物为15和76。在五个被分析的图书馆中，有三个，gydF4y2BaF-murAgydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba被恢复。gydF4y2BaF-murAgydF4y2Ba^{C117S / G58DgydF4y2Ba}而且gydF4y2BaF-murAgydF4y2Ba^{C117S / E406KgydF4y2Ba}都是在五个图书馆中的一个找到的。gydF4y2Ba

蛋白质纯化gydF4y2Ba

蛋白质纯化的详细信息可以在gydF4y2Ba补充信息gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

可行性分析gydF4y2Ba

在30°C或37°C下培养过夜，在12,000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba2分钟，重悬至过量gydF4y2Ba_{600海里gydF4y2Ba}重悬液在LB中连续稀释至10gydF4y2Ba^{−6gydF4y2Ba}每种稀释液取5 μ l涂抹在添加了适当诱导剂和抗生素的LB琼脂上。在37°C下孵育过夜，使用尼康D3400相机和尼康AF-S micro NIKKOR 40mm镜头成像。gydF4y2Ba

Western blot分析gydF4y2Ba

过夜培养稀释到过量gydF4y2Ba_{600海里gydF4y2Ba}在3 ml LB中加入0.01，在37℃下生长4小时，2 ml在12000℃下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba3分钟。必要时，在收集培养物1 h前，将IPTG加入1mm或阿拉伯糖加入0.1%。细胞颗粒重悬至外径gydF4y2Ba_{600海里gydF4y2Ba}在1× SDS样品缓冲液(50 mM Tris pH 6.8, 10%甘油，2% SDS, 0.2%溴酚蓝，1% β-巯基乙醇)中加入20，在100℃下煮沸10分钟。随后用Qsonica Q800R3超声波仪对裂解物进行声波检测，频率为25%，1 s开启，1 s关闭，循环30次。使用非干扰蛋白测定试剂盒(G-biosciences 786-005)定量蛋白质浓度。将10µg量的蛋白质加载到10%的聚丙烯酰胺- sds凝胶上，并在150 V下进行电泳70分钟。在Bio-Rad Trans-Blot Turbo转移系统上使用混合分子量协议将蛋白质转移到PVDF膜上，并将膜在TBST (20 mM Tris pH 8.0, 200 mM NaCl, 0.05% Tween-20)中与5%牛奶在室温下封闭1小时。然后分别用1:3 000、1:3 000或1:10万稀释的anti-His (GenScript A00186-100)、anti-Flag (Sigma F7425)或anti-RpoA (BioLegend 663104)在TBST + 5%牛奶中室温孵育1小时。膜在TBST中洗涤三次，每次5分钟，然后用过氧化物酶标记的山羊抗小鼠(Rockland 810 -1302)或兔trublot:抗兔IgG HRP (Rockland 18-8816-33)在TBST + 5%牛奶中1:3 000稀释，在室温下检测1小时。用SuperSignal West Pico PLUS化学发光衬底(Thermo 34580)在TBST中清洗膜3次，每次5分钟，并使用Azure Biosystems C600成像仪成像。gydF4y2Ba

体内共亲和纯化gydF4y2Ba

在体内识别相互作用的伙伴gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba以无偏倚的方式，在重复样品中使用两种共亲和纯化方案。具体来说，在条件1中，150 mM NaCl用于裂解和洗涤缓冲液，而在条件2中，300 mM NaCl用于裂解和洗涤缓冲液。在一夜之间gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba培养液稀释至ODgydF4y2Ba_{600海里gydF4y2Ba}在500 ml LB中= 0.01，在37°C生长到对数期早期。以PA1009为例，在收集前1小时用0.5%阿拉伯糖诱导培养。整个培养物在13000℃下进行离心gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟后，将微球重悬在4 ml裂解缓冲液(50 mM Tris pH 7.5, 2%甘油，5 mM咪唑，1% Triton X-100, 150 mM或300 mM NaCl)中，用Q125 Qsonica超声仪超声裂解细胞。在21,130离心时将细胞碎片制成颗粒gydF4y2BaggydF4y2Ba将澄清的上清液与Ni-NTA树脂(Qiagen 30230)在4℃下从头到尾旋转1.5 h。树脂用6毫升洗涤缓冲液(50 mM Tris pH 7.5, 2%甘油，25 mM咪唑，1% Triton X-100, 150 mM或300 mM NaCl)洗涤四次。蛋白质在洗脱缓冲液(50 mM Tris pH 7.5, 2%甘油，250 mM咪唑，0.1% Triton X-100和150 mM NaCl)中从树脂中洗脱。洗脱液与2× SDS样品缓冲液(100 mM Tris pH 6.8, 20%甘油，4% SDS, 0.4%溴酚蓝)1:1混合，40 μ l加载到4-20%聚丙烯酰胺Mini-PROTEAN TGX凝胶(Bio-Rad 4568094)上，在80 V下电泳25分钟。随后用考马斯氏R-250染色凝胶，并切除整个通道进行质谱分析。gydF4y2Ba

切除的车道被切割成大约1毫米gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba碎片。然后对凝胶片进行改良的凝胶内胰蛋白酶消化程序gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba．凝胶片用乙腈清洗脱水10分钟，然后去除乙腈。然后在快速真空中完全干燥。凝胶片用含有12.5 ngµl的50mm碳酸氢铵溶液再水化gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}修饰的测序级胰蛋白酶(Promega)在4°C。45分钟后，除去多余的胰蛋白酶溶液，用50mm碳酸氢铵溶液替换，刚好覆盖凝胶片。然后将样品放在37°C的房间中过夜。随后，通过去除碳酸氢铵溶液来提取肽，然后用含有50%乙腈和1%甲酸的溶液洗涤一次。然后将提取物在快速真空中干燥(约1小时)。然后将样品保存在4°C，直到分析。gydF4y2Ba

分析当天，样品在5-10 μ l高效液相色谱(HPLC)溶剂A(2.5%乙腈，0.1%甲酸)中重新构成。将2.6- m C18球形二氧化硅珠填充到熔融二氧化硅毛细管(内径100 μ m ×长约30 cm)中，采用火焰拉伸尖端，建立了纳米级反相高效液相色谱毛细管柱gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba．平衡色谱柱后，使用Famos自动进样器(LC填料)将每个样品加载到色谱柱上。形成梯度，用增加浓度的溶剂B(97.5%乙腈，0.1%甲酸)洗脱多肽。gydF4y2Ba

当肽洗脱后，进行电喷雾电离，然后进入LTQ Orbitrap Velos Pro离子阱质谱仪(赛默飞世尔科学公司)。多肽被检测，分离和碎片化，以产生每个肽的特定片段离子的串联质谱。通过软件程序Sequest v28 (rev. 13;赛默飞世尔科学公司)gydF4y2Ba^39gydF4y2Ba．所有数据库都包含所有序列的反向版本，数据被过滤到肽假发现率为1-2%。只有符合以下标准的蛋白质被报道:在两个PA1018样品中检测到至少5个独特的肽;与相应的PAO1和PA1009样品相比，PA1018样品中至少富集了3倍。gydF4y2Ba

体内有针对性的下拉gydF4y2Ba

通宵培养gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba编码H -组合的菌株gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC, F -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA(WT)和F -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA(C117S)稀释至ODgydF4y2Ba_{600海里gydF4y2Ba}= 0.01，在50 ml LB中，在37°C中生长2.5 h。将IPTG添加到每个培养物中至最终浓度为1 mM，培养物在37°C下再生长30分钟，然后将DMSO添加到0.1%，cir -090添加到0.5µg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}显示的地方。培养物在37°C下额外孵育一小时，并在12,000离心收集gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。细胞在1ml LB中洗涤，12000离心成粒gydF4y2BaggydF4y2Ba2分钟。细胞重悬于1 ml裂解缓冲液(25 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 2%甘油，0.1% Triton X-100, 5 mM咪唑，0.1% DMSO，加入或不加入0.5µg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}cir -090(如所示)，在冰上以40%振幅超声裂解，共4个周期，开15秒，关15秒。萃取物在21,130温度下通过两个连续离心步骤进行澄清gydF4y2BaggydF4y2Ba用非干扰蛋白测定试剂盒(G-biosciences 786-005)测定蛋白质浓度。上清液稀释至3.5 mg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}蛋白在500µl裂解缓冲液中，与25µl填充Ni-NTA树脂(Qiagen 30230)混合。混合物在4°C下旋转3小时。用500µl洗涤缓冲液(25 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 2%甘油，0.1% Triton X-100, 25 mM咪唑，0.1% DMSO加或不加0.5µg ml)洗涤三次gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}如所示，ir -090)。蛋白在40µl洗脱缓冲液(25 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 2%甘油，0.1% Triton X-100, 500 mM咪唑)中洗脱。gydF4y2Ba

每个输入样品10µg蛋白质和10µl洗脱样品在10%聚丙烯酰胺凝胶中通过SDS-PAGE进行解析。在Bio-Rad Trans-Blot Turbo转移系统上使用混合分子量协议将蛋白质转移到PVDF膜上，并将膜在TBST + 5%的牛奶中在室温下阻塞1小时。然后用抗his (GenScript A00186-100)或抗flag (Sigma-Aldrich F7425)在TBST + 5%牛奶中1:3 000稀释，在室温下检测1小时。膜在TBST中洗涤三次，每次5分钟，然后用过氧化物酶标记的山羊抗小鼠(Rockland 810 -1302)或兔trublot:抗兔IgG HRP (Rockland 18-8816-33)在TBST + 5%牛奶中1:3 000稀释，在室温下检测1小时。用SuperSignal West Pico PLUS化学发光衬底(Thermo 34580)在TBST中清洗膜3次，每次5分钟，并使用Azure Biosystems C600成像仪成像。gydF4y2Ba

体外共亲和纯化gydF4y2Ba

纯化F -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC和H-MurA变体分别在共纯化缓冲液(25 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 10%甘油，1 mM二硫苏糖醇(DTT)， 0.5% DMSO)中稀释至2.5 μ M，最终体积为100 μ l。当指示时，将ir -090添加到5.7µM中。混合物在冰上孵育30分钟后，将每种混合物85 μ l加入等体积的Anti-Flag M2磁珠(Sigma-Aldrich M8823)中，在4°C下从头到尾旋转孵育1小时。用磁架收集珠子，用300µl共纯化缓冲液洗涤两次，用200µl共纯化缓冲液洗涤一次。当指示时，在洗涤缓冲液中保持5.7 μ M ir -090。蛋白用85µl洗脱缓冲液(25 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 10%甘油，1 mM DTT, 100µgµl)洗脱gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}标记肽(Millipore Sigma F3290))在室温下孵育30分钟。输入样品(5µl)和洗脱样品(15µl)在4-20%聚丙烯酰胺Mini-PROTEAN TGX凝胶(Bio-Rad 4561095)中通过SDS-PAGE分离，考马斯色染色检测蛋白质。gydF4y2Ba

证券交易委员会gydF4y2Ba

F -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC和H -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA(WT)单独或组合在500 μ l SEC缓冲液1(10%甘油，0.33% DMSO, 1 mM DTT, 25 mM Tris pH 8.0和150 mM NaCl)中稀释至7.5 μ M。当指示时，将ir -090添加到37.5µM中。随后，使用配有Superdex 200 10/300 GL色谱柱的ActaPure系统对混合物进行SEC处理，该色谱柱与SEC缓冲液2平衡(10%甘油，1 mM DTT, 25 mM Tris pH 8.0和150 mM NaCl)，每0.35 ml收集一次洗脱馏分。对F -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC和H -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA(WT)混合物，对应移位峰的三个组分(14.1-15.2 ml，不含ir -090, 13.8-14.8 ml，含ir -090)通过4°C离心浓缩，使用分子量截止值为10-kDa的离心过滤器(Amicon UFC801024)。如上所述，浓缩蛋白在Superdex 200 10/300 GL色谱柱上进行SEC反应。将15µl体积的相关组分溶解在4-20%的聚丙烯酰胺Mini-PROTEAN TGX凝胶(Bio-Rad 4568094)上，并用考马斯色染色检测蛋白质。gydF4y2Ba

增长曲线gydF4y2Ba

在30°C下培养过夜的培养物在12000℃下制成颗粒gydF4y2BaggydF4y2Ba在新鲜LB中重悬2分钟。培养物在96孔微量滴定板中稀释至ODgydF4y2Ba_{600海里gydF4y2Ba}在Tecan Infinite M-Plex平板阅读器中培养，37°C和ODgydF4y2Ba_{600海里gydF4y2Ba}在每个时间点后每4 min监测一次，在1毫米轨道震动200 s。gydF4y2Ba

LPS银染gydF4y2Ba

过夜培养稀释到过量gydF4y2Ba_{600海里gydF4y2Ba}在25 ml LB培养物中增加0.01，在37°C下培养4小时。对于在诱导剂存在下生长的MurA-和murb -消耗菌株，整个生长过程中都存在1 mM的IPTG。对于MurA和LpxC过表达菌株，在生长3小时后加入1mm IPTG或0.1%阿拉伯糖，并继续培养1小时。每个培养物的体积为20毫升，在12000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟，颗粒在1ml LB中洗涤，然后在12000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba2分钟。颗粒重悬至ODgydF4y2Ba_{600海里gydF4y2Ba}加入LDS样品缓冲液(Invitrogen NP0008) + 4% β-巯基乙醇，100°C煮沸10分钟。用Q125 Qsonica超声仪以25%振幅对样品进行超声，1 s开启，1 s关闭，30个周期，使用非干扰蛋白质检测试剂盒(G-biosciences 786-005)测定蛋白质浓度。将5µg的蛋白质加载到15%的聚丙烯酰胺- sds凝胶上，在150 V下电泳70分钟，然后进行如上所述的RpoA western blot分析。对于LPS凝胶，每个样品50µl与1.25µl蛋白酶K (NEB P8107S)混合，在55°C下孵育1小时，然后在95°C下孵育10分钟。相当于10µg蛋白质的当量体积在4-12%的Criterion XT Bis-Tris凝胶(Bio-Rad 3450124)上在100 V下溶解1小时45分钟，如前所述，用银染色法检测LPSgydF4y2Ba^40gydF4y2Ba．简单地说，凝胶在200毫升40%乙醇和5%醋酸中培养过夜。加入0.7%的周期性酸，孵育5分钟。随后用200毫升超纯水在2小时内三次清洗凝胶。凝胶用150ml现制染色液(0.018 N NaOH, 0.4% NH)浸渍gydF4y2Ba_4gydF4y2BaOH和0.667%硝酸银)浸泡10分钟，然后在2小时内用200毫升超纯水三次洗涤。凝胶用200毫升新鲜制备的显影剂溶液(0.26 mM柠檬酸pH值3.0,0.014%甲醛)显影，在100毫升1%的乙酸中停止显影。凝胶在Bio-Rad ChemiDoc MP成像系统中成像。gydF4y2Ba

显微镜gydF4y2Ba

过夜培养稀释到过量gydF4y2Ba_{600海里gydF4y2Ba}在3 ml LB中加入1 mM IPTG作为适当的剂量。培养物在37°C下生长2.5 h，适当时，抗生素添加到以下浓度:0.5µg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}ir -090, 64µg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}磷霉素或0.5µg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}ir -090 + 16µg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}磷霉素。培养物在37°C下生长1.5小时，在12,000的温度下将1 ml制成颗粒gydF4y2BaggydF4y2Ba细胞球重悬至ODgydF4y2Ba_{600海里gydF4y2Ba}10in LB，在LB + 1.5%琼脂板上标记，在尼康Eclipse 50i显微镜上成像，配备100倍物镜和Photometrics CoolSNAP HQgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba相机。图像使用斐济图像分析平台版本2.3.0/1.53q进行统一编辑gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba．使用ImageJ的MicrobeJ插件(版本5.13I)量化细胞宽度，使用以下设置:面积:250-max，长度:3-100，宽度:5-25，宽度变化:0-0.25，宽度对称性:0-1，圆度，0.01-1。通过Prism (GraphPad Software, LLC)进行的D 'Agostino和Pearson检验和Anderson-Darling检验对每个群体进行正性检验，并确定其缺乏正性。采用Prism (GraphPad Software, LLC)进行Kruskal-Wallis检验，以确定统计学意义。显微图像来源可在gydF4y2Bahttps://doi.org/10.5281/zenodo.7455522gydF4y2Ba(ref。gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

体内LpxC产物和底物水平的测定gydF4y2Ba

过夜培养稀释到过量gydF4y2Ba_{600海里gydF4y2Ba}在200 ml LB中添加0.01，在37°C下生长3小时，并将IPTG添加到最终浓度为1 mM。在37°C下孵育一小时后，在12000℃下离心收集细胞gydF4y2BaggydF4y2Ba在LB中重悬后，细胞在12000离心时重新成粒gydF4y2BaggydF4y2Ba2分钟。然后在400µl HPLC-grade H中重悬颗粒gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO.随后，在混合物中加入250µl氯仿和500µl甲醇。样品被大力涡旋，放置在冰上10分钟，然后在4°C, 21000度下旋转gydF4y2BaggydF4y2Ba．收集500 μ l体积的水层，并在旋转蒸发器中在30°C下过夜干燥。干燥后的材料在100µl超纯H中重悬gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba哦，还有gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba采用液相色谱-串联质谱(LC-MS /MS)对LpxC产物和底物进行检测，检测结果如下所示。gydF4y2Ba

体外LpxC活性测定gydF4y2Ba

纯化F -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba将LpxC和H-MurA变体在结合缓冲液(25 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 6%甘油)中稀释至200 nM，最终体积为15 μ l，并让混合物平衡至30°C 10分钟。反应由15µl底物混合物(25 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 4% DMSO, 200µM UDP-3-)开始gydF4y2BaOgydF4y2Ba-（gydF4y2BaRgydF4y2Ba-3-羟基癸基)-GlcNAc (Carbosynth MU75071))，并允许在30°C下进行5或10分钟，此时通过添加45 μ l 2%乙酸停止反应。将停止的反应冷冻在干冰上，冻干，并将冻干后的材料重悬于60µl H中gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO。gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba液相色谱-质谱法检测LpxC产物和底物，如下所示。用纯化的F -测定了上述反应的线性范围gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC单独作用，1、2、5、10、15或20 min后反应停止。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．H -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA(WT)和H -gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA(C117S)单独表现出LpxC活性的背景水平，证实所观察到的LpxC活性的刺激不是由于蛋白质制剂中的污染或替代的酶活性gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba扩展数据图。gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

活动测定与gydF4y2Ba退伍军人gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba除了H-MurA变体在最终反应混合物中的浓度为200 nM外，LpxC-MurA对进行如上所述。gydF4y2Ba退伍军人gydF4y2Ba10 min后停止反应gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba1 min后停止反应。gydF4y2Ba

质gydF4y2Ba

为定量测定LpxC的体外活性gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC产品和底物在Agilent Technologies的1200系列HPLC系统上用LC-MS检测，该系统与Agilent 6520 Q-TOF质谱联用，电喷雾电离质谱在负模式下工作。样品在Waters Symmetry C18色谱柱上分离(5µm;3.9毫米× 150毫米)与匹配的柱保护使用以下方法:流速= 0.5 ml mingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}， 95%溶剂A (HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 10mm甲酸铵)和5%溶剂B(乙腈)浸泡5分钟，然后溶剂B从5 - 80%线性梯度浸泡20分钟。MS数据分析采用安捷伦MassHunter工作站定性分析软件B.06.00版本。的gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC底物(UDP-3-gydF4y2BaOgydF4y2Ba-（gydF4y2BaRgydF4y2Ba3-hydroxydecanoyl) -gydF4y2BaNgydF4y2Ba-乙酰葡萄糖胺)通过监测丰度776.21进行定量gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba并分解为一个单峰，将其积分来推断底物浓度。的gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC产品(UDP-3-gydF4y2BaOgydF4y2Ba-（gydF4y2BaRgydF4y2Ba-3-羟基癸基)-葡萄糖胺)通过监测734.1944的丰度进行定量gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba如前所述，通常会分解为多个峰值gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba，所有这些都被整合来推断产物浓度。gydF4y2Ba

巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba采用与上述LC-MS分析相同的设置，对甲醇-氯仿提取的全细胞裂解物的水馏分中的LpxC底物和产物进行了LC-MS /MS分析，并进行了以下调整。父离子gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba的776.1986(对应于gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC衬底)和gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba的734.1872(对应于gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaLpxC产品)的目标为MS/MS，碰撞能量为40。碎片离子在50到850之间gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba进行分析。的相对丰度gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba通过对776.1986中观察到的峰进行积分，对LpxC底物和产物进行了定量gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba和734.1872gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba,分别。LC-MS /MS原始数据可在gydF4y2Bahttps://doi.org/10.5281/zenodo.7455522gydF4y2Ba(ref。gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

体外MurA活性测定gydF4y2Ba

纯化的MurA变体被稀释到200 nM(用于gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba色差(WT),gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2Ba色差(G58D)和gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA(E406K))或2µM(用于gydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构gydF4y2BaMurA*变体)在MurA反应缓冲液(25 mM Tris pH 7.75, 6%甘油)中，最终体积为25 μ l，并允许平衡至室温30分钟。通过添加25 μ l MurA底物混合物(25 mM Tris pH 7.75, 2 mM UDP-)开始反应gydF4y2BaNgydF4y2Ba-乙酰氨基葡萄糖(Sigma-Aldrich U4375)和1 mM磷酸烯醇丙酮酸(Sigma-Aldrich 10108294001))，在37°C下反应30分钟。加入800µl Lanzetta试剂(0.033%孔雀石绿、1%钼酸铵、1 N HCl、0.2% Triton X-100)停止反应。gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba室温孵育1.25 min后加入34%柠檬酸钠100µl。在室温下再孵育30分钟后，在600 nm (AgydF4y2Ba_{660海里gydF4y2Ba})。由NaH构成的标准曲线gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba用超纯水稀释，定量游离磷含量gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba由反应释放。gydF4y2Ba

MurA-LpxC复杂结构预测gydF4y2Ba

使用AlphaFold的默认参数预测LpxC-MurA复合物的结构gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba．的gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2BaPAO1 LpxC和MurA序列或gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaMG1655 LpxC和MurA序列由包含15个Gly-Gly-Gly-Ser重复序列的连接子分离，为了清晰，没有显示该连接子。该结构使用ChimeraX版本1.1.1进行可视化。gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

预测复杂的相互作用gydF4y2Ba

我们试图使用进化共变来预测LpxC-MurA相互作用存在或不存在的生物体。我们使用EVComplex运行evcoupling v0.0.5(参考。gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba)，由AlphaFold模型通知，以根据推断出的成对交互项定义交互得分gydF4y2Ba\ ({J} _ {{ij}} \)gydF4y2Ba并验证我们提出的复杂结构。gydF4y2Ba

我们首先生成LpxC和MurA的多个序列对齐使用手提钻v3.1b2(参考。gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba)，在Uniref100数据集上进行5次迭代gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba将于2021年2月上映。这两个gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba色差(Uniprot:gydF4y2BaQ9HVW7gydF4y2Ba而且gydF4y2BaP0A749gydF4y2Ba)和LpxC (Uniprot:gydF4y2BaP47205gydF4y2Ba而且gydF4y2BaP0A725gydF4y2Ba)作为初始序列。在每种情况下，序列评分阈值范围为0.1 - 0.8比特/残基，这并不会显著改变物种或蛋白质的序列。从两个物种开始收集到相同的序列。对于所有的分析，我们从54,940个MurA和23,634个LpxC序列的比对开始，然后将每个物种的MurA和LpxC序列连接起来，通过选择每个物种中最接近原始序列的序列来解决配对中的模糊性gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba同系物。最终的串联比对包含11834个序列。从这个串联的多序列比对，进化耦合确定使用伪似然最大化gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

我们更仔细地分析了排名前五的分子间偶联(gydF4y2BaJgydF4y2Ba_ijgydF4y2Ba)的直接耦合分析模型，对应于AlphaFold2模型中结构接触中的氨基酸位置对，定义为Cα原子在9 Å以内。每对序列都可以对MurA位置之间的耦合进行打分gydF4y2Ba我gydF4y2Ba和LpxC位置gydF4y2BajgydF4y2Ba在适当的基础上gydF4y2Ba\ ({J} _ {{ij}} \)gydF4y2Ba来自模型的项。将每个物种的这五个分数相加，我们观察到一个双峰分布(扩展数据图)。gydF4y2Ba9 cgydF4y2Ba)．我们只选取了5个分数之和超过0.1的序列对，共计1689对序列对(Extended Data Fig。gydF4y2Ba9 cgydF4y2Ba)，并在级联比对的这些序列上训练一个新的EVcomplex模型。在这个模型中，前六个分子间偶联中的五个对应于AlphaFold2结构中的预测接触(扩展数据图。gydF4y2Ba9 dgydF4y2Ba)．我们根据这个改进模型中的前20个耦合项定义了一个最终的“交互得分”，并使用它再次对所有11,834对序列进行级联比对。序列分析文件可在gydF4y2Bahttps://doi.org/10.5281/zenodo.7455522gydF4y2Ba(ref。gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba)．前20个术语是任意选择的，但这个确切的选择对下游分析没有意义，并且对于5到500个顶级耦合的选择，所有关于相对相互作用得分的结论仍然成立。gydF4y2Ba

为了估计每个分支中相互作用序列的百分比，我们使用sklearn v1.0.2拟合了一个双组分高斯混合模型。gydF4y2Ba^49gydF4y2Ba)到所有序列对的相互作用得分，并计算每个序列从上分布中抽取的后验概率。我们使用ETE3 v1.3.2(参考文献)将每个序列对的分类标识符映射到国家生物技术信息分类数据库中的类。gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba)，共鉴定出2459个阿尔法变形菌门(alphaproteobacteria)和2781个γ变形菌门(gammaproteobacteria)。然后，我们估计每个分支中相互作用序列的期望分数，作为该分支中每个序列相互作用概率的平均值。gydF4y2Ba

为了可视化这些序列的系统发育结构，我们利用FastTree 2.1.11版本的串联多序列比对构建了MurA和LpxC的最大似然系统发育(参考文献)。gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba)．在Python v3.8.8中，交互得分被映射到树上，并使用交互式生命树(ITOL) v5进行可视化(参考。gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba)．本研究中使用的自定义代码可以在gydF4y2Bahttps://github.com/samberry19/evcomplex-interaction-scoringgydF4y2Ba或gydF4y2Bahttps://doi.org/10.5281/zenodo.7471436gydF4y2Ba(ref。gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然组合报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba