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机械和配体依赖性粘附GPCR解离的分子传感gydF4y2Ba

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摘要gydF4y2Ba

粘附g蛋白偶联受体(agpcr)与Notch蛋白具有显著的相似性gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，一类表面受体准备机械蛋白水解激活gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，包括进化上保守的裂解机制gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba．然而，到目前为止，还没有统一的解释为什么agpcr是自蛋白水解处理。在这里，我们介绍了一个基因编码传感器系统来检测aGPCR异二聚体到其组成的n端和c端片段(分别为NTFs和CTFs)的解离事件。一种NTF释放传感器(NRS)的神经嗜凝素型aGPCR Cirl (ADGRL)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,从gydF4y2Ba黑腹果蝇gydF4y2Ba，是由机械力刺激的。Cirl-NRS激活表明神经元和皮层胶质细胞中存在受体解离。神经胶质细胞释放NTFs需要gydF4y2Ba反式-gydF4y2BaCirl与其配体toll样受体Tollo (Toll-8)之间的相互作用gydF4y2Ba12gydF4y2Ba而在神经祖细胞中表达Cirl和TollogydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba抑制aGPCR的解离。这种相互作用对于控制中枢神经系统中成神经细胞池的大小是必要的。我们得出结论，受体自身蛋白水解使agpcr的非细胞自主活动，agpcr的解离受其配体表达谱和机械力控制。NRS系统将有助于阐明agpcr的生理作用和信号调节器，这构成了心血管、免疫、神经精神和肿瘤疾病的巨大未开发药物靶点库gydF4y2Ba13gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

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图1:aGPCR Cirl的NRS激活依赖于GAIN结构域的蛋白水解。gydF4y2Ba
图2:Cirl-NRS以机械依赖的方式被激活。gydF4y2Ba
图3:Cirl受体解离需要与配体Tollo相互作用。gydF4y2Ba
图4:Cirl-NTF在CG细胞中解离，以调节成神经细胞池。gydF4y2Ba
图5:非神经agpcr的NRS。gydF4y2Ba

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在图表中绘制的所有数据集都可在gydF4y2Ba源数据gydF4y2Ba．Cirl配体的交互组数据集可在gydF4y2BaProteomeXchangegydF4y2Ba使用唯一标识符gydF4y2BaPXD033873gydF4y2Ba．原始western blot数据可在Figshare获得gydF4y2Bahttps://doi.org/10.6084/m9.figshare.21930960gydF4y2Ba．所有其他数据均可根据相关作者的要求提供。gydF4y2Ba源数据gydF4y2Ba提供了这篇论文。gydF4y2Ba

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    文章gydF4y2Ba广告gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  58. 李,h。et al。一种用于幼虫中枢神经系统发育和行为研究的GAL4驱动资源gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba．gydF4y2Ba细胞的代表。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba， 897-908(2014)。gydF4y2Ba

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  59. 基因定位和表达模式gydF4y2BaC380gydF4y2Ba，gydF4y2BaOK6gydF4y2Ba而且gydF4y2BaD42gydF4y2Ba幼虫神经系统中的增强诱捕线gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba．gydF4y2Ba基因Expr。模式gydF4y2Ba9gydF4y2Ba， 371-380(2009)。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

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    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

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  62. 史都华，阿特伍德，洪林，林杰，王俊杰，吴春峰。提高稳定性gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba幼虫神经肌肉制剂在血淋巴样生理溶液中。gydF4y2BaJ.比较物理。gydF4y2Ba175gydF4y2Ba， 179-191(1994)。gydF4y2Ba

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下载参考gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

这项工作得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft对N.S.和T.L.的资助，通过FOR2149，项目编号265903901(项目P01)和265996823(项目P03)，通过CRC 1423，项目编号421152132(项目A06和B06);并由莱比锡大学医学院的初级研究经费授予N.S.。我们感谢C. Klämbt, R. Kopan, D. Montell, N. Perrimon, M. Rossner, R. Schuh, G. Struhl和W. Hütteroth分享材料和协议;M. Ueffing对MS分析的帮助;T. Lecuit讨论Cirl-Tollo相互作用;L. Abicht, P. Beckmann, A. Böhme, H. Holzinger, K. Heise, S. Lautenschläger, M. Oppmann, S. Schmidt, U. Strobel和P. Tarlatt提供技术援助。本研究使用了来自布卢明顿果蝇种群中心(NIH P40OD018537)和维也纳果蝇资源中心(VDRC)的种群。gydF4y2Ba

作者信息gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

  1. 这些作者贡献相同:Nicole Scholz, Anne-Kristin DahsegydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

  1. 鲁道夫Schönheimer德国莱比锡大学医学院一般生物化学系生物化学研究所gydF4y2Ba

    Nicole Scholz, Anne- kristin Dahse, Marguerite Kemkemer, Anne Bormann, Genevieve M. Auger, Fernando Vieira Contreras, Lucia F. Ernst, Hauke Staake, Marek B. Körner, Max Buhlan, Amelie Meyer-Mölck, Yin Kwan Chung, Beatriz Blanco-Redondo, Dmitrij Ljaschenko, Marina Bigl & Tobias LangenhangydF4y2Ba

  2. 德国埃伯哈德·卡尔斯大学眼科研究所医学生物分析核心设施Tübingen, TübingengydF4y2Ba

    弗兰兹斯卡·克洛泽和穆罕默德·阿里·雅尔布伊gydF4y2Ba

作者gydF4y2Ba
  1. 妮可朔尔茨gydF4y2Ba
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  2. Anne-Kristin DahsegydF4y2Ba
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  3. 玛格丽特KemkemergydF4y2Ba
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  4. 安妮•鲍曼gydF4y2Ba
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  5. 吉纳维芙·m·奥格gydF4y2Ba
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  6. 费尔南多·维埃拉·孔特雷拉斯gydF4y2Ba
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  7. 露西亚·f·恩斯特gydF4y2Ba
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  8. Hauke StaakegydF4y2Ba
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  9. Marek B. KörnergydF4y2Ba
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  10. 马克斯BuhlangydF4y2Ba
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  11. 天使爱美丽Meyer-MolckgydF4y2Ba
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  12. 观音涌gydF4y2Ba
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  13. Beatriz Blanco-RedondogydF4y2Ba
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  14. Franziska克洛泽gydF4y2Ba
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  15. 穆罕默德·阿里·贾尔布伊gydF4y2Ba
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  16. Dmitrij LjaschenkogydF4y2Ba
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  17. 玛丽娜BiglgydF4y2Ba
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  18. 托拜厄斯LangenhangydF4y2Ba
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贡献gydF4y2Ba

N.S.和T.L.构思了这项研究，设计、执行和分析了实验，准备了数据，并在所有共同作者的同意下撰写了手稿。补充说明:克隆，荧光素酶测定，转基因产生，免疫组化，苍蝇遗传学，成像，蛋白提取和质谱和western blot分析。a.k.d:克隆，苍蝇遗传学，免疫组化，成像和t-GRASP分析。M.K.和a.m.。：ELISA and luciferase experiments. A.B.: protein extraction, MS and western blot analyses and luciferase experiments. G.M.A.: cell marker expression analyses. M.B.K.: immunohistochemical stainings. F.V.C.: Mayo-NRS and Ketchup-NRS expression profiles. L.F.E.: fly genetics and imaging. H.S.: fly genetics. M. Buhlan and D.L.: joint bending and TransTimer analyses. Y.K.C.: cloning and ELISA experiments. B.B.-R.: Mayo-NRS and Ketchup-NRS protein analyses. F.K. and M.A.J.: MS analyses. M. Bigl: protein extraction, MS and western blot analyses and ELISA experiments. T.L.: cloning, luciferase assays, transgene generation, fly genetics, imaging and quantification of cell marker expression.

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba妮可朔尔茨gydF4y2Ba或gydF4y2Ba托拜厄斯LangenhangydF4y2Ba．gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

N.S.和T.L.是一项正在申请的agpcr NTF释放传感器专利的共同发明人(WO/2022/063915;优先申请:EP 3974535;申请人:莱比锡大学)。其余作者声明没有竞争利益。gydF4y2Ba

同行评审gydF4y2Ba

同行评审信息gydF4y2Ba

自然gydF4y2Ba感谢Gregory Tall和其他匿名审稿人对本工作的同行评审所作的贡献。gydF4y2Ba同行评审报告gydF4y2Ba是可用的。gydF4y2Ba

额外的信息gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

扩展的数据图形和表格gydF4y2Ba

图1 agpcr的结构-功能关系和NRS技术的功能。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Baagpcr由细胞外区域(ECR)和细胞内区域(ICR)以及七螺旋跨膜结构域(7TM)组成。由于GPCR自身蛋白水解诱导(GAIN)结构域的自催化裂解作用，大多数agpcr以非共价稳定的异质二聚体形式存在，由N- (NTF)和c端片段(CTF)组成，它们由包含栓系激动剂(TA)/Stachel的GAIN结构域相互固定。Cirl受体的ECR中含有鼠李糖结合凝集素(RBL)和激素受体基序(HRM)结构域。gydF4y2BabgydF4y2Ba，两种主要的aGPCR激活模式已经得到了证据，其中一种是(gydF4y2Ba离解模型gydF4y2Ba)或不(gydF4y2BaNon-Dissociation模型gydF4y2Ba)依靠aGPCR分离异源二聚体。gydF4y2BacgydF4y2BaNRS由给定黏附GPCR的ECR组成，包括具有自身蛋白水解活性的GAIN结构域，其GPCR蛋白水解位点(GPS)融合到GPCR的并膜段和跨膜段(JTS)gydF4y2Ba果蝇gydF4y2BaNotch受体和细胞内异源转录因子(TF)单位。JTS包含金属蛋白酶和膜内蛋白酶裂解的识别位点(S2-S4)。所示为Cirl-NRS中使用的GPS上的蛋白质序列。gydF4y2Ba

图2 Notch受体通路的激活。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，结构布局gydF4y2Ba果蝇gydF4y2BaNotch受体蛋白，其ECR包含大量表皮生长因子(EGF)结构域，负调控区(NRR)，在生理上抑制不同切割位点(S2-S4)的交错蛋白水解过程，直到受体受到刺激，以及ICR序列涉及Notch细胞内结构域(NICD)的核输入和基因转录的共激活。gydF4y2BabgydF4y2BaNotch加工和跨膜信号转导对应的事件序列和涉及的蛋白酶gydF4y2Ba31gydF4y2Ba．gydF4y2BacgydF4y2BaCirl-NRS-LexA蛋白的氨基酸序列及结构域和基序注释。ADAM，一种分解素和金属蛋白酶;ECR，细胞外区;ICR，细胞内区;TM，跨膜结构域。gydF4y2Ba

图3 NRS激活的体外表征。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba包含融合到Notch的人CD4受体ECR的混合跨膜传感器的特性gydF4y2BaJTSgydF4y2Balexa模块(CD4-NRS-LexA)在gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba施耐德-2细胞使用荧光素酶为基础的试验。加入CD4-ECR到NRS基(CD4-NRS-LexA)抑制NRS活性。当CD4- ecr被插入到传感器的CD4和NRS-LexA组分(CD4- 3tevs -NRS-LexA, CD4- 6tevs -NRS-LexA)之间的tev的同源TEVp的secTEVp切断时，它被激活(品红)。可切割传感器和atevp的共表达不会导致传感器激活(灰色)。NgydF4y2BaΔEGFgydF4y2Ba-LexA / NgydF4y2BaΔECNgydF4y2Ba-LexA组、CD4-3TEVs-NRS-LexA组和CD4-6TEVs-NRS-LexA组分别进行检测，但显示在同一图表中。数据(gydF4y2BangydF4y2Ba除CD4-3TEVs-NRS-LexA组外，所有组均为3个独立实验的10个生物重复gydF4y2BangydF4y2Ba= 3(来自一个实验)被归一化，并在盒须图中表示为对照数据集的倍数(所有数据点绘制;水平线代表中位数，框代表25gydF4y2BathgydF4y2Ba和75年gydF4y2BathgydF4y2Ba百分位数、胡须最小值和最大值)。NgydF4y2BaΔEGFgydF4y2Ba-LexA / NgydF4y2BaΔECNgydF4y2Ba-LexA组采用双尾Mann-Whitney U检验，CD4-3TEVs-NRS-LexA数据集采用普通单因素方差分析，采用Tukey 's检验，CD4-6TEVs-NRS-LexA数据集采用Kruskal-Wallis单因素方差分析，采用Dunn 's检验(所有比较的置信区间均为95%)。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值显示在数据上方。另请参阅gydF4y2Ba源数据gydF4y2Ba．gydF4y2BabgydF4y2Ba， NRS-LexA活动的传感器集与中相同gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，通过表达一个gydF4y2BalexAop-DsRedgydF4y2Ba报告(CD4-3TEVs-NRS-LexA未显示)。带有NRS-LexA信号的Schneider-2细胞培养的代表性共聚焦图像(紫红色，箭头)用Hoechst(蓝色)反染。比例尺bar = 100µm。实验独立重复3次，得到相似的结果。gydF4y2BacgydF4y2Ba的JTS蛋白序列比对gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba(Uniprot:gydF4y2BaP07207gydF4y2Ba)和人Notch1受体(Uniprot:gydF4y2BaP46531gydF4y2Ba)．图中显示了TM螺旋(灰框)和S2、S3、S4蛋白酶裂解位点的位置。对于本研究中的控制传感器，S3裂解位点(浅棕色框)的临界缬氨酸残基是点突变的(V1763K)。黑盒子描绘了高度保守的残基。gydF4y2BadgydF4y2Ba， N的函数gydF4y2BaΔECNgydF4y2Ba-LexA和CD4-6TEVs-NRS-LexA变体(灰色圈)需要γ-分泌酶活性，因为应用10µM DAPT会抑制它们的激活(白色圈)。数据(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物重复来自所有组的一个实验)在盒须图中以对照数据集的倍数表示(所有数据点绘制;水平线代表中值、胡须最小值和最大值)。数据组(每个传感器的-DAPT/+DAPT)与双尾未配对进行比较gydF4y2BatgydF4y2Ba-test(置信区间= 95%)。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值显示在数据上方。另请参阅gydF4y2Ba源数据gydF4y2Ba．gydF4y2BaegydF4y2BaELISA定量分析Cirl-NRS-LexA基因的表面和总表达量，结果显示gydF4y2BabgydF4y2Ba传递到细胞表面。表面(gydF4y2BangydF4y2Ba= 24个来自6个独立实验的所有组的生物重复，Cirl-NRS除外gydF4y2BaΔS3gydF4y2Ba-LexA集团gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个独立实验的12个生物重复)和总ELISA数据(gydF4y2BangydF4y2Ba=除Cirl-NRS外，所有组的7个独立实验的28个生物重复gydF4y2BaΔS3gydF4y2Ba-LexA集团gydF4y2BangydF4y2Ba=来自三个独立实验的12个生物重复)被归一化，并在盒须图中作为对照数据集的倍数表示(所有数据点绘制;水平线代表中位数，框代表25gydF4y2BathgydF4y2Ba和75年gydF4y2BathgydF4y2Ba百分位数、胡须最小值和最大值)。数据分析采用Kruskal-Wallis单因素方差分析和Dunn检验(所有比较的置信区间= 95%)。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值显示在数据的上方和下方。归一化为Cirl- nrs - lexa比值的表面/总表达比(右图)表示每个Cirl- nrs - lexa变体和Cirl的表面转运程度。另请参阅gydF4y2Ba源数据gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

图4不同二进制表达式系统读出的Cirl-NRS活性的比较。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，组织gydF4y2Ba黄道眉鹀gydF4y2Ba轨迹,gydF4y2BaCirl-NRSgydF4y2Ba等位基因及其基因产物。gydF4y2BabgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba， Cirl-NRS-LexA (gydF4y2BabgydF4y2Ba)， Cirl-NRS-GAL4 (gydF4y2BacgydF4y2Ba)和Cirl-NRS-QF2 (gydF4y2BadgydF4y2Ba)的传感器显示成人的鼻子(v形)、眼睛(双v形)和腿部关节(箭头)的神经元有类似的活动。报告转基因的有:gydF4y2Ba13 xlexaop2-6xmcherry-hagydF4y2Ba（gydF4y2BabgydF4y2Ba)，gydF4y2Ba20 xuas-6xmcherry-3xhagydF4y2Ba（gydF4y2BacgydF4y2Ba),gydF4y2BaQUAS-mtdTomato-3xHAgydF4y2Ba（gydF4y2BadgydF4y2Ba)．比例尺= 0.5 mm。gydF4y2BaegydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaggydF4y2Ba， Cirl-NRS分离信号报告使用(gydF4y2BaegydF4y2Ba) LexA/lexAop， (gydF4y2BafgydF4y2Ba) GAL4/UAS及(gydF4y2BaggydF4y2BaQF2/QUAS二元表达系统。顶部面板显示Cirl-NRS在眼睛(双v形)、喙(v形)和天线的花梗(白色箭头)和珠柄(灰色箭头)中的活动。中间面板显示腿部的Cirl-NRS活动，底部面板显示股骨胫骨关节的Cirl-NRS阳性机械感觉神经元特写(白色箭头)。比例尺= 250µm(头和腿)，50µm(关节)。所有实验都独立重复了3次，结果相似。gydF4y2Ba

扩展数据图5二进制表达式系统控件。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，表达控制gydF4y2BalexAop-myr-mCherrygydF4y2Ba．gydF4y2BabgydF4y2Ba，表达控制gydF4y2BalexAop2-mCherrygydF4y2Ba．gydF4y2BacgydF4y2Ba，表达控制gydF4y2BaUAS-RFP.nlsgydF4y2Ba．gydF4y2BadgydF4y2Ba，表达控制gydF4y2Ba2 xhrgfp.nlsgydF4y2Ba．比例尺= 50µm。就像在gydF4y2BacgydF4y2Ba表达两个记者。gydF4y2Ba

图6腿部关节运动的操作。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，成人后胸腿股骨胫骨关节位置。改编自ref。gydF4y2Ba67gydF4y2Ba．gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba成年果蝇被粘在支架上，并在腿部固定手术前、中、后进行录像。在照片中，苍蝇只在固定间隔中显示，当实验的后胸腿伸展时，腿伸展过程中有一个紧绷的约束(gydF4y2BabgydF4y2Ba)和屈曲(gydF4y2BacgydF4y2Ba)阶段。约束的支撑板固定点未在图像中描绘。对侧腿在手术过程中可以自由活动。虚线表示股骨轴和胫骨轴，它们之间的角度分别为固定腿和活动腿确定。gydF4y2BadgydF4y2Ba，关节的运动范围(ΔgydF4y2BaαgydF4y2Ba)通过测量最大伸展时股骨-胫骨轴角的差值(gydF4y2BaαgydF4y2BaegydF4y2Ba)和屈曲(gydF4y2BaαgydF4y2BafgydF4y2Ba)．移动腿的清晰度轴如图所示gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba都反映在插图中。gydF4y2Ba

图7 Cirl- nrs - lexa蛋白与Cirl蛋白的共定位。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BacgydF4y2Ba， L3幼虫携带野生型(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)、γ抗分泌(gydF4y2BabgydF4y2Ba)或增益域切割无能(gydF4y2BacgydF4y2BaCirl- nrs - lexa变体表明，除了凯尼恩细胞(chevron)和整个中枢神经系统的少数单个神经元(箭头)外，Cirl解离在所有神经元中都依赖于受体自身蛋白水解。NLS =核定位序列;比例尺，50µm。gydF4y2BadgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba，标记NRS传感器变体示意图。gydF4y2BaggydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba我gydF4y2Ba不同NRS传感器变体的中央脑半球单平面使用抗ha(洋红色)和抗v5(绿色)抗体进行免疫染色，以可视化NRS传感器变体的ECR和C端(右图)。比例尺= 30µm。gydF4y2BajgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BalgydF4y2Ba，中所示的合并半球图像的插图gydF4y2BaggydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba我gydF4y2Ba(虚线矩形)。N端和c端NRS端共定位于三龄幼虫中央脑半球细胞的膜(箭头)。比例尺bar = 10µm。gydF4y2Ba米gydF4y2Ba， L3幼虫大脑表达转录报告gydF4y2BaCirlp-GAL4gydF4y2Ba(绿色)和释放传感器gydF4y2BaCirl-NRS-LexAgydF4y2Ba(红色)。比例尺= 50µm。gydF4y2BangydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BapgydF4y2Ba， RFP-Cirl(绿色)和不同Cirl-NRS变体(洋红色)的免疫组化共染色显示这两种蛋白在L3幼虫中央脑半球细胞(箭头)的膜上共定位。虚线矩形表示在下面的插图中放大的区域的位置。比例尺= 30µm，镶嵌= 10µm。所有实验都独立重复了3次，结果相似。gydF4y2Ba

扩展数据图8gydF4y2BaTollogydF4y2Ba不会影响Cirl表达水平或定位。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba， Cirl配体亲和免疫沉淀实验装置示意图。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BaTollo-GAL4gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCirl-NRS-LexAgydF4y2Ba共标记显示Cirl-NRS-LexA共表达gydF4y2Ba+gydF4y2Ba(洋红色)和Tollo-GAL4gydF4y2Ba+gydF4y2Ba(绿色)在大脑半球的特定区域和VNC(插图)。强大的gydF4y2BaCirl-NRS-LexA > lexAop-myr-mCherrygydF4y2Ba中央大脑的活动在蘑菇体(星号)和皮层的网状图案(箭头)中被发现。比例尺，25µm。插入:VNC中的部分单元格显示Tollo-GAL4gydF4y2Ba+gydF4y2Ba/ Cirl-NRS-LexAgydF4y2Ba+gydF4y2Ba共标记(封闭箭头)，而其他要么是Tollo-GAL4gydF4y2Ba+gydF4y2Ba或Cirl-NRS-LexAgydF4y2Ba+gydF4y2Ba(打开箭头)。比例尺，10µm。独立实验重复6次，结果相似。gydF4y2BacgydF4y2Ba， Tollo-GAL4间突触相互作用筛选原理gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和Cirl-NRS-LexAgydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞通过t-GRASP。gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba，抗gfp免疫染色增强L3脑半球t-GRASP信号;使用抗mir抗体可见成神经细胞。比例尺= 50µm。代表性t-GRASP信号经共表达gydF4y2BaTollo-GAL4gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCirl-NRS-LexAgydF4y2Ba丰富的(gydF4y2BaegydF4y2Ba)，但在没有驱动器的对照组果蝇中几乎检测不到(gydF4y2BadgydF4y2Ba)．t-GRASP信号似乎排列细胞边界(箭头)。比例尺，10µm。gydF4y2BafgydF4y2Ba脑内t-GRASP信号定量表明Tollo-GAL4gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和Cirl-NRS-LexAgydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞相互接触。(i)和(ii)与gydF4y2BadgydF4y2Ba而且gydF4y2BaegydF4y2Ba,分别。gydF4y2Bapre-t-GRASP / +;post-t-GRASP / +gydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba= 4个独立的苍蝇)，gydF4y2BaTollo-GAL4 > pre-t-GRASP;Cirl-NRS-LexA > post-t-GRASPgydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba= 5个独立的苍蝇)。数据以盒须图(所有数据点绘制;水平线代表中位数，框代表25gydF4y2BathgydF4y2Ba和75年gydF4y2BathgydF4y2Ba百分位数、胡须最小值和最大值)。数据与双尾未配对的数据进行比较gydF4y2BatgydF4y2Ba-test(置信区间= 95%)。另请参阅gydF4y2Ba源数据gydF4y2Ba．gydF4y2BaggydF4y2Ba， c端v5标记Cirl的插图。gydF4y2BahgydF4y2Ba， Western blot分析显示存在和不存在的Cirl表达水平相似gydF4y2BaTollogydF4y2Ba．α-微管蛋白作为负载对照。独立实验重复2倍，得到相似的结果。凝胶源数据参见补充图。gydF4y2Ba1 hgydF4y2Ba．gydF4y2Ba我gydF4y2Ba在幼虫大脑中Cirl表达的共聚焦图像未发生改变gydF4y2BaTollogydF4y2BaKOgydF4y2Ba．比例尺100 μ m。独立实验重复3次，得到相似的结果。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

图9环状ntf释放发生在胶质细胞中，足以维持成神经细胞池。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，单共焦平面显示稀疏共标记gydF4y2BaCirl-NRS-LexAgydF4y2Ba和pan-glialgydF4y2Barepo-GAL4gydF4y2BaL3中枢神经系统标记(箭头)。盒装区域放大在插图中。星号表示蘑菇体。比例尺，50µm;刻度条插入，10µm。gydF4y2BabgydF4y2Ba，原理图gydF4y2BaCirl-T2A-LexAgydF4y2Ba记者等位基因。gydF4y2BacgydF4y2BaCirl-NRS-LexA足以维持成神经细胞池大小。Mir的定量gydF4y2Ba+gydF4y2BaL3中枢脑的神经母细胞(gydF4y2BangydF4y2Ba=每个基因型8只独立果蝇)。数据以盒须图(所有数据点绘制;水平线代表中位数，框代表25gydF4y2BathgydF4y2Ba和75年gydF4y2BathgydF4y2Ba百分位数、胡须最小值和最大值)。在进行夏皮罗-威尔克正态检验后，采用普通单因素方差分析和Tukey检验(置信区间= 95%)对数据进行分析。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值显示在数据上方。另请参阅gydF4y2Ba源数据gydF4y2Ba．gydF4y2BadgydF4y2BaCirl只在CG细胞中需要，而在神经母细胞或GMCs中不需要，以维持正常的神经母细胞池大小。圆形表示转基因的存在。Mir的定量gydF4y2Ba+gydF4y2Ba具有基因型的独立果蝇L3中脑神经母细胞gydF4y2BaUAS-CirlgydF4y2BaRNAigydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba= 8个独立的苍蝇)，gydF4y2BaCirlp-GAL4gydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba= 11个独立的苍蝇)，gydF4y2BaCirlp-GAL4 > UAS-CirlgydF4y2BaRNAigydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba= 9个独立的苍蝇)，gydF4y2Ba55 b12-gal4gydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba= 8个独立的苍蝇)，gydF4y2Ba55 b12-gal4gydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba= 7个独立的苍蝇)，gydF4y2BaTollo-GAL4gydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba= 9个独立的苍蝇)和gydF4y2BaTollo-GAL4 > UAS-CirlgydF4y2BaRNAigydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba= 8个独立的苍蝇)。数据以盒须图(所有数据点绘制;水平线代表中位数，框代表25gydF4y2BathgydF4y2Ba和75年gydF4y2BathgydF4y2Ba百分位数、胡须最小值和最大值)。数据分析采用普通单因素方差分析，采用Tukey检验(置信区间= 95%)。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值显示在数据上方。另请参阅gydF4y2Ba源数据gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

扩展数据图10gydF4y2Ba黑腹果蝇gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba的所有已知agpcr的结构布局gydF4y2Ba黑腹果蝇gydF4y2Ba．领域缩写:7TM，七螺旋跨膜;钙,钙粘蛋白;GAIN, GPCR诱导自身蛋白水解;HRM，激素受体motif;搞笑,免疫球蛋白;林,层粘连蛋白;EGF，表皮生长因子;LRR，富含亮氨酸重复。gydF4y2BabgydF4y2Ba，利用Jukes-Cantor算法进行GAIN结构域氨基酸序列的系统发育比较。以人类PKD1 GAIN域作为外群。gydF4y2BacgydF4y2Ba所有果蝇agpcr的GPS氨基酸序列比对显示，5个受体中有4个的GPS位点是保守的。虚线表示增益畴介导的自裂部位。NTF侧用蓝色框起。gydF4y2BadgydF4y2Ba， Mayo-NRS和Ketchup-NRS的结构。gydF4y2Ba

补充信息gydF4y2Ba

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肖尔茨，N.， Dahse, AK。， Kemkemer, M。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba机械和配体依赖性粘附GPCR解离的分子传感。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba(2023)。https://doi.org/10.1038/s41586-023-05802-5gydF4y2Ba

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