文摘gydF4y2Ba
常见的革兰氏阴性细菌外膜结构,线粒体和叶绿体,包含外膜β-barrel蛋白质(OMPs)交换门户的材料至关重要gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。所有已知OMPs分享反平行的β-strand拓扑gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,暗示一个共同的进化起源和守恒的折叠机制。模型提出了细菌β-barrel组装机械(BAM)启动OMP折叠gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba;然而,机制BAM收益完成OMP组装仍不清楚。我们在这里报告中间结构的BAM组装OMP衬底,EspP,展示顺序的构象动态BAM OMP组装的后期阶段,进一步支持的分子动力学模拟。诱变体外和体内装配分析揭示功能残留巴马EspP桶杂交,关闭和释放。我们的工作提供了新颖的见解的共同机制OMP组装。gydF4y2Ba
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引用gydF4y2Ba
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确认gydF4y2Ba
感谢y .问:魏董和b . r .他们持续的支持,鼓励和建议,马c .浙江大学医学院为他的援助在蛋白质纯化和z苏SKLB杜宇四川大学高性能计算中心寻求帮助在图准备。这部分工作是由中国国家重点研发项目(2018 yfa0507700 x张2021 yfa1301900和2021 yfa1301203收听距离2017 yfa0504803 x张,2021 yfa1201201和2021 yff1200404 R.Z.);中国国家自然科学基金(X.T. 31900039和3217002932000844,南卡罗莱纳州,81年971974to H.D. and U1967217 to R.Z.); the National Center of Technology Innovation for Biopharmaceuticals (NCTIB2022HS02010 to R.Z.); the Fundamental Research Funds for Central Universities (226-2022-00043 and 226-2022-00192 to R.Z.); the 1.3.5 Project for Disciplines Excellence of West China Hospital, Sichuan University (ZYYC20021 to H.D.); the National Independent Innovation Demonstration Zone Shanghai Zhangjiang Major Projects (ZJZX2020014 to R.Z.); the Starry Night Science Fund at Shanghai Institute for Advanced Study of Zhejiang University (SN-ZJU-SIAS-003/006/009 to R.Z.); and BirenTech Research (BR-ZJU-SIAS-001 to R.Z.); as well as grants from Laboratory and Equipment Management Department, Zhejiang University (SYB202132 to S.C.).
作者信息gydF4y2Ba
作者和联系gydF4y2Ba
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收听距离X.T.构思和设计实验。R.Z. K.C.C.设计分子模型和模拟。X.T.,收听距离,C.S.和Q.L. made the constructs for protein expression. X.T., C.S., Q.L. and Z.Z. expressed and purified the proteins. C.S. and Q.L. did the mutagenesis, the transport assays and the cell-based assays. C.S., Q.L. and Z.Z. prepared the samples. S.C. and X. Zhang undertook data collection, processed electron microscopy data and performed structure construction. R.Z., K.C.C. and T.X. performed the MD simulations. X.W., X. Zhu, G.L. and B.L. analysed the experimental data and prepared the figures. H.D., X.T. and C.D. did the model building and refinement. H.D. and X.T. wrote the manuscript. X. Zhang, R.Z., S.C. and C.D. revised the manuscript.
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自然gydF4y2Ba由于尼古拉斯Pfanner,亚历山德拉Polissi,匿名的,评论家罗伯特•Tampe和其他(s)为他们的贡献的同行评审工作。gydF4y2Ba
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出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然保持中立在发表关于司法主权地图和所属机构。gydF4y2Ba
扩展数据数据和表gydF4y2Ba
扩展数据图1分析含有半胱氨酸的蛋白质纯化BAM-EspP pair1 + 4, pairs1, pair2 pair3。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba方案的外膜蛋白(OMP)运输和组装从细胞质到通过BAM外膜。新合成OMP转移在我通过SecYEG周质,说法苏拉和Skp携带新生的OMP BAM组装。gydF4y2BabgydF4y2Ba、重组BamABCDE示意图和maltose-binding蛋白(MBP)融合EspP蛋白质包含β-barrel乘客和短肽(上半部分)。示意图BAM-EspP复杂的显示位置的半胱氨酸对突变(下图)。半胱氨酸对1:巴马(G431C) -EspP (N1293C),半胱氨酸对2:巴马(N427C) -EspP (R1297C),半胱氨酸对3:巴马(S425C) -EspP (S1299C)和半胱氨酸对4:巴马(G781C) -EspP (A1043C)。gydF4y2Bac-jgydF4y2Basds - page(氟)和证券交易委员会(g-j)尺寸排阻色谱法纯化BAM-EspP蛋白质的使用增加Superdex200 10/300列(孔隙体积≈4.8毫升)没有或德勤的存在。结果表明n = 3代表数据的实验。凝胶源数据,请参阅补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
扩展数据图2评估半胱氨酸的二硫键的形成pair1, pair2 pair3。gydF4y2Ba
在活的有机体内gydF4y2Ba巴马半胱氨酸的二硫键形成突变体N431C (a), N427C (b)和S425C (c)和EspP半胱氨酸突变体R1297C N1295C, R1297C S1299C。交联巴马-gydF4y2BaMBPgydF4y2BaEspP,不成熟gydF4y2BaMBPgydF4y2BaEspP和成熟EspP被检测到anti-Flag EspP(上两个屁股)和anti-Myc巴马(低两个屁股)在没有和德勤的存在。非特异性带*表示。结果表明n = 3代表数据的实验。源数据,请参阅补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
扩展数据图3交联的生理评估BAM-EspP复合物。gydF4y2Ba
模拟gydF4y2Ba,gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba交联的折叠状态由半胱氨酸BAM-EspP pair1 (a), pair1 + 4 (b), pair2 (c)和pair3 (d)监控超过90分钟。gydF4y2BaMBP -gydF4y2BaEspP中间,成熟EspP和巴马减少条件下检测到西方的屁股。EspP突变体的c端循环删除(▽S1281-D1289 ECL6)作为一个积极的控制。Anti-RpoB免疫印迹作为加载控制。结果表明n = 3代表数据的实验。gydF4y2Ba超高频gydF4y2Ba200 - ns分子动力学(MD)刺激的交联(绿线)和链接在油脂的野生型(紫色的线)BAM-EspP复杂nanodisc (e, f)或分离的野生型BAM-EspP复杂nanodisc / PL双分子层膜(红色线)和有限合伙人和PL(蓝线)(g, h)。污点源数据,请参阅补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
扩展数据图4流程图BAM的决心——低温电子显微镜结构gydF4y2Bapair1 + 4gydF4y2Ba-EspP和BAM -gydF4y2Bapair1gydF4y2Ba在nanodisc -EspP复合物。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba,gydF4y2BafgydF4y2Ba砰——,代表低温电子显微镜显微镜图像gydF4y2Bapair1 + 4gydF4y2Ba-EspP (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和BAM -gydF4y2Bapair1gydF4y2Ba-EspP (gydF4y2BafgydF4y2Ba)复合物。gydF4y2BabgydF4y2Ba,gydF4y2BaggydF4y2Ba数据收集方案,两-三维分类,改进和当地的低温电子显微镜分辨率密度地图的BAM -gydF4y2Bapair1 + 4gydF4y2Ba-EspP (gydF4y2BabgydF4y2Ba)和BAM -gydF4y2Bapair1gydF4y2Ba-EspP (gydF4y2BaggydF4y2Ba)。gydF4y2BacgydF4y2Ba砰——,选择二维分类图像gydF4y2Bapair1 + 4gydF4y2Ba-EspP。gydF4y2BadgydF4y2Ba,gydF4y2BahgydF4y2Ba为对照,傅里叶壳修正(FSC)曲线结构分辨率测定BAM -gydF4y2Bapair1 + 4gydF4y2Ba-EspP (gydF4y2BadgydF4y2Ba)和BAM -gydF4y2Bapair1gydF4y2Ba-EspP (gydF4y2BahgydF4y2Ba)。gydF4y2BaegydF4y2Ba,gydF4y2Ba我gydF4y2Ba、低温电子显微镜所选巴马的地图和EspPβ-strands BAM -gydF4y2Bapair1 + 4gydF4y2Ba-EspP (gydF4y2BaegydF4y2Ba)和BAM -gydF4y2Bapair1gydF4y2Ba-EspP (gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
扩展数据图5低温电子显微镜结构流程图确定BAM -gydF4y2Bapair2gydF4y2Ba-EspP和BAM -gydF4y2Bapair3gydF4y2Ba在nanodisc -EspP复合物。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba,gydF4y2BafgydF4y2Ba代表BAM -低温电子显微镜显微镜图像gydF4y2Bapair2gydF4y2Ba-EspP (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和BAM -gydF4y2Bapair3gydF4y2Ba-EspP (gydF4y2BafgydF4y2Ba)复杂。gydF4y2BabgydF4y2Ba,gydF4y2BaggydF4y2Ba低温电子显微镜图像收集、调整、二维和三维的分类、细化和地方决议BAM -密度图gydF4y2Bapair2gydF4y2Ba-EspP (gydF4y2BabgydF4y2Ba)和BAM -gydF4y2Bapair3gydF4y2Ba-EspP (gydF4y2BaggydF4y2Ba)。gydF4y2BacgydF4y2Ba,选择二维图像的BAM -gydF4y2Bapair2gydF4y2Ba-EspP复杂。gydF4y2BadgydF4y2Ba,gydF4y2BahgydF4y2Ba,FSC曲线分辨率BAM的决心——结构gydF4y2Bapair2gydF4y2Ba-EspP (gydF4y2BadgydF4y2Ba)和BAM -gydF4y2Bapair3gydF4y2Ba-EspP (gydF4y2BahgydF4y2Ba)。gydF4y2BaegydF4y2Ba,我,低温电子显微镜的地图选择的巴马和EspPβ-strands BAM的-gydF4y2Bapair2gydF4y2Ba-EspP (gydF4y2BaegydF4y2Ba)和BAM -gydF4y2Bapair3gydF4y2Ba-EspP (gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
扩展数据图6 BamA-EspP结构的叠加与其他报道BAM结构。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba、侧混合桶BAM——的观点gydF4y2Bapair1 + 4gydF4y2Ba-EspP,巴马的n端之间的接口和糖基EspP(左)和糖基的巴马和n端EspP暴露疏水侧链(右)。红色圆圈表示巴马C1043之间形成二硫键的位置和EspP C781。gydF4y2BabgydF4y2BaBAM的叠加gydF4y2Bapair1 + 4gydF4y2Ba-EspP和BAM -gydF4y2Bapair1gydF4y2Ba-EspP结构从侧面(左)和俯视图(右)gydF4y2BacgydF4y2Ba巴马的叠加桶BAM -gydF4y2Bapair1gydF4y2Ba-EspP结构(浅绿色)与晶体结构(PDB:gydF4y2Ba5 d0ogydF4y2Ba鲑鱼)(左)和开放的晶体结构(PDB:gydF4y2Ba5 d0qgydF4y2Ba,gydF4y2Ba苍白的gydF4y2Ba黄色)(右)。gydF4y2BadgydF4y2Ba叠加的BAM -gydF4y2Bapair1 + 4gydF4y2Ba与BAM-BamA -EspP复杂(暗青色)gydF4y2Ba∆L1gydF4y2Ba复杂(PDB):gydF4y2Ba6 v05gydF4y2Ba,gydF4y2Ba黑暗gydF4y2Ba紫色)侧(左)和(中)的混合桶和周质的环(右)。gydF4y2BaegydF4y2Ba巴马的叠加和EspP混合桶pair1(浅绿色)和pair1 + 4(暗青色)复合物从顶部视图。的侧链R1297 pair1 + 4(红色)和pair1(蓝色)结构,显示不同的方向。gydF4y2BafgydF4y2Ba,gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba折叠的评估BAM-EspP (R1297A)超过90分钟。gydF4y2BaMBP -gydF4y2BaEspP中间,成熟EspP和巴马减少条件下检测到西方的屁股。数据的实验结果表明代表n = 3。污点源数据,请参阅补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
扩展数据图7所示gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba组装化验设备。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba的计划,gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba折叠试验。尿素变性EspP掺杂BAM proteoliposomes苏拉的存在。gydF4y2BabgydF4y2Ba的设置gydF4y2Ba在体外gydF4y2BaEspP大会通过免疫印迹分析。折叠EspP和巴马脂质体被热变性测试。gydF4y2BacgydF4y2Ba脂质体,BAM复杂的方向是由蛋白酶K治疗。gydF4y2BadgydF4y2Ba,展开EspP被蛋白酶K降解。gydF4y2BaegydF4y2Ba免疫沉淀反应与苏拉(喉炎的症状)gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba组装试验退出界EspP(国旗)变异显示苏拉的正常表现。gydF4y2BafgydF4y2Ba、蛋白质检测EspP (∆L1)和EspP(哈佛∆)变体有或没有丙氨酸链接器恢复后30分钟gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba免疫印迹EspP和巴马组装。Anti-RpoB作为加载控制。gydF4y2BaggydF4y2Ba、细胞生存能力分析巴马突变体在阿拉伯糖的存在。可行性分析缺乏树胶醛醣如无花果所示。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba。gydF4y2BahgydF4y2Ba,sds - page纯化BAM复杂的巴马突变体的g。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba,脂质体重组巴马突变前后热变性。结果表明n = 3代表数据的实验。源数据,请参阅补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
扩展数据图8构象变化的结构在不同的州。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba叠加的混合桶pair1 + 4和pair2结构(左),显示关闭侧门口pair2结构的相互作用对巴马ECL1(右)。gydF4y2BabgydF4y2Ba,叠加的巴马桶pair2结构和晶体结构(PDB:gydF4y2Ba5 d0ogydF4y2Ba鲑鱼)。放大部分显示了巴马β1之间的相互作用和β16封闭的晶体结构(PDB:gydF4y2Ba5 d0ogydF4y2Ba)(右面板)gydF4y2BacgydF4y2Ba叠加巴马桶四个BAM-EspP结构、构象变化的c端β16结束。gydF4y2BadgydF4y2Ba的叠加pair1 + 4周质的环,pair2和pair3结构。gydF4y2BaegydF4y2Ba巴马桶,叠加和周质的pair1和pair2结构的环,pair1 + 4的参考结构。盒装部分显示出弯曲巴马ECL1从S436 pair1和pair2结构的相互作用。gydF4y2BafgydF4y2Ba,gydF4y2BaggydF4y2Ba叠加巴马桶pair1 + 4, pair2和侧向封闭水晶(5 d0o)结构,显示构象的变化巴马β1周质的链接器(f), POTRA域(g(左)和POTRA3循环(g,右)。gydF4y2BahgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BalgydF4y2Ba,叠加四BAM-EspP结构强调POTRA5之间的相互作用,PT1和PT4(绿色)和PT1和BamD之间(橙色)。BAM-EspP pair1 + 4的暗青色,pair1亮绿色,在中紫色和pair3 pair2皇家蓝色。gydF4y2Ba
扩展数据图9 EspP桶zipper-like的方式关闭。gydF4y2Ba
安妮gydF4y2Ba从pair1 EspP桶+ 4 (a), pair1 (b), pair2 (c), pair3 (d)和水晶成熟EspP (PDB:gydF4y2Ba2库姆gydF4y2Ba、黄橙色)(e)结构(上部面板)。形成的氢键的β-seam EspP桶对应的结构较低的面板所示。gydF4y2BafgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BalgydF4y2Ba、MD模拟从pair2 EspP结构的显示顺序形成氢键的时间内监控(f - k)。监视的氢键用不同的颜色表示。结构的比较我们pair2和水晶EspP折叠结构在模拟桶关闭(j l)。gydF4y2Ba米gydF4y2Ba,gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba二硫键形成的半胱氨酸突变观察互动残留的EspP pair2结构。数据的实验结果表明代表n = 3。污点源数据,请参阅补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
扩展数据图10结构比较的BAM组装与晶体结构的BAM报道中间。gydF4y2Ba
叠加的pair1 + 4(暗青色),pair1(浅绿色),pair2(中紫色),pair3 PDB(紫色)和晶体结构:gydF4y2Ba5 d0qgydF4y2Ba(淡黄色),5 ekq(海洋)和5 d0o(鲑鱼)。gydF4y2BafgydF4y2Ba巴马桶,构象变化的叠加结构,显示状态转换从外侧打开关闭。gydF4y2Bag-lgydF4y2Ba巴马的整体构象变化的叠加结构从打开的状态关闭状态。gydF4y2Ba先生gydF4y2Ba的顶视图POTRA1-5叠加结构从打开到关闭状态,显示的顺时针旋转POTRA域。gydF4y2Ba
扩展数据图11日报道配体结合的结构比较巴马BAM-EspP结构。gydF4y2Ba
得了gydF4y2Ba叠加的报道,BamA-EspP PDB:gydF4y2Ba7 tt5gydF4y2Ba(肮脏的紫色)或7 tt7(橄榄)与我们pair1 + 4(暗青色)(a), pair1(浅绿色)(b)和pair2(中紫色)(c)结构,显示不同的巴马中间构象和EspP桶。较低的面板是90°旋转上层板的轴,显示混合桶的顶部视图。gydF4y2BadgydF4y2Ba,叠加的巴马BAM-EspP报道gydF4y2Baβ9-12gydF4y2Ba(PDB:gydF4y2Ba7 ri4gydF4y2Ba)(浅粉),关闭水晶PDB:gydF4y2Ba5 d0ogydF4y2Ba(淡黄色)(d)和pair1 + 4(暗青色)结构(eg),显示不同的构象巴马POTRA域(d, e)和桶边孔BAM-EspP (f)gydF4y2Baβ9-12gydF4y2Ba结构。的EspPgydF4y2Baβ9-12gydF4y2Ba(介质兰花)是夹在β1β16巴马(g)。gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充图1gydF4y2Ba
Uncropped凝胶和免疫印迹。剪裁区域所示的主要和扩展数据数据用红色虚线表示。gydF4y2Ba
补充视频1gydF4y2Ba
动力学的BAM-EspP BAM的观点。BAM-EspP复杂的状态转换为视图显示BAM构象变化和EspP巴马β-barrel侧的门。gydF4y2Ba
补充视频2gydF4y2Ba
动力学的BAM-EspP EspP的观点。BAM-EspP复杂的状态转换,显示BAM构象变化和EspP视图的EspPβ-barrel。gydF4y2Ba
补充视频3gydF4y2Ba
动态BAM-EspP从前面和前视图。BAM-EspP复杂的状态转换,显示BAM构象变化和EspP从前面和前视图。gydF4y2Ba
权利和权限gydF4y2Ba
Springer性质或其许可方(例如一个社会或其他合作伙伴)拥有独占权下本文与作者出版协议(s)或其他情况下(年代);作者self-archiving接受这篇文章的手稿版本是完全由这样的出版协议的条款和适用法律。gydF4y2Ba
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引用这篇文章gydF4y2Ba
沈,C。,Chang, S., Luo, Q.et al。gydF4y2Ba基础结构BAM-mediated外膜β-barrel蛋白质组装。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba617年gydF4y2Ba,185 - 193 (2023)。https://doi.org/10.1038/s41586 - 023 - 05988 - 8gydF4y2Ba
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发表gydF4y2Ba:gydF4y2Ba
发行日期gydF4y2Ba:gydF4y2Ba
DOIgydF4y2Ba:gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/s41586 - 023 - 05988 - 8gydF4y2Ba
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