文摘
生物合成是一种环保和可再生的方法,可以用来产生一个广泛的自然和,在某些情况下,new-to-nature产品。然而,生物学缺乏可用的许多反应来合成化学家,导致更窄的范围使用生物合成时易访问产品而不是合成化学。这种化学carbene-transfer反应的一个典型的例子1。虽然最近表明carbene-transfer反应可以执行在一个细胞,用于生物合成2,3碳烯捐赠者和不自然的代数余子式需要补充道,和运输到体内细胞效应所需的反应,从而排除成本效益扩大生物合成过程的这些反应。这里我们报告访问重氮酯碳烯前体通过细胞代谢和微生物自然carbene-transfer反应引入到生物合成的平台。的α-diazoester重氮乙酰丝氨酸是由生物合成基因簇的表达链霉菌属白色。重氮乙酰丝氨酸产生的细胞被用作碳烯捐赠者cyclopropanate molecule-styrene产生另一个细胞。加快了反应工程P450酶突变体包含一个本地辅因子具有优良的选择性很大和温和的产量。我们的研究建立了一个可伸缩的、微生物平台进行细胞内非生物的一系列自然和new-to-nature carbene-transfer反应用产品和有机产品的范围,可以扩大所产生的细胞新陈代谢。
这是一个预览的订阅内容,通过访问你的机构
访问选项
访问其他自然组合期刊性质和54
得到自然+,请求书在线访问订阅
29.99美元/ 30天
取消任何时候
订阅本杂志
收到51印刷问题和网络访问
每年199.00美元
只有3.90美元的问题
本文租或购买
价格不同的文章类型
从1.95美元
来39.95美元
价格可能受当地税收计算在结帐
数据可用性
在这项研究中使用的质粒DNA序列存入公共版本的JBEI注册表(http://public-registry.jbei.org)。加入代码提供了补充表2(ID)。的序列和注释阿扎BGC基因库(可用NZ_BEVZ01000003.182400 - 111549年)生成基地。确定结构已经存入PDB (8流化床燃烧器)。MS蛋白质组学数据一直在沉积ProteomeXchange财团通过骄傲63年合作伙伴库数据集标识符PXD037509。源数据本文提供的。
引用
阿诺德·f·h·定向进化:化学带来新的生机。Angew。化学。Int,艾德。英格兰。57,4143 - 4148 (2018)。
华莱士,s & Balskus e . p .接口微生物在生物相容的摘要苯乙烯生产的反应。Angew。化学。Int,艾德。英格兰。54,7106 - 7109 (2015)。
黄,j . et al。自然由工程微生物生物合成与异种的表达自然酶和人造金属酶。Nat,化学。13,1186 - 1191 (2021)。
戴维斯h . m . l . &曼宁,j . r .催化碳氢键功能化金属carbenoid和nitrenoid插入。自然451年,417 - 424 (2008)。
柯南道尔,m . P。达菲,R。,Ratnikov, M. & Zhou, L. Catalytic carbene insertion into C-H bonds.化学。牧师。110年,704 - 724 (2010)。
福特、et al。现代有机合成α-diazocarbonyl化合物。化学。牧师。115年,9981 - 10080 (2015)。
朱,D。,Chen, L. F., Fan, H. L., Yao, Q. L. & Zhu, S. F. Recent progress on donor and donor-donor carbenes.化学。Soc。牧师。49,908 - 950 (2020)。
克鲁格,r .硫胺二磷酸:机械的更新的酶和非酶的催化脱羧。化学。牧师。87年,863 - 876 (1987)。
李,j·k·&胡克k . n .精通酶重新审视:预测orotidine一磷酸脱羧酶的机制。科学276年,942 - 945 (1997)。
迈耶,D。,Neumann, P., Ficner, R. & Tittmann, K. Observation of a stable carbene at the active site of a thiamin enzyme.Nat,化学。医学杂志。9,488 - 490 (2013)。
科克伦,A . r . et al .自然产品lepidiline作为N杂环卡宾配体配合物的前体类型(Ir (cod) (NHC) PPh3)] X:合成、描述和应用程序在氢同位素交换催化。催化剂10161 (2020)。
程,r·h . et al .影响imidazole-2-yl碳烯中间厌氧ergothioneine rhodanase-catalyzed c键形成反应的生物合成。ACS Catal。11,3319 - 3334 (2021)。
科埃略,p S。,Brustad, E. M., Kannan, A. & Arnold, F. H. Olefin cyclopropanation via carbene transfer catalyzed by engineered cytochrome P450 enzymes.科学339年,307 - 310 (2013)。
Brandenberg, o . F。,Fasan, R. & Arnold, F. H. Exploiting and engineering hemoproteins for abiological carbene and nitrene transfer reactions.咕咕叫。当今。Biotechnol。47,102 - 111 (2017)。
Liu z &阿诺德·f·h·New-to-nature蛋白质化学从旧机械:碳烯和氮烯转移酶。咕咕叫。当今。Biotechnol。69年43-51 (2021)。
华莱士,s & Balskus e . p .设计师胶束加速通过工程代谢通量大肠杆菌可以使化学的生物相容性和支持。Angew。化学。Int,艾德。英格兰。55,6023 - 6027 (2016)。
Wong h·n·c·等。使用环丙烷及其衍生物在有机合成。化学。牧师。89年,165 - 198 (1989)。
Talele, t·t·“环丙基片段”是一个多才多艺的球员经常出现在临床前和临床药物分子。j .地中海,化学。59,8712 - 8756 (2016)。
富尔顿,j . R。,Aggarwal, V. K. & de Vicente, J. The use of tosylhydrazone salts as a safe alternative for handling diazo compounds and their applications in organic synthesis.欧元。j . Org。化学。2005年,1479 - 1492 (2005)。
莫兰迪,b & Carreira e . M . Iron-catalyzed摘要在6米KOH原位生成重氮甲烷。科学335年,1471 - 1474 (2012)。
张,l . M。,DeMuynck, B. M., Paneque, A. N., Rutherford, J. E. & Nagib, D. A. Carbene reactivity from alkyl and aryl aldehydes.科学377年,649 - 654 (2022)。
夏,Y。,Qiu, D. & Wang, J. B. Transition-metal-catalyzed cross-couplings through carbene migratory insertion.化学。牧师。117年,13810 - 13889 (2017)。
达,C。,年代onzini, P. & Gallo, E. Iron catalysts with N-ligands for carbene transfer of diazo reagents.化学。Soc。牧师。49,4867 - 4905 (2020)。
Nawrat, c . c &喜怒无常,c . j .天然产物含有重氮组。Nat。刺激。代表。28,1426 - 1444 (2011)。
卡瓦依,s . et al . alazopeptin的完整生物合成途径,6-diazo-5-oxo——两个分子组成的三肽l正亮氨酸和丙氨酸分子之一。Angew。化学。Int。。60,10319 - 10325 (2021)。
Le Maux P。,Nicolas, I., Chevance, S. & Simonneaux, G. Chemical reactivity of 6-diazo-5-oxo-l正亮氨酸(唐)催化金属(铁、俄文)。四面体66年,4462 - 4468 (2010)。
Sugai Y。,Katsuyama, Y. & Ohnishi, Y. A nitrous acid biosynthetic pathway for diazo group formation in bacteria.Nat,化学。医学杂志。12,73 - 75 (2016)。
妈,g . l . et al . tasikamides生物合成的途径耦合和diazonium-mediated腙的形成。j。化学。Soc。144年,1622 - 1633 (2022)。
巴茨,问:r . et al .重氮乙酰丝氨酸的隔离和表征。自然173年,72 - 73 (1954)。
股票,C . C。,Clarke, D. A., Reilly, H. C., Rhoads, C. P. & Buckley, S. M. Azaserine, a new tumour-inhibitory substance: studies with crocker mouse sarcoma 180.自然173年,71 - 72 (1954)。
键,h . m . et al .超越铁:iridium-containing P450酶结构多样化的烯烃的选择性的摘要。ACS分钱。科学。3,302 - 308 (2017)。
Lee m . d . et al .新的抗肿瘤抗生素LL-D05139β。发酵、分离、结构确定和生物活动。j . Antibiot。40,1657 - 1663 (1987)。
松田,k . et al .基因组挖掘氨基航母protein-mediated机械:发现和天然产物的生物合成的特性具有独特腙单位。ACS化学。医学杂志。12,124 - 131 (2017)。
Twigg f . f . et al .识别triacsins的生物合成基因簇N-hydroxytriazene一半。ChemBioChem20.,1145 - 1149 (2019)。
威廉姆斯,m . v . & Tritz g . j .研究模式重氮乙酰丝氨酸抑制的作用大肠杆菌。苯丙氨酸逆转的强化。j . Antimicrob。Chemother。3,65 - 77 (1977)。
分数,s m . et al .直接烷基化重氮乙酰丝氨酸导致的脱氧鸟苷O6-carboxymethyldeoxyguanosine。化学。Toxicol >,34,1518 - 1529 (2021)。
护镜,j·g . et al . P450-mediated非天然的摘要的dehydroalanine-containing thiopeptides。ACS化学。医学杂志。12,1726 - 1731 (2017)。
张,r . j . k . et al .酶通过iron-catalysed组装碳碳键sp3碳氢键功能化。自然565年,67 - 72 (2019)。
阮,k t . et al .表征高温厌氧细胞色素P450的CYP203A亚科在越南太平洲温泉。2月开放的生物11,124 - 132 (2021)。
Ost, t . w . b . et al .氧活化和电子转移在flavocytochrome P450BM3。j。化学。Soc。125年,15010 - 15020 (2003)。
麦肯纳,r &尼尔森·d·r·苯乙烯合成葡萄糖的工程大肠杆菌。金属底座。Eng。13,544 - 554 (2011)。
麦肯纳,R。,Thompson, B., Pugh, S. & Nielsen, D. R. Rational and combinatorial approaches to engineering styrene production by酿酒酵母。活细胞。细胞的事实。13123 (2014)。
李,K。,Bang, H. B., Lee, Y. H. & Jeong, K. J. Enhanced production of styrene by engineered大肠杆菌处和原位产品恢复(ISPR)有机溶剂。活细胞。细胞的事实。1879 (2019)。
林,f M。,Ferguson, K. L., Boyer, D. R., Lin, X. X. N. N. & Marsh, E. N. G. Isofunctional enzymes PAD1 and UbiX catalyze formation of a novel cofactor required by ferulic acid decarboxylase and 4-hydroxy-3-polyprenylbenzoic acid decarboxylase.ACS化学。医学杂志。10,1137 - 1144 (2015)。
Brandenberg, o . F。,Chen, K. & Arnold, F. H. Directed evolution of a cytochrome P450 carbene transferase for selective functionalization of cyclic compounds.j。化学。Soc。141年,8989 - 8995 (2019)。
费舍尔,m & Sawers r . g .普遍适用的和快速的方法测量链霉菌属的增长和其他由亚甲蓝adsorption-desorption丝状微生物。达成。环绕。Microbiol。79年,4499 - 4502 (2013)。
阿齐兹,r·k . et al。拉斯特服务器:使用子系统技术快速注释。BMC染色体组。975 (2008)。
Navarro-Munoz, j . c . et al .计算框架探索大规模生物合成的多样性。Nat,化学。医学杂志。1660 - 68 (2020)。
阮,l . T。,年代chmidt, H. A., von Haeseler, A. & Minh, B. Q. IQ-TREE: a fast and effective stochastic algorithm for estimating maximum-likelihood phylogenies.摩尔。杂志。另一个星球。32,268 - 274 (2015)。
冬天,G。,Lobley, C. M. C. & Prince, S. M. Decision making in xia2.Acta Crystallogr。D69年,1260 - 1273 (2013)。
真品,a . j . et al .移相器晶体软件。j:。Crystallogr。40,658 - 674 (2007)。
跳投,j . et al .高度精确和AlphaFold蛋白质结构预测。自然596年,583 - 589 (2021)。
Liebschner说道,他致力于小到d . et al .大分子结构的决心使用x射线、中子和电子:凤凰的近期发展。Acta Crystallogr。D75年,861 - 877 (2019)。
Afonine, p . v . et al .对自动化与phenix.refine晶体结构细化。Acta Crystallogr。D68年,352 - 367 (2012)。
Emsley p &卡谭,k .傻瓜:模型分子图形的工具。Acta Crystallogr。D60,2126 - 2132 (2004)。
威廉姆斯,c . j . et al . MolProbity:更多更好的参考数据改善所有原子结构验证。蛋白质科学。27,293 - 315 (2018)。
李,t . s . et al . BglBrick向量和数据表:一种合成生物学基因表达的平台。生物。Eng。512 (2011)。
Yuzawa, s . et al .短链酮生产工程酮化合物合成酶链霉菌属白色。Commun Nat。94569 (2018)。
埃尔利希,j . et al .生产重氮乙酰丝氨酸的过程。美国专利2996435 (1961)。
陈,Y。,Gin, J. & Petzold, C. Discovery proteomic (DIA) LC-MS/MS data acquisition and analysis V.2.Protocols.iohttps://doi.org/10.17504/protocols.io.e6nvwk1z7vmk/v2(2022)。
Demichev, V。,Messner, C. B., Vernardis, S. I., Lilley, K. S. & Ralser, M. DIA-NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput.Nat方法。1741-44 (2020)。
Ahrne E。,Molzahn, L., Glatter, T. & Schmidt, A. Critical assessment of proteome-wide label-free absolute abundance estimation strategies.蛋白质组学13,2567 - 2578 (2013)。
Perez-Riverol y . et al ., 2022年骄傲数据库资源:中心质量spectrometry-based蛋白质组学证据。核酸Res。50D543-D552 (2022)。
马德拉,f . et al . 2022年从EMBL-EBI搜索和序列分析工具服务。核酸Res。50W276-W279 (2022)。
确认
这项工作是支持的联合生物能源研究所(https://www.jbei.org),这是由美国能源部、办公室科学、生物和环境研究办公室合同DE-AC02-05CH11231和国家科学基金会拨款2027943。我们感谢h·侯赛因和员工在加州大学伯克利分校的核磁共振设备的大学化学(CoC-NMR)光谱学援助。仪器在CoC-NMR由NIH S10OD024998支持部分。
作者信息
作者和联系
贡献
J.H.和J.D.K.构思这个项目。J.H. J.D.K.写手稿和所有的其他作者的意见。J.D.K.上午,,J.F.H. and D.S.C. provided project guidance. A.Q. and K.D. synthesized the chemical standards. J.H., P.C.-M. and D.V.C. identified the gene cluster. J.H.P. determined the crystal structure. Q.D. purified the proteins. J.H., R.K. and E.E.K.B. performed MS. Y.C. performed proteomics analysis. J.H. conducted the other experiments. E.P.B., P.D.A., T.R.N. and C.J.P. provided resources. All of the authors contributed to the manuscript.
相应的作者
道德声明
相互竞争的利益
J.D.K.在a公司有经济利益,Demetrix枫生物,兰戈,Napigen,伯克利酵母,零英亩的农场,Ansa生物技术,Apertor制药、ResVit生物和Cyklos材料。其他作者声明没有利益冲突。
同行评审
同行审查的信息
自然感谢弗朗西斯·阿诺德,匿名的,尼古拉斯·特纳和其他评论家(s)为他们的贡献的同行评审工作。
额外的信息
出版商的注意施普林格自然保持中立在发表关于司法主权地图和所属机构。
扩展数据数据和表
扩展数据图2重氮乙酰丝氨酸毒性大肠杆菌和美国阿不思·。
一个,重氮乙酰丝氨酸是有毒的大肠杆菌BL21 (DE3)。b,重氮乙酰丝氨酸不影响的增长美国阿不思·在测试浓度。生物质是归一化的文化没有增加重氮乙酰丝氨酸。数据均值±南达科他州。n生物复制= 3。
扩展数据图3重氮乙酰丝氨酸的表达基因簇美国fragilis在美国阿不思·。
一个,生物信息学注释重氮乙酰丝氨酸生物合成基因簇的基因簇和比较一些自然n n bond-containing化合物。b蛋白质组学分析的重氮乙酰丝氨酸基因簇表达美国阿不思·。数据均值±南达科他州。n生物复制= 3。
扩展数据图4重氮乙酰丝氨酸退化的差异在不同的媒体。
一个删除后,重氮乙酰丝氨酸滴定度继续减少美国阿不思·细胞。的azaserine-producing美国阿不思·是生长在TSB媒介。24 h后,细胞从文化汤使用0.22 -µm无菌过滤,滤液孵化在30°C(贴上0 h),在不同的时间点和重氮乙酰丝氨酸浓度监测。b重氮乙酰丝氨酸是稳定的新鲜TSB介质正常pH值7.3或调整pH值8.4。相同体积的重氮乙酰丝氨酸股票添加到最终的浓度大约35 mg / L (0 h。数据均值±南达科他州。n生物(= 3一个)或技术(b)复制。
扩展数据图5纯化P450-T2 WT和突变与重氮乙酰丝氨酸体外催化苯乙烯的反应。
一个,Coomassie蓝染色的sds - page凝胶纯化蛋白P450-T2 WT(左)和P450-T2-5变异(右)。每个车道是一个样本分数期间收集的离子交换净化。b,纯化P450-T2 WT和P450-T2-5突变蛋白催化反应体外高选择性很大。5日,P450-T2-5突变。苯乙烯反应条件:5毫米,5毫米重氮乙酰丝氨酸10µM酶,10毫米Na2年代2O45卷%乙醇,M9-N缓冲区,在有氧条件下22°C 18 h。P总,和所有的非对映体。灰色条指示数据意味着南达科他州±。博士;n= 3反应复制。
扩展数据图6 CYP203A1 WT和轴向配体突变体与重氮乙酰丝氨酸苯乙烯的反应。
启德集团([M + H]+,米/z250.1074)为目标的产品。代表两个重复实验痕迹。包含5毫米苯乙烯的反应,5毫米重氮乙酰丝氨酸,大肠杆菌细胞浓度30 OD600年作为催化剂,5卷%乙醇,M9-N缓冲区和22°C在有氧条件下进行了18 h。
扩展数据图7保守氨基酸选择饱和突变。
残留在蓝色的标签是血红素配体半胱氨酸p450酶类。残留贴上红色的两个守恒的残留之前报道影响P450 BM3的催化行为。序列与Clustalω64年。
扩展数据图8苯乙烯合成条件的探索美国阿不思·。
一个,不同的表达PAL2和FDC1能够生成苯乙烯。pAZA121和pAZA138整合质粒用于引入苯乙烯通路美国阿不思·。b、生产苯乙烯的工程美国阿不思·生长在TSB中补充了额外0毫米,2毫米到4毫米板式换热器。数据均值±南达科他州。n= 3生物样本。
扩展数据图9描述和时间的积累最终的产品。
一个20 MS / MS (eV)的光谱P1标准(红色)和biosynthesized主要产品(黑色)。b生物合成的最终产品在96 - h发酵过程。24小时的数据不是因为少量的产品展示观察(< 10µg / L),因此无法准确滴定度计算。1 b中4毫米板式换热器是用于生成最终的产品。数据均值±南达科他州。n= 3生物样本。
权利和权限
Springer性质或其许可方(例如一个社会或其他合作伙伴)拥有独占权下本文与作者出版协议(s)或其他情况下(年代);作者self-archiving接受这篇文章的手稿版本是完全由这样的出版协议的条款和适用法律。
关于这篇文章
引用这篇文章
黄,J。,Quest, A., Cruz-Morales, P.et al。完整的集成carbene-transfer化学到生物合成。自然617年,403 - 408 (2023)。https://doi.org/10.1038/s41586 - 023 - 06027 - 2
收到了:
接受:
发表:
发行日期:
DOI:https://doi.org/10.1038/s41586 - 023 - 06027 - 2
