文摘gydF4y2Ba
同源重组是生活的一个基本过程。应保护并重新启动复制叉,碎的修复染色体减数分裂期间优惠和遗传物质的交换。个人主要重组基因的突变,如gydF4y2BaBRCA2gydF4y2Ba(也称为gydF4y2BaFANCD1gydF4y2Ba),或gydF4y2BaRAD51gydF4y2BaparaloguesgydF4y2BaRAD51BgydF4y2Ba,gydF4y2BaRAD51CgydF4y2Ba(也称为gydF4y2BaFANCOgydF4y2Ba),gydF4y2BaRAD51DgydF4y2Ba,gydF4y2BaXRCC2gydF4y2Ba(也称为gydF4y2BaFANCUgydF4y2Ba),gydF4y2BaXRCC3gydF4y2Ba是倾向于乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba和癌变综合症Fanconi贫血gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba。BRCA2肿瘤抑制蛋白产品gydF4y2BaBRCA2gydF4y2Ba的特点是好,但细胞功能RAD51 paralogues尚不清楚。遗传淘汰赛中显示增长缺陷,减少RAD51集中形成,自发染色体异常,对PARP抑制剂的敏感性和复制叉的缺陷gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,但精确的分子的角色RAD51 paralogues叉稳定,避免DNA修复和癌症仍然未知。这里我们使用低温电子显微镜,AlphaFold2造型和结构蛋白质组学以确定RAD51B-RAD51C-RAD51D-XRCC2复杂的结构(BCDX2),显示RAD51C-RAD51D-XRCC2模仿三RAD51原体排列在一个核蛋白灯丝,而RAD51B是高度动态的。生化和单分子分析表明,BCDX2刺激的成核和扩展RAD51 filaments-which至关重要的重组DNA修复反应取决于耦合RAD51B和RAD51C腺苷三磷酸酶活动。我们的研究表明,BCDX2协调RAD51大会对单链DNA复制叉保护和双链断裂修复,避免肿瘤反应至关重要。gydF4y2Ba
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作者感谢西实验室成员的支持和建议;n·克罗宁和a . nan低温电子显微镜数据收集;h . n . Ho和g·卡梅伦试剂;答:Kaczmarczyk与单分子分析和d·埃达的帮助;m . Tuppi贡献实验设计;r . Carzaniga问:陈和d·巴里的援助与电子显微镜和数据分析;a·科斯塔和d·本顿的批判阅读手稿;m .间谍提供pCH1-RAD51opt;m . Modesti提供phRPA-mStrawberry pET-TEV和m .艾伦;张x p·沃克,结构生物学STP和肽化学STP。 Work in the S.C.W. laboratory was funded by the Francis Crick Institute, which receives its core funding from Cancer Research UK (CC2098), the UK Medical Research Council (CC2098) and the Wellcome Trust (CC2098), by the European Research Council (ERC-ADG-666400), by the BBSRC (BB/W01355X/1) and by the Louis-Jeantet Foundation. Work in the S.J.B. laboratory was supported by the Francis Crick Institute (CC2057), European Research Council Advanced Investigator grants (TelMetab 742437 and ChrEndProt 101053876), and a Wellcome Trust Senior Investigator grant (220808/Z/20/Z). For the purpose of Open Access, the authors have applied a CC BY public copyright licence to any Author Accepted Manuscript version arising from this submission.
作者信息gydF4y2Ba
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贡献gydF4y2Ba
L.A.G.,C。-C.L. and S.C.W. designed the study. L.A.G. purified proteins and carried out biochemical analyses, with contributions from M.C.R.-B., and performed cryo-EM and data analyses with C-C.L. O.B. carried out the single-molecule assays and was assisted by R.A. S.K., S.M. and M.S. performed biophysical assays, MS and HDX experiments and analysed the data. S.C.W. and S.J.B. supervised the experiments and data analyses. L.A.G. and S.C.W. prepared the manuscript with contributions from all authors.
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道德声明gydF4y2Ba
相互竞争的利益gydF4y2Ba
S.J.B.是该制药公司联合创始人、副总裁科学策略。其他作者声明没有利益冲突。gydF4y2Ba
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自然gydF4y2Ba感谢匿名审稿人(s)为他们的贡献的同行评审工作。gydF4y2Ba
额外的信息gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然保持中立在发表关于司法主权地图和所属机构。gydF4y2Ba
扩展数据数据和表gydF4y2Ba
扩展数据图1单粒子分析BCDX2-ADP的管道。AlFx BCDX2-ADP.AlFx-ssDNA。gydF4y2Ba
总结数据处理策略,包括中间2 d和3 d类平均水平,产量BCDX2-ADP的最终重建。AlFx(2.2)和BCDX2-ADP。AlFx-ssDNA (2.9)。gydF4y2Ba
扩展数据图2单粒子分析BCDX2-ADP.BeFx的管道。gydF4y2Ba
总结数据处理策略,包括中间2 d和3 d类平均水平,而收益率最终BCDX2-ADP重建。BeFx (3.4)。gydF4y2Ba
扩展数据图3角分布、地图和模型分辨率统计和当地的分辨率。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba角分布的阴谋。gydF4y2BabgydF4y2Ba、傅里叶壳牌相关性(FSC)的阴谋。gydF4y2BacgydF4y2Bafsc,地图和模型。gydF4y2BadgydF4y2Ba,当地决议BCDX2-ADP估计。BCDX2-ADP AlFx (2.2)。AlFx (2。9 Å) and BCDX2-ADP.BeFx (3.4 Å).
扩展数据图4 BCDX2结构和生化分析。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba,sds - page BCDX2和BgydF4y2Ba被忽视的热带病gydF4y2BaCDX2。gydF4y2BabgydF4y2Ba,前(左)和(右)BCDX2-ADP的观点。BeFx低温电子显微镜图(3.4)和原子模型。gydF4y2BacgydF4y2Ba,gydF4y2BadgydF4y2Ba,NS-EM 2 d类BCDX2显示运动的平均移动域在ATP和ADP的存在,分别。gydF4y2BaegydF4y2Ba,BCDX2蛋白水解作用有限。sds - page凝胶和免疫印迹Superdex 200分数3.2/300未经处理和胰凝乳蛋白酶BCDX2治疗。凝胶和免疫印迹源数据,请参阅补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
扩展数据图5耦合RAD51B RAD51C atp酶。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba和gydF4y2BacgydF4y2Ba从BCDX2-ADP,原子模型。BeFx结构(3.4)绑定的ATP XRCC2,分别由RAD51C RAD51D ATP和ADP。沃克沃克赖氨酸和苏氨酸,天冬氨酸,催化谷氨酸、赖氨酸的手指从相邻单元表示。核苷酸是显示为黑色网格的密度。绿色球=毫克gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba离子。gydF4y2BadgydF4y2Ba、序列比对的RAD51 RAD51B RAD51C, RAD51D XRCC2蛋白质序列。用红色突出显示的是守恒的催化谷氨酸残基(RAD51 RAD51B和RAD51C)和青色的赖氨酸的手指(RAD51B、RAD51C RAD51D和XRCC2)。gydF4y2BaegydF4y2Ba,图中使用的突变蛋白sds - page。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。凝胶源数据,请参阅补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2BafgydF4y2Ba,高效液相色谱色谱(左)的标准(标准化2µM ATP、ADP ATPγS)和BCDX2(标准化1µM BCDX2)。柱状图(意味着+其中。)核苷酸(右)。都是n = 3除了wt和BgydF4y2BaK114AgydF4y2BaCDX2 n = 7分别和n = 4。n值是独立的实验。未配对的双尾t检验。gydF4y2BaggydF4y2Ba南达科他州,条形图(意味着+)的ATP水解率。都是n = 3除了wt n = 6。n值是独立的实验。未配对的双尾t检验。gydF4y2BahgydF4y2Ba和gydF4y2Ba我gydF4y2BaBCDX2-ADP之间,不同情节。AlFx BCDX2-ADP, BCDX2-ADP。BeFx BCDX2-ADP,分别显示的氘吸收后3(橙色),30(红色),300(蓝色)和3000(黑)秒。正值=暴露;负值=保护。RAD51B: 116肽,91.1%的覆盖率,3.36冗余。RAD51C: 134肽,88%的覆盖率,4.11冗余。RAD51D: 99肽,93.0%的覆盖率,3.5冗余。XRCC2: 76肽,93.6%的覆盖率,2.67冗余。gydF4y2Ba
扩展数据图6 ATP水解BCDX2刺激RAD51灯丝组装。gydF4y2Ba
一个gydF4y2BaNS-EM显微图,代表RAD51细丝BCDX2的缺失和存在,显示纤维检测曲线线分析和crYOLO粒子挑选。比例尺= 100海里。gydF4y2BabgydF4y2Ba南达科他州,散点图(意味着+)的每个显微照片的crYOLO选粒子数(n = 631显微图)。未配对的双尾t检验。gydF4y2BacgydF4y2Ba之间,力测量陷阱作为时间的函数没有(n = 6)和BCDX2存在(n = 7)。阴影区域代表SEM。gydF4y2BadgydF4y2Ba,代表波动曲线记录仪和time-binned强度直方图诗句基因组在狙击枪上的立场gydF4y2BamStrawberrygydF4y2Ba涂布λssDNA RAD51gydF4y2BaAF488gydF4y2Ba信号(蓝色)没有或BCDX2的存在。每一行代表1分钟计算。成核率计算的每个时间平滑波动曲线记录仪AF488检测峰的强度。gydF4y2BaegydF4y2BaRAD51灯丝增长的波动曲线记录仪(ssDNA成蛋白质的运动+ ATP通道)和随后的拆卸(运动到缓冲通道不含ATP)。增长和拆卸率测定的斜率RAD51的边界gydF4y2BaAF488gydF4y2Ba信号。gydF4y2BafgydF4y2Ba散点图(值和差)RAD51拆卸利率没有(n = 47丝)和存在BCDX2 (n = 50丝)。双面Mann-Whitney测试。gydF4y2BaggydF4y2Ba之间,力测量陷阱作为时间的函数(n = 6)缺失或存在BCDX2 (n = 6), BgydF4y2BaE144AgydF4y2BaCDX2 (n = 6), BCgydF4y2BaE161AgydF4y2BaCDX2 (n = 7)和BgydF4y2BaE144AgydF4y2BaCgydF4y2BaE161AgydF4y2BaCDX2 (n = 6)。n值是独立的实验。阴影区域代表SEM。gydF4y2Ba
需要扩展数据图7 ATP水解ssDNA绑定。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba绑定后,荧光各向异性的变化WT BCDX2 FAM-dNgydF4y2Ba15元gydF4y2BassDNA存在ATPγS (n = 3,洋红色),AMP-PNP (n = 3,绿松石),ADP。BeFx (n = 3,海军)和ADP。钒酸盐(n = 3,布朗)。行表示符合二次曲线。每个点和错误栏表示的意思是美国南达科他州+ n值是独立的实验。gydF4y2BabgydF4y2Ba,计算ssDNA绑定亲和常数(中心=gydF4y2BaKgydF4y2BaDgydF4y2Ba值,误差= 95%可信区间的上下极限)的野生型BCDX2 ATP, ADP, ADP。AlFx、ATPγS AMP-PNP, ADP。BeFx ADP.Vanadate。X轴=日志gydF4y2Ba10gydF4y2Ba规模。gydF4y2BacgydF4y2Ba双重标记BCDX2 sds - page, BgydF4y2BaE144AgydF4y2BaCDX2和公元前gydF4y2BaE161AgydF4y2BaDX2。左= Coomassie污渍。正确的= AF555和AF647荧光。凝胶源数据,请参阅补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2BadgydF4y2Ba南达科他州,条形图(意味着+)BCDX2绑定频率,BgydF4y2BaE144AgydF4y2BaCDX2和公元前gydF4y2BaE161AgydF4y2BaDX2 ssDNA没有(n = 3, n = 5, n = 5独立实验中,分别)或存在(n = 4, n = 5, n = 5独立实验中,分别)30年代RAD51的窗口。未配对的双尾t检验。gydF4y2BaegydF4y2Ba和gydF4y2BafgydF4y2Ba归一化荧光强度,AF555信号荧光标记BCDX2 BgydF4y2BaE144AgydF4y2Ba公元前CDX2或gydF4y2BaE161AgydF4y2BaDX2随着时间的推移,在没有(n = 3, n = 4, n = 4独立实验中,分别)或存在(n = 4, n = 5, n = 5独立实验中,分别)的未标记的RAD51。阴影区域代表SEM。gydF4y2BaggydF4y2Ba,力测量RAD51陷阱作为时间的函数之间的缺乏(n = 5)和荧光标记的存在BCDX2 (n = 7), BgydF4y2BaE144AgydF4y2BaCDX2 (n = 6)或BCgydF4y2BaE161AgydF4y2BaDX2 (n = 5)。n值是独立的实验。阴影区域代表SEM。gydF4y2BahgydF4y2Ba的波动曲线记录仪RAD51gydF4y2BaAF555gydF4y2Ba/ BCDX2gydF4y2BaAF647gydF4y2Ba烦恼。1 =烦恼RAD51和BCDX2之间。2 = BCDX2水解或RAD51绑定。3 = RAD51能级。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba独自RAD51 AF647强度值的散点图(渗滤)(n = 39), BgydF4y2BaAF647gydF4y2BaCDX2 (n = 48)和BCDX2gydF4y2Baybbr-AF647gydF4y2Ba(n = 61)。值+差。双面Mann-Whitney统计测试。gydF4y2Ba
扩展数据图8 BCDX2 ssDNA绑定机制。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba,低温电子显微镜BCDX2绑定到ssDNA模型。未建模的密度ssDNA标记(红色)和一个额外的密度,认为是由于蛋白质构象变化,显示(蓝色)。gydF4y2BabgydF4y2BaBCDX2-ADP之间,不同情节。AlFx BCDX2-ADP。一个lFx-ssDNA showing level of deuterium uptake after 3 (orange), 30 (red), 300 (blue) and 3000 (black) seconds. Positive values = exposure (red); negative values = protection (blue). Purple text = L1 loops. Orange text = L2 loops. RAD51B: 110 peptides, 97.7% coverage, 3.38 redundancy. RAD51C: 113 peptides, 98.1% coverage, 3.32 redundancy. RAD51D: 108 peptides, 98.5% coverage, 3.88 redundancy. XRCC2: 89 peptides, 97.9% coverage, 3.27 redundancy.cgydF4y2Ba,假定的守恒ssDNA绑定精氨酸残基的L1 RAD51B循环,RAD51C, RAD51D XRCC2。gydF4y2BadgydF4y2Ba突变BCDX2蛋白质sds - page。凝胶源数据,请参阅补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。荧光各向异性ssDNA绑定曲线没有ATP(蓝色)或ADP(红色)gydF4y2BaegydF4y2BaBgydF4y2BaR217AgydF4y2BaCDX2 (n = 3)和BgydF4y2BaR231AgydF4y2BaCDX2 (n = 3),gydF4y2BafgydF4y2Ba公元前,gydF4y2BaR258AgydF4y2BaDX2 (n = 3)和BCgydF4y2BaR258HgydF4y2BaDX2 (n = 3),gydF4y2BaggydF4y2Ba,BCDgydF4y2BaR221AgydF4y2BaX2 (n = 3),gydF4y2BahgydF4y2Ba,BCDX2gydF4y2BaR159AgydF4y2Ba(n = 3)。n值是独立的实验。行表示符合二次曲线。每个点和错误栏表示的意思是南达科他州+。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba,计算ssDNA绑定亲和常数(中心=gydF4y2BaKgydF4y2BaDgydF4y2Ba值,误差= 95%可信区间上下BCDX2精氨酸突变体的限制)。X轴=日志gydF4y2Ba10gydF4y2Ba规模。gydF4y2BajgydF4y2Ba南达科他州,条形图(意味着+)的ATP水解率。未配对的双尾t检验。所有n = 3,除了wt n = 6。n值代表独立的实验。gydF4y2BakgydF4y2BassDNA亲和力的相关性(错误= 95% CI)对褶皱增加ssDNA atp酶刺激(意思是南达科他州+)。曲线拟合指数衰减曲线。gydF4y2BalgydF4y2Ba南达科他州,条形图(意味着+)的烦恼荧光比率(我gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba/我gydF4y2BaDgydF4y2Ba)之间的5′-Cy3-dNgydF4y2Ba15元gydF4y2Ba或dNgydF4y2Ba15元gydF4y2Ba-Cy3-3′BCDX2, BgydF4y2BaAF647gydF4y2BaCDX2和BCDX2gydF4y2BaAF647gydF4y2Ba。所有n = 3独立实验。正反未配对t检验。gydF4y2Ba
扩展数据图9 BCDX2与RAD51细丝相互作用。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba,RAD51B结合ssDNA RAD51。gydF4y2BabgydF4y2BaRAD51长丝的结构(PDB = 5 h1b)绑定到ssDNA(左)。RAD51B造型gydF4y2Ba连续油管gydF4y2Ba在RAD51-1 (rmsd = 1.024)(右)。放大视图(上层板)显示RAD51订婚gydF4y2BaR229 / R241gydF4y2Ba和RAD51BgydF4y2BaR217 / R231gydF4y2BassDNA。gydF4y2BacgydF4y2Ba在ATP水解RAD51B RAD51C交互,促进高亲和力ssDNA BCDX2复杂的绑定。gydF4y2BadgydF4y2Ba、结构造型RAD51C绑定的核苷酸三联体RAD51C地面和活跃的中间构象。gydF4y2Ba
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补充信息gydF4y2Ba
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Greenhough,洛杉矶,Liang, CC., Belan, O.et al。gydF4y2BaRAD51B-RAD51C-RAD51D-XRCC2肿瘤抑制基因的结构和功能。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba(2023)。https://doi.org/10.1038/s41586 - 023 - 06179 - 1gydF4y2Ba
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发表gydF4y2Ba:gydF4y2Ba
DOIgydF4y2Ba:gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/s41586 - 023 - 06179 - 1gydF4y2Ba
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