Wake-like皮肤模式和神经活动在章鱼睡眠gydF4y2Ba

脊椎动物的快速眼动(REMs)和慢波睡眠的特点是一组核心的行为和电生理学的关联,并提出了认知功能gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba}而表现出丰富的多样性特有的特性gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba。如果功能归结为两阶段的睡眠是真正的将军,然后你可能期待的神经和行为相关的两阶段睡眠动物中广泛复杂的认知能力。章鱼是最大的脑的无脊椎动物和展示一系列复杂的行为gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba,使它们适合测试的通用性两阶段睡眠。睡觉头足类动物gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba已经观察到接受节奏的身体抽搐和快速变化的皮肤图案吗gydF4y2Ba^{6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba},由神经控制大量的皮肤色素细胞(色素细胞)gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba其他特殊类型的细胞gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba。在章鱼,这被称为“主动睡眠”(作为)和伴随着兴奋阈值,增加睡眠的标准之一gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}。扩大在这以前的工作,我们测试是否章鱼拥有两个阶段的睡眠行为。然后我们检查和皮肤神经活动模式动力学在半睡半醒,通过开发新的行为记录和量化方法,纸张成像和LFP在这些软绳录音使用Neuropixels探针的动物。gydF4y2Ba

在白天、夜间章鱼(gydF4y2Ba章鱼绾带gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba)闭上他们的眼睛,采用一个平坦的休息姿势和均匀的白色皮肤模式,先前描述的标志章鱼安静的睡眠(QS)gydF4y2Ba^{6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}。大约每60分钟,这种行为被约1分钟的时间快速的转换通过一系列皮肤模式(无花果。gydF4y2Ba1 a, bgydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba和gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba),伴有明显的眼睛和身体动作(无花果。gydF4y2Ba1 c, dgydF4y2Ba),增加呼吸频率和arhythmicity(无花果。gydF4y2Ba1 e, fgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1得了gydF4y2Ba)。我们量化模式行为使用卷积神经网络从1743 h的视频段九动物,跟踪变化的平均亮度章鱼皮肤(图。gydF4y2Ba1 a, bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2 a - cgydF4y2Ba)。QS分离活性发作期间,动物产生短暂的(7.1±0.3,gydF4y2BangydF4y2Ba= 1163事件,六个动物)和微妙的闪光色与速度,减少活性发作(图之间的时间间隔。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2 d-fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

活跃的发作的间隔依赖水的温度,与1 -°C之间的增加导致大约5分钟减少发作(无花果。gydF4y2Ba1 hgydF4y2Ba线性模型,gydF4y2BaRgydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba}= 0.55,gydF4y2BaFgydF4y2Ba291年统计和常数模型,gydF4y2BaPgydF4y2Ba值为2.33×10gydF4y2Ba^{−43gydF4y2Ba})。活跃的发作率强烈调制24 h,峰值在12 h(主观的白天。在一个典型的24小时周期22°C动物接受10±3.5活跃的75±28 s持续时间和12±3 QS的50.5±16.43分钟时间(gydF4y2BangydF4y2Ba南达科他州= 3动物,意味着±)。这个调制坚持通过长时间常数光明或黑暗(无花果。gydF4y2Ba1 i, jgydF4y2Ba),表明内部控制gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba(瑞利测试,灯gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 1.5×10gydF4y2Ba^{−12gydF4y2Ba},gydF4y2BangydF4y2Ba= 322次,灯gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 3.0×10gydF4y2Ba^{−13gydF4y2Ba},gydF4y2BangydF4y2Ba= 318次)。布特长度保持不变在这些操作(扩展数据图。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

活跃的发作构成不同的睡眠阶段吗?我们第一次测试唤醒水平交付使用电磁机械刺激动物的坦克,和记录动物运动光流(gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)。动物表现出不同的反应在QS机械刺激,积极发作或清醒。强大和中等(86和40伏特分贝)刺激产生大约1 s的反动运动高于基线,无论行为状态,常常导致停止动力学模式。弱刺激(6伏特分贝)产生运动虽然醒了,但不是在QS或活跃的发作,在其他头足类动物物种(图一致的结果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)。因此,积极发作正在快速可逆的减少兴奋的状态。防止睡2天(gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)导致显著增加活跃的发作率两个晚上后剥夺(无花果。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)。活跃发作因此自我平衡地监管,会议的另一个进化保守的标准睡眠行为gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba。本条例是敏感:特定中断的一个主动轮导致下一个主动轮发生约22分钟早于不间断睡眠(图。gydF4y2Ba2 c, dgydF4y2Ba和gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)。因此我们在章鱼:指两个阶段的睡眠行为和QS。gydF4y2Ba

检查神经活动在章鱼睡眠,我们开发了执行中央大脑的电生理记录技术(supra-oesophageal质量)head-fixed章鱼使用多站点Neuropixels探测器(gydF4y2BangydF4y2Ba= 9动物/探针插入)。本地化录音我们使用组织清算和纸张成像,计算所有实验注册到一个三维(3 d)参考脑图谱,我们构造(图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba无花果、扩展数据。gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba补充视频gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba和gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)。在我们的脑图谱,我们手动分割中央大脑(supra-oesophogeal质量)分成九个大区域,之后详细解剖报告gydF4y2Ba^{25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

章鱼睡着了在神经记录,显示时间的QS打断了节奏,发作持续时间和间隔类似的自由表现动物(扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。联赛录音从上级额叶(同声传译)和垂直叶(重要),与学习和记忆相关的大脑区域的功能gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba}显示,根据不同级别的联赛活动大脑状态(无花果。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。在这两个方面,就像在联赛活动伴随着大量增加QS,意识活动的中间力量。跨地区联赛频率含量不同。生成的微活动在一个宽的频带,包括知名30-Hz振荡(无花果。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6罪犯gydF4y2Ba)。相比之下,产生一系列重要的可靠的大(大约700μV),低频波形(图gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

系统地比较神经活动作为半醒之间,我们检查了LFP强度在大脑区域低频(0.1 -10 Hz)和高频(20 - 150 Hz)乐队(图。gydF4y2Ba2 e-jgydF4y2Ba和gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)。一般来说,一个大脑区域之间有很强的相关性的活动而清醒,在(皮尔森的gydF4y2BaRgydF4y2Ba= 0.74和0.95低和高频率,分别)。大脑不同区域的相对强度低和高频活动(图。gydF4y2Ba3 i, jgydF4y2Ba)。subfrontal叶(Subfr)和颊叶(Buc)显示更强的低频活动比在清醒。其他大脑区域,特别是同声传译,期间更积极比醒着的(扩展数据图。gydF4y2Ba6 e, fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

在QS,章鱼大脑相对沉默,与联赛活动低于在频率和记录大脑区域(图。gydF4y2Ba3 i, jgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7 a、bgydF4y2Ba)。我们发现两个突出的活动的来源。第一次是与皮肤颜色的短暂的闪光在QS(无花果。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2 d-fgydF4y2Ba)。这些行为活动都伴随着LFP活动类似,清醒的大脑区域(皮尔森的gydF4y2BaRgydF4y2Ba= 0.94、0.99活动强度相关性为低频,高频;扩展的数据图。gydF4y2Ba7汉英gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

我们发现第二个源活动的同声传译。这里,几乎沉默LFP不时被12-18-Hz振荡事件持续1 s(无花果。gydF4y2Ba4得了gydF4y2Ba和gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)。这些事件通常没有任何明显的行为改变,只有11%出现在10 s (QS颜色闪光(2066 18058检测到事件,gydF4y2BangydF4y2Ba= 3动物)。重尾inter-event间隔分布提出了一个不带代机制(扩展数据图背出来。gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba)。搜索所有记录大脑区域通过寻找峰值在过滤LFP(4-40赫兹,gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba),我们发现了类似的事件有选择地前地区的六世和接近垂直的叶(Subv)(无花果。gydF4y2Ba4 d, egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7 g hgydF4y2Ba)。这暗示功能之间的交互的部分在QS sFL-VL复杂,符合直接解剖这些区域之间的连接gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

直接神经控制下皮肤模式操作,从而提供一个独特的窗口在离线的大脑神经活动的内容。分析快速皮肤模式(图中可观察到的变化。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba),我们记录了8 k 98次从三个章鱼的视频,拍摄一个自上而下的视图。提取一个健壮的和富有表现力的有效定量描述动物,我们使用神经网络(R-CNN面具gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba)段章鱼地幔在每一帧,用pretrained VGG-19皮肤神经网络量化模式作为512 -维的向量gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba(gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)。平行分析显示的空间皮肤模式估计从我们的数据大致60-dimensional(59.6±0.3),与模式不同的章鱼基本上重叠(轮廓得分0.0497±1.8×10gydF4y2Ba^{−4gydF4y2Ba},扩展数据图。gydF4y2Ba8 a, cgydF4y2Ba和gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)。特性转化的新色素细胞的位置插入到皮肤上gydF4y2Ba^{29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba}意味着在微观尺度上没有两个章鱼,甚至相同的章鱼在不同的日子,同样的模式。在这里,我们专注于宏观模式出现。gydF4y2Ba

接下来我们分析了轨迹穿越皮肤模式空间的模式。开始和结束之间统一的白色皮肤的模式,随着轨迹追踪出多样化和复杂的路径(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。在给定时间的,任何两个轨迹平均约6倍远离对方(inter-trajectory距离)比下一个时间点上沿着一个轨道(intra-trajectory距离,无花果。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)。对轨迹仍然遥远,即使使用动态时间扭曲(扩展数据图。gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba)。次因此不序列通过同一组皮肤模式速度不同。然而,类似的模式出现在不同的时间在发作。最近的模式之间的分布对轨迹,不管时间,重叠的分布intra-trajectory距离。这个过程是可视化在无花果。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba:每10 s模式提取从一个轨道(无花果。gydF4y2Ba5(我)gydF4y2Ba)显示特征的多样性动态(扩展数据图。gydF4y2Ba8 dgydF4y2Ba)。最近指出,这些模式,从其他的轨迹从其他章鱼,章鱼一样是相似的外观。总之,轨道动力学不同,显示一组模式没有刻板的序列,保存在动物,有时互相交叉。gydF4y2Ba

醒来时,gydF4y2Bao .绾带gydF4y2Ba可以生成一系列皮肤模式来伪装在不同自然环境(扩展数据图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba),以及显示社会威胁。在实验室里,醒着章鱼偶尔会采用扁平的姿势,不同的皮肤模式所示。这些模式的分析表明,他们皮肤的空间模式中观察期间(扩展数据图。gydF4y2Ba8 b, cgydF4y2Ba)。看详细匹配,我们确定了对图像从相同的章鱼在和清醒。非线性变形从清醒模式显示精确对齐模式两者之间的结构(图gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba,扩展数据图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。这表明,动力学包括快速转换通过皮肤模式所示清醒,动物的行为。gydF4y2Ba

章鱼拥有至少两个阶段的睡眠:“安静”(QS)和“活跃”()。有节奏的发作是自我平衡地监管和健壮的操作温度和照明,象征积极维护生物现象的重要性gydF4y2Ba^{31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba}。QS显示12-18-Hz振荡在与学习和记忆有关的区域(frontal-VL系统)gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba},类似于哺乳动物的睡眠纺锤波的频率和持续时间gydF4y2Ba^{11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}。然而,QS似乎不同于脊椎动物慢波睡眠没有低频振荡夹带大量的大脑区域gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba。短暂的闪光的颜色在QS伴随着神经活动水平像醒着,尽管低振幅。这是否构成短暂的清醒,micro-arousal状态gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba,一种QS或不同的睡眠阶段仍不清楚。像类似于脊椎动物的快速眼动睡眠wake-like神经活动伴随眼睛和身体的抽搐gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba}。协调体位改变(例如,胳膊伸向)期间未见,可能表示某种程度的肌肉抑制。然而,缺乏解剖学的同源性比较复杂的弛缓骨骼肌脊椎动物中发现快速眼动睡眠gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba。未来的工作将会调查这些相似之处的机械化的深度。gydF4y2Ba

此外,在章鱼通过套皮肤迅速过渡模式十分类似看到而清醒。这通常发生在章鱼洞穴的安全,因此不播放动物的捕食者。为什么章鱼执行这种明显的睡眠行为呢?一种可能性是,它代表了时间的离线优化皮肤模式控制,类似于过程发生在脊椎动物运动学习gydF4y2Ba^{36gydF4y2Ba,gydF4y2Ba37gydF4y2Ba}。另一种可能是,它反映了神经活动的重新激活潜在醒着更广泛的经验,让人想起脊椎动物现象与记忆的巩固等啮齿动物海马重播gydF4y2Ba^{38gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba}和结构化活动头部方向系统在哺乳动物的快速眼动睡眠gydF4y2Ba^{40gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba}。全面调查的功能是需要研究的模式是否可以操作,以及更好地理解的行为性的上下文醒来皮肤表达模式gydF4y2Ba^{42gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

头足类动物的皮肤模式似乎是有组织的层级结构,与假定的高阶电动机控制电路协调大量的色素细胞生成宏观模式元素gydF4y2Ba^{19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba,gydF4y2Ba47gydF4y2Ba,gydF4y2Ba48gydF4y2Ba}。的伪随机激活动力学符合此高级控制系统。它可能会推断出电机控制元素之间的相互作用通过研究统计模式激活。以这种方式,动力也可能有助于理解醒来皮肤模式的逻辑控制。gydF4y2Ba

在最初观察到人类gydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba},最近的工作在许多脊椎动物中建立了两阶段的睡眠gydF4y2Ba^{1克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}。我们的研究结果补充在头足类动物的几个行为报告gydF4y2Ba^{6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba}和节肢动物gydF4y2Ba^49gydF4y2Ba类似的活跃和QS阶段。鉴于进化距离,这些现象可能互相独立进化,可能代表收敛解决共同面临的问题复杂的代理gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba。如果这样的解决方案确实存在,那么高维,可读出的章鱼是皮肤的神经活动模式有助于揭示两阶段的睡眠一般原则。gydF4y2Ba

实验动物gydF4y2Ba

所有研究和动物护理程序依法进行了机构的指导方针,通过OIST动物保健和使用委员会批准编号2019-244-6和2022 - 364。成人章鱼(gydF4y2Bao .绾带gydF4y2Ba,地幔长度约3厘米)收集的男女在冲绳潮汐池和安置在12 l坦克连接到一个海水张开海洋循环系统。动物们提供一个丰富的环境包括砂、植物、岩石和珊瑚碎石,以及一个避难所(瓦锅)。gydF4y2Ba

o .绾带gydF4y2Ba精心挑选了本研究评估后,其他几个选项由于(1)紧凑的大脑和身体大小使他们适合Neuropixels记录和纸张成像,(2)他们的白色皮肤休息模式辅助检测的发作,(3)他们的夜间行为意味着我们可以下电影睡眠行为白色照明和(4)他们在本地可用,监管要求保持OIST海洋站。的大脑gydF4y2Bao .绾带gydF4y2Ba像沿海昼夜章鱼拥有seven-gyrus六世(扩展数据图。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)。六世占据9.05%的中央大脑体积,略高于其他沿海夜间物种,如常见的研究gydF4y2Bao .寻常的gydF4y2Ba和gydF4y2Bao . bimaculoidesgydF4y2Ba^51gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

行为拍摄gydF4y2Ba

实验在海水封闭系统中,循环过滤天然海水。水过滤机械和生物学上,紫外线消毒,含氧和交换新鲜海水每周两次。另有报道,温度冷却到22°C,与照明交替12/12-h光/暗周期30分钟锥光强度。动物喂养活螃蟹每周三次在主观的夜晚,而清醒。动物有一个适应的时期生活在实验坦克2周。实验开始后,动物被视为通常白天休息。gydF4y2Ba

低分辨率的录音(无花果。gydF4y2Ba1 b, g-jgydF4y2Ba无花果和扩展数据。gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba使用三个定制拍摄室)拍摄。每个室放置一个4 k相机(巴斯勒ace acA4024-29uc, 4024×3036像素,24 fps)查看四个透明的丙烯酸100×150×100毫米坦克从顶部,每毫米13.4像素分辨率使用12毫米镜头。照明安装在两侧的四个坦克,与白光LED天照明(Koval智能水族灯,300毫米,654 lx)和红色LED夜晚照明(Leimac IDBA-HM300R, Barlight 300×40毫米,129 lx)。除了在喂养,5-mm-thick玻璃罩是放在坦克来防止动物逃跑。记录动物运动(无花果。gydF4y2Ba1氟gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba),我们把动物放在透明丙烯酸300×200×200毫米坦克配备收容所(三维印刷和terracotta锅),住所入口面临舱壁。相机(如上所述,24岁或30 fps)定位面临单一动物的避难所。灯(Leimac IDBA-HM300W 300×40毫米,3 klx)被放置在背心和/或双方。gydF4y2Ba

录音是用PylonRecorder2 (v.0.6),利用网络硬件压缩h264格式和写作固态硬盘。一台计算机运行Windows 10配备两个显卡(Nvidia方形住宅区P1000和方形住宅区P5000),同时运行7相机。gydF4y2Ba

高分辨率记录(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)是由把一个8 k的相机(佳能EOS R5, 8192×5464像素,30 fps)配备了一个佳能微距镜头EF常平架180毫米镜头,拍摄和自上而下的单一动物使用45°镜子(96像素/毫米)。三个白色的酒吧灯光(Leimac IDBA-HM300W 300×40毫米,3933 lx)用于轻型坦克。所有记录都是使用下面的相机设置:1/200,F32, ISO 3200。因为事件是周期性的,录音开始预期随着时间的前几分钟,和结束模式动力停止。一些成对的清醒和睡眠模式被枪杀4 k分辨率(巴斯勒ace acA4112-30uc, 4096×3000像素,30 fps,每毫米32.3像素,1000 lx),俯视着动物使用50 mm镜头。高分辨率记录被枪杀在24°C(室温水)。gydF4y2Ba

把照明水平的背景下,日光范围从10到25 klx阳光明媚的时候,1000 lx当阴云密布。夜间光线水平范围从约0.3 lx满月0.002期间lx当月亮是不可见的。动物睡眠时间、持续时间和间隔似乎正常照明各种实验条件下(扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。深色皮肤模式下没有出现3 klx照明虽然醒了,但1 klx灯光下观察。gydF4y2Ba

行为实验gydF4y2Ba

测量兴奋阈值,使用电磁机械刺激了舱壁固定在一个恒定的位置和控制由Arduino (Arduino大型2560)。同步相机和电磁冲击时间使用相机的红色发光二极管放置在视图的视图的动物。刺激强度校准使用水听器(DolphinEar DE200),放置在章鱼的位置。三个优势刺激6、40和86伏特分贝交付给章鱼活跃发作期间,QS和terracotta后在锅里。QS被定义为两个活动之间的时间间隔发作,章鱼的特点缺乏运动,平坦的姿势,光滑的质地,闭上眼睛和白色的颜色。所有试验进行了12点到17点之间。gydF4y2Ba

对睡眠的体内平衡,章鱼记录连续48小时之前开始睡眠不足。第二天,动物们睡不着07:00至17:00时用刷子轻轻刷他们的皮肤上每2 - 3分钟。运动,提高姿态和眼睛打开被认为是觉醒的标志。17点后动物离开自由的行为。睡眠不足是重复,使用上述过程,第二天。Post-deprivation行为被记录为48小时没有任何干扰。主动轮的中断试验,随机子集的活跃使用画笔发作被打断了。布特的QS前以下相比在中断和不间断的“试验”。gydF4y2Ba

测量昼夜节律,章鱼是适应12 h光/暗周期为2周。经过48小时的连续拍摄,他们受72 h连续日光或72 h连续黑暗。喂养在此期间暂停以防止线索活螃蟹。动物是切换回12 h光/暗周期。gydF4y2Ba

测量的温度依赖性,水的温度循环的拍摄行为系统冷却到19日22和24°C使用冷却器(Poafamx al - 300)与水循环系统。每个温度维持2天。更高的温度是通过关闭凉爽。水箱水温测量使用温度传感器(Tinytag水生2 tg - 4100)。gydF4y2Ba

手术电生理学gydF4y2Ba

动物麻醉(2%乙醇在过滤海水)超过3天在录音之前,和远端2 - 4厘米的手臂手术缩短未来防止删除头固定。伤口与组织密封胶(Histoacryl B.Braun)。这个过程后,动物恢复实验箱配备一个封闭的海水循环系统(上图),他们可以吃立即从麻醉中醒来。章鱼没有演示的迹象疼痛(也就是说,手臂修饰行为gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba),因此本地镇痛不应用,防止政府相关的压力和睡眠中断。一天记录之前,动物麻醉如上所述,头顶被从水里拉出来。皮肤、软组织在软骨和肌肉与microscissors头颅被移除。三维印刷塑料环极是粘在头颅在中央大脑组织粘合剂和牙科光治疗胶粘剂(3 m, Transbond XT光治疗糊状胶粘剂)。戒指的里面充满了硅酮密封剂(Kwik-Cast WPI)防止伤口接触海水。动物们离开油箱在一夜之间就恢复录音。当天记录,动物麻醉。一个小洞是切成头颅暴露中央大脑和大脑周围的鞘被使用钳。戒指又覆盖了使用硅酮密封剂。新鲜的海水被动物,之前的实验箱。 It was then head-fixed using a metal rod. Animals recovered from anaesthesia within minutes of exposure to fresh seawater. The water level in the recording tank was reduced to have the top of the animal’s head above the water line during probe insertion. The animal’s body was supported with an aquarium wool filter mat. A Neuropixels v.1.0 probe shank was coated with CM-DiI (100 μg to 50 μl ethanol, Thermo Fisher Scientific, CellTracker CM-DiI Dye) for post hoc probe position localization. The probe was mounted on a motorized micromanipulator (New Scale Technologies, M3-LS). After removing the cured silicone sealant, the Neuropixels probe was lowered into the brain at the speed of 200 μm min^{−1gydF4y2Ba}。在实验中记录的深度不同。我们探索了一系列深度、插入网站和角度。降低后,里面的head-fixation塑料环再次充满了硅酮密封剂和水位长大,这样动物的头被淹没。录音罐充气海水传播的速度约0.2 l分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在室温(24°C)。gydF4y2Ba

电生理记录gydF4y2Ba

Neuropixels录音进行使用SpikeGLX软件(v.3.0)。与采样率为2.5千赫(LFP信号)和30千赫(细胞外信号峰值)。动物的地幔是同时使用4 k的相机,拍摄行为记录(gydF4y2Ba行为拍摄gydF4y2Ba上图,1034 lx)。视频同步电生理记录通过发送一个25-Hz晶体管晶体管逻辑(TTL)信号从一个Arduino触发相机框架接触并使用spikeGLX日志TTL时间。动物显示为12.7±6.6(他)h在录音开始,展示发作相似的时间和间隔的自由表现动物(扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

组织清算和纸张成像gydF4y2Ba

录音后,Neuropixels探针被从大脑和动物安乐死的逐渐增加乙醇浓度在海水从2到5%。记录动物的解剖,组织周围的头颅尽可能删除。大脑的头颅在4%多聚甲醛固定在4°C 24 - 48 h。解剖大脑组织使用第二代立方清除方法gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba。首先,组织孵化CUBIC-L溶液50% 25°C一夜之间,其次是100% CUBIC-L孵化24小时25°C。PBS洗后,组织是沉浸在BOBO-1核染色染料(ThemoFisher B3582;1/800稀释)3天。组织用PBS洗净,然后放在50% CUBIC-R一夜之间遵循100% CUBIC-R 24 h(扩展数据图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。清除样本是嵌入在一个透明的琼脂糖凝胶对显微镜安装。扫描大脑,我们定制的纸张显微镜使用轴向扫纸张显微镜的技术gydF4y2Ba^54gydF4y2Ba。显微镜是配备了10倍检测物镜(奥林巴斯XLPLN10XSVMP)和10 x光照物镜(京瓷SOC公司cs03 - 10 - 30 - 152)。获得的图像(gydF4y2BaxgydF4y2Ba,gydF4y2BaygydF4y2Ba,gydF4y2BazgydF4y2Ba)=(0.65,0.65,2.5)μm决议。BOBO-1与488 nm激发激光成像和536/40 nm带通滤波器,而CM-DiI成像532 nm激发激光和593/40-nm带通滤波器(扩展数据图。gydF4y2Ba3 b, cgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

大脑注册和阿特拉斯建设gydF4y2Ba

脑图谱的构建一个参考gydF4y2Bao .绾带gydF4y2Ba之后,我们清除和彩色成人章鱼大脑上面描述的过程和大脑扫描(gydF4y2BaxgydF4y2Ba,gydF4y2BaygydF4y2Ba,gydF4y2BazgydF4y2Ba)=(0.65,0.65,2.5)μm决议。我们从整个大脑图像裁剪supra-oesophageal质量,downsampled (gydF4y2BaxgydF4y2Ba,gydF4y2BaygydF4y2Ba,gydF4y2BazgydF4y2Ba)=(10、10、10)μm。我们使用3 d切片机gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba手动标注这3 d图像,引用现有的解剖地图册gydF4y2Ba^{25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}(扩展数据图。gydF4y2Ba3 d, egydF4y2Ba)。3 d图像的章鱼大脑被映射到这个参考图集使用对称图像归一化法(SyN)方法实现先进的标准化工具(蚂蚁)图书馆gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba。在注册之前,BOBO-1通道downsampled (gydF4y2BaxgydF4y2Ba,gydF4y2BaygydF4y2Ba,gydF4y2BazgydF4y2Ba)=(10、10、10)μm。二进制的面具之后,使用3 d切片机,手动创建屏蔽组织除了supra-oesophageal质量。大脑被映射到参考大脑通过一个两步转换。首先,一个仿射变换计算大致对齐两个大脑,用互信息度量函数。第二,非线性变形与互相关计算使用SyN算法作为度量函数。蚂蚁在命令行中,使用以下参数:仿射变换[0.1]——度量MI ({fix_img}, {mov_img},美元1128年定期,0.5]——融合[1000 x1000x1000 1 e-5 15]——shrink-factors 8 x4x2——smoothing-sigmas 3 x2x1vox变换SyN(0.1, 4.0, 0.2)——度量CC ({fix_img}, {mov_img},美元1,6]——融合[500 x500x100x30 1 e-6 10]——shrink-factors 8 x4x2x1 smoothing-sigmas 3 x2x1x0vox。这生成一个仿射变换矩阵和变形场的四维矩阵(扩展数据图。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)。我们在蚂蚁控制参数,以防止过度扭曲,量化的雅可比行列式的值(扩展数据图。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)。atlas和注册大脑覆盖,显示视觉精确校准(扩展数据图。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)。对齐质量量化通过计算voxel-wise归一化互相关gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba值与窗口半径4体素(扩展数据图。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba),这表明在大多数领域的积极的价值观,尤其是高正值脑叶之间的边界。我们也平均核染色图像生成gydF4y2BangydF4y2Ba= 9个独立的大脑(扩展数据图保持一致。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba)。叶结构维护,进一步支持我们登记的质量。gydF4y2Ba

分析Neuropixels探测器的位置,CM-DiI通道从3 d大脑图像首次downsampled (gydF4y2BaxgydF4y2Ba,gydF4y2BaygydF4y2Ba,gydF4y2BazgydF4y2Ba)=(5 5 5)μm。CM-DiI探测器轨道然后手动标记使用3 d切片机。这个标签跟踪图像平滑先记下概要使用形态学的二进制对象。skeletonize_3d scikit-image库中的函数实现,然后用b样条拟合得到的骨架。的gydF4y2BaxyzgydF4y2Ba坐标Neuropixels探测通道被映射到参考空间使用上面的转换计算。最后,每个记录通道被分配一个独特的区域ID的基础上,阿特拉斯地区。确定从CM-DiI探测深度图像有时是一个简单的问题,由于染料的扩散传播。在以前的启发式方法gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba映射后,我们检查特点LFP模式在解剖区域的边界。如果有必要,我们改变了探针位置沿深度轴增加LFP-anatomy信件。自动确定位置通常是非常准确的,和最大修正十频道(大约100μm)。gydF4y2Ba

将大脑区域分为前部和后部部分(无花果。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba插图),我们把最前部,后部的每个大脑区域作为其p最大和最小值,计算它们之间的中点(min + max) / 2。渠道分为前部或后部的基础上是否大脑前部或后部区域中点。gydF4y2Ba

行为分析gydF4y2Ba

测量章鱼皮肤亮度行为记录(无花果。gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba),我们从背景与公平Detectron2平台分段章鱼gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba(v.0.1.3),使用pretrained基本模型(可可实例分割与面具R-CNN R50-FPN 3×时间表),调整与章鱼训练数据集。训练集标签是使用Labelbox平台完成的。加快数据处理,章鱼是每100帧分割(4.16秒),意味着强度计算每一帧使用最近的前分割。持续多日的视频并行处理利用FFMPEG视频切成1小时剪辑、独立运行的每个片段,然后重新组合。gydF4y2Ba

颜色的闪光在QS QS期间使用意味着皮肤亮度检测跟踪。跟踪是过滤0.005 - 2赫兹用三极巴特沃斯滤波器,和在负的发现了山峰gydF4y2BazgydF4y2Ba最小峰高的得分信号,2,最低0.5的重要性和最小分离的10年代。颜色闪光持续时间计算通过一个窗口的皮肤亮度跟踪500帧(21岁)之前颜色flash峰值1000帧峰值后(42)。这个时间序列gydF4y2BazgydF4y2Ba得分和跨越门槛(2gydF4y2BazgydF4y2Ba)两侧的高峰时间作为开始和结束的时间。gydF4y2Ba

睡眠时间、持续时间和间隔和QS时间被确定使用平均皮肤亮度手动记录加上视频确认。后时间同样手动确认。之间inter-event间隔计算发作的动物才醒了过来。时间是由考虑窗口前十年代和100年代后开始时间。这些时间序列gydF4y2BazgydF4y2Ba得分,低通使用双刀巴特沃斯滤波器过滤在0.1赫兹。最大的长度连续的数据低于一个阈值被作为持续时间。我们研究了一系列的阈值(扩展数据图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba0.2),决定好主观匹配视频数据。gydF4y2Ba

直方图在无花果。gydF4y2Ba1 i, jgydF4y2Ba使用2 h面元,连续的速度估计计算通过使用高斯平滑0.1 - h面元内核与南达科他州。40箱(4小时)。图gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba计算类似,使用1小时直方图装箱。图gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba使用5分钟装箱,使用核密度估计的概率密度估计(MATLAB ksdensity)。gydF4y2Ba

的运动分析,兴奋阈值实验(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1胃肠道gydF4y2Ba),我们提取的片段1 s之前刺激时间1秒之后。动物从背景分割(如上所述)的第一帧视频。在分割掩模,突出使用筛选功能检测gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba关键点检测(对比度阈值为0.05)。Lukas-Kanade光学流gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba(512像素的窗口大小)被用来跟踪这些点帧。运动幅度平均光流计算相邻帧之间的大小。计算反动运动,一个基线平均大小为25帧(1)之前刺激时间减去25帧平均大小的(1)刺激后。gydF4y2Ba

在QS动物运动的分析,如(图。gydF4y2Ba1氟gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1得了gydF4y2Ba),我们提取2分钟短片集中在开始时间。眼睛,身体和前地幔(测量呼吸)从这个视频的第一帧手动分割。运动幅度计算如上所述,分别为每个细分的面具。孤立的眼睛从整体身体动作和呼吸运动,眼睛内的平均运动/前地幔面具从每一帧,我们报道剩余动作。呼吸频率是提取前地幔残余运动,与吸入通过峰值检测发现gydF4y2BazgydF4y2Ba得分,平滑(10帧)跟踪,峰值的0.05。呼吸频率是线性插值的视频帧速率。图gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba报告的第一个30多岁的平均运动级剪辑(QS),第三个30多岁的剪辑()。计算呼吸arythmicity清醒动物(扩展数据图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)计算了QS /,在单独的30年代视频剪辑。gydF4y2Ba

行为分析是使用OIST Saion HPC系统执行,使用多达32 gpu (Nvidia V100和p100)。岩心分析是用Python写(v.3.6和3.7),2019年进一步分析使用MATLAB编写。gydF4y2Ba

电生理分析gydF4y2Ba

联赛数据被重采样预处理从2.5到1 kHz,过滤0.1点将零度-150赫兹和减去十通道的值位于大脑的所有通道。使用连续小波变换与谱图计算Mortlet小波(MATLAB cmor1.5-1)尺度对数间隔在1和100赫兹之间。声音在振幅归一化所有值除以最大价值。在非重叠光谱计算1块的数据使用Chronux工具箱(v.2.12,gydF4y2Bahttp://chronux.org/gydF4y2Ba)gydF4y2Ba^{61年gydF4y2Ba}五和九时间带宽积的蜡烛。然后,结果被平均的数据块。gydF4y2Ba

计算通道强度在不同的行为状态,一个统一的程序进行不同选择的数据。QS和清醒,是60年代的联赛数据加载,开始在每个检测到的过渡或后阶段,60年代之前QS的倍。QS色彩闪烁,700 -女士的数据块加载,以色闪光(如上所述)检测到的事件。数据加载之后,两个版本的数据过滤然后生成,0.1 -10 - 20 - 150 Hz每记录频道。这些过滤信号的包络计算使用150 -利用希尔伯特过滤器。信号强度为一个通道计算这个信封的意思。我们中值过滤超过五频道删除噪声信道读数。然后我们这个向量平均超过所有事件。gydF4y2Ba

QS振荡事件,1200年代LFP数据加载前每轮和任何后事件(手动检测,上图)被移除。QS振荡事件被检测到4-40赫兹过滤数据,然后发现山峰gydF4y2BazgydF4y2Ba得到信号的最低身高2,最低的两个,最低1 s的分离。估计振荡事件率和平均每个数据块。这是再用五频值平滑滤波器,如活动强度测量。计算LFP在大脑区域活动强度,我们平均频道所有电极位于一个大脑区域的强度。我们需要至少两个探测数据考虑为一个大脑区域活动强度。不同的活动强度之间的相关性进行了测量电极从这些大脑区域。除非另有说明,使用三极巴特沃斯滤波器过滤了。gydF4y2Ba

皮肤模式分析gydF4y2Ba

量化作为皮肤模式,我们适应技术发展来描述墨鱼伪装gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba。高分辨率章鱼视频处理首先检测章鱼地幔,使用Detectron2平台gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba如上所述。披风被选择一个源图像对齐和映射所有图片到这个源图像中椭圆拟合和相似变换。前部和后部方向的确定是手动完成清醒的第一帧图像和视频剪辑。图像被剪裁和downsampled 1004×675像素(图像大小裁剪分割地幔后20%),与背景像素颜色均匀的灰色(如无花果。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)。遵循标准的预处理(zero-centring)、400×400像素的作物背地幔被VGG-19 (ref评估。gydF4y2Ba^{62年gydF4y2Ba})网络pretrained ImageNetgydF4y2Ba^{63年gydF4y2Ba}数据库,使用KerasgydF4y2Ba^{64年gydF4y2Ba}平台(包括在TensorFlow v.2.0)。我们使用了max-pooled第五层激活(block5_pool)作为我们的皮肤模式指标gydF4y2Ba^{65年gydF4y2Ba}。这导致512 -维的向量描述皮肤模式每一帧视频剪辑。gydF4y2Ba

作为轨道动力学的出发点是一致的在视频剪辑通过计算的第一主成分512 -框架矩阵特性,及其近似导数阈值的绝对值(相邻时间点差异,阈值0.1)。所有启动时间一致的轨迹做了进一步分析。估计是空间的维度,我们跑平行分析gydF4y2Ba^{66年gydF4y2Ba}几次10000随机选择的图像数据集。估计不同动物的重叠模式空间内,我们同样计算轮廓的分数gydF4y2Ba^{67年gydF4y2Ba}几次10000随机选择的图像数据集。Intra-trajectory距离之间的平均欧氏距离计算相邻时间点沿着轨迹。Inter-trajectory两轨迹之间的距离计算均值element-wise欧几里得距离,从轨迹开始结束时间较短的轨迹。动态时间扭曲后轨迹之间的距离gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}是除以轨迹距离与本文的扭曲inter-trajectory距离。最近的inter-trajectory距离(发作和清醒之间图像和发作)是通过计算,对轨迹,点之间的最小欧氏距离。gydF4y2Ba

对于调整选择醒来皮肤模式,类似的模式是手动从视频中提取。精确的定位是通过手动选择对应点,这些点之间的插值使用移动最小二乘算法gydF4y2Ba^{69年gydF4y2Ba}产生一个从为图像映射到清醒的形象。在显示图像是一致和线性增大。绿色矩形图像(图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)近似作物(非线性映射)。显示覆盖匹配,图像是灰色的了,倒和阈值(图片具体的8位灰度阈值180 - 230)的黑暗区域模式。gydF4y2Ba

统计和再现性gydF4y2Ba

除非另有规定,数据意味着±s.e.m。箱形图,利润率第25和第75百分位数;中线,中位数;胡须,边界在异常值;离群值(+)值超出1.5×四分位范围从盒子里的利润率。独立实验重复几次类似的结果,对数字的重复和性别(男性或女性)如下:温度调制gydF4y2BangydF4y2Ba= 9动物,兴奋阈值gydF4y2BangydF4y2Ba= 5动物,体内平衡gydF4y2BangydF4y2Ba= 6动物,主动轮运动gydF4y2BangydF4y2Ba= 3动物,连续光开/关gydF4y2BangydF4y2Ba= 6动物,电生理学gydF4y2BangydF4y2Ba= 9动物,皮肤动力学模式gydF4y2BangydF4y2Ba= 3和生物钟动物和模式匹配gydF4y2BangydF4y2Ba= 5的动物。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

进一步研究信息设计是可用的gydF4y2Ba自然投资组合报告总结gydF4y2Ba与这篇文章有关。gydF4y2Ba