GDF15促进减肥通过增强肌肉的能量消耗gydF4y2Ba

GDF15是肝脏和肾脏中高度表达,诱导在所有类型的细胞线粒体毒素和内质网应激反应(前面了gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba11 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba})。GDF15第一次被认定为可溶性因子从巨噬细胞分泌gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba和癌症细胞gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba,后来证明诱导恶病质gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba}和保护小鼠免受肥胖和胰岛素抵抗gydF4y2Ba^{17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba}。在啮齿动物喂高脂肪的食物,重组GDF15抒发减肥治疗,减少肝脏脂肪变性和改善血糖控制gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba11 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}。这些减肥的效果已被证明需要后脑gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba更具体地说,GDF15受体GFRALgydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}。在短期实验生成7 - 10天,一对喂养(热量匹配)GDF15 vehicle-treated老鼠显示,减肥引起的是由于减少食物摄入量gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}。重要的是,生殖系gydF4y2BaGdf15gydF4y2Ba空的老鼠gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba,liver-targetedgydF4y2BaGdf15 -gydF4y2Ba空的老鼠gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba和生殖系gydF4y2BaGfral -gydF4y2Ba空的老鼠gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}都有适度的食物摄入量和肥胖症的增加高脂肪饮食支持这个通路在调节能量平衡的生理作用。这些研究导致概念GDF15信号通过GFRAL减少体重和改善血糖控制主要通过抑制食欲,最少对能量消耗的影响gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

肥胖的结果从一个卡路里的能量摄入和支出之间的不平衡。虽然它是成熟的,GDF15在啮齿类动物和非人灵长类的抑制能量摄入gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}结束之前,需要考虑三个重要的区别,这是唯一的机制有助于减肥。第一和最重要的是,能量摄入能量消耗和体重是彼此相互依赖的变量,这些变量都是动态链接的,在这一点上,减少能量摄入和减肥都可以导致减少了能量消耗gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba。第二,研究重组GDF15在gydF4y2BaGfralgydF4y2Ba空的老鼠进行了相对较短的一段(7 - 10天)gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba},这可能是不足以检测计数器相关监管反应减少能量消耗(即适应性产热),通常发生在啮齿动物经过更长时间的热量限制gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba。最后,现在认识到,进行能量平衡实验老鼠住在室温下(21°C),下面是啮齿动物的热中性的区,刺激交感开车gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba。这可能抑制减肥引起的代理诱导徒劳的自行车或者刺激能量消耗通过β-adrenergic信号通路gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba。总的来说,这些研究表明,重要的是要考虑的卡路里摄入量之间的相互关系,干预时间和住房时温度研究小鼠的体重和药理干预。gydF4y2Ba

为了更好地理解GDF15的机制可以促进减肥,我们研究老鼠住在热力中性(29°C),西方饮食习惯进行喂养高脂肪和果糖促进肥胖、胰岛素抵抗与非酒精性脂肪肝(NASH)类似的病理组织学和转录的人类疾病的发展gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。在小鼠肝脏脂肪变性的卡路里摄入量的变化特别敏感,我们假设,考虑到短半衰期在老鼠(2 h)的本地人力GDF15治疗开始的时候光周期(时间当老鼠吃更少的热量)将对食品消费产生较小的影响与先前的研究相比当小白鼠注射在黑暗周期的开始gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}。符合这一假说,与vehicle-treated控制相比,注射的老鼠在光周期的开始GDF15(每公斤5 nmol)导致每日食物摄入量减少30%相比,减少了43%的暗周期(约40%的差异;扩展的数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。我们随后注入老鼠每天一次的光周期与车辆或重组GDF15在三种不同剂量(0.3,每公斤1和5 nmol) 6周。个人食物摄入量每天测量,匹配pair-fed控制。注入GDF15迅速,剂量依赖性的血清水平升高GDF15在下降之前回到基线开始的黑暗周期(图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。正如预期的那样,慢性每日治疗GDF15导致剂量依赖性减少食物摄入量(无花果。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba),与以前的观测一致使用相同的重组蛋白的准备gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

GDF15在每公斤0.3 nmol并未显著降低体重,脂肪质量,血清胰岛素、葡萄糖耐量、胰岛素抵抗、肝组织学、肝脏甘油三酯或其他等离子体变量与vehicle-treated pair-fed控制(扩展数据图。gydF4y2Ba1 blgydF4y2Ba)。当GDF15在1和5 nmol /公斤,在治疗的前十天,减肥是相似的轨迹GDF15治疗和pair-fed控制,反映在这个时期之前的实验gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}(无花果。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。然而,10天后,pair-fed控制的体重没有进一步减少,而GDF15-treated老鼠继续减肥(无花果。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。通过实验的最后,老鼠接受GDF15在每公斤1和5 nmol失去了体重的13.6%和23.0%,分别只有5%左右pair-fed控制老鼠(图。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)。重要的是,这个减肥是归因于减少脂肪量但不是精益质量(图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba),这被认为是重要的维持能量消耗gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba。符合减少体重和肥胖,GDF15在每公斤1和5 nmol降低血清胰岛素(图。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba每公斤5点),而GDF15 nmol改善葡萄糖耐量和胰岛素敏感性与vehicle-treated控制(扩展数据图。gydF4y2Ba2 b, cgydF4y2Ba)。这些数据表明GDF15在慢性环境促进减少体重,降低胰岛素抵抗程度大于热量限制。gydF4y2Ba

非酒精性脂肪肝胰岛素抵抗是一个重要的因素gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。GDF15(每公斤1和5 nmol),但不是pair-feeding,降低肝脂肪变性、膨胀和非酒精性脂肪肝活动分数(图。gydF4y2Ba1 g hgydF4y2Ba)。与这些组织学变化一致,GDF15但不是pair-feeding,减少肝脏甘油三酯,肝脏non-esterified free-fatty酸和血清丙氨酸转氨酶(ALT)(扩展数据图。gydF4y2Ba2 d-fgydF4y2Ba)。主成分分析(PCA)使用方差稳定的转换(VST)数据和热地图same-to-sample区别肝RNA-sequencing (RNA-seq)数据显示不同的分离GDF15-treated(1每公斤nmol)和vehicle-treated pair-fed控制(图。gydF4y2Ba1 i, jgydF4y2Ba)。与vehicle-treated和pair-fed控制相比,GDF15引起许多(扩展数据图的差异表达基因。gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba)与组织细胞外基质,细胞外结构组织(图。gydF4y2Ba1 kgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba),白细胞/巨噬细胞迁移和磷脂酰肌醇3-kinase-AKT信号(扩展数据图。gydF4y2Ba3 d, egydF4y2Ba),而没有差异vehicle-treated pair-fed集团(扩展数据图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)。层次聚类显示GDF15改变liver-fibrosis-related转录组签名与vehicle-treated或pair-fed集团(扩展数据图。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)。此外,一个既定25-gene签名用来预测纳什在人类发展gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba发现GDF15下调20的25基因(gydF4y2BaAkr1b10gydF4y2Ba,gydF4y2BaAnkrd29gydF4y2Ba,gydF4y2BaCcl20gydF4y2Ba,gydF4y2BaClic6gydF4y2Ba,gydF4y2BaCol1a1gydF4y2Ba,gydF4y2BaCol1a2gydF4y2Ba,gydF4y2BaDtnagydF4y2Ba,gydF4y2BaDusp8gydF4y2Ba,gydF4y2BaEpb41l4agydF4y2Ba,gydF4y2BaFermt1gydF4y2Ba,gydF4y2BaGdf15gydF4y2Ba,gydF4y2BaHecw1gydF4y2Ba,gydF4y2BaItgbl1gydF4y2Ba,gydF4y2BaLtbp2gydF4y2Ba,gydF4y2BaPdgfagydF4y2Ba,gydF4y2BaRgs4gydF4y2Ba,gydF4y2BaSctrgydF4y2Ba,gydF4y2BaThy1gydF4y2Ba,gydF4y2BaTnfrsf12agydF4y2Ba和gydF4y2BaTymsgydF4y2Ba),而只上调1基因(gydF4y2BaHsd17b14)gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)。因此,GDF15独立于减少热量摄取减少了纳什。gydF4y2Ba

检查是否GDF15治疗的效果与pair-fed控制依赖于住房温度相比,我们随后完成匹配实验老鼠住在21°C和29°C,分别(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。在16天,GDF15治疗导致了类似的累积食物摄入量减少21岁和29°C(21.3%和19.2%)(无花果。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)。GDF15-induced减肥并不不同于pair-fed控制在21或5或10天后29°C(无花果。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)。10天后,无论房屋温度,GDF15-treated老鼠继续减肥,而pair-fed控制老鼠没有(图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

研究GDF15促进减肥,老鼠置于代谢笼。没有变化之间的体育活动组(补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。然而,增加减肥GDF15治疗与能量消耗在黑暗周期的维护与pair-fed控制老鼠相比,其能量消耗甚至在修正了体重减少了协方差分析(ANCOVA;无花果。gydF4y2Ba2 d, egydF4y2Ba)。这个GDF15维持能量消耗的影响是明显的,不管住房温度。正如预期的那样,能量消耗明显高于21°C相比,在所有条件(图29°C。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)。这些数据表明,在老鼠身上有21°C或29°C,治疗GDF15 10多天,促进减肥与热量限制通过维持能量消耗。gydF4y2Ba

昼夜节律和喂养时间影响能量消耗;因此我们检查GDF15在两种不同的影响pair-fed组(pair-fed早上组,美联储在光周期的开始(06:00-07:00);pair-fed晚上组,美联储在黑暗周期(18:00-19:00))开始执行在不同的网站(丹麦诺和诺德公司)。使用这个修改后的协议在不同位置的高剂量GDF15(每公斤8和1 nmol)导致能量消耗的增加,刺激身体质量损失与pair-fed和对照组(扩展数据图。gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

另一个重要的机制有助于减少能量消耗与热量限制包括甲状腺激素三碘甲状腺氨酸gydF4y2Ba^{29日gydF4y2Ba}。GDF15激活垂体轴gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba,暗示这可能是重要的维持能量消耗。然而,促甲状腺激素(TSH)水平并没有改变GDF15治疗小鼠(扩展数据图。gydF4y2Ba5 a、bgydF4y2Ba)和慢性治疗的小鼠三碘甲状腺氨酸阻断剂丙硫氧嘧啶并没有阻止GDF15-induced体重减轻或增加能量消耗(扩展数据图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba与pair-feeding相比)。同样,也没有相关性TSH和GDF15在肥胖的女性曾经参加食源性减肥计划gydF4y2Ba^{31日gydF4y2Ba}(扩展数据图。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)。因此,GDF15维持能量消耗热量限制独立住房温度相比,时间喂养或甲状腺激素。gydF4y2Ba

老鼠在21°C和喂高脂肪的食物,gydF4y2BaGfralgydF4y2Ba淘汰赛(KO)比野生型更肥胖小鼠(WT)控制和抵抗的抑制食欲影响GDF15在7 - 10天gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}也很重要,但这是否受体GDF15减少体重的影响和纳什在热力中性更延长治疗期是不清楚。使用如上所述(图类似的待遇条件。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba),我们发现gydF4y2BaGfralgydF4y2Bako小鼠gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba有更大的食物摄入量和抵抗的抑制食欲影响GDF15(1每公斤nmol)与WT同窝出生(无花果。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba)。gydF4y2BaGfralgydF4y2Bako小鼠体重与WT相比更大的同胞(无花果。gydF4y2Ba2 hgydF4y2Ba)。WT老鼠,GDF15减少体重与WT vehicle-treated和pair-fed controls-effects减毒的gydF4y2BaGfralgydF4y2Bako小鼠(无花果。gydF4y2Ba2 hgydF4y2Ba)。gydF4y2BaGfralgydF4y2Bako小鼠也耐GDF15降低脂肪变性的影响,不断膨胀、炎症和非酒精性脂肪肝活动分数(扩展数据图。gydF4y2Ba5 h,我gydF4y2Ba),肝脏甘油三酯(扩展数据图。gydF4y2Ba5 jgydF4y2Ba)和血清ALT(扩展数据图。gydF4y2Ba5 kgydF4y2Ba)。GDF15可能出现在肝脏的抗炎效应作用于独立于GFRAL髓细胞gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba;然而,我们发现,与肝脏炎症评分一致,GDF15减少肝髓系细胞群通过GFRAL和独立于减少食物的摄入量(扩展数据图。gydF4y2Ba5 l, mgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba)。数据表明,与体重的变化一致,通过GFRAL-dependent GDF15减少非酒精性脂肪肝和肝脏炎症机制,减少食物摄入量无关。gydF4y2Ba

检查是否通过GFRAL GDF15维持能量消耗,我们在WT,进行了研究gydF4y2BaGfralgydF4y2Bako小鼠后19天GDF15治疗(图。gydF4y2Ba2我gydF4y2Ba)——计算之前体重组之间有显著差异(图gydF4y2Ba2 hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。没有身体活动之间的差异治疗组(扩展数据图。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)。与WT vehicle-treated老鼠相比,在黑暗中循环,GDF15维持能量消耗与pair-fed控制相比,消除的影响gydF4y2BaGfralgydF4y2Bako小鼠(无花果。gydF4y2Ba2 jgydF4y2Ba)。的维护与GDF15而pair-fed或能量消耗gydF4y2BaGfralgydF4y2Ba由ANCOVA ko小鼠持续在修正了身体质量(无花果。gydF4y2Ba2 kgydF4y2Ba)。GDF15也减少了呼吸交换率(r),表明高脂肪酸和低碳水化合物的氧化与pair-fed管制效应,也消除了gydF4y2BaGfralgydF4y2Bako小鼠(扩展数据图。gydF4y2Ba6汉英gydF4y2Ba)。因此,符合更大的长期减肥,GDF15增加脂肪酸氧化,防止减少能量消耗引起通过热量限制要求GFRAL机制。gydF4y2Ba

在后脑GFRAL完全表达gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba,这表明GDF15可能通过brain-somatic组织电路增加了能量消耗。除了三碘甲状腺氨酸的变化,抑制交感神经系统(SNS)活动的减少能量消耗是一个重要的因素与热量限制和减肥gydF4y2Ba^{35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}。测试是否GDF15治疗可以促进减肥而pair-fed控制通过增加社交活动,我们管理GDF15 WT老鼠和老鼠缺乏βgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba,βgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}和βgydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}肾上腺素能受体(以后,β-less老鼠)(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。β-less老鼠反应通常GDF15抑制食物摄取的影响(图gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba);然而,当置于代谢笼前体重发生(扩展数据图的差异。gydF4y2Ba6克gydF4y2Ba),β-less小鼠耐GDF15维持能量消耗的影响相比,在暗循环WT控制(图。gydF4y2Ba3 c, dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6 fgydF4y2Ba)。β-less老鼠也耐GDF15减少r的影响,增加脂肪酸氧化(无花果。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6 h lgydF4y2Ba)。此外,类似于观察gydF4y2BaGfralgydF4y2Bako小鼠,小鼠慢性治疗β-less GDF15没有减少体重超过pair-feeding独自(无花果。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)。综上所述,这些数据表明GDF15促进体重增加能量消耗通过GFRAL-β-adrenergic信号轴。gydF4y2Ba

检查组织是什么导致这种效果,我们测量血清和组织去甲肾上腺素注射后2 h GDF15(每公斤1 nmol)在小鼠治疗30天。GDF15没有增加去甲肾上腺素血清,intrascapular褐色脂肪组织(iBAT)或肝脏(扩展数据图。gydF4y2Ba6 m-ogydF4y2Ba)。符合这一发现,肝脏,白色脂肪组织和蝙蝠没有β-adrenergic变化或无用的信号通路(扩展数据图。gydF4y2Ba7模拟gydF4y2Ba),没有脂肪组织褐变(扩展数据图的迹象。gydF4y2Ba7 e, fgydF4y2Ba)。我们还发现,AMPK脂肪tissue-null老鼠,它们对β-adrenergic诱导脂肪组织产热增加gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba失去了身体质量与GDF15 WT小鼠(扩展数据图。gydF4y2Ba7胃肠道gydF4y2Ba)。GDF15并未改变直肠或iBAT温度(扩展数据图。gydF4y2Ba8 a - cgydF4y2Ba)。同样,GDF15不会大幅改变氧化代谢评估使用正电子发射tomography-computed断层在iBAT pet - ct机(),心脏、肝脏或肾脏与车辆控制(扩展数据图。gydF4y2Ba8 d - igydF4y2Ba)。氧化代谢低于pet - ct机检测的局限性在白色脂肪组织和骨骼肌。最后,我们去神经的蝙蝠与当地注入6-hydroxydopaminehydrobromide (6 ohda) iBAT仓库,发现,虽然这削弱了β的影响gydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}受体激动剂cl - 316243增加能量消耗和iBAT温度与生理盐水注入(补充图。gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba),它没有抑制GDF15促进减肥的能力,增加能量消耗或脂肪酸氧化而pair-fed控件(扩展数据图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。总的来说,这些数据表明GDF15不太可能刺激通过β-adrenergic信号能量消耗脂肪组织。gydF4y2Ba

β-Adrenergic信号也会增加徒劳的在骨骼肌中骑自行车通过增加线粒体解偶联蛋白的表达和sarcolipin (SLN)gydF4y2Ba^{38gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba}。SLN结合石棺/内质网钙腺苷三磷酸酶(SERCA的),从Ca解偶联atp酶活性gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}运输,促进ATP水解,因此徒劳的自行车的存在增加了CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}(参考文献。gydF4y2Ba^{41gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba})。蝙蝠或肝相比,我们发现,去甲肾上腺素水平升高GDF15-treated小鼠胫骨前肌(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。热图RNA-seq same-to-sample差异的数据发现,车辆和胫骨前肌GDF15-treated动物聚在一起明显pair-fed控件(无花果。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba),发现不同于肝脏,转录组概要文件之间pair-fed和车辆控制没有不同(图。gydF4y2Ba1 i, jgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)。与去甲肾上腺素的增加相一致,基因本体论(去)注释之间的差异表达基因在骨骼肌GDF15和pair-fed组织表明,GDF15增加营地/ PKA pair-fed控制信号相比gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)。有针对性的分析显示更高水平的PKA-regulated基因,包括gydF4y2BaPpargc1agydF4y2Ba,gydF4y2BaUcp3gydF4y2Ba,gydF4y2BaAtp2a1gydF4y2Ba(编码SERCA1),gydF4y2BaSlngydF4y2Ba和gydF4y2BaPlngydF4y2Ba相比之下,pair-fed控制或gydF4y2BaGfralgydF4y2Bako小鼠,这表明内生GDF15水平也可能是重要的维持这个途径(图。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)。GDF15治疗也增加了gydF4y2BaSlngydF4y2Ba表达在氧化比目鱼肌和糖酵解伸肌手提键盘长肌肉与pair-fed控制(扩展数据图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。符合GFRAL不是表达介导的肌肉和响应通过SNS,治疗β-less小鼠GDF15没有改变肌肉基因表达谱(扩展数据图。gydF4y2Ba10 bgydF4y2Ba)。同样,去甲肾上腺素但不是GDF15,增加了表达gydF4y2BaAtp2a1gydF4y2Ba,gydF4y2BaSlngydF4y2Ba和gydF4y2BaPlngydF4y2Ba在培养C2C12肌管(扩展数据图。gydF4y2Ba10 cgydF4y2Ba)。最后,最近发表的分析gydF4y2Ba^44gydF4y2BaRNA-seq数据从肥胖小鼠股四头肌肌肉治疗βgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}受体激动剂瘦肉精也发现增加gydF4y2BaSlngydF4y2Ba表达式(扩展数据图。gydF4y2Ba10 dgydF4y2Ba)。综上所述,这表明GDF15增强基因重要徒劳的自行车在β-adrenergic信号通过增加骨骼肌。gydF4y2Ba

检查是否这些改变基因表达的诱导功能肌肉代谢的变化,我们评估了脂肪酸氧化和发现,与体内的观察减少r一致,有强烈刺激脂肪酸氧化的倾向在孤立的比目鱼肌(+ 44%,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0507;无花果。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)。符合氧化表型越多,GDF15治疗改善原位电刺激收缩的趾长伸肌肌腱牵向前(EDL)肌肉与pair-fed控制(图。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)。这些影响是一个独立的纤维类型转换(扩展数据图。gydF4y2Ba10 e, fgydF4y2Ba)或其他明显的肌肉结构(扩展数据图的变化。gydF4y2Ba10克gydF4y2Ba),这表明GDF15可能促进氧化代谢。氧化骨骼肌线粒体呼吸的评估,通过测量ADP / O比率或泄漏呼吸在孤立的线粒体(扩展数据图。gydF4y2Ba10 h-kgydF4y2Ba)、呼吸控制比(RCR) permeabilized肌肉纤维(扩展数据图。gydF4y2Ba10 lgydF4y2Ba),发现GDF15并不直接影响线粒体耦合效率。然而,GDF15增加CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}支持在permeabilized呼吸肌肉纤维相比,车辆控制(扩展数据图。gydF4y2Ba10 m, ngydF4y2Ba)。轻快但是,基于高频ADP反应在ADP滴定(补充图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),ADP浓度在350µM Ca的存在gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}估计显示,GDF15治疗引起更大的Ca吗gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}派生的ADP相比,车辆和pair-fed控制(图。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba10 m, ngydF4y2Ba)。进一步检查的重要性钙徒劳的自行车驾驶肌肉耗氧量,我们评估呼吸比目鱼肌的肥胖老鼠的纳什饮食的热量限制和注射车辆(pair-fed)或GDF15 21天。肌肉呼吸评估基础,由于咖啡因(增加SERCA的活动和细胞内钙)和治疗后丹曲洛林(抑制阿诺定受体和释放从肌浆网的钙)。符合我们观察permeabilized纤维、慢性治疗GDF15没有显著增加基底呼吸(无花果。gydF4y2Ba4 h,我gydF4y2Ba)。正如所料,添加咖啡因刺激呼吸pair-fed控制;然而,在GDF15-treated老鼠,这种反应是提高了30%(图。gydF4y2Ba4 hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba10 ogydF4y2Ba)。重要的是,这呼吸增加被淘汰的丹曲洛林(无花果。gydF4y2Ba4 h,我gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba10 ogydF4y2Ba),这表明GDF15增强骨骼肌能量消耗通过钙徒劳的自行车。gydF4y2Ba

上述研究表明GDF15维持能量消耗的一个重要作用引起通过热量限制。然而,我们的研究结果gydF4y2BaGfralgydF4y2Bako小鼠(无花果。gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba)表明减少能量消耗和抑制β-adrenergic信号通路在骨骼肌(无花果。gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba内生GDF15)也支持的生理作用。因此,我们检查了这些途径在三个不同的临床人群。首先,我们评估循环GDF15水平人口健康成人(gydF4y2BangydF4y2Ba= 154)的静息代谢率(RMR)使用通风罩系统评估gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba,我们发现有一个倾向之间的弱正相关GDF15和RMR(扩展数据图。gydF4y2Ba11个gydF4y2Ba),保持脂肪量校正后,无脂质量和年龄(扩展数据图。gydF4y2Ba11 bgydF4y2Ba正如我们前面描述的gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba。然而,鉴于RMR测量与稳定的体重和个人,通过设计,在缺乏运动,这一发现可能不是使我们的观察小鼠的差异与GDF15在黑暗中最大的周期和热量限制。因此我们分析了RNA-seq从人类骨骼肌样本数据(gydF4y2BangydF4y2Ba= 806)Genotype-Tissue表达式(GTEx)门户,符合我们的观察在老鼠中,参与者的肌肉更GDF15表达(25%)明显高于gydF4y2BaSLNgydF4y2Ba和其他PKA-regulated基因重要脂肪酸氧化与较低的表达GDF15(25%)(扩展数据图。gydF4y2Ba11 c, dgydF4y2Ba)。最后,尽管以前的观察性流行病学研究表明增加GDF15在人类与肝脏脂肪变性gydF4y2Ba^{47gydF4y2Ba,gydF4y2Ba48gydF4y2Ba},这些研究没有混杂因素与非酒精性脂肪肝占已知增加GDF15,如肥胖和线粒体的压力。孟德尔随机化研究避免干扰,通常影响观察性流行病学研究的基础上通过随机分配组的等位基因从父母继承和关联这一遗传变异(即gydF4y2BaGDF15gydF4y2Ba单核苷酸多态性(SNPs))接触(血清蛋白质含量GDF15)。因此,检查潜在的转化我们的发现与非酒精性脂肪肝的相关性,我们进行了两个示例孟德尔随机化鼻中隔黏膜下切除术后(2)应用全基因组关联研究(GWAS)汇总的数据对肝脏脂肪含量和体积使用磁共振成像(MRI)扫描的英国生物库参与者(gydF4y2BangydF4y2Ba= 32859)。相比以前的流行病学研究gydF4y2Ba^{47gydF4y2Ba,gydF4y2Ba48gydF4y2Ba},我们发现GDF15与肝脏脂肪含量负相关(扩展数据图。gydF4y2Ba11个e, fgydF4y2Ba),而不改变肝脏体积(扩展数据图。gydF4y2Ba11 ggydF4y2Ba)。这些数据表明,GDF15与增加SLN和减少非酒精性脂肪肝临床人群。gydF4y2Ba

这里,进行仔细控制和扩展pair-feeding实验老鼠,我们已经确定了一个生物电路连接GDF15和GFRALβ-adrenergic受体和骨骼肌钙循环(扩展数据图。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)。这在GDF15-treated老鼠维持能量消耗,与热量限制pair-fed控制相比,与骨骼肌中去甲肾上腺素增加,脂肪酸氧化、耗氧量和钙徒劳的自行车。值得注意的是,这个拟表型小鼠overexpressing SLN也失去了更多的体重和肥胖,增加了能量消耗和肌肉脂肪酸氧化和减少肌肉疲劳而pair-fed控制gydF4y2Ba^{39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba}。增加SLN的表达式也观察到患者的骨骼肌GDF15水平高,但是没有在人类血清GDF15和RMR之间的显著联系。缺乏RMR和GDF15之间的联系可能会因为我们的观察的最小差异的耗氧量基底没有增加钙的自行车也被所示gydF4y2BaSlngydF4y2Ba转基因gydF4y2Ba^39gydF4y2Ba和KO小鼠gydF4y2Ba^49gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

很难精确量化的具体贡献这个途径基础代谢率。据估计,骨骼肌贡献大约30%每日总能量消耗gydF4y2Ba^49gydF4y2Ba和钙循环大约是50%的支出gydF4y2Ba^{32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba},也就是说,钙在肌肉中骑自行车大约15%有助于全身能量消耗。鉴于我们观察到GDF15 calcium-stimulated呼吸pair-fed控制老鼠相比,增加了30%左右,这将是一个能源expenditure-an总额增加约5%,相当于大约100千卡能量消耗减少观察与适度的热量限制和减肥gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba。虽然我们不能发现任何差异在脂肪组织产热,这也可能导致增加能量消耗。我们的研究结果表明,考虑到不同的行动GDF15在针对骨骼肌生热作用,这些发现可能解释观察增强减肥当incretin-based疗法相结合,从而抑制食欲gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba。未来的研究调查GDF15-GFRAL信号之间的联系,肌钙循环和能量消耗在人类之前和之后的减肥很重要,进一步建立这个途径的治疗潜力适应性生热作用。gydF4y2Ba

老鼠gydF4y2Ba

GfralgydF4y2Ba零老鼠产生如前所述gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba和繁殖对r·斯利提供的。生成的β-less小鼠b·洛厄尔如前所述gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba和繁殖提供了双j .吴。研究在老鼠身上进行了三个网站(路易斯塔里夫大学,麦克马斯特大学和诺和诺德公司)。所有的动物研究中使用被安置和关心依照当地的动物使用指南,和研究动物伦理研究董事会批准的麦克马斯特大学(AUP: 210104),路易斯塔里夫(2021 - 3001)和丹麦大学动物实验检查员(2020-15-0201-00756:C01)。所有的老鼠都是群居饲养与随意12 h-12 h光暗周期获得食物和水。所有的老鼠都雄性C57BL / 6 j背景。所有的老鼠被安置在安慰区加热印度河流域文明32-Cage(替代设计制造和供应)HEPA过滤通风和调温笼子里保持在21或29°C或在特定病原体自由microisolators在一个房间里保持在21或29°C。GDF15治疗之前,老鼠喂食高脂肪、高果糖饮食(纳什饮食:40千卡%脂肪(主要是棕榈油),20千卡%果糖和0.02%胆固醇)(研究饮食,D19101102;麦克马斯特和路易斯塔里夫大学实验执行)或西方饮食(研究饮食,D12079B;实验在诺和诺德公司)。慢性实验中使用的老鼠在麦克马斯特大学被放置在纳什的饮食和居住在热中性的条件下(12 ~ 29°C, h-12 h光暗周期)或环境温度(~ 21°C,相对湿度40 - 60%)在8周的年龄。 Mice at Novo Nordisk were placed on a housing condition (~29–30 °C, 12 h–12 h light–dark cycle) when treatment with GDF15. Before treatment, mice were randomized and separated into different treatment groups matched on body weight and composition, and single-housed. Recombinant GDF15 (Novo Nordisk, 0247-0000-0001; dissolved in synthetic buffer with 5 mM acetate, 240 mM propylene glycol and 0.007% polysorbate 20) was delivered by subcutaneous injection at the start of the light cycle in the morning (07:00–09:00) at 0.3, 1 and/or 5 nmol per kg once daily. The individual dosage was calculated by the body weight 1 day before. Pair-fed animals received the same amount of food as ingested by the corresponding GDF15-treated groups the day before. Body weight and food weight were recorded daily during the treatment period. Food intake was calculated by subtraction of the amount of food content in food hoppers from the amount added the previous day. Spillage and grind of food in cages was carefully monitored every day. Mice were euthanized in a fed state. Terminal blood was collected by cardiac puncture and blood from live animals was collected from a tail snip. Blood samples were centrifuged at 10,000 rpm for 10 min at 4 °C after clotting at room temperature for 30 min, and the supernatant was collected. Serum was saved and stored at −80 °C until use. Mice were anaesthetized using ketamine–xylazine (McMaster) or isoflurane (Novo Nordisk).

药代动力学分析gydF4y2Ba

老鼠放在纳什饮食和住房条件(29°C) 20周从8周的年龄。后一个皮下注射重组人类GDF15(0.3,每公斤1和/或5 nmol)在小鼠(gydF4y2BangydF4y2Ba每组)= 3,尾巴的血液是在0,0.5,1、2、4、8和24小时来衡量重组人类GDF15在使用人类的血清浓度GDF-15 DuoSet酶联免疫试剂盒(研发系统,DY957)gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

身体成分测量gydF4y2Ba

身体成分(瘦肉和脂肪)分析了使用力量的Minispec整个身体成分分析仪(Minispec低频90 ii)基于TD-NMR或磁共振扫描器从EchoMRITM表示时间。gydF4y2Ba

测量温度的老鼠gydF4y2Ba

小鼠的体温测量通过使用一个数字温度计的直肠温度测试。老鼠的表面温度是衡量一个标准化的红外成像技术使用一个红外摄像机(T650sc,发射率0.98,FLiR系统)如前所述gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

代谢活动gydF4y2Ba

代谢监测进行了使用综合实验动物监测系统(蛤,哥伦布在麦克马斯特仪器)或Promethion系统(貂系统国际,诺和诺德)。实验进行了驯化后系统12或24小时。食物摄入量、身体活动(梁断裂),耗氧量(签证官gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}生产(VCO),二氧化碳gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}),r和能量消耗数据收集每20分钟(蛤)或5分钟(Promethion)表示。脂肪酸氧化(mg / kg / h)是计算使用以下方程(1.70×签证官gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}−1.69×VCOgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba})。碳水化合物氧化(mg / kg / h)是计算使用以下方程(4.58×VCOgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}−3.23×签证官gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba})。gydF4y2Ba

GTT和ITT公司gydF4y2Ba

葡萄糖耐量测试(GTT)和胰岛素耐受性测试(ITT)进行安乐死,前3和2周。快速测试都执行后6 h。GTT,小鼠腹腔注射1.25克/公斤gydF4y2BadgydF4y2Ba葡萄糖。ITT公司,小鼠腹腔注射胰岛素的每公斤1.2 U (Novorapid)。对于所有的测试,血糖测量从血液一滴尾使用ACCU-CHEK英杰华手持glucometer(罗氏)0,20、40、60、90和120分钟后注入。曲线下的面积进行了分析使用GraphPad棱镜(v.9.3.0)。gydF4y2Ba

在血清和肝脏生化分析gydF4y2Ba

甘油三酸酯(开曼化学,10010303),non-esterified脂肪酸(NEFA)(和光诊断,富士胶片kouichi 999 - 34691, 995 - 34791, 991 - 34891, 993 - 35191)、胰岛素(晶体化学,90080),葡萄糖(和光诊断,富士胶片kouichi 997 - 03001)、去甲肾上腺素(Abbexa abx055012)和ALT(凝聚力生物科学,CAK1002)测量根据设备协议。gydF4y2Ba

组织学分析gydF4y2Ba

肝脏和iWAT收集和固定neutral-buffered 10%福尔马林36-48 h。固定后,样本沉浸在70%的酒精溶液。肝脏组织被处理,石蜡包埋,连续切片和染色组织学与麦克马斯特)的免疫学研究中心核心设施。图像被使用尼康90我Eclipse正直的显微镜。瞎了肝脏半定量的组织学分数分配给肝脏部分由一个病理学家。肝细胞气球样变性(0 - 2),脂肪变性评分(0 - 3)和炎症评分(0 - 3)评估根据圆)染色肝部分如前所述gydF4y2Ba^54gydF4y2Ba。非酒精性脂肪肝活动评分(主)被定义为这三个分数的总和。定量评估iWAT脂肪细胞的大小和数目进行了使用图像J如前所述gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

单细胞的准备和流式细胞术分析gydF4y2Ba

制备的肝细胞,叶肝脏的肝灌注后收集与PBS和消化的酶解含有0.5毫克毫升的缓冲区gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}链霉蛋白酶E, 0.088 U mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}胶原酶D和1% (v / v) DNase我30分钟37°C。肝non-parenchymal单细胞悬浮细胞制备如前所述gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba,一个小修改。总之,消化后,细胞被过滤100μM细胞过滤器。后两个离心步骤的1分钟50gydF4y2BaggydF4y2Ba去除肝细胞,其余细胞悬浮进一步透过一个40μM细胞过滤器。non-parenchymal单一细胞在1500转离心5分钟前在4°C程序阻塞/抗体染色流式细胞术。流式细胞术分析细胞被封锁,抗体对Fc受体(Fc块(1∶BD生物科学,553142))和彩色30分钟与抗体冰鸡尾酒:CD45.2 BV510 (1:25, BioLegend, 109838), CD11b APC-Cy7(1:10 0,表达载体,A15390) F4/80-APC(1:10 0,英杰公司,17-4801-82),CD3 BV605 (1:50, BD生物科学,563004),CD4 PerCP-Cy5.5 (1:10 0, BD生物科学,550954)。7法(1:10 0,热费希尔科学A1310)被用作细胞生存能力标志。染色后,细胞分析与CytoFlex流式细胞分析仪(贝克曼库尔特生命科学)。数据分析使用FlowJo (v.10.5)。gydF4y2Ba

RNA隔离,互补脱氧核糖核酸合成和qPCRgydF4y2Ba

组织在试剂盒均质和细胞溶解试剂。使离心后,上清液(水相)是应用于RNeasy工具包(试剂盒,74106)随后的总RNA提取和纯化根据其协议。互补脱氧核糖核酸的合成进行了使用上标IV逆转录酶工具包(表达载体,18090010)根据制造商的指示。cDNA表达特定基因的检测是由定量PCR (qPCR)使用AmpliTaq黄金DNA聚合酶工具包(应用生物系统公司,N8080241)。从热费希尔科学Taqman引物被购买。使用Δ相对mRNA水平量化gydF4y2BaCgydF4y2Ba_tgydF4y2Ba方法,使用鼠标gydF4y2BaActbgydF4y2Ba(Mm02619580_g1)作为内生控制。Gene-specific引物如下:gydF4y2BaUcp1gydF4y2Ba(Mm01244861_m1),gydF4y2BaPparagydF4y2Ba(Mm00440939_m1),gydF4y2BaUcp3gydF4y2Ba(Mm01163394_m1),gydF4y2BaPpargc1agydF4y2Ba(Mm01208835_m1),gydF4y2BaAtp2a1gydF4y2Ba(Mm01275320_m1),gydF4y2BaAtp2a2gydF4y2Ba(Mm01201431_m1),gydF4y2BaSlngydF4y2Ba(Mm00481536_m1),gydF4y2BaPlngydF4y2Ba(Mm04206541_m1),gydF4y2BaCkbgydF4y2Ba(Mm00834780_g1),gydF4y2BaRyr2gydF4y2Ba(Mm00465877_m1),gydF4y2BaGpd2gydF4y2Ba(Mm00439082_m1),gydF4y2BaPpardgydF4y2Ba(Mm00803184_m1),gydF4y2BaCox8bgydF4y2Ba(Mm00432648_m1)和gydF4y2BaCideagydF4y2Ba(Mm00432554_m1)。gydF4y2Ba

RNA-seq和转录组分析gydF4y2Ba

肝脏和收集和胫骨前肌snap-frozen在液氮存储在−80°C。冰冻的肝组织或(30 - 50毫克样品)胫骨前肌在试剂盒试剂均质和细胞溶解。使离心后,上清液(水相)是应用于RNeasy工具包(试剂盒,74106)随后的总RNA提取和纯化根据制造商的协议。所有的RNA样品通过了生物分析仪的质量控制测试。RNA-seq执行使用Illumina公司NextSeq 2000 (P2流细胞,2×50个基点配置)系统。MultiQC用于质量控制从RNA-seq原始数据gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba。削减大量的用于自动化质量和适配器修剪以及质量控制。我们使用RNA-seq数据量化的表达记录通过鲑鱼gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba。鲑鱼的转录水平量化DESeq2被用来探测度gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba使用以下阈值:肝脏样本,|日志gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}(褶皱变化)| > 1,调整gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05;对样品:胫骨前肌|日志gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}(褶皱变化)| > 0.6,调整gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.1。主成分分析是通过DESeq2使用威仕特执行数据。功能富集分析是由浓缩去分析gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba和京都基因和基因组的百科全书(KEGG)映射gydF4y2Ba^{61年gydF4y2Ba}使用GOstats (gydF4y2Bahttps://bioconductor.orggydF4y2Ba)和KEGG。db (gydF4y2Bahttps://bioconductor.orggydF4y2Ba分别)包。结果示gene-concept网络图使用cnetplot包(gydF4y2Bahttps://bioconductor.orggydF4y2Ba)。转录组分析使用Linux系统,R和RStudio软件。RNA-seq老鼠接受β股四头肌样本的数据gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}受体激动剂氨哮素从NCBI下载顺序读取存档参考号码gydF4y2BaPRJNA756816gydF4y2Ba(ref。gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba)。我们使用RNA-seq数据量化的表达记录通过鲑鱼gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba。gydF4y2BaSlngydF4y2Ba表达式的股四头肌决心使用威仕特数据。gydF4y2Ba

磁共振成像gydF4y2Ba

雄性C57Bl / 6 j小鼠被放置在纳什的饮食和热中性的住房条件(29°C) 4周从7周的年龄。使用随机交叉设计(gydF4y2BangydF4y2Ba= 13),小鼠禁食7 h,然后收到一个车辆或皮下注射GDF15(每公斤5 nmol), 4 h之前连续动态宠物收购(gydF4y2Ba^{11 gydF4y2Ba}醋酸C]和[gydF4y2Ba^{11 gydF4y2Ba}棕榈酸酯。实验课程然后重复7天后。宠物进行与雪崩photodiode-based小动物LabPET8扫描仪路易斯塔里夫分子成像中心(中心de矫揉造作的du楚,大学路易斯塔里夫)。首先在老鼠的麻醉(2%异氟烷在1.5 L分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}的氧气)然后用10兆贝可静脉注射丸的gydF4y2Ba^{11 gydF4y2Ba}C)醋酸(100µl最终体积的生理盐水)通过尾静脉,后跟一个15分钟列表模式宠物收购。然后,10丸兆贝可(gydF4y2Ba^{11 gydF4y2Ba}C]棕榈酸酯(100µl最终体积的生理盐水)注射,和一个15分钟列表模式宠物收购了。剩余(gydF4y2Ba^{11 gydF4y2Ba}C)醋酸活动(gydF4y2Ba^{11 gydF4y2Ba}C)收购棕榈酸酯是通过收购一个60年代框架纠正之前的注入gydF4y2Ba^{11 gydF4y2Ba}C]棕榈酸酯,占的蜕变速度gydF4y2Ba^{11 gydF4y2Ba}C)。最后,低剂量CT图像从综合x o小动物获得的CT扫描仪平台上的胜利。gydF4y2Ba

对于[gydF4y2Ba^{11 gydF4y2Ba}醋酸C)扫描,图像重建成26动态帧(12×10、8×30和6×90年代),而(gydF4y2Ba^{11 gydF4y2Ba}C]棕榈酸酯扫描重建到29日动态帧(1×60,12×5、6×10 6×30和4×150年代)使用一个三维的最大似然估计方法和20个迭代,跨越63年,视野80毫米与最后一个矩阵的分辨率为160×160×128和体素的大小为0.5×0.5×0.597毫米。为(gydF4y2Ba^{11 gydF4y2Ba}C)醋酸、输入曲线提取如前所述gydF4y2Ba^{62年gydF4y2Ba}。总之,使用酰胺(v.1.0.4) image-derived输入函数(IDIF)是通过手动定位感兴趣的区域(ROI)腔静脉,上面下面的肾脏和心肌血池。(gydF4y2Ba^{11 gydF4y2Ba}为[C]醋酸IDIF当时纠正gydF4y2Ba^{11 gydF4y2Ba}C]标签代谢物gydF4y2Ba^{63年gydF4y2Ba}。组织roi被吸引对肝脏、肾脏、心肌,白色脂肪组织,iBAT,股四头肌和腓肠肌肌肉。从合成时间获得定量数据曲线,并用来评估组织血流指数(的吸收速率的基础上gydF4y2Ba^{11 gydF4y2Ba}C)醋酸,gydF4y2BakgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba在g毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}最小值gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}),氧化代谢指数(快速分级组织间隙,gydF4y2BakgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}在最小值gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba},(gydF4y2Ba^{11 gydF4y2Ba}C]乙酸)和non-oxidative处理(捕获gydF4y2Ba^{11 gydF4y2Ba}C在组织免费gydF4y2Ba^{11 gydF4y2Ba}C)醋酸或其他代谢物,如脂质,gydF4y2BakgydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}在最小值gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})使用一个标准的两舱制、two-tissue动力学模型gydF4y2Ba^{63年gydF4y2Ba}。对于蝙蝠,一个四室、two-tissue动力学模型应用,如前所述gydF4y2Ba^{64年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba65年gydF4y2Ba}。为(gydF4y2Ba^{11 gydF4y2Ba}C]棕榈酸酯,IDIFs得到描述为gydF4y2Ba^{11 gydF4y2Ba}C)醋酸和roi是画在肝脏、心肌、肾脏和iBAT。脂肪酸氧化、酯化和吸收,使用three-compartment甘油三酯释放率计算,two-tissue动力学模型gydF4y2Ba^{66年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba67年gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

细胞培养的肌管gydF4y2Ba

C2C12细胞线从写明ATCC购买并验证通过在写明ATCC短串联重复序列分析和测试为阴性支原体污染。C2C12细胞保持在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)含10%胎牛血清在37°C公司5%gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}。达到融合后,分化细胞在DMEM补充肌管2%马血清5 - 7天。肌管治疗与车辆,GDF15 (10 nM)和去甲肾上腺素(10μM) 15 h。肌管收集和RNA隔离,互补脱氧核糖核酸合成和qPCR进行如上所述。gydF4y2Ba

体外测定脂肪酸氧化的比目鱼肌gydF4y2Ba

比目鱼肌的肌肉被仔细解剖肌腱腱对肌肉的孵化项目如前所述gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba69年gydF4y2Ba}。脂肪酸代谢实验使用先前描述的过程gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba69年gydF4y2Ba}。总之,孤立的比目鱼肌的肌肉被放置在加热(30°C) Krebs-Henseleit缓冲pH值7.4包含2毫米丙酮酸,fatty-acid-free 4%牛血清白蛋白和0.5毫米棕榈酸。在最初孵化15 - 30分钟的玻璃小瓶,孵化缓冲区被Krebs-Henseleit取代缓冲区补充0.5μCi毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(gydF4y2Ba^14gydF4y2BaC]棕榈酸酯(PerkinElmer NEC534250UC) 60分钟450瓶包含μl苄索氢氧化铵。肌肉被移除的追逐和冲洗和冷冻在液态氮,供以后使用。总共1毫升的醋酸当时仔细添加到玻璃小瓶,立即密封。解放的醋酸有限公司gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}通过三羧酸循环产生的脂肪酸氧化。玻璃小瓶被放置在75 rpm瓶1 h允许苄索氢氧化铵陷阱释放有限公司gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}。内部埃普多夫管含苄索氢氧化铵小心地放入一个塑料闪烁瓶含有5毫升的液体闪烁和允许淬火在黑暗中过夜。一半的比目鱼肌均质在1.5毫升氯仿:甲醇(2:1)的解决方案。然后,2.0毫升的蒸馏HgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}O是添加到上层的分数在新管,轻轻地漩涡。然后将水相转移到塑料闪烁瓶包含5毫升的液体闪烁。dpm测量由闪烁计数器(贝克曼库尔特,LS 6500多功能闪烁计数器)。数据被表示为空闲的和有限公司gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}和酸溶性中间体和标准化组织的重量。gydF4y2Ba

化学去神经iBATgydF4y2Ba

去神经的iBAT通过局部注射6 ohda(10毫克毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})在盐水含1%抗坏血酸为五个不同的地方在iBAT垫(5μl每点)gydF4y2Ba^{70年gydF4y2Ba}。老鼠被允许恢复48 h。蝙蝠去神经的确认,我们治疗小鼠βgydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}受体激动剂cl - 316243和蝙蝠温度测量使用一个标准化的红外成像技术使用一个红外摄像机(T650sc,发射率0.98,FLiR系统)gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba在蛤和能量消耗gydF4y2Ba^{37gydF4y2Ba,gydF4y2Ba71年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba72年gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

肌肉功能测试gydF4y2Ba

肌肉功能测试进行体外使用的水平浴whole-mouse测试系统(1300年,极光科学)。林格氏溶液(4.7毫米120毫米氯化钠,氯化钾,2.5毫米CaClgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba},1.2毫米KHgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}警察丁,1.2毫米MgSOgydF4y2Ba_{4 gydF4y2Ba},消息灵通的25毫米,5.5毫米葡萄糖)在水平浴都洋溢着氧气在实验开始前30分钟。简而言之,对肌肉功能测试、反伊斯兰教英国防御联盟肌肉是孤立的,使用编织丝近端和远端肌肉肌腱连接,固定在固定杠杆臂钩和测力传感器(型号809 c,极光科学)在水平浴。在这个位置,反伊斯兰教英国防御联盟肌肉是两个刺激之间对齐的平行电极。反伊斯兰教英国防御联盟肌肉刺激之前被允许休息10分钟。确定最优肌肉长度、反伊斯兰教英国防御联盟肌肉在不同刺激紧张的休息,直到最大抽搐紧张的决心gydF4y2Ba^{73年gydF4y2Ba}。反伊斯兰教英国防御联盟这种优化后肌肉休息2分钟。force-frequency曲线是用来确定峰值强直的力量。这个力测定由1刺激每30年代初10赫兹和增加刺激频率10赫兹的增量。所有的数据收集和分析使用动态肌肉控制和分析软件(v。615年,极光科学)。gydF4y2Ba

免疫组织化学染色的老鼠的肌肉gydF4y2Ba

)染色法对冷冻腓肠肌肌肉部分使用标准协议。在每个腓肠肌,整个肌肉横截面是可视化和成像评估整个横截面。肌纤维类型如前所述gydF4y2Ba^{74年gydF4y2Ba}。免疫荧光可视化使用尼康Eclipse 90我显微镜(尼康)和分析使用NIS-Elements AR软件(尼康,v.5.41.02)。确定fibre-type百分比,总共有4000纤维(IIb类型我、活动花絮和IIx)每腓肠肌截面被数(gydF4y2BangydF4y2Ba每组)= 4gydF4y2Ba^{75年gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

从红骨骼肌线粒体呼吸在孤立gydF4y2Ba

骨骼肌线粒体分离使用温度控制(4°C)差速离心如前所述gydF4y2Ba^{76年gydF4y2Ba}。总之,后肢骨骼肌(红色红腓肠肌、跖肌、胫骨前,比目鱼肌和股四头肌的红色部分)被切除,减少可见脂肪和结缔组织,称重和切碎的孤立的缓冲区(蔗糖100毫米,100毫米氯化钾,50 mM Tris-HCl, KH 1毫米gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}阿宝gydF4y2Ba_{4 gydF4y2Ba}、0.1毫米EGTA 0.2% BSA和1毫米ATP, pH值7.4)。剁碎组织是均质和离心机在800年gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟分离subsarcolemmal和intermyofibrillar线粒体分数。线粒体颗粒包含intermyofibrillar resuspended,对待一个蛋白酶枯草杆菌蛋白酶(0.025克每毫克湿组织)5分钟和冰冷的隔离缓冲随后添加蛋白酶。样本立即离心机在5000gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟和颗粒在800年resuspended和离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟解放intermyofibrillar线粒体的上层清液。Subsarcolemmal intermyofibrillar线粒体和进一步离心10分钟10000克、resuspended,结合离心之前在10000年的两倍gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟恢复最后的线粒体颗粒。这些颗粒是resuspended毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}缺席MiR05(0.5毫米EGTA 60 mM lactobionate钾,KH 10毫米gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}阿宝gydF4y2Ba_{4 gydF4y2Ba},消息灵通的20毫米,110毫米蔗糖,1 g lgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}脂肪酸自由BSA, pH值7.2)和保存在冰,直到呼吸实验。gydF4y2Ba

呼吸试验中执行Oroboros Oxygraph-2k与恒定搅拌系统在37°C。总共20µg线粒体蛋白质是加载/ 2毫升室(由布拉德福德蛋白质分析量化)。ADP / O比率计算使用氧含量的变化(nmol)后的ADP(分别在50µM (100 nmol)丸,耗尽时,100年µM (200 nmol)丸)在5毫米丙酮酸和苹果酸2毫米。最大呼吸评估后续增加5毫米ADP, 10毫米谷氨酸(最大复杂我支持呼吸)和琥珀酸10毫米(最大呼吸支持的复杂II)。软被量化为状态3的比值(饱和ADP)状态4(丙酮酸和苹果酸,缺乏ADP)呼吸。在另一项实验中,0.5µM寡霉素最初添加到室和呼吸确定饱和混合基质的存在(丙酮酸、苹果酸、ADP、谷氨酸和琥珀酸)。gydF4y2Ba

线粒体纯度被西方墨点法检查如前所述gydF4y2Ba^{77年gydF4y2Ba}。总之,线粒体样本添加1毫升60%之上Percoll(1.336毫升5×SMEA, 4毫升Percoll, 1.334毫升蒸馏HgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}O;密度1.08 - -1.12 g毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})。样本离心机,享年20000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba5 h在4°C。纯化的线粒体层被悬浮在1毫升隔离缓冲和离心机,享年12000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C为10分钟去除剩余Percoll。最后的颗粒是resuspended在隔离缓冲储存在−80°C到样本准备西方墨点法。主要包括抗体COXI (1:50 0, OXPHOS鸡尾酒,Abcam Ab110413), COXIV(1:30,000,表达载体,A21347), GLUT4 (1:2,500, Abcam Ab654) calnexin(下,Sigma-Aldrich C4731)和SERCA2 (1:1,000, Abcam ab2861)。gydF4y2Ba

呼吸在permeabilized从红骨骼肌肌肉纤维gydF4y2Ba

Permeabilized肌肉纤维是准备从红色腓肠肌肌肉如前所述gydF4y2Ba^{78年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba79年gydF4y2Ba}。总之,肌肉被放在冰冷的BIOPS (MES 50毫米,7.23毫米KgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}CaK EGTA, 2.77毫米gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}咪唑EGTA 20毫米,0.5毫米二硫苏糖醇,20毫米牛磺酸、5.77毫米ATP, MgCl PCr 15毫米和6.56毫米gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}·HgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}O, pH值7.1)和纤维束分离fine-tipped钳在显微镜下面(MX6立体镜,蔡司微系统)。纤维在40µg毫升孵化gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}皂素30分钟和洗MiR05呼吸缓冲区(呼吸实验)15分钟。线粒体呼吸实验在MiR05呼吸缓冲Oxygraph高分辨率呼吸器在37°C (Oroboros仪器)常数旋转750 rpm。实验在室温空气饱和与复氧后的每个基质(~ 180 - 195µM OgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba})。所有实验进行的5µM blebbistatin, 5毫米丙酮酸和苹果酸1毫米。轻快的高频ADP实验,ADP是滴定在不同浓度(25,100,250,500,1000,2000,4000,6000,8000,10000µM ADP)其次是10毫米的谷氨酸,10毫米琥珀酸和10µM细胞色素gydF4y2BacgydF4y2Ba。软计算除以最大状态3呼吸(ADP)的存在状态4呼吸(丙酮酸+苹果酸,缺乏ADP)。CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}实验进行的5毫米ATP CaCl滴定前gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}(25、50、100、200、250、300、350年µM CaClgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba})最近报道gydF4y2Ba^{80年gydF4y2Ba}。达到平台期后,40µM会计师加入抑制SERCA的活动。在CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}滴定,SERCA的ATP水解,生成ADP刺激呼吸。因此我们使用单阶段协会从ADP滴定曲线估计ADP生成在CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}滴定SERCA的索引效率。ADP滴定的回归方程如下:汽车:乔gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}= 127 + (598−127)×(1−exp (−0.0005292×(ADP))), GDF15:乔gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}= 128 + (463−128)×(1−exp (−0.0006502×(ADP))), pair-fed:乔gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}= 119 + (590−119)×(1−exp (−0.0005858×(ADP)))。纤维束中恢复了所有的实验中,干体重和体重正常呼吸组织(pmol年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}毫克gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}干重)。gydF4y2Ba

呼吸在孤立的比目鱼肌的肌肉gydF4y2Ba

从老鼠呼吸实验孤立的比目鱼肌肌肉表现如前所述gydF4y2Ba^{81年gydF4y2Ba}与一些细微的修改。比目鱼肌的肌肉与肥胖老鼠的纳什饮食超过13周的热量限制和注射车辆(pair-fed)或GDF15 21天。总之,比目鱼肌肌肉切除和放置在一个密封的小瓶包含2毫升pre-gassed(95%啊gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba},5%的公司gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba})修改克雷布斯的铃声(MKR)缓冲区在30°C(2.6毫米115毫米氯化钠,氯化钾,1.2毫米KHgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}阿宝gydF4y2Ba_{4 gydF4y2Ba}10毫米NaHCOgydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}10毫米玫瑰)补充4% BSA、0.5毫米棕榈酸酯和10毫米gydF4y2BadgydF4y2Ba葡萄糖1 h。1 h预培养后,比目鱼肌的肌肉都被转移到呼吸运动计量法系统(Oroboros O2k)包含hyper-oxygenated(开始[OgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba})~ 500μM)补充MKR缓冲与恒定搅拌30°C。耗氧速率(乔gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}基线的奇遇记》)立志20分钟之前的3毫米咖啡因(Sigma-Aldrich C0750)刺激钙泄漏,提高ATP水解。caffeine-mediated呼吸10分钟后,丹曲洛林(Sigma-Aldrich D9175 10μM在DMSO)添加到室评估抑制钙的影响gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}释放。比目鱼肌的肌肉恢复,减少剩余肌腱/结缔组织,涂抹干燥,重归一化的呼吸肌肉重量弄湿。所有实验测定一式两份(成对的比目鱼肌的肌肉)和技术复制平均每个乔gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}的决心。gydF4y2Ba

生物信息学GTEx数据集的分析gydF4y2Ba

我们已经进入GTEx分析V8。本文中描述的数据用于分析得到从dbGaP加入号码gydF4y2Baphs000424.v8.p2gydF4y2Ba2022年5月11日。研究生理水平的GDF15对骨骼肌的影响在人类中,我们评估了原始RNA-seq基因计数数据来自803人的肌肉。我们比较了通过建立两组肌肉基因表达的基础上GDF15骨骼肌中的表达水平使用R和RStudio软件。gydF4y2Ba

相关分析GDF15和TSH的人类gydF4y2Ba

收集血液样本后一夜快速肥胖女性(gydF4y2BangydF4y2Ba= 22)gydF4y2Ba^{31日gydF4y2Ba}。TSH测量由渥太华医院实验室服务。GDF15水平进行分析使用人类GDF-15 Quantikine按照制造商的指示酶联免疫试剂盒(研发系统,DGD150)。gydF4y2Ba

相关研究GDF15和RMR人类gydF4y2Ba

154名参与者的RMR测量使用通风罩gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba(JAEGER Oxycon Pro, Viasys医保)。测量了一夜后快速喂饲到10点之间。罩是放在伏卧的科目。测量持续了40分钟,当参与者被要求保持期间仍然保持清醒。平均每10分钟的值被计算和最小值作为参与者的RMR。RMR对身体成分的基础上调整TANITA数据使用我们发表的自然对数方程(Ln)gydF4y2Ba_{蜜蜂(基底支出)gydF4y2Ba}=−0.954 + 0.707 LngydF4y2Ba_{FFM(不含脂肪的质量)gydF4y2Ba}+ 0.019 LngydF4y2Ba_{调频(脂肪)gydF4y2Ba}(ref。gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba)。GDF15在人血浆水平测试通过使用人类GDF-15 DuoSet酶联免疫试剂盒(研发系统,DY957)gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba。GDF15水平校正年龄和体重的多元线性回归使用R。gydF4y2Ba

鼻中隔黏膜下切除术后2使用GWAS汇总数据gydF4y2Ba

鼻中隔黏膜下切除术后2使用曝光和执行结果从两个重叠和独立的数据集进行汇总的接触分析和instrument-outcome协会分析工具。鼻中隔黏膜下切除术后2都使用了TwoSampleMR R包(v0.5.6)gydF4y2Ba^{82年gydF4y2Ba}。验证的因果效应GDF15在人类肝脏脂肪,鼻中隔黏膜下切除术后我们执行2使用曝光数据集(GDF15, GWAS ID: ebi-a-GCST90011998,样本大小:21758)gydF4y2Ba^{83年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba84年gydF4y2Ba}和结果的数据集(肝脂肪比例,GWAS ID: ebi-a-GCST90016673,样本大小:32858)gydF4y2Ba^{85年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba86年gydF4y2Ba}。检查GDF15在人类肝脏体积的影响,我们进行了鼻中隔黏膜下切除术后2使用曝光数据集(GDF15, GWAS ID: ebi-a-GCST90011998,样本大小:21758)和结果数据集(肝脏体积,GWAS ID: ebi-a-GCST90016666,样本大小:32858)gydF4y2Ba^{85年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba86年gydF4y2Ba}。我们确定了基因变异(snp)蛋白质含量与血液GDF15在GWAS目录数据集的基础上gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-pQTL(在500 kbgydF4y2BaGdf15gydF4y2Ba基因),进一步选择代理单核苷酸多态性连锁不平衡(LD)凝结(p1 = 5 e-08,丛= TRUE, p2 = 1 e-07, r2 = 0.001 kb = 10000)。删除重复的exposure-outcome总结集后,我们进一步做了敏感性分析,包括异质性统计,水平基因多效性和分析分析。后确认没有异质性或水平基因多效性,我们接下来先生进行分析和可视化结果使用散点图和森林情节功能TwoSampleMR R包中。我们使用斯泰格尔方向测试gydF4y2Ba^{87年gydF4y2Ba}评估之间的因果方向GDF15在人类和肝脏脂肪。方差倒数加权的方法被用来评估的意义的因果影响接触的结果。使用R和RStudio鼻中隔黏膜下切除术后2执行。gydF4y2Ba

统计数据gydF4y2Ba

统计分析使用GraphPad棱镜(v.8.4.1 v.9.3.0)或R (v.4.2.3) RStudio软件(v.1.3.1056)。所有值都报道说±s.e.m。除非另有规定。数据分析使用单向或双向方差分析与图基,Dunnett或Šidak因果测试在适当的地方。差异被认为是重要的时候gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。统计学意义的组织学评分评估使用未配对Mann-Whitney非参数测试。ANCOVA被用来纠正协变量的变异性的影响(例如,体重)主要变量(例如,治疗)。ANCOVA执行和可视化使用HH包(v.3.1-47)gydF4y2Ba^{88年gydF4y2Ba}在R和RStudio软件检查后回归斜坡上的同质性。相关分析是使用皮尔逊积差相关。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

进一步研究信息设计是可用的gydF4y2Ba自然投资组合报告总结gydF4y2Ba与这篇文章有关。gydF4y2Ba