文摘gydF4y2Ba
在哺乳动物细胞,增殖的决定被认为是不可逆转地在细胞周期的限制gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,当有丝分裂原信号进行一个积极的反馈回路之间的细胞周期蛋白A2 /细胞周期蛋白依赖性激酶2 (CDK2)和视网膜母细胞瘤蛋白gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba。这种教科书模式相反,在这里,我们表明,扩散的决定实际上是完全可逆的。相反,我们发现所有循环细胞将退出细胞周期在缺乏有丝分裂原,除非他们首先使其有丝分裂和分裂。这时间之间的竞争两个命运,有丝分裂和细胞周期退出,是因为细胞周期蛋白A2 / CDK2活动取决于CDK4/6活动在整个细胞周期中,不仅仅是在G1期。没有分裂,有丝分裂时才观察到细胞周期蛋白A2蛋白的半衰期是足够长的时间来维持CDK2活动在G2 / M。因此,细胞是依赖于有丝分裂原,CDK4/6活动保持CDK2活动在间期和视网膜母细胞瘤蛋白磷酸化。因此,即使2 h延迟细胞对有丝分裂可以诱导细胞周期的进程退出如果有丝分裂原信号丢失。我们的研究结果揭示背后的分子机制限制点现象,揭示一个意想不到的角色CDK4/6活动年代和G2阶段和解释的行为后所有的细胞分裂素信号的损失。gydF4y2Ba
主要gydF4y2Ba
限制点(R点)标志着点在哺乳动物细胞的细胞周期成为独立的有丝分裂原信号和不可逆转地致力于扩散gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。分子,这个不可逆细胞命运的决定被认为是由于细胞细胞外促分裂原信号转换成一个自我维持的正反馈循环(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。有丝分裂原激活细胞周期蛋白依赖性激酶4和6 (CDK4/6),这使磷酸化肿瘤抑制视网膜母细胞瘤蛋白(Rb),导致转录因子的激活E2F1-3。这些细胞周期蛋白E和e2f促进转录的,也与CDK2形成复合物,使磷酸化细胞周期蛋白E和Rb和进一步推动E2F-mediated转录A。因此,一旦激活,CDK2被认为与Rb形成一个正反馈循环,能保持连续CDK2活动即使没有上游有丝分裂原信号gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,具有双稳态的特性和不可逆转的滞后对有丝分裂原浓度(图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8 gydF4y2Ba。因此,教材的R模型的关键在于CDK2激活和Rb磷酸化确定从一个pre-R post-R状态转换gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba。然而,最近的研究还发现,CDK2活动和Rb磷酸化状态不能确定是否所有细胞穿过R点,观察异常细胞似乎矛盾教科书模型gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba。这种差异质疑长期R-point模型和哺乳动物细胞周期控制的基本理解。因此,需要新的单细胞研究发现细胞周期控制的通用模型。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba教科书信号通路表明R点标志着从分裂素依赖到独立的转变。gydF4y2BabgydF4y2Ba改编自姚明等数学模型。gydF4y2Ba8 gydF4y2Ba显示双稳性和磁滞CDK2活动对有丝分裂原信号。gydF4y2BacgydF4y2Ba预测命运的预处理和post-R细胞由R-point模型。gydF4y2BadgydF4y2Ba直方图显示,DNA含量(上部面板)。散点图的Rb磷酸化与DNA含量(较低的面板)。粉红色的盒子马克G0-like状态(hypophosphorylated Rb和4 n DNA内容)。G0-like细胞的百分比表示。gydF4y2BaNgydF4y2Ba= 2000细胞/条件。gydF4y2BaegydF4y2BaCDK2和APC / C活动从一个例子MCF-10A细胞治疗DMSO在表示时间。多次细胞分裂,形成四个孙女细胞(补充视频gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)。gydF4y2BafgydF4y2Ba从两个例子,CDK2和APC / C活动MCF-10A细胞治疗CDK4/6i表示。在上部面板中,细胞分裂,其女儿在G0被捕。在较低的面板中,细胞退出细胞周期到G0-like状态没有分裂(补充视频gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。gydF4y2BaggydF4y2Ba、热地图显示CDK2和APC / C活动按时间排序的有丝分裂细胞治疗DMSO(左面板)或CDK4/6i(右面板)。扩展的数据图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba演示了如何CDK2和APC / C活动转化为热量地图。gydF4y2BahgydF4y2Bapost-R细胞的百分比,退出后G0-like状态分裂素(Mit)去除,MEKi或CDK4/6i。误差线代表s.e.m.gydF4y2BangydF4y2Ba= 4独立实验。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用一个单向方差分析值进行了计算。gydF4y2BaPgydF4y2Ba值从上到下9×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba,不到1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba和2.8×10gydF4y2Ba−3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba散点图的Rb磷酸化与DNA内容CDK4/6i-treated post-R细胞gydF4y2BaggydF4y2Ba显示两个不同的细胞周期轨迹后post-R细胞分裂素信号的损失。粉色框表明G0-like状态,和卡通(上半部分)显示细胞周期轨迹。gydF4y2BaNgydF4y2Ba= 3621个细胞。gydF4y2BajgydF4y2Ba命运,示意图显示观察结果后post-R细胞分裂素信号的损失。a.u。,一个rb我tr一个ryunit. phosph., phosphorylation.
有丝分裂原信号保持在S / G2 CDK2活动gydF4y2Ba
R-point模型的主要宗旨是pre-R细胞敏感的损失有丝分裂原信号并将退出细胞周期G0如果删除了有丝分裂原,而post-R细胞敏感,并将完整的有丝分裂,细胞之后,他们的女儿将在G0被捕(参考文献。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)。为了测试这个基本R-point模型的预测,我们血清饥饿MCF-10A细胞增殖或治疗他们蛋白激酶激酶抑制剂(MEKi)或4和6细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDK4/6i) 48 h,然后测量DNA内容和Rb磷酸化gydF4y2Ba13gydF4y2Ba。R-point模型相反,多达15%的MCF-10A细胞4 n DNA含量(例如4每个染色体的复制,二倍体),表明这些细胞G0没有完成有丝分裂和逮捕,但相反,退出细胞周期从G2期(无花果。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba柱状图)。然而,与一个典型的G2逮捕与过度磷酸化Rb细胞,这些细胞已经hypophosphorylated Rb(无花果。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba散点图)。因此,而不是所有的细胞都在G0逮捕2 n DNA含量损失促分裂原信号后,我们发现,一些细胞进入了一个“G0-like”状态4 n DNA内容和hypophosphorylated Rb,表明提出的反馈回路CDK2 - Rb不是无限期地保持在这些细胞。表明一个普遍的现象,我们又一次重复这在主细胞细胞周期状态,非转换细胞,转化细胞和细胞缺乏应激CDKis p21, p27和p16(扩展数据图。gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
评估损失影响的有丝分裂原信号和Rb磷酸化CDK2活动,我们细胞转导MCF-10A CDK2活动传感器(扩展数据图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),对应的激活与Rb磷酸化gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。因为它已经表明,R点先于S期gydF4y2Ba14gydF4y2Ba和失活anaphase-promoting复杂/ cyclosome (APC / C)标志着进入S期gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,我们利用一个APC / C活动传感器gydF4y2Ba16gydF4y2Ba识别pre-R (APC / C)或post-R (APC / C)细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba)。我们结合这些活动与live-cell成像传感器和自动单细胞跟踪测量CDK2活动促分裂原去除后,MEK抑制或post-R CDK4/6抑制细胞。gydF4y2Ba
Post-R细胞接受二甲亚砜(DMSO)分裂多次(图。gydF4y2Ba1 e, ggydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba),而治疗干扰有丝分裂原信号通路导致两种不同的细胞周期轨迹(无花果。gydF4y2Ba1 f, ggydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2 b, cgydF4y2Ba)。大多数post-R细胞建立CDK2活动直到他们分为两个子细胞,逮捕在G0 CDK2活动较低和高APC / C活动(图。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba,上面板和补充视频gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。然而,多达15%的post-R没有进入细胞有丝分裂,而是,逐渐失去了CDK2过早活动和重新激活APC / C(无花果。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba较低的面板,无花果。gydF4y2Ba1 hgydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba),这表明这些post-R细胞已经退出细胞周期G0-like状态(CDK2低,APC / C, hypophosphorylated Rb和4 n DNA内容)(图gydF4y2Ba1我gydF4y2Ba)。值得注意的是,进入这G0-like状态解释人口持续的G2的外观当观察DNA内容(图。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba粉红色的盒子)。因此,在对比的教科书模型R点(无花果。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba),我们发现并不是所有post-R细胞不可逆转地致力于扩散因为一些细胞退出细胞周期G0-like状态后损失的有丝分裂原信号(图。gydF4y2Ba1 jgydF4y2Ba)。此外,这些G0-like细胞最终展出senescence-associatedβ-galactosidase活动(扩展数据图。gydF4y2Ba2 d-fgydF4y2Ba),与先前的报道一致,过早APC / C活化在S / G2期细胞衰老的前兆gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
有丝分裂和出口之间的竞争决定细胞命运gydF4y2Ba
理解为什么这些局外人post-R细胞进入有丝分裂失败后促分裂原信号的损失,我们的时间排序的所有细胞治疗对S阶段条目(即APC / C失活),发现细胞更有可能退出细胞周期接近时开始治疗时比有丝分裂S期(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。因为有丝分裂和细胞周期的退出是互斥的命运,妨碍彼此的观察gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,我们假设一个细胞有丝分裂分裂素信号丢失时可能不会有足够的时间让他们反应,会进入有丝分裂而不是退出细胞周期,而接近于S期细胞将退出细胞周期而不是进入有丝分裂。这个时间反对的命运结果之间的竞争可以概念化作为两个分子时钟之间的竞争,代表时间从S期进展到有丝分裂(有丝分裂时钟)和所需的时间损失后失去CDK2活动促分裂原信号(退出细胞周期时钟)(图gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)。如果,对于一个给定的细胞,其细胞周期的退出时间长于其有丝分裂时钟,然后有丝分裂赢得竞争和退出细胞周期不会观察,反之亦然。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Bapost-R细胞,观察到的百分比在每本退出DMSO(灰色圆圈)和CDK4/6i治疗(粉色圆圈)。误差线代表s.e.m.gydF4y2BangydF4y2Ba= 3实验。逻辑回归模型拟合数据。阴影区域代表95%的置信区间。gydF4y2BaPgydF4y2Ba从逻辑回归模型计算值使用的小动物——一张长有瓦尔德测试:DMSO (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.64)和CDK4/6i (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 1.38×10gydF4y2Ba−51gydF4y2Ba)。gydF4y2BabgydF4y2Ba示意图,说明时间之间的竞争post-R细胞有丝分裂和细胞周期的退出,在S / G2期失去了有丝分裂原信号。gydF4y2BacgydF4y2Ba示意图说明,抑制有丝分裂时钟或退出细胞周期的时钟使赛前退出细胞周期测量时钟或有丝分裂时钟,分别。gydF4y2BadgydF4y2Ba单细胞CDK2活动一致的痕迹,时间的治疗。绿线描述细胞进入有丝分裂(黑点)。灰色线条描绘细胞继续致力于CDK2高的细胞周期活动(大于0.6)。粉色线条描绘细胞失去CDK2活动(小于0.6)和退出细胞周期。gydF4y2BaNgydF4y2Ba分别为= 232、299和242个细胞。gydF4y2BaegydF4y2Ba直方图显示,赛前有丝分裂和细胞周期的分布退出时钟测量从左边和中间板gydF4y2BadgydF4y2Ba,分别。gydF4y2BafgydF4y2Ba直方图显示,赛后有丝分裂和细胞周期的分布退出时钟测量正确的小组gydF4y2BadgydF4y2Ba。gydF4y2BaggydF4y2Ba蒙特卡罗模拟显示,赛后对有丝分裂(绿色柱状图)和细胞周期分布退出(粉红色直方图)覆盖在各自赛前分布直方图(灰色)。散点图显示模拟时间退出细胞周期和有丝分裂色彩编码是否有丝分裂细胞周期(绿点)或退出(粉红色圆点)赢得了比赛。gydF4y2BahgydF4y2Ba直方图的赛后时间退出细胞周期和有丝分裂。线表示实验测量分布,和固体酒吧代表模拟分布gydF4y2BaggydF4y2Ba。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba示意图显示,有丝分裂原信号损失后,退出细胞周期的不同时间和细胞有丝分裂时钟决定是否将退出细胞周期或有丝分裂。gydF4y2BajgydF4y2Ba,从p21 MCF-10A CDK2活动痕迹gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba细胞排列与羟基脲治疗的时间(胡)和CDK4/6i彩色gydF4y2BadgydF4y2Ba。gydF4y2BaNgydF4y2Ba= 300、286、300和297个细胞,分别。gydF4y2BakgydF4y2Ba示意图说明,post-R细胞分裂素信号损失后,CDK2活动可以保持大约15 h,这是大约4 h超过中值时间进入有丝分裂。NS,不重要。gydF4y2Ba
竞争的时钟模型使得两个主要的预测。第一个预测是,因为所有的细胞都包含有丝分裂时钟和退出细胞周期时钟独立运作,要么阻塞时钟将允许对方命运赢得竞争(图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)。先测试这个预测,我们打破了这种平衡的增长细胞有丝分裂的全面发展媒体和观察到的几乎所有细胞有丝分裂,揭示一个潜在的“赛前”分布的有丝分裂*(图。gydF4y2Ba2 d, egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4 d-fgydF4y2Ba)。相反,我们把平衡的有丝分裂细胞周期退出通过禁用时钟使用CDK1i(扩展数据图。gydF4y2Ba4 a、bgydF4y2Ba)的同时阻止有丝分裂原信号(图。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4得了gydF4y2Ba)。与有丝分裂时钟残疾,几乎所有post-R细胞失去CDK2活动和退出细胞周期有丝分裂原信号损失后,露出一个潜在的赛前退出细胞周期分布,只能显示通过阻止有丝分裂(无花果。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)。禁用逮捕G2期细胞的有丝分裂时钟的小分子抑制剂Polo-like激酶1,G2 / M过渡的关键调节器,或触发G2 / M DNA损伤检查点使用radiomimetic药物neocarzinostatin取得了类似的结果(扩展数据图。gydF4y2Ba4 g hgydF4y2Ba)。因此,通过禁用有丝分裂时钟,我们发现所有post-R细胞而不仅仅是10 - 15%的异常细胞包含一个退出细胞周期时钟。这意味着所有post-R细胞无法维持CDK2活动缺乏CDK4/6信号的情况下,与此形成鲜明对比的是,教科书模型CDK2活动是自给自足。gydF4y2Ba
第二个预测由时钟模型是知识竞争的赛前的有丝分裂和细胞周期时钟分布仅应足以解释细胞是否会决定进入有丝分裂或退出细胞周期后促分裂原信号的损失。测试第二个预测,我们首先测量了预处理和赛后的分布有丝分裂和细胞周期的退出时间(无花果。gydF4y2Ba2 e, fgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5 a、bgydF4y2Ba)。然后我们使用蒙特卡罗算法的随机样本的赛前退出细胞周期分布和有丝分裂和模拟竞争(扩展数据图。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)。竞争的时钟模型是正确的,模拟的竞争应该匹配实验测量赛后退出细胞周期分布和有丝分裂的时期。退出细胞周期和有丝分裂模型作为独立的竞争过程,因为一旦有丝分裂时钟是禁用的,退出细胞周期的概率是独立的有丝分裂细胞的接近治疗(扩展数据图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)。仿真结果从我们同意我们的实验观察CDK4/6i-treated细胞,包括退出细胞周期的频率(无花果。gydF4y2Ba2 g hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba),”赛后“退出细胞周期时钟倍(无花果。gydF4y2Ba2 hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba)和之间的关系接近的S期和细胞周期的概率退出(扩展数据图。gydF4y2Ba5克gydF4y2Ba)。值得注意的是,尽管绝对差异在退出细胞周期和有丝分裂时钟之间的细胞系(扩展数据图。gydF4y2Ba5 h-jgydF4y2Ba),我们发现,模拟同意实验观察从多个细胞系(扩展数据图。gydF4y2Ba5 kmgydF4y2Ba)。这些模拟表明,一些细胞之所以观察退出细胞周期在G2期是因为这些细胞有一个短的比他们的有丝分裂细胞周期退出时钟时钟和相对差异在每个时钟的时间结合细胞间变化在人口级别可以占的频率退出细胞周期的细胞分裂素信号损失,我们观察到实验(无花果。gydF4y2Ba2我gydF4y2Ba)。因此,我们的数据支持另一种细胞周期模型的承诺,可以占的行为后所有的细胞分裂素信号的损失。gydF4y2Ba
这个修正模型的一个重要影响细胞的细胞周期的承诺是有有限的时间来完成细胞周期,因为中间的赛前退出细胞周期和有丝分裂时钟时间不同平均只有4 h(例如,15和11 h,分别在MCF-10A细胞)(图gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5 h-jgydF4y2Ba)。为了验证这一点,我们试图扩展而不是阻止有丝分裂时钟完全通过与羟基脲或胸苷治疗细胞是暂时性的,摊位DNA复制在S期不会引起DNA损伤(扩展数据图。gydF4y2Ba6模拟gydF4y2Ba从S期),延长时间到post-R细胞的有丝分裂2 h增量(扩展数据图。gydF4y2Ba6 e, fgydF4y2Ba)。将这种延迟强加于有丝分裂时钟结合CDK4/6i治疗增加了细胞周期的函数退出的频率的增加有丝分裂时钟(无花果。gydF4y2Ba2 jgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6胃肠道gydF4y2Ba),显示缺乏促分裂原信号的情况下,细胞有有限的时间来完成细胞周期(无花果。gydF4y2Ba2 kgydF4y2Ba)。当我们观察到CDK2活动下降羟基脲或胸苷治疗后,我们可以挽救这个下降抑制Wee1,激酶负调节CDKs(扩展数据图。gydF4y2Ba6 j-lgydF4y2Ba)。再一次,我们观察到细胞退出细胞周期进入G0-like状态当处理CDK4/6i和小如4 - h脉冲的胸苷有或没有Wee1抑制剂。因此,我们延长了S / G2长度没有深刻的干扰CDK2活动,我们还观察到细胞退出CDK4/6抑制后进入G0-like状态。gydF4y2Ba
在S / G2 CDK4/6促进细胞周期蛋白A2合成gydF4y2Ba
我们的数据表明CDK2激活和Rb是可逆的磷酸化在所有post-R细胞分裂素信号损失提高是否CDK2和Rb组成一个真正的自我维持的反馈回路。为了解决这个问题,我们测量的每个组件提出CDK2-Rb反馈回路在post-R细胞CDK4/6i治疗后(图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。而细胞周期素E激活CDK2在G1期,它是退化gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba而对CDK2在S / G2期活动;因此,它并不包含在此分析(扩展数据图。gydF4y2Ba7 a、bgydF4y2Ba)。细胞周期素A2蛋白质含量,CDK2活动,Rb磷酸化和E2F1 mRNA保持高6 - 8 h之前与此同时下降,而细胞周期蛋白A2 mRNA水平下降2 h(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7汉英gydF4y2Ba)。实时定量逆转录酶聚合酶链反应(存在)分析证实,2 h CDK4/6i治疗post-R细胞细胞周期蛋白A2 mRNA水平降低了50%,尽管规范E2F目标基因的mRNA水平(CCNE1和E2F1)保持不变(扩展数据图。gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba)。表达的细胞周期蛋白A2不受管制的启动子阻止post-R细胞失去CDK2活动CDK4/6i治疗后,建立的镇压CDK4/6-mediated细胞周期蛋白A2转录的原因是细胞周期退出(图。gydF4y2Ba3汉英gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba,提出了CDK2-Rb反馈回路模型。gydF4y2BabgydF4y2Ba每个组件的测量gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba与CDK1i + CDK4/6i采取治疗后。gydF4y2BangydF4y2Ba= 2 CCNA2 mRNA和E2F1 mRNA,gydF4y2BangydF4y2Ba= 3,细胞周期蛋白A2蛋白质和CDK2活动和gydF4y2BangydF4y2Ba= 4 phospho-Rb水平。误差线代表s.e.m。gydF4y2BacgydF4y2Ba,实验设计测试如果细胞周期蛋白A2表达一个不受监管的启动子可以拯救CDK2活动CDK4/6i治疗后的损失。gydF4y2BadgydF4y2BaCDK2活动痕迹细胞视为表示。灰色和粉红色痕迹代表细胞CDK2大于0.6和CDK小于0.6活动24 h,分别。gydF4y2BaNgydF4y2Ba分别为= 200、209和200个细胞。gydF4y2BaegydF4y2Ba细胞的百分比,退出细胞周期gydF4y2BadgydF4y2Ba。误差线代表s.e.m.gydF4y2BangydF4y2Ba= 4独立实验。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用一个单向方差分析值进行了计算。gydF4y2BaPgydF4y2Ba值从上到下都小于1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba和0.99。gydF4y2BafgydF4y2BaCDK4/6基质,提出CCNA2转录监管机构。gydF4y2BaggydF4y2Ba、中值CDK2活动痕迹细胞治疗以来表示条件保持一致。阴影区域代表95%的置信区间。gydF4y2BaNgydF4y2Ba> 1000细胞/条件。虚线下面的横线代表CDK2活动所需的阈值Rb磷酸化(CDK2小于0.6)。gydF4y2BahgydF4y2Ba细胞的百分比,退出细胞周期gydF4y2BaggydF4y2Ba。误差线代表s.e.m.gydF4y2BangydF4y2Ba= 3独立实验。gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用一个单向方差分析值进行了计算。gydF4y2BaPgydF4y2Ba从左到右值小于1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba,不到1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba,0.23,0.03和0.89。gydF4y2Ba我gydF4y2BaCDK4/6i治疗后,量化蛋白质磷酸化的口袋。每个磷蛋白质被规范化水平的总水平相应的蛋白质。误差线代表s.e.m。(Rb,gydF4y2BangydF4y2Ba= 5;p107,gydF4y2BangydF4y2Ba= 2;p130,gydF4y2BangydF4y2Ba= 3独立实验)。gydF4y2BajgydF4y2Ba,平均CDK2活动痕迹(左面板)和内源性细胞周期蛋白A2水平(右面板)一致以来U2OS-eYFP细胞治疗。阴影区域表示95%的置信区间。gydF4y2BakgydF4y2Ba相图的中位数CDK2活动和内源性细胞周期蛋白A2中位数水平。gydF4y2BalgydF4y2Ba,退出细胞周期时间的函数表示细胞株细胞周期蛋白A2半衰期。最佳拟合线和方程gydF4y2BargydF4y2Ba2gydF4y2Ba值显示。误差线代表s.e.m。(U2OSgydF4y2BangydF4y2Ba= 5;MCF-10A,gydF4y2BangydF4y2Ba= 6;RPE-1,gydF4y2BangydF4y2Ba= 4;RPE-1 CCNA2gydF4y2BaddgydF4y2Badia,gydF4y2BangydF4y2Ba= 2;RPE CCNA2gydF4y2BaddgydF4y2Ba+ DIA,gydF4y2BangydF4y2Ba= 2独立实验)。R.F.U.,rel一个t我ve fluorescence units.
识别蛋白质受CDK4/6可能调解细胞周期蛋白的转录A2,我们测试是否携带RNA (siRNA)可拆卸的各种已知CDK4/6基质控制细胞周期基因转录可以挽救的损失CDK2活动(图。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)。击倒的CDK4/6-regulated转录因子FOXO3和FOXM1没有救援的损失CDK2活动(扩展数据图。gydF4y2Ba7胃肠道gydF4y2BaRb(图),也没有击倒。gydF4y2Ba3 g hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8 a、bgydF4y2Ba)。然而,击倒p107和p130 Rb一样的蛋白家族的成员,并营救CDK2活动(无花果。gydF4y2Ba3 g hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8 a、bgydF4y2Ba)。同样,击倒p107 p130,但不是Rb,防止损失的细胞周期蛋白A2 mRNA CDK4/6i治疗后(扩展数据图。gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba),这表明CDK4/6压制细胞周期蛋白A2转录主要通过p107 / p130和Rb。符合这种模式的监管,我们发现p107和p130脱去磷酸CDK4/6i 1 - 2小时内的治疗,而Rb仍然过度磷酸化,表明p107 p130,但不是Rb,激活了CDK4/6i治疗(图。gydF4y2Ba3我gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8 d-fgydF4y2Ba)。形式的p107和p130抑制转录激活通过复杂的形成抑制因子e2f E2F4 E2F5gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba。与此一致的是,CDK4/6抑制诱导E2F4之间复杂的形成和p107(扩展数据图。gydF4y2Ba8 ggydF4y2Ba),结合击倒E2F4 E2F5也阻止CDK2活动(扩展数据图的损失。gydF4y2Ba8 h-jgydF4y2Ba)。因此,我们发现CDK4/6-p107 / p130调节细胞周期蛋白A2 post-R细胞转录和CDK2活动,暗示CDK4/6活动的一个关键的角色在维护CDK2在S / G2期活动。gydF4y2Ba
鉴于CDK2活动是由细胞周期蛋白A2 post-R细胞gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,细胞周期蛋白A2蛋白质有大约12 h半衰期post-R细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba9 a、bgydF4y2Ba),这表明,细胞周期蛋白A2蛋白质含量是主要的贡献者的时机退出细胞周期时钟,这中间的时间大约15 h。为了验证这一点,我们表示CDK2 U2OS细胞生物传感器与细胞周期蛋白A2内生标记黄色荧光蛋白(YFP)时,孵化它们与细胞周期蛋白A2 siRNA(扩展数据图。gydF4y2Ba9 c, dgydF4y2Ba),然后测量内源性细胞周期蛋白A2水平随着时间的推移和CDK2活动后CDK1i + CDK4/6i治疗。符合我们的预测,细胞周期蛋白A2蛋白质水平组的时机退出细胞周期时钟,我们发现,细胞开始较低水平的细胞周期蛋白A2失去CDK2活动用的时间少,退出细胞周期后的损失有丝分裂原信号(图。gydF4y2Ba3 j, kgydF4y2Ba),时间失去CDK2活动并退出细胞周期有密切关系的时候失去细胞周期蛋白A2蛋白质(扩展数据图。gydF4y2Ba9 egydF4y2Ba),细胞周期蛋白A2水平当时失去了有丝分裂原信号预测是否细胞有丝分裂或退出细胞周期(扩展数据图。gydF4y2Ba9 f, ggydF4y2Ba)。此外,在有丝分裂和细胞周期的支持退出由独立分子时钟驱动流程,减少我们指出,只有一个小细胞周期蛋白A2水平能够缩短的时机退出细胞周期时钟,而有丝分裂时钟的时间保持不变(扩展数据图。gydF4y2Ba9小时gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
进一步测试细胞周期蛋白A2蛋白质是否稳定是主要的贡献者的时机退出细胞周期时钟,我们直接操纵细胞周期蛋白A2蛋白质稳定使用CRISPR-engineered RPE-1细胞系的内源性细胞周期蛋白A2蛋白质融合两个诱导degrons:一个auxin-inducible degron和一个小molecule-assisted关闭(粉碎)标记gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba(RPE-1 CCNA2gydF4y2BaddgydF4y2Ba细胞)(扩展数据图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。添加诱导degron已经降低了稳定正常RPE-1细胞的细胞周期蛋白A2从10 h在设计线(图5 h。gydF4y2Ba3 lgydF4y2Ba)。细胞周期素A2稳定可以进一步减少到2 h的除了DIA鸡尾酒(强力霉素,indole-3-acetic酸和asunaprevir) (gydF4y2Ba补充的方法gydF4y2Ba)。细胞周期蛋白的半衰期缩短A2和治疗细胞CDK4/6i导致更快速退出细胞周期(扩展数据图。gydF4y2Ba10 b, cgydF4y2Ba),允许更大比例的细胞退出细胞周期在S / G2期(扩展数据图。gydF4y2Ba10 dgydF4y2Ba)和扩展时期细胞敏感CDK4/6抑制3 h之前进入有丝分裂(扩展数据图。gydF4y2Ba10 d-fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
最后,我们利用自然变异细胞系和策划之间的细胞周期蛋白A2蛋白半衰期以及五个不同细胞株细胞周期的退出时间。我们发现很强的相关性之间的细胞周期蛋白A2半衰期和退出细胞周期时间(无花果。gydF4y2Ba3 lgydF4y2Ba)。值得注意的是,最佳适合行有一个gydF4y2BaygydF4y2Ba拦截不到2 h,惊人相似的时间对细胞周期蛋白A2 mRNA丢失CDK4/6抑制后,大约一斜坡,表明细胞周期蛋白A2稳定是主要的贡献者退出细胞周期时钟。gydF4y2Ba
一个前馈回路构成CDK2可逆性gydF4y2Ba
我们的数据表明有丝分裂原信号损失后,细胞周期蛋白A2转录p107紧/ p130几个小时之前检测到变化CDK2活动或Rb磷酸化与教材模式,预示着细胞周期蛋白A2-CDK2活动是自我维持的由于一个积极的反馈回路(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba),尽管是一致的占主导地位的前馈回路(图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)。然而,这个信号如何架构,而不是一个只有一个反馈回路,能产生明显的不可逆的细胞周期的承诺通常与R-point现象有关尚不清楚。为了解决这个问题,我们使用了一个数学模型由姚明et al。gydF4y2Ba8 gydF4y2Ba后,这表明不可逆性的提议CDK2-Rb循环促分裂原删除(图。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba后),适应模型前馈通路有丝分裂原删除(图。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)。产生的稳态水平的CDK2反馈回路模型随着时间的推移仍持续高促分裂原信号损失后,不符合我们的实验观察(图。gydF4y2Ba4 c, egydF4y2Ba)。然而,CDK2活动产生的前馈通路仍处于高位时细胞通常会进入有丝分裂(无花果。gydF4y2Ba4 d, egydF4y2Ba),但在稳定状态,相应的退出细胞周期中值时间,CDK2活动很低(图。gydF4y2Ba4 d, egydF4y2Ba)。因此,前馈信号通路匹配我们的实验观察,CDK2在post-R细胞活动是可逆的。缺乏真正的不可逆性CDK2激活挑战教科书模型,即磁滞CDK2活动对有丝分裂原信号是不可逆的细胞周期在R点的承诺。检测滞后,我们对待不同剂量的预处理和post-R细胞MEKi和测量细胞的分数高CDK2活动在治疗后在不同的时间。CDK2活动展示缺乏滞后对有丝分裂原信号在R点,我们观察到pre-R和post-R细胞失去了在同一剂量的MEKi CDK2活动如果有足够的时间达到稳定状态(图。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)。这些结果同意竞争时钟模型,认为不可逆损失后对细胞周期有丝分裂原信号只有被观察到以前因为之前一个细胞进入有丝分裂分子信号通路驾驶CDK2活动达到一个稳定状态,部队退出细胞周期。换句话说,R-point现象观察,因为在大多数细胞,细胞周期蛋白的半衰期A2蛋白质后允许CDK2活动持续亏损的有丝分裂原信号需要的时间也要超过一个细胞进入有丝分裂。这个修正模型的细胞周期的承诺意味着没有单点当细胞不可逆转地提交由单个分子扩散,可以定义事件,但它是由有丝分裂细胞的接近以及细胞周期蛋白A2蛋白质的水平,当有丝分裂原信号丢失(无花果。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba,信号通路的教科书模型显示,细胞周期蛋白A2水平和CDK2活动可以不断维护独立的有丝分裂原信号由于提出CDK2-Rb反馈循环。gydF4y2BabgydF4y2Ba,修改后的模型显示一个前馈信号通路有丝分裂原连续信号保持细胞周期蛋白A2和CDK2在post-R细胞活动。gydF4y2BacgydF4y2Ba,输出反馈回路模型的数学模型gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba经过有丝分裂原。细胞周期素A2和CDK2活动水平居高不下。gydF4y2BadgydF4y2Ba,输出前馈通路模型的数学模型gydF4y2BabgydF4y2Ba经过有丝分裂原。细胞周期素A2水平和CDK2活动时出现不可逆的细胞进入有丝分裂,尽管他们最终达到一个稳定状态的零,解释为什么细胞退出细胞周期。gydF4y2BaegydF4y2BaCDK2活动水平和post-R细胞对有丝分裂原的浓度反馈回路模型(顶面板)和前馈通路模型(中间面板)在指定时间后模拟的有丝分裂原的变化。观察(底板)剂量反应关系CDK2活动和MEKi显示了预处理和post-R细胞浓度。CDK2活动评估MEKi治疗后在《纽约时报》表示。有丝分裂使用CDK1i受阻。误差是s.e.m.gydF4y2BangydF4y2Ba= 2复制。gydF4y2BafgydF4y2BaMCF-10A细胞在有丝分裂原的缺席,有丝分裂和细胞周期退出之间的竞争决定着细胞的命运由于前馈回路调节细胞周期蛋白A2。细胞大于大约15 h远离当时的有丝分裂分裂素信号阻塞(电池1)将失去细胞周期蛋白A2和退出,而细胞沿着有丝分裂细胞周期细胞(2)将达到之前将失去细胞周期蛋白A2和分裂成两个子细胞。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
在这里,我们使用高通量单细胞成像和跟踪研究促分裂原信号的损失如何影响在post-R细胞细胞周期的承诺。我们发现异常细胞的主要预测其行为与R-point模型,所有post-R细胞将使其有丝分裂和分裂即使没有促分裂原信号(图。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)。值得注意的是,这些异常细胞中发现大量的先前的研究gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,但他们的矛盾的行为很大程度上是无法解释的。在我们试图理解为什么这些post-R细胞退出细胞周期,而不是分裂,我们发现任何post-R细胞有丝分裂的时间距离当时的促分裂原去除预测是否会退出细胞周期或有丝分裂和分裂。随后,通过阻止有丝分裂细胞中剥夺了有丝分裂原信号,我们发现CDK2在所有细胞活动和Rb磷酸化是可逆的。我们可以观察这种可逆性CDK2活动和细胞周期的承诺因为通过阻止细胞进行有丝分裂,分子信号通路驾驶CDK2活动被允许足够的时间达到稳定状态。先前的研究未能观察到这种可逆性,因为细胞被允许进入有丝分裂前CDK2活动达到稳定状态,阻碍了细胞周期的观察退出post-R细胞。我们研究还发现了一个意想不到的角色CDK4/6 S和G2阶段通过维持细胞周期蛋白A2转录在整个细胞周期,这意味着小分子CDK4/6阶段可能是有效的细胞周期G1期之外,特别是结合传统化疗延长有丝分裂时钟通过诱导DNA损伤和触发细胞周期检查点。gydF4y2Ba
使用遗传、生物化学和药理学方法以及数学模型,我们发现信号通路连接有丝分裂原信号与CDK2活动主要是由一个前馈回路而不是包含一个占主导地位的正反馈循环。这个信号结构路径包含超灵敏的信号节点,使系统双稳态开关,但缺乏一个占主导地位的正反馈循环意味着系统仍然是可逆的。我们也不能排除额外的存在正反馈循环信号通路参与自相似的信号系统,如控制G2 / M的过渡,也被发现含有正反馈循环仍然是可逆的gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba。然而,我们的数据表明,占主导地位的架构包含一个前馈信号循环,导致缺乏滞后。鉴于这两个相互竞争的命运(有丝分裂和细胞周期退出)是相互排斥的,可能有一个双重否定反馈回路的这些细胞命运的决定,确保一次电池出口,这使得它不可能进行有丝分裂,反之亦然。我们的研究结果提供了一个简单的解释为什么先前R-point现象被观察和带我们到一个新的模型,细胞周期的承诺,不包含一个决策点。这个模型的有丝分裂和细胞周期退出之间的竞争可以解释所有细胞的行为,包括异常细胞的明显矛盾的行为观察和在先前的研究gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
我们的结果表明,相互排斥竞争细胞命运(有丝分裂和细胞周期退出)加上细胞状态的变化(分裂或退出细胞周期)可以作为不可逆转的命运的转变。更普遍的是,时间任意两个相互排斥的命运之间的竞争可以利用细胞的细胞在其他环境决策gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba:例如,决定增殖或分化之间或有丝分裂和细胞凋亡之间的决定。因此,我们的研究结果可能会影响决策以外的细胞周期调控和细胞可能是一个更一般的主题,支撑着其他细胞的决策。gydF4y2Ba
报告总结gydF4y2Ba
进一步研究信息设计是可用的gydF4y2Ba自然投资组合报告总结gydF4y2Ba与这篇文章有关。gydF4y2Ba
数据可用性gydF4y2Ba
源数据gydF4y2Ba本文提供的。在生成的数据集和/或分析在当前研究也可以从相应的作者以合理的要求。所有数据支持本研究的发现可以从相应的作者以合理的要求。gydF4y2Ba
代码的可用性gydF4y2Ba
所有原始代码上gydF4y2Bahttps://github.com/scappell/Cell_trackinggydF4y2Ba并公开。gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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确认gydF4y2Ba
我们感谢a Lindqvist U2OS CycA2-eYFP细胞系;的h . Hochegger RPE-1 CCNA2gydF4y2BaddgydF4y2Ba细胞系;c . Cataisson Carofino和h . Al Khamici技术支持;g . Altan-Bonnet和s r·柯林斯的有用的讨论和批判阅读手稿。我们感谢流式细胞术的核心设施国家癌症研究所癌症研究中心实验室的技术支持和全体成员S.D.C.有用的意见和支持。这项研究受到了欧洲分子生物学组织交流(ALTF 247 - 2022)和美国国立卫生研究院的校内研究项目S.D.C.齐亚(公元前011830年)。gydF4y2Ba
作者信息gydF4y2Ba
作者和联系gydF4y2Ba
贡献gydF4y2Ba
J.A.C. S.D.C.项目构思和设计实验。J.A.C.,交流,M.M.A., K.T., R.A. and S.D.C. performed all experiments and analysed data. J.A.C. performed all the live-cell imaging, RT-PCR and IF experiments and the Monte Carlo simulations. J.A.C. and S.D.C. analysed all of the live-cell imaging data and developed the mathematical model. K.T. and R.A. performed all of the siRNA validation western blots. A.C. performed all the immunoprecipitation experiments, and A.C. and K.T. performed phosphopocket protein time course western blots. M.M.A. performed the senescence-associated β-galactosidase staining and image analysis. J.A.C. and S.D.C. wrote the manuscript with help from A.C. and M.M.A. S.D.C. supervised and funded the project.
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自然gydF4y2Ba感谢匿名审稿人(s)为他们的贡献的同行评审工作。gydF4y2Ba同行审查报告gydF4y2Ba是可用的。gydF4y2Ba
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出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然保持中立在发表关于司法主权地图和所属机构。gydF4y2Ba
扩展数据数据和表gydF4y2Ba
扩展数据图1不同细胞类型在S / G2依赖于有丝分裂原。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba,损失的影响有丝分裂原信号Rb磷酸化和DNA含量在不同细胞类型:MCF7,改变了乳腺上皮细胞;U2OS,改变了骨肉瘤细胞;RPE-1,非转换hTERT-immortalized视网膜色素上皮细胞;HLF主要人肺成纤维细胞;MCF-10A,非转换乳腺上皮细胞。直方图显示DNA含量为每一个治疗(上)。散点图的Rb磷酸化和DNA含量为每个治疗(底部)。粉红色的盒子马克G0-like状态(hypo-phosphorylated Rb和4 n DNA内容)。所有治疗都是48小时。N = 2000细胞是策划/条件。gydF4y2BabgydF4y2Ba,每个条件G0-like细胞的百分比(a)表示。误差线扫描电镜从至少n = 3生物复制。使用一个单向方差分析假定值计算。从上到下假定值;MCF7: 2.79×10gydF4y2Ba−2gydF4y2Ba,0.32,0.1,U2OS: 1.1×10gydF4y2Ba−2gydF4y2Ba,0.78,0.12,RPE-1: 1.1×10gydF4y2Ba−2gydF4y2Ba,8×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba,2.2×10gydF4y2Ba−3gydF4y2Ba,HLF: 2.3×10gydF4y2Ba−3gydF4y2Ba,8.3×10gydF4y2Ba−2gydF4y2Ba,6.4×10gydF4y2Ba−3gydF4y2Ba,p21 MCF-10AgydF4y2Ba−−/gydF4y2Basip27: 3×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba5×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba,p21 MCF-10AgydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba:< 1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba,< 1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba,< 1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba。gydF4y2BacgydF4y2Ba使用核,免疫印迹的验证p27击倒。代表图像(n = 2独立实验。gydF4y2Ba
扩展数据图2 CDK2和APC / C活动以活细胞。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba示意图的荧光生物传感器用于CDK2活动(左)和APC / C活动(右)。传感器的工作原理的详细描述中可以找到gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba。gydF4y2BabgydF4y2Ba,例如单细胞跟踪显示CDK2(上)和APC / C(底部)活动之前和之后DMSO溶液治疗。垂直灰色线表明相变和绿色栏显示地区我们认为细胞post-Restriction点(Post-R)。生活动的痕迹(左)(右)转换为colormap格式允许成千上万的时间序列分析异步细胞在一个图(参见无花果。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba无花果和扩展数据。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。gydF4y2BacgydF4y2Ba,热图显示CDK2和APC / C对齐为三个成千上万的细胞有丝分裂活动视为表示。麻省理工学院,有丝分裂原。gydF4y2BadgydF4y2Ba细胞作为代表荧光显微镜图像显示为7天,DAPI染色可视化原子核,phospho-Rb,荧光探针检测活动senescence-associatedβ-半乳糖(SA-βgal;左)。酒吧是20μm规模。图片是代表细胞从n = 3独立实验。gydF4y2BaegydF4y2Ba直方图显示,DNA含量为每一个治疗(上)。散点图的Rb磷酸化和DNA含量为每个治疗(底部)。每个点代表一个单细胞,彩色基于SA-βgal染色的状态。粉红色的盒子马克G0-like状态(hypho-phosphorylated Rb和4 n DNA内容)。每个情节都包含N > 22000细胞。gydF4y2BafgydF4y2Ba、量化的百分比高SA-βgal染色的细胞,4 n DNA内容,hypo-phosphorylated Rb (e),误差代表扫描电镜从n = 3实验。使用一个单向方差分析假定值计算。假定值从上到下:0.19,9×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba0.68点。gydF4y2Ba
扩展数据图3开始接近s阶段决定细胞命运。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba,热图CDK2活动(上)和APC / C活动(底部)post-R细胞条目按时间排序s阶段治疗。当DMSO溶液处理所有post-R细胞分裂在24小时用黑色/青色点表示。在有丝分裂原去除或MEKi治疗一些细胞分裂(黑色/青色点)和其他失去CDK2活动并退出细胞周期(粉色圆点)。gydF4y2BabgydF4y2Ba,退出细胞周期的概率作为时间的函数S期以来在每个治疗治疗。误差线代表扫描电镜从n = 3实验。gydF4y2Ba一部gydF4y2Ba,退出细胞周期的概率作为时间的函数S期以来在治疗作为MCF7细胞(c)表示,U2OS细胞(d),或RPE-1细胞(e)。从n = 3实验误差代表SEM (c, d)或n = 5实验(e)。gydF4y2Ba
扩展数据图4细胞分裂素信号需要如果有丝分裂受阻。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba,单细胞CDK2活动的痕迹与细胞的治疗对时间视为表示。灰色和粉红色痕迹代表细胞CDK2 > 0.6和CDK2 < 0.6的观察期,分别。N = 200细胞/条件。gydF4y2BabgydF4y2Ba细胞的百分比,退出细胞周期阻断后的有丝分裂时钟CDK1i分裂素结合,即可去除,MEKi或CDK4/6i治疗。误差线代表SEM n = 4实验。使用一个单向方差分析假定值计算。假定值从上到下:< 1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba,< 1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba4×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba。gydF4y2BacgydF4y2Ba直方图显示,赛前退出细胞周期分布,测量从(a)和有丝分裂的赛前分布,测量从无花果。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba。gydF4y2Bad-fgydF4y2Ba,单细胞的痕迹CDK2活动与细胞的治疗对时间视为MCF7细胞(d)中指出,U2OS细胞(e),或者RPE-1细胞(f)。绿色痕迹仍然致力于描述细胞的细胞周期和进入有丝分裂(黑点)。灰色和粉红色痕迹代表细胞CDK2 > 0.6和CDK2 < 0.6的观察期,分别。N = 200细胞/情节,除了DMSO溶液条件(f),其中包含N = 117个细胞。离开,量化细胞退出细胞周期的百分比。误差线代表扫描电镜从n = 3实验。使用一个单向方差分析假定值计算。从上到下假定值;MCF7: < 1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba,1.1×10gydF4y2Ba−2gydF4y2Ba,0.23,U2OS: < 1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba,3×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba,3.1×10gydF4y2Ba−2gydF4y2BaRPE-1: < 1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba,4.7×10gydF4y2Ba−3gydF4y2Ba0.36点。gydF4y2BaggydF4y2BaCDK2活动痕迹对齐时间的治疗p21 MCF-10A表示条件gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba细胞。N = 99, 148, 67,和85个细胞。gydF4y2BahgydF4y2Ba、量化细胞百分比的退出(g)。从n = 3实验误差代表SEM。使用一个单向方差分析假定值计算。假定值从上到下:7.8×10gydF4y2Ba−3gydF4y2Ba,1.7×10gydF4y2Ba−3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
扩展数据图5模拟实验数据匹配的竞争。gydF4y2Ba
一个gydF4y2BaDMSO,单细胞CDK2活动的痕迹,除有丝分裂原,MEKi治疗治疗时间保持一致。绿色痕迹仍然致力于描述细胞的细胞周期和进入有丝分裂(黑点)。粉红色痕迹描述细胞失去CDK2活动(CDK2 < 0.6)和退出细胞周期。N = 232、282和252个细胞。gydF4y2BabgydF4y2Ba,直方图显示S / G2的赛后分布长度(有丝分裂时钟)和赛后分布的时候失去CDK2活动(退出细胞周期时钟)从(a)衡量。每个分布显示平均时间。gydF4y2BacgydF4y2Ba,示意图列出蒙特卡罗算法用于模拟时间有丝分裂和细胞周期退出时钟之间的竞争。gydF4y2BadgydF4y2Ba,退出细胞周期的概率作为时间的函数S期开始以来治疗。误差线代表扫描电镜从n = 4实验。单向方差分析显示无显著影响的S期以来治疗退出细胞周期的概率。P = 0.92。gydF4y2BaegydF4y2Ba,比较观察到的频率退出细胞周期的细胞进入S期的1小时内收到CDK4/6i蒙特卡罗模拟的结果。误差线代表扫描电镜从n = 3实验。假定值计算使用的小动物——一张长有Mann-Whitney U测试。P > 0.99。gydF4y2BafgydF4y2Ba,比较观察细胞细胞周期分布的退出时间1 h内收到CDK4/6i进入S期与蒙特卡罗模拟的结果。中位数乘以每个分布表示。Wilcoxon等级和测试用于测试的统计学意义。不显著(n)。gydF4y2BaggydF4y2Ba,比较观察细胞周期退出的频率作为时间的函数S期以来在治疗与蒙特卡罗模拟的结果。误差线代表扫描电镜从n = 3实验。gydF4y2Bah-jgydF4y2Ba直方图的赛前时间退出细胞周期和有丝分裂MCF7 (h), U2OS(我),和RPE-1 (j)细胞。数据测量从单细胞形式扩展数据图。gydF4y2Ba四德,fgydF4y2Ba。gydF4y2BakmgydF4y2Ba直方图的赛后时间退出细胞周期和有丝分裂MCF7 (k), U2OS (l),或RPE-1 (m)细胞。行代表实验测量分布和固体酒吧代表模拟分布的蒙特卡罗模拟。gydF4y2Ba
扩展数据图6 CDK4/6抑制诱发退出当S / G2拉伸。gydF4y2Ba
a、bgydF4y2Ba在p21 MCF-10AγH2AX染色gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba细胞治疗DMSO,羟基脲(胡),胸苷或neocarzinostatin (nc)表示。nc治疗作为一个积极的控制。20μm规模酒吧。gydF4y2Bac, dgydF4y2Ba,盒子,须显示量化γH2AX核强度(a, b)。蓝线代表总体均值。胡须代表5 - 95gydF4y2BathgydF4y2Ba百分位数。红点表示细胞外的5 - 95gydF4y2BathgydF4y2Ba百分位数。单向方差分析和Kruskal-Wallace被用来测试的统计意义。假定值从上到下为c: < 1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba,< 1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba,< 1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba0.1 > 0.99,0.79。假定值从上到下为d: < 1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba,< 1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba,< 1×10gydF4y2Ba−gydF4y2Ba4 > 0.99、0.03 > 0.99。N = 500细胞/条件。gydF4y2Bae, fgydF4y2Ba直方图显示,S / G2 p21 MCF-10A的长度gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba细胞后瞬态羟基脲(胡)或胸苷治疗。gydF4y2BaggydF4y2Ba,从p21 MCF-10A CDK2活动痕迹gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba细胞排列和胸苷和CDK4/6i治疗时间。有丝分裂的长度增加时钟是上述每一个情节。绿色痕迹表明细胞进入有丝分裂(黑点)和粉红色痕迹表明细胞退出细胞周期(CDK2 < 0.6)。N = 129, 200, 157,或119细胞在每一个条件。N = 130, 200, 158,和120个细胞。gydF4y2BahgydF4y2Ba、量化细胞百分比的胡治疗后退出细胞周期图的痕迹。gydF4y2Ba2 jgydF4y2Ba。误差线代表扫描电镜从n = 3独立实验。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba,p21 MCF-10A的百分比gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba细胞退出细胞周期和胸苷治疗后不同时间的函数S / G2的增加长度。量化误差(g)的痕迹。禁止代表SEM n = 3独立实验。gydF4y2Baj, kgydF4y2BaCDK2活动痕迹与CDK4/6i治疗时间和Wee1i + 4 h脉冲的羟基脲(胡)或在p21 MCF-10A胸苷gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba细胞。绿色痕迹表明细胞进入有丝分裂(黑点)和粉红色痕迹表明细胞退出细胞周期(CDK2 < 0.6)。注意Wee1i救援CDK2活动的下降,对治疗(见图。gydF4y2Ba2 jgydF4y2Ba),但不会干扰细胞退出细胞周期的能力。N = 200细胞。gydF4y2BalgydF4y2Ba、量化细胞的百分比显示治疗后退出到G0-like状态。小动物——一张长有Mann-Whitney U n = 3独立实验的测试显示没有显著的影响Wee1抑制剂对细胞的能力退出G0-like状态的脉冲响应四个小时胡(左)或胸苷(右)。假定值从左到右:0.1,0.2。误差线代表SEM。gydF4y2Ba
扩展数据图7 CDK4/6活动维护CCNA2转录。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba、异步海拉细胞被固定,然后与细胞周期蛋白E1抗体染色。DNA直方图显示内容(上)和细胞周期蛋白E1(右)水平。密度的散点图,细胞周期蛋白E1水平与DNA含量(底部)。N = 63031细胞是策划。gydF4y2BabgydF4y2Ba,Coimmunoprecipitation CDK2在异步细胞或细胞治疗CDK1i过夜然后处理没有CDK4/6i 4小时。代表n = 2的实验。gydF4y2BacgydF4y2Ba用于图,示意图列出实验设计。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7 d, egydF4y2Ba。细胞首先预处理post-R CDK1i丰富的细胞,然后处理CDK4/6i之前固定的,染色,和成像在指定的时间点。gydF4y2BadgydF4y2Ba、密度的散点图(上面一行)和细胞周期蛋白A2水平phospho-Rb水平(底部行)策划反对CDK2活动以单个细胞。垂直虚线红线表示CDK2活动所需的阈值保持Rb磷酸化(CDK2 = 0.6)。水平虚线红线单独的细胞,次于vs hyper-phosphorylated Rb(底下一行)和细胞蛋白质含量高和低细胞周期蛋白A2(上面一行)。N > 1700细胞/阴谋。gydF4y2BaegydF4y2Ba,小提琴和箱形图显示单细胞水平的CCNA2 mRNA puncta(上面一行)和E2F1 mRNA puncta以mRNA的鱼。信使rna puncta水平0小时治疗的规范化。上图:N = 3850, 0人力资源;1579年,2小时;2252年,4小时;2212年,8小时;2316年,10小时;2405年,12小时细胞。底部:N = 2908, 0人力资源;1814年,2小时; 2306, 4 hr; 1843, 8 hr; 2030, 10 hr; 2098, 12 hr cells. The box plots show the median (centre line), interquartile range (box limits), and minimum and maximum values (whiskers).fgydF4y2Ba,存在数据显示mRNA水平正常化与CDK4/6i CDK1i治疗在治疗后2小时,或24小时的有丝分裂原切除是一个积极的控制。误差线代表SD从N = 3复制。代表n = 3的实验。使用一个单向方差分析假定值计算。从上到下假定值;CCNA2: < 1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba,< 1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba、2×10gydF4y2Ba−4gydF4y2BaCCNE1: 0.063, 0.95, 0.063, E2F1: 4×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba,0.86,4×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba。党卫军,血清饥饿。gydF4y2BaggydF4y2Ba,单细胞的痕迹CDK2活动一致的细胞治疗作为表示。灰色和粉红色痕迹代表细胞CDK2 > 0.6和CDK2 < 0.6的观察期,分别。N = 200细胞/阴谋。gydF4y2BahgydF4y2Ba、量化退出细胞周期的细胞的百分比(g)。从n = 3实验误差代表SEM。使用一个单向方差分析假定值计算。假定值从左到右:< 1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba,< 1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba,< 1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba使用核,免疫印迹的验证FoxM1击倒。年代,短曝光;L,长时间的曝光。代表n = 2的实验。gydF4y2Ba
扩展数据图8 p107 / p130抑制CDK2活动后,有丝分裂原的损失。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba,单细胞的痕迹CDK2活动时间的治疗表示条件保持一致。灰色和粉红色痕迹代表细胞CDK2 > 0.6和CDK2 < 0.6的观察期,分别。N > 117细胞/阴谋。gydF4y2BabgydF4y2Ba免疫印迹的验证Rb p107,并使用核p130击倒。代表图像(n = 2实验。gydF4y2BacgydF4y2Ba,存在数据显示mRNA水平正常化CDK1i单独治疗细胞治疗CDK4/6i 2小时。误差线代表SD从N = 4复制siControl (N = 3)。代表n = 3的实验。使用一个单向方差分析假定值计算。假定值从左到右:0.033,0.026,0.26,0.89,0.91。gydF4y2BadgydF4y2Ba,免疫印迹时间进程phospho-p130 (S672)和phospho-Rb S807/811 CDK4/6i治疗后。细胞被预处理的CDK1i 24小时post-R逮捕细胞状态,然后处理DMSO溶液或CDK4/6i表示时间。代表图像(n = 5实验。gydF4y2BaegydF4y2Ba,免疫印迹时间进程显示p107磷酸化CDK4/6i治疗后的损失。箭头表示p107的磷酸化和非磷酸化形式。代表图像(n = 2实验。gydF4y2BafgydF4y2Ba,在细胞治疗免疫印迹时间进程CDK1i然后CDK4/6i, CDK1/2i孤独,或两者兼而有之。gydF4y2BaggydF4y2Ba,Coimmunoprecipitation p107 E2F4在细胞治疗CDK1i过夜然后处理没有CDK4/6i 4小时。上图:IP E2F4抗体。底部:IP p107抗体。代表图像(n = 2实验。gydF4y2BahgydF4y2Ba、免疫印迹E2F4的验证和使用核E2F5击倒。代表n = 2的实验。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba,单细胞的痕迹CDK2活动一致的细胞治疗作为表示。灰色和粉红色痕迹代表细胞CDK2 > 0.6和CDK2 < 0.6的观察期,分别。分别为N = 197和167个细胞。gydF4y2BajgydF4y2Ba、量化退出细胞周期的细胞的百分比(h)。误差代表扫描电镜从n = 4实验。假定值计算使用的小动物——一张长有学生学习任务。P < 1×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
扩展数据图9细胞周期蛋白A2稳定性决定了退出细胞周期的时钟。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba、密度的散点图细胞周期蛋白A2对CDK2活动水平与环己酰亚胺治疗后表示时间点。垂直虚线红线表示CDK2活动所需的阈值保持Rb磷酸化(CDK2 = 0.6)。水平虚线红线单独的细胞蛋白质含量高和低细胞周期蛋白A2(上面一行)。最后一个面板显示细胞周期蛋白A2水平细胞细胞周期蛋白A2处理siRNA建立阈值高和低细胞周期蛋白A2的水平。N > 1300细胞/阴谋。gydF4y2BabgydF4y2Ba、情节的细胞周期蛋白A2低细胞百分比随时间与环己酰亚胺治疗后。误差线代表扫描电镜从n = 3实验。tgydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba表明测量的半衰期。gydF4y2BacgydF4y2Ba、免疫印迹验证使用核的细胞周期蛋白A2击倒。gydF4y2BadgydF4y2Ba,小提琴和箱形图显示单细胞细胞周期蛋白A2-eYFP水平治疗后与不同浓度的核目标细胞周期蛋白A2。红线代表总体均值。从左到右,N = 566, 479, 487, 394个细胞。箱形图显示中值(中线),四分位范围(框限制),最小值和最大值(胡须)。gydF4y2BaegydF4y2Ba,散点图显示时间失去CDK2活动之间的相关性(CDK2 < = 0.6)和细胞周期蛋白A2水平(细胞周期蛋白A2 < = G1细胞周期蛋白A2)的水平。ρ,皮尔森相关系数。N > 396细胞/条件。gydF4y2BafgydF4y2Ba,数据是一个盒子,晶须的情节细胞周期蛋白A2-eYFP水平当时post-R U2OS细胞治疗CDK4/6i在细胞有丝分裂或退出细胞周期。蓝线代表了人口的意思。胡须代表5 - 95gydF4y2BathgydF4y2Ba百分位数。红点表示单细胞异常值超出了5 - 95gydF4y2BathgydF4y2Ba百分位数。曼Whitney U测试用于测试的统计学意义。P = 4.53×10gydF4y2Ba−29gydF4y2Ba。N = 915(有丝分裂)和333(退出细胞周期)细胞。gydF4y2BaggydF4y2Ba,细胞周期的概率退出细胞周期蛋白的功能A2-eYFP CDK4/6i添加时的水平。误差线代表扫描电镜从n = 4实验。gydF4y2BahgydF4y2Ba,经验累积分布intermitotic乘以(左面板)和退出细胞周期时间(右面板)细胞治疗控制核和0.5 nM cyclinA2核。使用双尾柯尔莫哥洛夫斯米尔诺夫检验假定值计算。有丝分裂时钟(P = 9.5×10gydF4y2Ba−3gydF4y2Ba)和退出细胞周期(P = 7.6×10gydF4y2Ba−17gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
扩展数据图10不稳定细胞周期蛋白A2缩短退出细胞周期的时钟。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba的示意图,诱导degron系统用于破坏细胞周期蛋白A2。inducible-degron系统的详细信息,请参阅方法部分。gydF4y2BabgydF4y2Ba直方图的退出细胞周期时间RPE-1 CCNA2gydF4y2BaddgydF4y2Ba细胞治疗CDK4/6i或者CDK4/6i +迪亚。gydF4y2BacgydF4y2Ba,单细胞CDK2活动的痕迹与细胞的治疗对时间视为示RPE-1 CCNA2gydF4y2BaddgydF4y2Ba细胞。绿色痕迹仍然致力于描述细胞的细胞周期和进入有丝分裂(黑点)。灰色和粉红色痕迹代表细胞CDK2 > 0.6和CDK2 < 0.6的观察期,分别。为每个条件下,N = 200个细胞。gydF4y2BadgydF4y2Ba、细胞的命运RPE-1 CCNA2gydF4y2BaddgydF4y2Ba细胞(c)扔进垃圾箱的时候因为CDK2活动超过0.7时,药物补充道。代表独立实验数据从n = 2。gydF4y2BaegydF4y2Ba以来,单个细胞散点图比较CDK2活动超过0.7时添加药物是与时间治疗后细胞有丝分裂。单组分上面显示直方图和向右。实线代表平均为每个条件表示。DMSO, N = 280;CDK4/6i N = 126;CDK4/6i + DIA, N = 26细胞。gydF4y2BafgydF4y2Ba,左:CDK4/6抑制剂治疗,细胞S期的开始,因此远离有丝分裂细胞(1),更有可能退出细胞周期,而有丝分裂细胞接近(细胞2和3)更有可能达到有丝分裂。右:不稳定细胞周期蛋白A2与DIA缩短了治疗细胞细胞周期退出时钟,这意味着,相对于细胞没有DIA,接近有丝分裂细胞(2)当CDK4/6抑制剂添加更有可能退出细胞周期。gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充的方法gydF4y2Ba
方法部分。gydF4y2Ba
补充图1gydF4y2Ba
所有原始西部的屁股。gydF4y2Ba
补充视频1gydF4y2Ba
一个细胞通过细胞周期进展。MCF-10A细胞表达APC / C和CDK2记者以及H2B-mTurquoise。细胞原像,然后处理DMSO在S / G2期虚线所示。白色箭头标志着细胞感兴趣的剪裁留在视场的中心。额外的箭头显示为女儿和孙女细胞出现在每一个后续的有丝分裂。APC / C和CDK2活动痕迹的相应的细胞所示的图像。图像框是60μm×60μm。gydF4y2Ba
补充视频2gydF4y2Ba
单个细胞治疗CDK4/6i行为根据限制点模型。MCF-10A细胞表达APC / C和CDK2记者以及H2B-mTurquoise。细胞是原像,然后处理CDK4/6i在S / G2期虚线所示。感兴趣的白色箭头标记细胞出现继续的中心视野。一个额外的箭头出现在细胞有丝分裂,两个子细胞出现。APC / C和CDK2活动痕迹的相应的细胞所示的图像。图像框是40μm×40μm。gydF4y2Ba
补充视频3gydF4y2Ba
单个细胞治疗CDK4/6i表现矛盾的限制点模型。MCF-10A细胞表达APC / C和CDK2记者以及H2B-mTurquoise。细胞是原像,然后处理CDK4/6i在S / G2期虚线所示。感兴趣的白色箭头标记细胞出现继续的中心视野。APC / C和CDK2活动痕迹的相应细胞的图片所示。细胞失去CDK2活动和APC / C重新激活不经过有丝分裂。图像框是40μm×40μm。gydF4y2Ba
补充视频4gydF4y2Ba
一个MCF7细胞治疗CDK4/6i表现矛盾的限制点模型。MCF7细胞表达APC / C和CDK2记者以及H2B-mTurquoise。细胞是原像,然后处理CDK4/6i在S / G2期虚线所示。感兴趣的白色箭头标记细胞出现继续的中心视野。APC / C和CDK2活动痕迹的相应细胞的图片所示。细胞失去CDK2活动和APC / C重新激活不经过有丝分裂。图像框是40μm×40μm。gydF4y2Ba
补充视频5gydF4y2Ba
一个U2OS细胞治疗CDK4/6i表现矛盾的限制点模型。U2OS细胞表达APC / C和CDK2记者以及H2B-mTurquoise。细胞是原像,然后处理CDK4/6i在S / G2期虚线所示。感兴趣的白色箭头标记细胞出现继续的中心视野。APC / C和CDK2活动痕迹的相应细胞的图片所示。细胞失去CDK2活动和APC / C重新激活不经过有丝分裂。图像框是40μm×40μm。gydF4y2Ba
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康威尔,正当Crncec,。,Afifi, M.M.et al。gydF4y2Ba损失的S / G2期CDK4/6活动会导致细胞周期逆转。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba(2023)。https://doi.org/10.1038/s41586 - 023 - 06274 - 3gydF4y2Ba
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DOIgydF4y2Ba:gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/s41586 - 023 - 06274 - 3gydF4y2Ba
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