最小的细胞的进化gydF4y2Ba

基因组的复杂性反映基因的数量,它包含一个量变化的数量级在生命之树。而一些专性共生细菌有少于200个蛋白编码基因,许多植物和动物的基因组包含超过20000个基因gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}。原则上,最简单的有机体是一个只拥有最小数量的基因在一个给定的环境中生存和繁殖。任何这样的有机体可能致命的突变破坏一个或多个细胞功能,将限制进化,揭示的事实至关重要的蛋白质变化更慢比由可有可无的编码基因gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}。此外,生物与简化基因组目标的积极的选择可以较少,因此限制适应的机会。gydF4y2Ba

细胞是生命的最简单的独立的功能单元。然而,即使吹捧的温顺的单细胞生物模型是复杂的,拥有成千上万的基因和蛋白质,其中许多仍无特征甚至经过几十年的深入调查。追求最简单的生物辅助了合成生物学的进步,其中包括重新设计或新颖的生物部件和模块的建设gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba}。合成生物学提供了一个平台来开发强大的简单的情况下通过简化模型,即非从一个有机体的基因组序列gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba}。这些策略的指导下,最小的细胞是由一个基因组只包含最小的一组基因自治所需细胞的生活gydF4y2Ba^{3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}。尽管这些努力成功的实验确定的基因要求基本的细胞过程,如新陈代谢和细胞分裂,目前尚不清楚一个最小的细胞如何将如何应对进化的力量。一方面,进化的一个最小的细胞可能是受到自然选择的有限的原材料可以操作。另一方面,合成简化基因组可能导致一个高度破坏,改变蛋白质相互作用和扩大机会适应新的细胞环境。gydF4y2Ba

获得洞察进化的动力和结果在一个最小的细胞,我们对菌株进行了大量实验gydF4y2Bam . mycoidesgydF4y2Ba^{3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba},这是属于柔膜细菌的细菌。最小的细胞(JCVI-syn3B)综合构建基因组包含基因中找到相应的一个子集non-minimal应变(jcvi - syn1.0)。从901年到493年通过减少染色体基因,JCVI-syn3B最小基因组的任何生物能够生长在纯实验室文化gydF4y2Ba^{3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}。与这两个菌株,我们首先研究基因组streamlining-which是否包括两个DNA复制基因的去除、八function-altered不明的DNA修复基因与其他基因新突变的速率和频谱最小细胞相对于non-minimal生物条件下轻松的选择。第二,了解突变的输入,我们评估基因组最小化是否改变了速度和机制的进化自然选择,使用全基因组测序,衡量估计人口健康和表型细胞大小的变化。gydF4y2Ba

通过串行阻塞放松的选择下,我们进行了突变积累实验的人群gydF4y2Bam . mycoidesgydF4y2Ba(gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)。每个核苷酸突变的数量每一代non-minimal细胞(3.13±0.12×10gydF4y2Ba^{−8gydF4y2Ba},意味着±s.e.m)是不可区分的最小细胞(3.25±0.16×10gydF4y2Ba^{−8gydF4y2Ba})(gydF4y2BatgydF4y2Ba_{140年gydF4y2Ba}= 0.43,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.667;无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。这些变异率最高的记录,对任何一个细胞的生物体,符合其他报告中较小的生物基因组变异率较高gydF4y2Ba^{17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba}。值得注意的是,突变率没有受到基因组最小化,包括消除基因复制保真度(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。也许这是由于这一事实gydF4y2Bam . mycoidesgydF4y2Ba已经有一个突变速率升高。评估我们的研究结果的普遍性,基因组最小化的影响应该调查微生物内在突变率较低。在任何情况下,我们的数据是一致的预测从drift-barrier假说。这一理论假定,变异率向下发展,直到另一个增量的选择优势减少变异率足够小有效中性和抵消遗传漂变gydF4y2Ba^{19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba}。换句话说,人口较低有效种群大小(gydF4y2BaNgydF4y2Ba_egydF4y2Ba)经验强的漂移,因此进化变异率较高gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba。值得注意的是,野生型gydF4y2Bam . mycoidesgydF4y2Ba是一种专性病原体和基因组特征(小基因组大小和GC含量低)与它有一个低一致gydF4y2BaNgydF4y2Ba_egydF4y2Ba^{17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba}。注意,变异积累的研究通常是用来估计的速度和谱可行的突变。通过消除冗余,基因组简化可能会改变强烈有害或致命的突变的贡献不会被捕获在我们的研究中。gydF4y2Ba

虽然基因的突变率是健壮的精简,突变的类型出现在人口仍然可以影响进化。总的来说,突变的构成类型(插入、删除和单核苷酸突变(需求)是不受基因组最小化(gydF4y2BaχgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba= 4.16,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.125;无花果。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。然而,需求的构成,构成最大的变异(88%),类别之间的差异最小,non-minimal细胞(蒙特卡洛gydF4y2BaχgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 69.9,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 1.0×10gydF4y2Ba^{−4gydF4y2Ba})。对两种细胞类型,从G或C核苷酸突变或T核苷酸突变发生在更高的速度与相反的方向,也就是说,从一个或T G和C(无花果。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba;non-minimal细胞,gydF4y2BaχgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba= 3736,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 2.2×10gydF4y2Ba^{−16gydF4y2Ba};最小的细胞,gydF4y2BaχgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba= 1444,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 2.2×10gydF4y2Ba^{−16gydF4y2Ba})。这个的大小:T偏差是影响基因组精简(gydF4y2BaχgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba= 21.8,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 3.08×10gydF4y2Ba^{−6gydF4y2Ba};无花果。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)导致30倍的偏见non-minimal细胞和最小的细胞100倍的偏见。这种差异可能是由于删除gydF4y2Ba)gydF4y2Ba,其中一个基因的蛋白质产品将misincorporated尿嘧啶,否则会导致C-to-T突变gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba。删除从最小的细胞的基因组应该提升:突变偏差相对于non-minimal T细胞观察。gydF4y2Ba

变异率约3×10gydF4y2Ba^{−8gydF4y2Ba}每一代每核苷酸和人口规模超过10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba个人,将达到了一个新的突变基因组中每个核苷酸250倍在2000代的进化实验。因此,无论是细胞类型将是有限的可用性燃料适应性的遗传变异。任何差异在两个菌株的方式适应应该由改变基因组合成简化创建的内容。gydF4y2Ba

研究自然选择,我们通过复制的数量gydF4y2Bam . mycoidesgydF4y2Ba2000代(gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba),期间快速适应经常被观察到gydF4y2Ba^{24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba}。然后测量健身,一种基因型的后代子孙后代的贡献,使用两种方法gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba。首先,我们量化的最大增长率(gydF4y2BaµgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}每个复制的)人口每65 - 130代(gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)。我们证明,基因组简化导致减少了57%gydF4y2BaµgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba},但是这种程度的健身随后线性增加,在可比率最小单元(1.71×10gydF4y2Ba^{−5gydF4y2Ba}±4.53×10gydF4y2Ba^{−6gydF4y2Ba}每一天每一代)和non-minimal细胞(1.03×10gydF4y2Ba^{−5gydF4y2Ba}±4.53×10gydF4y2Ba^{−6gydF4y2Ba}每天每一代)在进化实验。利用广义线性混合模型的预测值,gydF4y2BaµgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}non-minimal和最小的细胞增加了17 - 68%的实验(扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。其次,我们使用面对面的竞争分析测量相对健康的祖先(第0代)和大多数进化(代2000)人口(gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)。祖先的菌株,我们确定基因组最小化导致健康下降53%(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),与估计基于持平gydF4y2BaµgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}。尽管这个主要的初始成本,最小的细胞迅速恢复了健康。事实上,健康的竞争估计表明,最小的细胞适应39%速度高于non-minimal细胞(gydF4y2BatgydF4y2Ba=−2.530,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.032)。与我们的实验设计,提供的力量进化最小平均相对健康的细胞(0.998)在统计学上没有区别的(gydF4y2BatgydF4y2Ba=−0.055,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.957)的祖先non-minimal细胞(1.00)。有鉴于此,我们认为有效的健身了基因组简化恢复在300天的连续使(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。我们的研究结果表明,流线型gydF4y2Bam . mycoidesgydF4y2Ba基因不是天生残疾,可以执行以及non-minimized readaptation后细胞。gydF4y2Ba

健身动力学的基础上,我们得出结论,适应并不是受制于基因组最小化。这个解释是由于人口基因组测序的结果(gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)。产生的相对比例的固定的需求(gydF4y2BadgydF4y2Ba_NgydF4y2Ba/gydF4y2BadgydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba}两个细胞类型(之间)是相似的gydF4y2BatgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba= 0.81,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.488;扩展的数据图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),符合解释分子进化的速度可比尽管几乎所有基因的最小单元是健康的关键gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

使用统计模拟和反向遗传学的组合,我们确定了突变可能导致观察到的模式的适应。首先,我们分析了gene-by-population矩阵产生突变,出现在共享的关键基因在自然选择实验(gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)。这两种细胞类型获得不同的重要基因的突变(置换多元方差分析(PERMANOVA),gydF4y2BaFgydF4y2Ba_7gydF4y2Ba= 4.12,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.029;无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)表明种群进化通过不同的路线。检验这一假说,我们寻找基因,获得了更多的产生,废话和小insertion-deletion (indel)突变比预期的假设下中立(gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)。我们确定了16个non-minimal基因组中的基因和14个潜在目标的最小基因组的积极的选择(扩展数据表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。其次,我们利用反向遗传学实验验证的一个常见的突变类型中观察到两株复制的数量实际上是有益的(扩展数据表gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。使用CRISPR编辑,我们重新创建gydF4y2BaftsZgydF4y2Bac端插入一个无意义突变gydF4y2BaftsZgydF4y2BaE315 *无义突变的祖先基因组最小化和non-minimized菌株(gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)。面对面的竞争与结构分析显示这种推定地适应性突变有显著的影响gydF4y2Ba支原体gydF4y2Ba性能依赖于基因组最小化(双向方差分析(方差分析),gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{1、32gydF4y2Ba}= 7.45,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.010)。突变赋予健身优势non-minimal细胞25%,14%的优势最小的细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

比较分析的基因推定地在积极的选择提供见解的功能后果适应的最小单元。我们假设突变基因与膜相关的运输会适应,因为最小的关键细胞依赖进出口的代谢物和其他生物分子的新陈代谢gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba}。然而,膜运输功能的突变细胞类型(浓缩到一个类似的学位确切概率法,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.934)。相反,我们发现浓缩的边缘信号突变生物合成基因的最小单元(确切概率法,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.090),包括那些参与脂类代谢。具体地说,gydF4y2BafakAgydF4y2Ba和gydF4y2Ba里昂证券(clsA)gydF4y2Ba(扩展数据表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)被认为是必不可少的合成双磷脂酰甘油和其他脂质游离脂肪酸gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba,这是建设的重要细胞膜和细胞分裂的规定。的基因gydF4y2BalgtgydF4y2Ba对膜结构也很重要,编码的蛋白质转移diacylglyceryl半个锚表面脂蛋白脂质双分子层gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba。因此,代谢创新涉及脂质合成和分布对最小可能更重要比增强细胞代谢物的收购已经出现在生长介质。gydF4y2Ba

为了更好地理解进化趋异的模式,我们比较在必要和不必要的基因出现突变,2000代专门non-minimal细胞内。在会计的相对数量必需和非必需的基因,突变的数量没有区别观察这两个基因之间分区(gydF4y2BatgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba= 0.646,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.565;补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。也没有任何可测量的差异gydF4y2BadgydF4y2Ba_NgydF4y2Ba/gydF4y2BadgydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba}必要和不必要的基因(gydF4y2BatgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba= 0.91,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.423;补充图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。基因中推定地积极的选择下,没有证据表明偏向必要或不必要的基因(gydF4y2BaχgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba= 0.377,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.539;扩展的数据表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。我们确定了11个删除non-minimal细胞,十是不必要的位点(补充表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。这些大多是小(1 - 3 bp),但三个删除大(1483、1495和7047个基点)。总之,似乎至关重要的基因没有不成比例的贡献non-minimal细胞的分子进化的,虽然我们不能排除上位必需和非必需基因之间的相互作用导致了新的细胞表型。gydF4y2Ba

单细胞生物的大小是可变的,常常与健身以复杂的方式gydF4y2Ba^{28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba}。在资源丰富的环境中,细胞大小往往与增长率呈正相关,健康最重要的一个组成部分gydF4y2Ba^{24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba}。例如,在第一个2000代的一个典型的长期进化实验gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,细胞体积和健身与此同时增加了50%和30%,分别gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba。虽然增加生长所需的大小可以容纳更多的大分子和分裂,它也能减少细胞的表面体积比,降低了底物扩散效率。鉴于这些反对压力,我们评估如何在复制单元格大小改变人口在进化的过程中。使用扫描电子显微镜,我们表明,基因组优化减少了31%的细胞直径从439±0.01 nm 305±0.01 nm的祖先细胞类型。2000后一代的进化,non-minimal细胞的大小增加了85%,至811±0.02 nm (gydF4y2BatgydF4y2Ba= 3.77,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.005),伴随着增加了十倍,体积比其祖先(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和扩展数据表gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。相比之下,最小的细胞的大小没有明显变化(0.08±0.05海里)在进化过程中(gydF4y2BatgydF4y2Ba= 1.51,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.181;扩展的数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

而细胞大小是一个复杂的multigenic特质,先前的研究认为FtsZ最小细胞形态学的变化gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba。这种蛋白质定位midcell和细胞分裂期间决定了膜的收缩。普遍在不同血统的细菌和古生菌gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba},gydF4y2BaftsZgydF4y2Ba仍然是不必要的,gydF4y2Bam . mycoidesgydF4y2Ba。然而,细胞缺乏gydF4y2BaftsZgydF4y2Ba表现出异常的细胞分裂和形态gydF4y2Ba^{3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba}。因此,连同18其他不必要的基因,gydF4y2BaftsZgydF4y2Ba在JCVI-syn3B帮助保留文化的维护和稳定增长gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba}。在我们的研究中,gydF4y2BaftsZgydF4y2Ba一直变异超过2000代的进化和被确认为目标的积极的选择在最小和non-minimal细胞(扩展数据表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。引入提前终止密码子,就像观察到多个种群进化,可以消除c端地区已知的蛋白质与膜相关的产品,招募FtsZ交互gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba。早期的终止密码子也可以创建一个转录极性效应gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba减少两个相邻下游基因的表达在可能的多顺反子操纵子gydF4y2BaMMSYN1_0521gydF4y2Ba细胞分裂的orthologue蛋白质gydF4y2BasepFgydF4y2Ba和gydF4y2BaMMSYN1_0520gydF4y2Ba、编码氨肽酶、酯酶、脂肪酶、α/β水解酶总科gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba。无论机制,我们表明,突变gydF4y2BaftsZgydF4y2Ba非附加效应导致细胞大小的进化趋异。我们记录gydF4y2BaftsZgydF4y2BaE315 *无义突变有显著的影响gydF4y2Ba支原体gydF4y2Ba细胞大小依赖于基因组最小化(双向方差分析,gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{1241年gydF4y2Ba}= 37.9,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 3.1×10gydF4y2Ba^{−9gydF4y2Ba})。non-minimal细胞的突变导致细胞直径(增加25%gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 2.0×10gydF4y2Ba^{−7gydF4y2Ba}),相应增加两倍的细胞体积。相比之下,一样的gydF4y2BaftsZgydF4y2Ba无义突变的最小细胞导致细胞直径(下降19%gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.015;扩展的数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba),细胞体积减少了一半。因此,gydF4y2BaftsZgydF4y2BaE315 *重现近60%的突变进化分歧在细胞大小,表明FtsZ细胞大小的核心作用gydF4y2Bam . mycoidesgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

虽然变化gydF4y2BaftsZgydF4y2Ba有相反的影响最小的大小和non-minimal细胞,这种基因的突变菌株(扩展数据图是有益的。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和扩展数据表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。自适应的考虑之一是快速增长的non-minimal细胞应该出现时富时贫的条件。在连续批处理环境中,重复指数之间的转换和平稳增长阶段可以选择增加细胞的大小gydF4y2Ba^{24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}。观察到的模式也反映了基因组所施加的限制条件简化的能力最小的细胞进化出一种自适应单元尺寸的增加gydF4y2Ba^{29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba}。有超过50%的膜转运蛋白,最小的细胞可能是无法隔离所需的资源建设和维护一个更大的细胞gydF4y2Ba^{3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba}在实验条件下。另外,细胞大小可以进化fitness-neutral副产物的其他特征,如dna复制率gydF4y2Ba^40gydF4y2Ba。例如,两种进化不同大小轨迹相似的选择压力,尽管由于上位性效应等基因组最小化这些演示使用gydF4y2BaftsZgydF4y2Ba^{E315 *gydF4y2Ba}突变体(扩展数据表gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。在任何情况下,我们的研究结果强调细胞如在多细胞生物复杂性的基本特性和单细胞生物alike-evolves的方式依赖于基因组上下文。gydF4y2Ba

我们发现基因、蛋白质和特征是进化的关键性能的综合gydF4y2Bam . mycoidesgydF4y2BaJCVI-syn3B-a细菌最小基因组的任何生物生长在在实验室纯培养。在其原始状态,这工作近似最小细胞显著减少健康。少于500个蛋白编码基因,gydF4y2Bam . mycoidesgydF4y2BaJCVI-syn3B几乎没有冗余当面对突变的异常高的输入。尽管存在这些挑战,减少基因组并没有改变任何基本的细胞资源,干扰的能力发展增加健康。相反,自然选择在扩展实验室增长超过任何有害的影响与合成相关的基因破坏和漂移精简,导致种群最小单元的灭绝。gydF4y2Ba

我们的结果证明合成生物学和工程学的原则可以了解进化生物学和种群遗传学。虽然现在可能与期望的表型,建立基因组进化过程代表了一个强大的但仍不发达生物提纯的方法。例如,快速适应的最小单元选择不同的目标,25%的未知函数的编码蛋白质。未来的研究将进化与合成生物学工具集有可能改善基因鉴定和监管网络的映射,这可能最终被用于优化稳定的生命系统。某种程度的基因组最小化可能是一个共同的生物技术的发展路径。这将是不可取的,如果这种方法复制或修复富达妥协,例如意外的细胞变化可能是由于诱变或其他干扰破坏维护。从工程的角度来看,需要更多的研究来评估其他基因组的最小化替代底盘在不同环境条件下。然而,如果我们假设我们的发现有些将军,看来细胞功能足够强大,能够简化随着时间的推移,使用最小化时是可取的细胞生物技术和bioproduction。gydF4y2Ba

我们的研究结果揭示基因组简化的现象,这在本质上是普遍的,尤其是在致病性和共生微生物与宿主共同进化方面,而且还浮游细菌中,主导全球海洋gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba}。自适应和中性理论得到了发展来解释为什么基因组成为流线型gydF4y2Ba^{42gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba}。很少有研究机械化研究基因组精简如何影响随后的演变,尤其是对于不同系统背景的微生物生活在环境截然不同的领域。尽管可能减少的序列空间轨迹,我们得出结论,精简不限制健身进化和多样化的人群。进化基因组最小化甚至创造机会的开发至关重要的基因,这通常观察到发展更加缓慢gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

品种和生长条件gydF4y2Ba

我们保持合成gydF4y2Bam . mycoidesgydF4y2Bajcvi - syn1.0和合成gydF4y2Bam . mycoidesgydF4y2BaJCVI-syn3B SP4介质与敲除血清替代(Gibco)代替胎牛血清(补充表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。文化的这些non-motile细菌生长在一个黑暗的,静态生长室在37°C。non-minimal jcvi - syn1.0应变被详细描述gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba。最小JVCI-syn3B相同应变合成的先前的研究gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba用以下例外:JVCI-syn3B拥有第二个rRNA操纵子复制,缺乏一个基因(gydF4y2BaMMSYN1_0531gydF4y2Ba19)编码一个蛋白质流出,并添加到最小基因组的基因使细胞更容易使用gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba}(补充表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。压力还包含一个停机坪系统(gydF4y2BacregydF4y2Ba重组酶,gydF4y2BaloxPgydF4y2Ba)促进基因操作。竞争实验用来量化相对健康,我们使用表达mCherry jcvi - syn1.0应变,使我们在混合文化区别于其他菌株利用流式细胞术和也提出任何费用与生产的荧光蛋白(见下文)。gydF4y2Ba

突变积累实验gydF4y2Ba

概述gydF4y2Ba

突变积累(MA)实验旨在减少自然选择的影响通过重复人口发展的瓶颈gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba。当使用的微生物种群,这通常是通过将单一的殖民地,经历了单细胞的瓶颈。马开始实验之前,我们适应jcvi - syn1.0和JCVI-syn3B实验室条件下维持种群SP4液体介质。我们把每个驯化的克隆株马开始实验和传播复制血统(gydF4y2BangydF4y2Ba= 87,gydF4y2BangydF4y2Ba分别为= 57 jcvi - syn1.0和JCVI-syn3B) 20 - 36周转移。gydF4y2Ba

数量的代gydF4y2Ba

比较在复制的变异率,我们都归一化率作为per-generation值。计算的数量每转移在马代,细胞增长SP4琼脂为1周和稀释的样本第七天殖民地为1毫升的磷酸盐(pH值7.4)。细胞被固定的20μl 25%戊二醛和沾2×SYBR绿色,然后计算一个NovoCyte流式细胞分析仪(究其生物科学)。我们使用稀释来计算细胞的数量在原来的殖民地,我们推断出一代又一代的数量(日志gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(gydF4y2BaNgydF4y2Ba),gydF4y2BaNgydF4y2Ba是细胞的数量未稀释的殖民地)必须达到一群发生尺寸gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba,假设每个殖民地都是由一个单一的祖细胞。增长率和其他健身组件可以减少在马实验gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba,我们还测量了每个殖民地的细胞数量在最后的妈,平均在时间点估计几代人的总数。然后我们使用代/转移的数量估计有效种群大小(gydF4y2BaNgydF4y2Ba_egydF4y2Ba使用谐波均值方法)gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba。具体地说,gydF4y2BaNgydF4y2Ba_egydF4y2Ba是近似的调和平均数系列(2gydF4y2Ba^0gydF4y2Ba,2gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba,2gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba2,…gydF4y2Ba^fgydF4y2Ba),gydF4y2BafgydF4y2Ba等于一代又一代的数量/转移从上一步推断。gydF4y2Ba

全基因组测序和序列分析gydF4y2Ba

我们执行提取DNA进化马细胞系使用DNeasy超净微生物工具包(试剂盒)根据制造商的指示,有额外的步骤添加50毫升μl 50毫克gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}溶菌酶改善细胞溶菌作用。基因组DNA测序用Illumina公司MiSeq测序深度至少35×报道。图书馆准备和DNA测序由印第安纳州布卢明顿大学基因和生物信息中心。使用cutadapt全基因组测序读是质量控制gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba削减劣质碱基对和去除残留适配器序列。我们使用breseq使用默认参数gydF4y2Ba^{49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba}使用修剪读取调用突变。我们只考虑固定突变细胞系。我们检查在实验中出现的突变菌株祖先在进化。祖先的突变被分析的所有进化马线来自使用gdtools应变gydF4y2Ba^{49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba}。我们使用了测序数据检查污染或交叉污染进化细胞系。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

比较不同菌株之间的突变速率和频谱,我们使用两个示例gydF4y2BatgydF4y2Ba测试数值响应变量和两个示例gydF4y2BaχgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba测试与连续性校正比较比例。比较比例在应变理论预期,我们用一个示例gydF4y2BaχgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba测试与连续性校正。gydF4y2Ba

自适应进化gydF4y2Ba

概述gydF4y2Ba

与突变积累的实验中,我们进行了实验,允许细菌达到庞大的人口规模增加自然选择的有效性。这涉及到串行使有限的细胞在液体培养基在每个传输瓶颈效应。例如,在我们的实验中,最低数量是2×10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba4×10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba为jcvi - syn1.0 JCVI-syn3B。我们通过复制3毫升液体培养的菌株(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4 /株)在13毫米玻璃试管1% (v / v)串行传输300天每天都在一个黑暗的,静态的孵化器举行37°C。我们计算的数量代每天日志gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba的稀释因子,日志gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba[101],二进制裂变后需要重新生成初始人口规模的1% (v / v)转移gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba。因此,我们估计gydF4y2Ba米gydF4y2Ba。gydF4y2BamycoidesgydF4y2Ba压力保持了1997代,基于其他实验,足够长对于大多数适应发生gydF4y2Ba^{51gydF4y2Ba,gydF4y2Ba52gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

测量健身gydF4y2Ba

首先,我们测量了健身gydF4y2BaµgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}进行生长曲线在孤立的细胞在不同时间点自适应进化实验(补充图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。冻存细胞解冻之前在冰上preculturing在37°C 24 - 72 h 3毫升SP4 13毫米试管中。在开始实验之前,我们调整precultures确保文化的开始时间从不同的进化时间点都在同一发展阶段。约6×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞从浑浊的precultures被接种到复制的96孔板包含200µl SP4媒介。另外,每一个人口在96孔板中孵化24小时BioTek协同H1标,每15分钟记录了吸光度在415海里。这个波长接近酚红的光谱峰值,酸碱指示剂,SP4介质(补充表的一个组成部分gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。之前的研究表明,酚红可以用作代理新陈代谢和增长gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba因为细菌喜欢gydF4y2Bam . mycoidesgydF4y2Ba产生有机酸作为碳水化合物代谢的副产品gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba(补充图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。由此产生的数据,我们使用最大似然估计生长曲线参数使用修改后的龚珀兹方程gydF4y2Ba^54gydF4y2Ba:gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2BalgydF4y2Ba延迟时间(h),gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba是承载能力或收益率(光密度在415海里),gydF4y2BaµgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}的最大增长率(一天gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}),gydF4y2BabgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba是拦截(补充图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和补充表gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

第二,我们测量相对健康的祖先和进化压力与竞争gydF4y2Bam . mycoidesgydF4y2Ba与mCherry jcvi - syn1.0参考应变标签(syn1.0::妇幼保健)gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba。冻存细胞用来制造precultures以类似的方式在生长曲线实验。每个菌株在液体培养基中生长记录阶段,然后标记和未标记的压力同时稀释成一个混合文化的新媒介。我们立即取样无菌文化或混合文化(gydF4y2BatgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba),与20μl冷25%戊二醛固定细胞,培养他们在4°C 20分钟,然后染色样品2×SYBR绿色。经过24小时的增长(gydF4y2BatgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba),混合文化采样并再次以相同的方式处理。适应性进化实验的样品,我们量化每个使用一个光敏电阻应变的丰富二流式细胞分析仪(BD生物科学)印第安纳大学的流式细胞仪核心设施。测量的相对适应性改造gydF4y2BaftsZgydF4y2Ba突变体,我们使用了NovoCyte流式细胞分析仪(究其生物科学)。,同时测量,我们涡样品以防止多个细胞聚集在一起,每一分钟得分为单一事件。纯度是评估在每次使用消极的控制和无菌控制运行。我们检测到每秒1800 - 2700事件,丰度的1×10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba每毫升细胞。结果数据,我们的基础上分化细胞mCherry的表达。使用NovoExpress FACSDiva和FCS表达软件,我们建立了盖茨在non-mCherry-expressing实验菌株的纯培养和syn1.0::妇幼保健参考菌株(补充无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba和gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。为实验菌株,建立了边界控制无菌mCherry-negative只有绿色SYBR荧光阳性细胞。参考应变,建立了边界控制无菌syn1.0::妇幼保健细胞阳性SYBR绿色和mCherry(补充图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。在竞争分析用来量化相对健康,我们应用axenically盖茨样本,建立包含参考应变和实验菌株的混合物。我们获得的比例假阴性mCherry细胞通过应用mCherry-negative门无菌mCherry-expressing细胞;这一比例是用作混合人群的校正因子。相对健康,最后,我们计算的相对丰度的变化感兴趣的应变在24小时期间竞争增长与syn1.0::妇幼保健。具体来说,相对健康和mCherry参考应变gydF4y2BaWgydF4y2Ba_CgydF4y2Ba是gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2BaNgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba代表了最初的大量的实验菌株,gydF4y2BaNgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba丰富的实验菌株24 h后,和gydF4y2BaNgydF4y2Ba_C0gydF4y2Ba和gydF4y2BaNgydF4y2Ba_CfgydF4y2Ba最初和最后的丰度参考菌株(syn1.0:妇幼保健),分别吗gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba。我们标准化的健身价值是相对于原始gydF4y2Bam . mycoidesgydF4y2Bajcvi - syn1.0祖先的压力。换句话说,我们代表健身(gydF4y2BaWgydF4y2Ba),gydF4y2Ba\ \(压裂{{W} _ {C}} {{W} _ {{\ rm {J}} {\ rm {C}} {\ rm {V}} {\ rm{我}}- {\ rm{年代}}{\ rm {y}} {\ rm {n}} 1.0}} \)gydF4y2Ba,在那里gydF4y2BaWgydF4y2Ba_{同时,-syn1.0gydF4y2Ba}的值是gydF4y2BaWgydF4y2Ba_CgydF4y2Ba为gydF4y2Bam . mycoidesgydF4y2Bajcvi - syn1.0。gydF4y2Ba

全基因组测序和序列分析gydF4y2Ba

DNA提取,根据相同的方法进行测序和生物信息学的突变积累实验有一些例外。具体来说,每个复制人口测序深度至少100×覆盖率,和多态突变被包含在我们的分析。作为选择压力的指标,我们使用Jukes-Cantor方法gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba计算一个网站gydF4y2BadgydF4y2Ba_NgydF4y2Ba/gydF4y2BadgydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba}值的基础上产生的数量和同义的需求在每个进化复制人口规范化的产生和同义目标尺寸。我们清点的数量的和产生的重心,在GC,在TA, CG GC, CG助教和CG breseq网站使用gdtools模块,这是一个计算管道从短内容识别突变DNA测序研究gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba。我们接下来结合信息与马的经验突变谱实验占每个六核的不同概率类型,从而计算出的总预期数量的需求产生和同义的网站gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba。观察到的数量的同义词和产生的替换了直接从breseq输出。同义和产生的多态性是包含在观察计数的概率等于映射读取的等位基因频率。我们添加了一个pseudocount 1同义替换的计算gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba因为两个种群的0同义替换。gydF4y2Ba

确定突变可能导致适应,我们寻找基因突变在两个或两个以上的复制为每个基因型人群。相同基因的突变,产生频率和增加在独立血统,表明,突变的崛起可能是由积极的选择gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba。为了验证这个假设,我们统计评估是否multiply-mutated基因(即基因突变在> 1复制发展人口)偶然获得了比预期更突变假设突变是中性的gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba。要做到这一点,我们记录了所有的多态和固定在基因突变,被称为。同义突变被排除在外。然后,我们使用PythongydF4y2Ba^59gydF4y2Ba随机模拟的放置这些突变在所有基因。任何给定的概率接受任何突变基因是身上的基因的长度和GC内容使用已知的G变异率:C核苷酸和:T核苷酸的变异积累实验。我们重复这个突变的随机放置100000倍。在每个仿真中,我们收到的每个基因突变的数量计算,每个固定突变计数增加1和每个多态性计数增加相当于其等位基因频率。每个multiply-mutated基因从真正的适应实验中,我们计算的比例的100000模拟基因收到至少尽可能多的突变被真正的观察和称为这一比例gydF4y2BaPgydF4y2Ba价值。然后,我们使用了Benjamini-Hochberg方法gydF4y2Ba^{60gydF4y2Ba,gydF4y2Ba61年gydF4y2Ba}生成修正gydF4y2BaPgydF4y2Ba值(gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{邻接的gydF4y2Ba})为多个测试帐户设置了错误发现率gydF4y2BaαgydF4y2Ba= 0.05(扩展数据表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。作为一个消极的控制,我们反复模拟只使用同义突变。这个过程返回两种假阳性重要基因,这是小比52重要签名检测产生的,虽然我们也承认,同义的基因分析由于小数量的控制力较弱的同义突变。gydF4y2Ba

一代的gydF4y2BaftsZgydF4y2BaE315 *突变细胞gydF4y2Ba

这个过程需要变异的细菌基因组时酵母着丝粒质粒(YCPs)突变基因的基因组移植紧随其后。YCPs的变异使用轮CRISPR-Cas9和酵母同源重组的修改方法以前变异gydF4y2Bam . mycoidesgydF4y2Ba菌株gydF4y2Ba^{62年gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

CRISPR-Cas9的第一步,是突变的分子裂解和供体DNA组成两侧翼序列基因重组,削减jcvi - syn1.0或JCVI-syn3B YCP,去除部分的基因侧翼基因和所有的目标基因。供体DNA有40 bp重叠基因侧翼目标基因和22日英国石油公司gydF4y2Ba支原体疾病gydF4y2Ba161 CRISPR-Cas9目标序列protospacer相邻主题(PAM) (5′-GTATAAATACATCCAGGAGTGG-3′),其他地区没有同源性jcvi - syn1.0或JCVI-syn3B。的gydF4y2Bam .检gydF4y2Ba的基因组序列将一种新的PAM在第二轮CRISPR-Cas9使用。gydF4y2Ba

第二轮CRISPR-CAS9削减jcvi - syn1.0或JCVI-syn3B YCP新gydF4y2Bam .检gydF4y2BaPAM。伤口YCP当时recircularized使用供体DNA包含所需的点突变。诱变处理区域YCPs PCR扩增和突变被Sanger测序证实。正确的诱变处理jcvi - syn1.0或JCVI-syn3B YCPs被移植到gydF4y2Ba山羊支原体gydF4y2Ba受体细胞之前报道gydF4y2Ba^{3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba59gydF4y2Ba,gydF4y2Ba60gydF4y2Ba,gydF4y2Ba63年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba64年gydF4y2Ba}。诱变处理区域的移植扩增和测序证实存在的菌进行所需的突变。gydF4y2Ba

显微镜和图像分析gydF4y2Ba

扫描电子显微镜(SEM)是用来比较进化种群的细胞大小的变化。所有的数量都是生长在同一批次的中、在相同的条件下在一个孵化器。文化的开始时间调整,达到固定相在同一时间。我们离心机固定相文化和resuspended 1毫升的小球磷酸盐(pH值7.4)。resuspended细胞被添加20μl冷25%戊二醛固定在4°C和孵化20分钟。显微镜观察,固定细胞集中4×离心和再悬浮。离心步骤进行25°C 2000 4分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba。SEM是印第安纳大学布卢明顿电子显微镜中心执行。在PBS固定细胞颗粒状和resuspended 100毫米钠甲次砷酸盐缓冲(pH值7.2)2毫米氯化钙和2%蔗糖。我们用0.1%聚-涂布12-mm-diameter玻璃盖玻片gydF4y2BalgydF4y2Ba赖氨酸为5分钟,之后盖玻片洗了几滴双重蒸馏水。Resuspended细胞被添加到盖玻片表面,可以坚持。5分钟后,盖玻片与100毫米洗两次钠甲次砷酸盐缓冲(pH值7.2)2毫米氯化钙和2%蔗糖。接下来,300µl 2%四氧化锇在100毫米钠甲次砷酸盐缓冲(pH值7.2)与2%蔗糖添加到盖玻片的表面在冰。30分钟后,盖玻片和重蒸馏的水清洗。盖玻片是放入CPD盖玻片持有人(电子显微镜科学,70193 - 01)。样品在分级脱水乙醇系列(30%,50%,70%,90%,95%)在冰。在室温下,盖玻片用100%的乙醇清洗三次。每个脱水步骤持续了2分钟。临界点干燥进行了使用Tousimis Samdri 790临界点干燥机。 The dried coverslips were placed on aluminium SEM stubs and sputter-coated using the Safematic CCU-010 with SP-010 Sputter Head with 45 nm of gold/palladium (80%/20%), which is accurate in the Angstrom range. All of the samples were coated simultaneously to minimize variance among samples. We viewed the samples using the FEI Teneo scanning electron microscope at 2.0 kV, 25 pA probe current and 3.0 mm working distance. The T2 detector was used. We calibrated the measurements using line grating replicas (2,160 lines per mm) with 0.261 μm latex spheres (Electron Microscopy Sciences). We analysed the SEM image data using ImageJ^{65年gydF4y2Ba}。我们使用了直和测量功能结合图像比例尺元数据来测量细胞成像的垂直直径符合以下标准:细胞必须是圆的;细胞必须没有明显的漏洞或穿刺;细胞内必须完全的视野;细胞必须有一个明确的周长;必须没有暗示一个细胞目前或最近经历了二分裂;细胞必须≥0.1μm。每个图像处理从东部开始逆时针。样品是按照随机的顺序进行处理。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

生长曲线的实验中,我们使用一个广义线性混合模型来测试时间的固定效应(代)和细胞类型(最小和non-minimal)在生长曲线参数(gydF4y2BaµgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba},滞后时间、产量),而随机拦截的复制进化种群(补充表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。我们使用分区系数估计方差的贡献复制数量(随机效应)的总变异解释模型(扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,扩展数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,补充无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和补充表gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。为适应进化实验(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba),我们测试假设使用一般线性模型(GLM)减去后的观察每个replicate-evolved人口(2000年一代)从其相应的祖先(第0代)。与截距项排除在外,漠视,测试是否为每个组进化轨迹不同于零。包含的截距项,漠视,测试是否之间的进化轨迹是不同的群体。我们也使用双向方差分析与图基的诚实的显著差异测试来测试假设的影响(最小和non-minimal)和细胞类型gydF4y2BaftsZgydF4y2BaE315 *(野生型与突变体)相对健康和细胞大小。必要时,数据日志gydF4y2Ba_10gydF4y2Ba改变以满足统计假设。gydF4y2Ba

我们比较基因的组合获得突变进化复制人群首先构造一个gene-by-population矩阵。在这里,每一行每一列代表一种进化的人口和代表了至少一个基因突变的人群。矩阵的每一个细胞都充满了总和价值基因的突变发生在人口,价值1固定突变和多态性的等位基因频率相等。只至关重要的基因,之间共享jcvi - syn1.0 JCVI-syn3B,被认为是。我们使用PERMANOVA Bray-Curtis gene-by-population产生的距离矩阵测试细胞类型的意义(最小和non-minimal)成分的变异使用阿多尼斯函数R包素食gydF4y2Ba^{66年gydF4y2Ba}。对于可视化,Bray-Curtis距离被分解为两个维度使用主坐标分析使用cmdscale函数。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

进一步研究信息设计是可用的gydF4y2Ba自然投资组合报告总结gydF4y2Ba与这篇文章有关。gydF4y2Ba