摘要
穿过纳米孔的肽或蛋白质的电流阻断可以用作生物传感器应用中的分子指纹。然而，全长蛋白质的穿线只能通过酶的展开和易位来实现。在这里，我们描述了一种单向的，全长蛋白质通过纳米孔缓慢运输的无酶方法。我们发现，耐化学腐蚀的生物纳米孔、α-溶血素(最窄的部分直径约1.4 nm)和高浓度氯化胍缓冲液的组合，可以在电渗透效应的推动下实现单向、单文件的蛋白质转运。我们发现，平均蛋白质易位速度线性地依赖于施加的电压，易位时间线性地依赖于长度，类似于ssDNA的易位动力学。使用监督机器学习分类器，我们证明了单个易位事件包含足够的信息来区分它们的线程方向和身份，精度大于90%。当基因编码的带电肽尾或DNA标签添加到蛋白质上时，蛋白质的捕获率大大提高。
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数据可用性
本手稿中使用的所有数据可在以下网站下载https://figshare.com/s/5cd39ee415c62a316a6f．
代码的可用性
所有数据解析(不包括DTW和GBC)都使用python -ion包(https://github.com/wanunulab/Pyth-Ion)和数字是用Igor生成的。为了进行分析，使用python -ion中的低通滤波器功能将原始的100 kHz纳米孔电流数据进一步低通滤波至10 kHz。DTW和GBC分析是通过Jupyter笔记本tslearn (v0.5.2)中编写和记录的python脚本进行的。77， SciKit-Learn (v1.0.2)78，以及PyPore的修改版本79纳米孔数据分析库。Jupyter笔记本和相关文件可在GitHub (https://github.com/wanunulab/protein-gd)．中提供了DTW和GBC分析的详细描述附图26-33，附图4 - 7，附注3、4．
参考文献
Shendure, J.等人。40岁时的DNA测序:过去、现在和未来。自然550， 345-353(2017)。
Ameur, A.， Kloosterman, W. P. & Hestand, M. S.单分子测序:面向临床应用。生物科技趋势》。37， 72-85(2019)。
Eid, J.等。来自单个聚合酶分子的实时DNA测序。科学323， 133(2009)。
Venkatesan, b.m. & Bashir, R.用于核酸分析的纳米孔传感器。Nanotechnol Nat。6， 615-624(2011)。
Deamer, D.， Akeson, M. & Branton, D.三十年的纳米孔测序。生物科技Nat。》。34， 518-524(2016)。
史密斯，l.m.等人。蛋白质形态:描述蛋白质复杂性的单一术语。Nat方法。10， 186-187(2013)。
Bogaert, A, Fernandez, E. & Gevaert, K.人类疾病中的n端蛋白质形态。学生物化学的发展趋势。科学。45， 308-320(2020)。
译后修饰与染色质动力学。学生物化学的论文。63， 89-96(2019)。
康尼熊，a.c.破译蛋白质翻译后修饰使用化学生物学工具。化学。4， 674-695(2020)。
MacCoss, M. J, Alfaro, J.， Wanunu, M.， Faivre, D. A. & Slavov, N.通过新兴的单分子和质谱方法对蛋白质组进行采样。预印在arXivhttps://doi.org/10.48550/arXiv.2208.00530(2022)。
用质谱分析单细胞蛋白质。咕咕叫。当今。化学。医学杂志。60， 1-9(2021)。
Specht, H. & Slavov, N.单细胞蛋白质组学的变革机遇。J.蛋白质组。17， 2565-2571(2018)。
斯佩希特，H.等人。使用SCoPE2分析巨噬细胞异质性的单细胞蛋白质组学和转录组学。基因组医学杂志。22， 50(2021)。
Alfaro, J. A.等。单分子蛋白质测序技术的新兴前景。Nat方法。18， 604-617(2021)。
赵阳，等。氨基酸和多肽的单分子光谱识别隧道。Nanotechnol Nat。9， 466-473(2014)。
Kennedy, E.， Dong, Z.， Tennant, C. & Timp, G.阅读0.07 nm蛋白质的一级结构3.分辨率使用亚纳米直径的孔隙。Nanotechnol Nat。11， 968-976(2016)。
斯瓦米纳坦，J.等。齐普托摩尔级混合物中蛋白质的高度平行单分子鉴定。生物科技Nat。》。36， 1076-1082(2018)。
van Ginkel, J.等。单分子肽指纹识别。国家科学院学报115， 3338-3343(2018)。
Restrepo-Pérez, L.， Joo, C. & Dekker, C.为单分子蛋白质测序铺平道路。Nanotechnol Nat。13， 786-796(2018)。
Stefureac, R, Long, Y.-t, Kraatz, H.-B。，Howard, P. & Lee, J. S. Transport of α-helical peptides through α-hemolysin and aerolysin pores.生物化学45， 9172-9179(2006)。
通过纳米孔挤压单个多肽。软物质4， 925-931(2008)。
Rodriguez-Larrea, D. & Bayley, H.纳米孔易位过程中的多步蛋白质展开。Nanotechnol Nat。8， 288-295(2013)。
Rosen, C. B.， Bayley, H. & Rodriguez-Larrea, D.膜共易位蛋白展开的自由能景观。Commun。医学杂志。3.， 160(2020)。
帕耶特，L.等。利用纳米孔在单分子水平探测蛋白质的热展开。肛交。化学。84， 4071-4076(2012)。
Soni, N.， Freundlich, N.， Ohayon, S.， Huttner, D. & Meller, A. sds变性全蛋白通过亚5纳米固态纳米孔的单文件易位动力学。ACS Nano16， 11405-11414(2022)。
Oukhaled, G.等人。通过单个纳米孔记录检测蛋白质的展开和长瞬态构象。理论物理。启。98， 158101(2007)。
Pastoriza-Gallego, M.等人。未折叠蛋白质通过气溶素孔运输的动力学。j。化学。Soc。133， 2923-2931(2011)。
默斯托夫，C.等人。单纳米孔记录检测野生型、突变蛋白展开和相变。ACS化学。医学杂志。7， 652-658(2012)。
Pastoriza-Gallego, M.等人。未折叠蛋白质通过蛋白质纳米孔易位的证据。ACS Nano8， 11350-11360(2014)。
Cressiot, B.等人。蛋白质在高压下通过狭窄的固体纳米孔传输:实验和理论。ACS Nano6， 6236-6243(2012)。
凯瑟，u.f.等人。对固态纳米孔中DNA的直接力测量。Nat。物理。2， 473-477(2006)。
Nivala, J.， Marks, D. B. & Akeson, M.通过α -溶血素纳米孔展开酶介导的蛋白质易位。生物科技Nat。》。31， 247-250(2013)。
Nivala, J.， Mulroney, L.， Li, G.， Schreiber, J. & Akeson, M.使用展开偶联纳米孔区分蛋白质变体。ACS Nano8， 12365-12375(2014)。
Yan, S.等。肽的单分子棘轮运动分枝杆菌smegmatis孔蛋白A (MspA)纳米孔。Nano。21， 6703-6710(2021)。
陈，Z.等。受控运动ssDNA结合肽通过分枝杆菌smegmatisporin A (MspA)纳米孔通过解旋酶马达用于肽测序应用。化学。科学。12， 15750-15756(2021)。
Brinkerhoff, H.， Kang Albert, s.w, Liu J.， Aksimentiev, A. & Dekker, C.利用纳米孔在单氨基酸分辨率下多次重读单个蛋白质。科学374， 1509-1513(2021)。
康X, Alibakhshi M. a . & Wanunu .在电压稳定的脂质双分子层平台上的单锅物种释放和纳米孔检测。Nano。19， 9145-9153(2019)。
于，L.等。在高氯胍浓度下用于蛋白质通道记录的稳定聚合物双层。Biophys。J。120， 1537-1541(2021)。
海恩斯，w。M。CRC化学和物理手册(CRC出版社，2016)。
蛋白质体积和水合作用。欧元。学生物化学j。157， 169-180(1986)。
刘国平，Topping, t.b, Cover, w H. & Randall, L. L.折叠延迟作为抑制输出蛋白前导序列突变的一种可能手段。生物。化学。263， 14790-14793(1988)。
Sheshadri, S.， Lingaraju, g.m.和Varadarajan, R.变性介导的麦芽糖结合蛋白原生和熔融球态的展开伴随着大deltaCp。蛋白质科学。8， 1689-1695(1999)。
Nakane, J.， Akeson, M. & Marziali, A.评价纳米孔作为电子分析物检测的候选。电泳23， 2592-2601(2002)。
Meller, A.， Nivon, L. & Branton, D.电压驱动DNA通过纳米孔易位。理论物理。启。86， 3435-3438(2001)。
梅勒，a . &布兰顿，D. DNA通过纳米孔传输的单分子测量。电泳23， 2583-2591(2002)。
霍恩布洛尔，B.等人。利用纳米孔进行dna -蛋白质复合物的单分子分析。Nat方法。4， 315-317(2007)。
Henrickson, S. E.， Misakian, M.， Robertson, B. & Kasianowicz, J. J.驱动DNA运输进入不对称纳米级孔隙。理论物理。启。85， 3057-3060(2000)。
Mathé， J.， Aksimentiev, A.， Nelson, D. R.， Schulten, K. & Meller, A. α-溶血素膜通道内单链DNA的取向鉴别。国家科学院学报美国102， 12377-12382(2005)。
杨，G.等。T4溶菌酶聚合物的固态合成与机械展开。国家科学院学报美国97， 139(2000)。
Aksimentiev, A. & Schulten, K.用分子动力学成像α-溶血素:离子电导，渗透渗透性和静电电位图。Biophys。J。88， 3745-3761(2005)。
杜娜，P. & Whye, t.y.(主编)。软dtw:时间序列的可微损失函数。第34届国际机器学习会议论文集第70卷，第894-903页(PMLR, 2017)。
拉金，J.等。利用固态纳米孔进行高带宽蛋白质分析。Biophys。J。106， 696-704(2014)。
凌德勇和凌晓生。关于固体纳米孔中DNA易位时间的分布:使用Schrödinger的首次通过时间理论的分析。期刊。提供者。事25， 375102(2013)。
Li, J. & Talaga, D. S.固体纳米孔中DNA易位时间的分布。期刊。提供者。事22， 454129(2010)。
李志强，李志强。单分子蛋白质在固体纳米孔中的展开。j。化学。Soc。131， 9287-9297(2009)。
Pavlenok, M.， Yu, L.， Herrmann, D.， Wanunu, M. & Niederweis, M.单链MspA纳米孔中亚单位化学计量的控制。Biophys。J。https://doi.org/10.1016/j.bpj.2022.01.022(2022)。
Ouldali, H.等人。利用气溶素纳米孔电识别20种蛋白质源性氨基酸。生物科技Nat。》。38， 176-181(2020)。
Versloot, R. C. A.， Straathof, S. A. P.， Stouwie, G.， Tadema, M. J. & Maglia, G. β-Barrel纳米孔具有酸-芳香传感区域，可在低pH值下识别蛋白源肽。ACS Nanohttps://doi.org/10.1021/acsnano.1c11455(2022)。
Versloot, r.c.a等。利用纳米孔定量蛋白质糖基化。Nano。22， 5357-5364(2022)。
黄，G.等。PlyAB纳米孔从血液中检测折叠血红蛋白中的单氨基酸差异。Angew。化学。Int。艾德。61， e202206227(2022)。
Noakes, m.t.等人。利用时变跨膜电压提高纳米孔DNA测序的准确性。生物科技Nat。》。37， 651-656(2019)。
Muthukumar, M.聚合物通过孔的易位。j .化学。理论物理。111， 10371-10374(1999)。
Ammenti, A.， Cecconi, F.， Marini Bettolo Marconi, U. & Vulpiani, A.结构化多肽链通过纳米孔易位的统计模型。期刊。化学。B113， 10348-10356(2009)。
菲利普斯，J. C.等。利用NAMD在CPU和GPU架构上扩展分子动力学。j .化学。理论物理。153， 044130(2020)。
克劳达，J. B.等。CHARMM全原子加性力场对脂类的更新:六种脂类的验证。期刊。化学。B114， 7830-7843(2010)。
Yoo, J. & Aksimentiev, A.老狗的新技巧:通过对非键相互作用的对特异性修正来提高生物分子力场的准确性。理论物理。化学。化学。理论物理。20.， 8432-8449(2018)。
Miyamoto, S. & Kollman, P. A. Settle:用于刚性水模型的SHAKE和RATTLE算法的分析版本。j .第一版。化学。13， 952-962(1992)。
安徒生，H. C.拉特尔:分子动力学计算的振动算法的“速度”版本。j .第一版。理论物理。52， 24-34(1983)。
达顿，T.，约克，D. & Pedersen, L.粒子网格Ewald:一个N⋅大系统中Ewald和的log(N)方法。j .化学。理论物理。98， 10089-10092(1993)。
Jo, S.， Kim, T.， Iyer, V. G. & Im, W. CHARMM- gui: CHARMM基于web的图形用户界面。j .第一版。化学。29， 1859-1865(2008)。
宋，L.等。葡萄球菌α-溶血素的结构，七聚跨膜孔。科学274， 1859-1865(1996)。
乔根森，钱德拉塞卡，J.，马杜拉，J. D.， Impey, R. W. & Klein, M. L.模拟液态水的简单势函数的比较。j .化学。理论物理。79， 926-935(1983)。
马蒂娜，郭杰，托拜厄斯，D. J. &克莱因，M. L.恒压分子动力学算法。j .化学。理论物理。101， 4177-4189(1994)。
段，X. & Quiocho, F. a .非极性相互作用在转运/化学感觉受体与其高极性配体结合中起主导作用的结构证据。生物化学41， 706-712(2002)。
汉弗莱，W.， Dalke, A. & Schulten, K. VMD:视觉分子动力学。J. Mol. Graph。14， 33-38(1996)。
李，H.，罗伯逊，A. D.和詹森，J. H.非常快速的蛋白质pKa值的经验预测和合理化。蛋白质结构。功能。Bioinf。61， 704-721(2005)。
Tavenard, R.等人。Tslearn，时间序列数据的机器学习工具包。j·马赫。学习。Res。21， 1-6(2020)。
Pedregosa, F.等人。Scikit-learn: Python中的机器学习。j·马赫。学习。Res。12， 2825-2830(2011)。
Schreiber, J. & Karplus, K.使用隐马尔可夫模型分析纳米孔数据。生物信息学31， 1897-1903(2015)。
确认
我们感谢C. McCormick对编辑手稿的帮助，以及N. Slavov对蛋白质测序的有益讨论。我们感谢国家卫生研究院拨款HG0011087 (M.W.)和GM115442 (M.C.)，以及国家科学基金会拨款PHY-1430124 (A.A.)。超级计算机时间是通过XSEDE分配拨款(MCA05S028)和德克萨斯州高级计算中心Frontera上的领导资源分配MCB20012提供的。
作者信息
作者及隶属关系
贡献
L.Y.和M.W.构想了这个项目并设计了实验。L.Y.制定了实验方案，进行了实验并分析了蛋白质易位数据。X.K.和L.Y.制作了用于实验的SU-8楔柱芯片。F.L.和M.C.制备并纯化了蛋白质样品。B.M.和A.A.设计并进行了MD模拟。A.M.和A.F.进行了“蛋白质特异性电流信号”(SDTW和GBC)中描述的数据分析，并撰写了手稿的各自部分。J.C.F.进行了dna -蛋白质偶联实验。l.y.， b.m.， A.A.和M.W.撰写了手稿的初稿，所有作者都对其进行了评论和编辑。
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作者声明没有利益竞争。
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关于本文
引用本文
于，L.，康，X.，李，F.。et al。通过纳米孔的全长蛋白质的单向单文件传输。生物科技Nat》(2023)。https://doi.org/10.1038/s41587-022-01598-3
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DOI：https://doi.org/10.1038/s41587-022-01598-3
