摘要gydF4y2Ba
由后剪接外显子产生的环状rna (circRNA)被广泛表达，但由于缺乏足够的方法来区分环状rna和具有重叠外显子的同源信使rna，因此对单个环状rna的功能仍然知之甚少。在这里，我们报道了CRISPR-RfxCas13d通过使用导向RNA靶向跨越RNA环中特征的后剪接结(BSJ)位点的序列，可以有效地区分环状RNA和mrna。使用一个慢病毒文库，该文库针对高表达的人类环状rna BSJ位点的序列，我们表明，一组环状rna主要以细胞类型特异性的方式对细胞生长很重要，一种常见的致癌环状rna，gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2Ba，通过阻止序列相似度为120A的家族的mRNA来促进细胞增殖(gydF4y2BaFAM120AgydF4y2Ba)与翻译抑制剂IGF2BP2结合。RfxCas13d-BSJ-gRNA筛选的进一步应用已被发现gydF4y2BacircMan1a2gydF4y2Ba，对小鼠胚胎着床前发育具有调控潜力。总之，这些结果表明CRISPR-RfxCas13d在个体和大规模水平上都是circrna发现和功能研究的有用工具。gydF4y2Ba
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自定义的Perl和Shell脚本用于cas13d介导的环状rna筛选(CDCscreen)的计算管道，以识别本文中消极选择的功能性环状rnagydF4y2Bahttps://github.com/YangLab/CDCscreengydF4y2Ba．gydF4y2Ba
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确认gydF4y2Ba
感谢陈实验室和杨实验室的讨论。中国科学院(CAS) (XDB19020104)、国家自然科学基金(NSFC)(91940303, 31821004, 31725009)、HHMI国际项目(55008728)资助l - l.c . NSFC(31730111, 31925011,91940306)资助L.Y.;国家自然科学基金(31730062,31821004)和上海市科委(19411951800)资助J.L.;国家自然科学基金委员会(31801073)、中国科学院青年创新促进会资助W. X.;gydF4y2Ba
作者信息gydF4y2Ba
作者及隶属关系gydF4y2Ba
贡献gydF4y2Ba
l。l。c。监督并构思了这个项目。L.-L.C L.Y。学生论文,S.L。X.L W.X.和L.Z.设计实验。在J.L.的监督下，L.Z.在小鼠胚胎中进行circRNA筛选;X.L S.L。,L.-Z.Y S.-M.C, C.-X.L, S.-K.G。l .,分子量,X.T, J.-L.Z, X.G, J.Z. J.W.执行所有其他实验;W.X, y - n.l和l.y进行了计算分析。l - l.c.和L.Y.在s.l.、x.l.、W.X和J.L.的参与下撰写了这篇论文gydF4y2Ba
相应的作者gydF4y2Ba
道德声明gydF4y2Ba
相互竞争的利益gydF4y2Ba
作者声明没有利益竞争。gydF4y2Ba
额外的信息gydF4y2Ba
同行评审信息gydF4y2Ba自然方法gydF4y2Ba感谢匿名审稿人对本工作的同行评议所作的贡献。唐磊是本文的主要编辑，并与编辑团队的其他成员合作管理其编辑过程和同行评审。gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba
扩展数据gydF4y2Ba
图1 RfxCas13d敲除效率和特异性的评价。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， RNAi、shRNA和ASO对circRNA击倒(KD)的策略。gydF4y2BabgydF4y2Ba， CRISPR/Cas9敲除circRNA的策略。上图，基因组编辑用于去除环状rna形成的外显子gydF4y2Ba5gydF4y2Ba；底部，基因组编辑破坏内含子RNA对以阻断环状RNA的表达gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba．gydF4y2BacgydF4y2Ba， Cas13环状rna KD示意图。为每个circRNA (BSJ-gRNAs)设计了3个靶向后剪接结位点(BSJ，红色箭头)的gRNAs。采用qRT-PCR检测环状rna和同源线性mrna的表达。gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba，采用msfGFP荧光法检测Cas13蛋白的表达(gydF4y2BadgydF4y2Ba)及WB (gydF4y2BaegydF4y2Ba)转染48 h后，在293FT细胞中表达。比例尺，200 μm。两个独立实验的结果具有代表性。gydF4y2BafgydF4y2Ba不同Cas13蛋白介导的比较gydF4y2Ba喀斯特gydF4y2Ba两种位置匹配的导联的敲除效率表明，RfxCas13d是最好的效应子gydF4y2Ba14gydF4y2Ba．gydF4y2BaggydF4y2Ba，不同cas13蛋白介导的环状rna KD的评价。N = 63个生物独立样本。数据以平均值±s.d表示。gydF4y2BahgydF4y2Ba， NB确认gydF4y2BacircPOLR2AgydF4y2BaRfxCas13d/BSJ-gRNAs敲除。两个独立实验的结果具有代表性。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，gydF4y2BajgydF4y2Ba， BSJ gRNAs (gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)或RfxCas13d (gydF4y2BajgydF4y2Ba)本身没有影响gydF4y2BacircPOLR2AgydF4y2Ba而且gydF4y2BacircRTN4gydF4y2Ba表达式。gydF4y2BakgydF4y2Ba，部分序列被相邻的线性外显子(gRNA-L)取代的gRNAs导致线性而不是环状RNA KD。上图为gRNA-L的原理图。底部是KD的效率gydF4y2BacircPOLR2AgydF4y2Ba而且gydF4y2BacircRTN4gydF4y2Ba以及相应的线性rna。gydF4y2BalgydF4y2Ba替换原本高效30nt gRNA(蓝条)两侧的10nt (scram/错配)完全阻断了靶mrna上的KD效应。两个30nt有效gRNAs和对应的10(scram/mismatch) + 20nt gRNAs在两个单独的mrna上进行了测试。（gydF4y2Baf i, j, k, lgydF4y2Ba)通过qRT-PCR检测所有rna的表达水平，归一化至gydF4y2BaACTBgydF4y2Ba，均值±标准差均来自三个独立的实验。（gydF4y2Baf, g, j, k, lgydF4y2Ba) *:gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05;* *:gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01;* * *:gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001;Ns，不显著，双尾学生gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2Ba
RfxCas13d是介导circRNA敲低的最佳效应器。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2BaCas13蛋白敲除环状rna的评价(gydF4y2BacircPOLR2AgydF4y2Ba而且gydF4y2BacircRTN4gydF4y2Ba)和它们在HeLa细胞中的同源mrna显示，RfxCas13d是环状rna特异性KD的最佳效应因子。gydF4y2BabgydF4y2Ba， n = 63个生物独立样本，转录水平归一化至ACTB。数据以平均值±s.d表示。gydF4y2BacgydF4y2Ba在HeLa细胞中，RfxCas13d/BSJ-gRNAs特异性地、有力地敲除环状rna，但不敲除它们的同源mrna。gydF4y2BadgydF4y2Ba， rxcas13d对circRNA靶向的错配耐受能力。在间隔序列的不同位置包含单次或双次不匹配的导轨gydF4y2BacircPOLR2AgydF4y2Ba用紫色表示;BSJ场址两侧的基地以红色显示。gydF4y2BaegydF4y2Ba、RfxCas13d对环状rna和同源线性mRNA KD的有效性和特异性。上图为gRNAs靶向示意图gydF4y2BacircPVT1gydF4y2Ba瓷砖10 nt增量远离BSJ网站。下图为每个gRNA和RfxCas13d对circRNA和线性RNA的KD效率。gydF4y2Ba做减法gydF4y2Ba，将23条导线的KD屏均匀地排列在BSJ上gydF4y2BacircHIPK3gydF4y2Ba（gydF4y2BafgydF4y2Ba),gydF4y2BacircRTN4gydF4y2Ba（gydF4y2BaggydF4y2Ba)．BSJ-gRNAs对rfxcas13d介导的KD的位置效应gydF4y2BacircHIPK3gydF4y2Ba（gydF4y2BafgydF4y2Ba),gydF4y2BacircRTN4gydF4y2Ba（gydF4y2BaggydF4y2Ba)在单核苷酸水平。二十三名导游平铺在BSJgydF4y2BacircHIPK3gydF4y2Ba（gydF4y2BafgydF4y2Ba),gydF4y2BacircRTN4gydF4y2Ba（gydF4y2BaggydF4y2Ba)。KD效率gydF4y2BacircHIPK3gydF4y2Ba（gydF4y2BafgydF4y2Ba)或gydF4y2BacircRTN4gydF4y2Ba（gydF4y2BaggydF4y2Ba)和线性gydF4y2BaHIPK3gydF4y2Ba（gydF4y2BafgydF4y2Ba)或线性gydF4y2BaRTN4gydF4y2Ba（gydF4y2BaggydF4y2Ba)，右侧为每个BSJ-gRNA。（gydF4y2Baa, c, d, e, f, ggydF4y2Ba)通过qRT-PCR检测所有rna的表达水平，归一化至gydF4y2BaACTBgydF4y2Ba，均值±标准差均来自三个独立的实验。（gydF4y2Baa, b, cgydF4y2Ba) * *:gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01;* * *:gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001;Ns，不显著，双尾学生gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2Ba
扩展数据图3靶向762个环状rna的BSJ-gRNA文库的特征。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，计算circRNA拷贝数(使用gydF4y2BacircPOLR2AgydF4y2Ba例如H9, HT29, HeLa和293FT细胞。根据FPBcircgydF4y2BacircPOLR2AgydF4y2Ba和其他环状rna在H9, HT29, HeLa和293FT细胞，以及6个拷贝gydF4y2BacircPOLR2AgydF4y2Ba每海拉细胞gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，我们分别计算了所有circrna的拷贝数。的副本gydF4y2BacircPOLR2AgydF4y2Ba列出了每个单元格。gydF4y2BabgydF4y2Ba， H9、HT29、HeLa和293FT细胞中circRNA拷贝数计算示意图。gydF4y2BacgydF4y2Ba762个候选circRNAs的表达，这些候选circRNAs是用不同细胞系的BSJ-gRNAs设计的。gydF4y2BadgydF4y2Ba， 762个候选环状rna(实线)和总环状rna(虚线)的匹配长度分布。密度曲线和饼图显示，762个候选circRNAs中超过80%的circRNAs小于1000nt。gydF4y2BaegydF4y2Ba，构造库的每个gRNA读取数的累积分布。红线表示不到0.2%的grna被少于100次读取覆盖。gydF4y2BafgydF4y2Ba， WB证实Flag-RfxCas13d在用于筛选的HT29、293FT和HeLa细胞中稳定表达。两个独立实验的结果具有代表性。gydF4y2BaggydF4y2Ba， 30天内环状rna的KD效率保持不变。在一系列时间点(第1、10、20、30天)收集RfxCas13d/BSJ-gRNA感染的HT29、293FT和HeLa细胞。通过qRT-PCR检测不同环状rna的KD效率，归一化至gydF4y2BaACTBgydF4y2Ba．平均值±标准差来自三个独立的实验。gydF4y2BahgydF4y2Ba， HT29、293FT和HeLa细胞D1和D30样本重复(代表)之间的Pearson相关系数(PCC)。在每个细胞株的D1和D30分别进行两次生物学上独立的实验。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba， HT29、293FT和HeLa细胞中配对对照和circRNA BSJ-gRNAs在D1和D30样品间的折叠变化散点图。灰色虚线分别表示2倍或0.5倍的变化。gydF4y2Ba
扩展数据图4用于识别对细胞生长重要的负选候选环状rna的管道。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba分析管道通过CDCscreen识别阴性选择的circRNA候选。将每个gRNA的唯一映射reads归一化，并使用两个生物重复的平均归一化reads进行后续分析。gydF4y2BaPgydF4y2Ba通过MAGeCK排列检验计算负选circRNA的值，并从归一化gRNA reads获得D30和D1处理之间针对相同circRNA的负选gRNA的平均折叠变化。仅计算FPBcirc > 0表达的环状rna。最后，CDCscreen评分≥2,FC≤0.667的负选grna≥2的circRNA被鉴定为促进细胞增殖的circRNA候选。gydF4y2BabgydF4y2Ba，在HT29、293FT和HeLa细胞中，通过CDCscreen评分对阴性选择的候选circrna进行排名。CDCscreen评分≥2、≥阴性选择grna且FC≤0.667的circrna按红色虚线分组。在每个细胞系中标记候选环状rna的例子。gydF4y2BacgydF4y2Ba，表中的每一项对应于CDCscreen管道中候选circRNAs计算的每一步，如(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)．gydF4y2BaCircFAM120AgydF4y2Ba为例，所有其他circrna的相关分析均列在补充表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．gydF4y2BadgydF4y2Ba， FC中grna≤0.667的分析，识别出相同的circRNA作为靶基因。显示每个细胞系中FC≤0.667(紫色)的circRNA候选数量、平均总gRNAs和改变的gRNAs。HT29中n = 67个circRNAs, 293FT中n = 62个circRNAs, HeLa中n = 63个circRNAs。数据以平均值±s.d表示。gydF4y2BaegydF4y2Ba对于CDCscreen评分≥2的circRNA候选基因，错误发现率(FDR)小于0.1gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba),gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)屏幕。gydF4y2Ba
图5通过RfxCas13d/BSJ-gRNA系统验证候选circRNAs在细胞增殖中的作用gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，热图显示HT29(紫色)、293FT(橙色)和HeLa(绿色)细胞中候选circRNA的相对KD效率、细胞增殖和折叠变化，其中单个BSJ-gRNA针对每个候选circRNA。gydF4y2Bab, cgydF4y2Ba， KDgydF4y2BacircKLHL8gydF4y2Ba通过RfxCas13d抑制293FT细胞增殖gydF4y2Ba(b)gydF4y2Ba和海拉细胞gydF4y2Ba(c)gydF4y2Ba，由MTT细胞增殖试验(中间图)和由细胞所占表面积计算的细胞融合度(右边图)所示;KD效率显示在左侧面板上。gydF4y2BadgydF4y2Ba， KDgydF4y2BacircHIPK3gydF4y2Ba通过MTT细胞增殖试验(中)和通过细胞所占表面积计算细胞合拢度(右)显示，RfxCas13d抑制了HeLa细胞的细胞增殖;KD效率显示在左边。gydF4y2BaegydF4y2Ba， KDgydF4y2BacircKLHL8gydF4y2Ba通过shRNAs抑制293FT细胞增殖。KD效率显示在左边;右图为MTT细胞增殖试验。gydF4y2BafgydF4y2Ba， KDgydF4y2BacircKLHL8gydF4y2Ba而且gydF4y2BacircHIPK3gydF4y2Ba海拉细胞中的shrna。gydF4y2BaggydF4y2Ba， KDgydF4y2BacircKLHL8gydF4y2Ba或gydF4y2BacircHIPK3gydF4y2BaMTT细胞增殖实验显示，shRNAs抑制了HeLa细胞的增殖。（gydF4y2Baa, b, c, d, e, fgydF4y2Ba)通过qRT-PCR检测所有rna的表达水平，归一化至gydF4y2BaACTBgydF4y2Ba．平均值±标准差来自三个独立的实验。*：gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05;* *:gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01;Ns，不显著，双尾学生gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2Ba
图6对细胞生长具有细胞类型特异性影响的circRNAs的CDCscreen评分分布和表达水平。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，分别在HT29 (n = 59)、293FT (n = 47)和HeLa (n = 53)细胞中对细胞增殖具有细胞类型特异性影响的circRNAs的cdc筛选评分分布。有关盒状图元素的定义，请参阅方法中的“数据可视化”。gydF4y2BabgydF4y2Ba，表达式(由FPBcirc, log显示)gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)所示的环状rna (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)在HT29 (n = 59个circRNAs)， 293FT (n = 47个circRNAs)和HeLa (n = 53个circRNAs)细胞中。有关盒状图元素的定义，请参阅方法中的“数据可视化”。gydF4y2BacgydF4y2Ba．表达式(由FPBcirc, log显示)gydF4y2Ba10gydF4y2Ba) (n = 6)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba在HT29、293FT和HeLa细胞中对细胞增殖具有细胞类型特异性作用。有关盒状图元素的定义，请参阅方法中的“数据可视化”。gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BaCircFAM120AgydF4y2Barxcas13d /BSJ-gRNAs介导的KD抑制了HT29、293FT或HeLa细胞的增殖，细胞融合性实验显示。gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BaCircFAM120AgydF4y2BaHeLa细胞中shrna的KD。采用qRT-PCR检测环状rna和同源线性rna的表达，归一化至gydF4y2BaACTBgydF4y2Ba．gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BaCircFAM120AgydF4y2BaMTT实验显示，shRNAs KD抑制了HeLa细胞的增殖。gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2BaCircFAM120AgydF4y2Ba293FT细胞中shrna的KD。采用qRT-PCR检测环状rna和同源线性rna的表达，归一化至gydF4y2BaACTBgydF4y2Ba．gydF4y2BahgydF4y2Ba，gydF4y2BaCircFAM120AgydF4y2BaMTT实验显示，shRNAs KD抑制了293FT细胞的增殖。（gydF4y2Bad, e, f, g, hgydF4y2Ba)均值±标准差来自三个独立的实验。（gydF4y2Baa, b, d, e, f, g, hgydF4y2Ba) *:gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05;* *:gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01;* * *:gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001;Ns，不显著，双尾学生gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2Ba
图7使用BSJ-gRNA文库针对2908个环状rna进行体内筛选的测序分析概述。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，构建了2908个环状rna的gRNA文库。为每个候选circRNA设计一个配对对照gRNA (n = 2908)和三个bsj -gRNA (circRNA gRNA, n = 8,724)。gydF4y2BabgydF4y2Ba，构造库的每个gRNA读取数的累积分布。红线表示不到1%的grna被少于100次读取覆盖。gydF4y2BacgydF4y2Ba2908个候选环状rna在不同人体组织中的代表gydF4y2Ba41gydF4y2Ba在图书馆中构建。平均而言，在每个组织中含量最高的100个circRNAs中，超过90%的circRNAs被包含在2908个候选circRNAs中。gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba筛选对细胞生长和增殖重要的环状rna。将gRNA慢病毒文库单独送入稳定表达RfxCas13d的HT29细胞。7天后富集感染细胞，皮下注射裸鼠22天。在感染细胞的第1天(D1)和第30天(D30)提取基因组dna，进行gRNA扩增和深度测序。gydF4y2BaegydF4y2Ba， D1和D30重复(代表)之间的Pearson相关系数(PCC)gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2BaHT29样品。在D1和D30进行两次生物学独立实验。gydF4y2BafgydF4y2Ba，配对对照和circRNA bsj - grna在D1至D30之间的折叠变化散点图gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2BaHT29样品。灰色虚线分别表示2倍或0.5倍的变化。gydF4y2BaggydF4y2Ba，分析FC≤0.5的gRNAs，识别出相同的circRNA作为靶基因。环状crna候选数量(n = 79)， FC中平均总gRNAs和改变的gRNAs≤0.5(紫色)gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba屏幕显示。数据以平均值±s.d表示。gydF4y2Ba
图8 rxcas13d /BSJ-gRNA-或shRNA-介导的RNA-seq分析gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2BaKD。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，利用RfxCas13d/BSJ-gRNA-或shRNA-介导的293FT细胞中poly(A) + RNA-seq数据集的两个生物重复的映射统计gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2BaKD。gydF4y2BabgydF4y2Ba，对数的斯皮尔曼秩相关系数热图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(FPKM)在rxcas13d /BSJ-gRNA-或shRNA-介导的RNA-seq文库中检测到的所有线性mrna在靶向复制和非靶向复制之间的值gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2BaKD。gydF4y2BacgydF4y2Ba，日志中的表达式级别gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(FPKM)在非靶向对照的RNA-seq文库中检测到的所有基因的值(x轴)gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2Ba-通过RfxCas13d/BSJ-gRNA(红色)或shRNA(蓝色)靶向条件(y轴)。给出了两个生物重复的平均值。gydF4y2BadgydF4y2Ba，一个工作流显示了之后候选基因的选择gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2Ba通过RfxCas13d/BSJ-gRNA进行KD。gydF4y2BaegydF4y2Ba，之后检测到的deg (n = 97)的热图gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2Ba通过RfxCas13d/BSJ-gRNA进行KD。gydF4y2BafgydF4y2Ba，从RNA-seq富集后的DEGsgydF4y2BacircFAM120AgydF4y2Ba通过RfxCas13d/BSJ-gRNA进行KD。x轴表示给定类别的功能注释中的基因数量除以deg总数的比值。y轴显示了功能注释的类别。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值是根据费雪精确检验计算出来的。gydF4y2BaggydF4y2Ba，之后与细胞增殖相关的DEGs的验证gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2Ba293FT细胞中RfxCas13d/BSJ-gRNA的KD表达。所有转录本都标准化为gydF4y2BaACTBgydF4y2Ba， n = 3个独立实验。* * *:gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001，双尾学生gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BahgydF4y2Ba，细胞质分布gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2Ba．gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，预测ago2结合峰值gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2Ba．上，基因组基因座和线性图gydF4y2BaFAM120AgydF4y2Ba而且gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2Ba(洋红色圆柱所示)。蓝色和洋红色箭头表示线性底漆的位置gydF4y2BaFAM120AgydF4y2Ba或gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2Ba．下图为HEK293FT细胞中通过TargetScan和PAR-CLIP数据中的AGO2结合峰预测的miRNA靶点(GEO:gydF4y2BaGSE43573gydF4y2Ba)．gydF4y2BajgydF4y2Ba，显示潜在环状rna - mirna靶点预测的示意图。gydF4y2BakgydF4y2Ba，gydF4y2BaCircFAM120AgydF4y2Ba在使用抗AGO2抗体的293FT细胞中RIP不与AGO2相互作用。（gydF4y2Bag h, kgydF4y2Ba)所有RNA水平均采用qRT-PCR检测，均数±标准差均来自三个独立的实验。gydF4y2Ba
扩展数据图9gydF4y2BaCircFAM120AgydF4y2Ba以igf2bp2依赖的方式调节其亲本基因翻译，促进细胞增殖。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba， KDgydF4y2BaFAM120AgydF4y2Ba293FT中shRNAs的mRNA表达(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)及HT29 (gydF4y2BacgydF4y2Ba)细胞。gydF4y2BabgydF4y2Ba稳定的KDgydF4y2BaFAM120AgydF4y2Ba293FT细胞中的两个shrna，通过一个WB实验证实。gydF4y2BadgydF4y2Ba， KDgydF4y2BaFAM120AgydF4y2BaMTT实验显示shRNAs mRNA抑制HT29细胞增殖。gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2Ba两种gRNAs的KD降低了HT29细胞中FAM120A蛋白的表达，一种实验的WB证实了这一点;另见三个独立的293FT细胞实验(图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)．gydF4y2BafgydF4y2Ba，多聚体分析中用于分离馏分的蔗糖梯度示意图。轻的部分包含核糖体亚单位和单个核糖体;重质部分含有多核糖体。gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2BaCircFAM120AgydF4y2BaKD导致的分布改变gydF4y2BaFAM120AgydF4y2Ba核糖体上的mRNA。gydF4y2BaFAM120AgydF4y2Ba采用qRT-PCR法检测各组分mRNA含量，归一化至gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba．gydF4y2BahgydF4y2Ba之后，FAM120A蛋白的稳定性保持不变gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2BaKD。使用环己亚胺(CHX)抑制翻译。下面显示了重复测定结果的量化。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，每个细胞IGF2BP2拷贝的绝对定量。三个实验的结果具有代表性。gydF4y2BajgydF4y2Ba，副本gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2Ba,线性gydF4y2BaFAM120AgydF4y2Ba和IGF2BP2蛋白在HT29, 293FT或HeLa细胞。gydF4y2BakgydF4y2Ba， IGF2BP2主要定位于细胞质。左图为IGF2BP2免疫荧光的代表图像。右，每张图像中IGF2BP2信号的统计。N = 14张图片。数据以平均值±s.d表示。gydF4y2BalgydF4y2Ba，绝对副本gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2Ba和线性gydF4y2BaFAM120AgydF4y2Ba与IGF2BP2相关，根据293FT细胞中IGF2BP2 RIP测定计算(图2)。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)．gydF4y2BamngydF4y2Ba， IGF2BP2蛋白的分布，gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaFAM120AgydF4y2Ba293FT细胞多体谱部分mRNA的表达。gydF4y2BaogydF4y2Ba,米gydF4y2Ba6gydF4y2Ba一个提升gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2Ba与IGF2BP2结合gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba，由NB检测。gydF4y2BapgydF4y2Ba,米gydF4y2Ba6gydF4y2Ba增强了的能力gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2Ba与线性竞争gydF4y2BaFAM120AgydF4y2Ba与IGF2BP2结合gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba．Dig-labeled线性gydF4y2BaFAM120AgydF4y2BaNB检测His-IGF2BP2相关蛋白。gydF4y2Ba问gydF4y2BaFAM120A蛋白的表达因IGF2BP2缺失而部分恢复gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2BaKD 293FT细胞，WB显示。（gydF4y2Baa、c、d、g h, m, n, o, p, qgydF4y2Ba)均值±标准差来自三个独立的实验。（gydF4y2Baa、c、d、g o, p, qgydF4y2Ba) *:gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05;* *:gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01，双尾学生gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。（gydF4y2BahgydF4y2Ba，gydF4y2BaO, p, q)gydF4y2Ba统计数据从三个独立的平行实验中量化处理。gydF4y2Ba
图10应用RfxCas13d/gRNA干扰小鼠着床前发育过程中RNA表达。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， KDgydF4y2Ba缺失gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba喀斯特gydF4y2BaRfxCas13d/gRNA在受精卵中的作用。采用qRT-PCR检测mrna表达，归一化至gydF4y2BaActbgydF4y2Ba．gydF4y2BabgydF4y2Ba，微量注射RfxCas13d mRNA和gRNA靶向后96 h囊胚形成减少的代表图像gydF4y2Ba缺失gydF4y2BamRNA进入小鼠受精卵。红色箭头和放大视图显示囊胚形成失败的例子。gydF4y2BacgydF4y2Ba，微量注射RfxCas13d mRNA和gRNA靶向后胚胎发生的代表图像gydF4y2Ba喀斯特gydF4y2BamRNA进入小鼠受精卵。未观察到异常小鼠着床前发育。gydF4y2BadgydF4y2Ba，的影响gydF4y2Ba缺失gydF4y2Ba（gydF4y2BabgydF4y2Ba),gydF4y2Ba喀斯特gydF4y2Ba（gydF4y2BacgydF4y2Ba) KD对小鼠受精卵微量注射RfxCas13d mRNA和BSJ-gRNAs 96 h后囊胚形成的影响。gydF4y2BaegydF4y2Ba、鼠标示意图gydF4y2BacircMan1a2gydF4y2Ba和人类gydF4y2BacircMAN1A2gydF4y2Ba用洋红色圆柱表示。gydF4y2BafgydF4y2Ba， KDgydF4y2BacircMan1a2gydF4y2Ba在小鼠受精卵中微量注射RfxCas13d mRNA和BSJ-gRNAs 72 h后，囊胚形成减少。2细胞期、4细胞期、桑葚胚期和囊胚期的代表性图像;每个条件下的示例都用红线和放大视图突出显示。gydF4y2BaggydF4y2Ba， KDgydF4y2BacircDcbld2gydF4y2Ba通过RfxCas13d/BSJ-gRNA修饰受精卵。的表达gydF4y2BacircDcbld2gydF4y2Ba经qRT-PCR检测，归一化至gydF4y2BaActbgydF4y2Ba．gydF4y2BahgydF4y2Ba， 2细胞期、4细胞期、桑葚胚期和囊胚期正常胚胎形态图像gydF4y2BacircDcbld2gydF4y2Ba通过RfxCas13d/BSJ-gRNA对受精卵进行KD分析。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，统计gydF4y2BacircDcbld2gydF4y2Ba在小鼠受精卵中微量注射rfxcas13dmrna和BSJ-gRNAs后，KD对桑葚胚和囊胚形成的影响。gydF4y2Baj, kgydF4y2Ba， RfxCas13d-gRNA注入(gydF4y2BacircMan1a2gydF4y2BaKD)注射到假孕雌性小鼠的受精卵导致E7.5小鼠着床后发育迟缓。E7.5胚胎图像见gydF4y2Ba(j)gydF4y2Ba；发育迟缓胚胎的统计资料载于(gydF4y2BakgydF4y2Ba)．（gydF4y2Baa、d、g、h、i, j, kgydF4y2Ba)均值±标准差来自三个独立的实验。（gydF4y2Bab、c、f、h, jgydF4y2Ba)三个独立实验的结果具有代表性。（gydF4y2Baa、d、g、kgydF4y2Ba) *:gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05;* *:gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01;* * *:gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001;Ns，不显著，双尾学生gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充协议gydF4y2Ba
补充表1gydF4y2Ba
本研究中762个环状rna的RfxCas13d-BSJ-gRNA文库序列列表。a, 762种环状rna在HT29、293FT和HeLa细胞中的表达(FPBcirc)。b, 762个环状rna的RfxCas13d/BSJ-gRNA文库序列。gydF4y2Ba
补充表2gydF4y2Ba
CDCscreen在HT29, 293FT和HeLa细胞系中阴性选择环状rna的结果。a, HT29细胞中排序环状rna的CDCscreen评分(D30/D1)。b, 293FT细胞中排序环状rna的CDCscreen评分(D30/D1)。c, HeLa细胞中排序环状rna的CDCscreen评分(D30/D1)。gydF4y2Ba
补充表3gydF4y2Ba
HT29、293FT和HeLa细胞系中RfxCas13d-BSJ-gRNA筛选鉴定的阴性环状rna的cdc筛选评分列表。a, HT29细胞中阴性选择的circRNA的CDCscreen评分(D30/D1)。b, 293FT细胞中阴性选择circRNA的CDCscreen评分(D30/D1)。c, HeLa细胞中阴性选择circRNA的cdc筛选评分(D30/D1)。gydF4y2Ba
补充表4gydF4y2Ba
体外和体内筛选中阴性选择环状rna的cdc筛选评分和FDR列表。a, HT29细胞中阴性选择环状rna的CDCscreen评分和FDR(体外)。b, 293FT细胞(体外)中负选环状rna的cdc筛选评分和FDR。c, HeLa细胞中负选环状rna的cdc筛选评分和FDR(体外)。d, HT29细胞中负选环状rna的CDCscreen评分和FDR(在体内)。gydF4y2Ba
补充表5gydF4y2Ba
HT29、HeLa和293FT细胞中RfxCas13d-BSJ-gRNA验证的circRNA候选名单。列出了亲本基因、基因组位置、FPBcirc、CDCscreen评分。在HT29、HeLa和293FT细胞中，RfxCas13d可以分别用至少一个gRNA验证大多数被检测的候选circrna。gydF4y2Ba
补充表6gydF4y2Ba
本研究中2908个环状rna的RfxCas13d-BSJ-gRNA文库序列列表a, 2908个环状rna的RfxCas13d-BSJ-gRNA文库序列。b，体内HT29中排名靠前的环状rna的CDCscreen评分(D30/D1)。c，体内HT29中阴性选择环状rna的cdc筛选评分(D30/D1)。d, HT29中阴性选择环状rna的体外和体内cdc筛选评分重叠(D30/D1)。gydF4y2Ba
补充表7gydF4y2Ba
线性基因的表达gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2Ba在293FT细胞中被RfxCas13d或shRNA敲除。a，后线性基因列表gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2Barxcas13d NT和gRNA1基因敲除。b，后线性基因列表gydF4y2BacircFAM120AgydF4y2Ba在shRNA NT和shRNA1中敲除。gydF4y2Ba
补充表8gydF4y2Ba
24种circRNA在小鼠着床前发育中的表达。gydF4y2Ba
补充表9gydF4y2Ba
通过敲除小鼠受精卵中每24个候选circRNA，筛选在小鼠胚胎着床前具有潜在调节作用的circRNA。gydF4y2Ba
补充表10gydF4y2Ba
本研究中使用的gRNA, shRNA和引物序列列表。a, gRNA序列。b, shRNA序列。c, qRT-PCR和NB探针引物。gydF4y2Ba
源数据gydF4y2Ba
图1 .来源数据gydF4y2Ba
统计源数据gydF4y2Ba
图2 .来源数据gydF4y2Ba
统计源数据gydF4y2Ba
图3 .源数据gydF4y2Ba
统计源数据gydF4y2Ba
图4 .来源数据gydF4y2Ba
统计源数据gydF4y2Ba
图1 .源数据扩展数据gydF4y2Ba
统计源数据gydF4y2Ba
图2 .扩展数据gydF4y2Ba
统计源数据gydF4y2Ba
图3 .扩展数据gydF4y2Ba
统计源数据gydF4y2Ba
图5 .源数据扩展数据gydF4y2Ba
统计源数据gydF4y2Ba
图6 .源数据扩展数据gydF4y2Ba
统计源数据gydF4y2Ba
图8 .源数据扩展数据gydF4y2Ba
统计源数据gydF4y2Ba
图9 .源数据扩展数据gydF4y2Ba
统计源数据gydF4y2Ba
图10 .源数据扩展数据gydF4y2Ba
统计源数据gydF4y2Ba
图3 .源数据gydF4y2Ba
未加工的屁股gydF4y2Ba
图1 .源数据扩展数据gydF4y2Ba
未加工的屁股gydF4y2Ba
图3 .扩展数据gydF4y2Ba
未加工的屁股gydF4y2Ba
图9 .源数据扩展数据gydF4y2Ba
未加工的污渍和凝胶gydF4y2Ba
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李，S.，李，X.，薛，W.。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba利用CRISPR-Cas13系统筛选功能性环状rna。gydF4y2BaNat方法gydF4y2Ba18gydF4y2Ba， 51-59(2021)。https://doi.org/10.1038/s41592-020-01011-4gydF4y2Ba
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