摘要gydF4y2Ba
单导rna可以将外源CRISPR-Cas蛋白定位到独特的DNA位置，使遗传工具高效、特异和可扩展。在这里，我们表明，从染色体外转基因中表达的短合成引导piwi -相互作用rna (piRNAs)(21核苷酸sg-piRNAs)可以类似地重新编程内源性piRNA通路，用于雌雄同体生殖系、精子和胚胎的基因特异性沉默gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba．pirna介导的干扰(' piRNAi ')比RNAi更有效，可以多路复用，生长素介导的pirna特异性Argonaute PRG-1降解允许条件基因沉默。靶向特异性沉默导致信使RNA水平降低，次要小干扰RNA扩增和抑制性染色质修饰。从阵列寡核苷酸池扩增的短(300个碱基对)piRNAi转基因也诱导沉默，潜在地使piRNAi具有高度可扩展性。我们发现piRNAi可以诱导两个内源性基因的跨代表观遗传沉默(gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba而且gydF4y2Bahim-8gydF4y2Ba)．靶特异性sg-piRNAs丢失后，沉默可遗传4至6代，而耗尽PRG-1则导致本质上永久的表观遗传沉默。gydF4y2Ba
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支持本研究结果的测序数据可在NCBI基因表达Omnibus (gydF4y2BaGSE165210gydF4y2Ba)．数据gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba10gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba11gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba13gydF4y2Ba在源数据文件中提供相关的原始数据。作者声明，支持本研究结果的所有数据均可在论文中获得gydF4y2Ba补充信息gydF4y2Ba文件)。的基因组和注释文件gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba而且gydF4y2Bac . briggsaegydF4y2Ba从WormBase v.WS270和WS190 (ftp.wormbase.org)下载。所有数据均不受限制。gydF4y2Ba源数据gydF4y2Ba提供了这篇论文。gydF4y2Ba
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作者的自定义脚本可在gydF4y2Bahttps://doi.org/10.5281/zenodo.5599659gydF4y2Ba．自定义软件应用程序描述在gydF4y2Bahttps://github.com/AmhedVargas/piRNAi_reprogramminggydF4y2Ba．gydF4y2Ba
所有代码都是可用的，没有限制。gydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
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确认gydF4y2Ba
我们感谢L. Wahba和A. Fire(斯坦福大学)在发表前分享试剂。一些菌株是由CGC提供的，CGC是由NIH研究基础设施项目办公室(批准号为no。P40 OD010440)。本研究由KAUST资助研究办公室no. 1资助。OSR-CRG2019-4016 (C.F.-J.)，罗格斯大学布希生物医学基金(S.G.G.)和美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所，奖励号为R01GM111752 (S.G.G.)。内容仅为作者的责任，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。gydF4y2Ba
作者信息gydF4y2Ba
作者及隶属关系gydF4y2Ba
贡献gydF4y2Ba
m.p.， J.Z.N.和c.f.j。进行实验。A.M.V.-V。S.G.G.进行生物信息学分析。A.M.V.-V。开发了在线piRNA应用程序。构想并监督项目。C.F.-J。从所有作者的输入写的手稿。gydF4y2Ba
相应的作者gydF4y2Ba
道德声明gydF4y2Ba
相互竞争的利益gydF4y2Ba
作者声明没有利益竞争。gydF4y2Ba
同行评审gydF4y2Ba
同行评审信息gydF4y2Ba
自然方法gydF4y2Ba感谢张冬雷和其他匿名审稿人对这项工作的同行评审所做的贡献。唐磊是本文的主要编辑，并与编辑团队的其他成员合作管理其编辑过程和同行评审。gydF4y2Ba
额外的信息gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba
扩展数据gydF4y2Ba
图1 piRNAi可以沉默多种种系表达基因。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba．中自子代数的量化gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba以精子特定基因为目标的sg-piRNAs菌株gydF4y2Baspe-8gydF4y2Ba而且gydF4y2Baspe-12gydF4y2Ba．对未交配的L4型雌雄同体进行了生育能力测定gydF4y2Ba他5 (e1490)gydF4y2Ba突变体的背景。对照(' - ')=集群中随机化的sg-piRNAsgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．Kruskal-Wallis方差分析P = 0.0376, Dunn的多重比较，* P = 0.0458, ns = P > 0.99。gydF4y2BabgydF4y2Ba．piRNAi反对gydF4y2Bames-4gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba野生型(N2)动物。对转基因动物进行不育动物和雄性动物的评分(以确定“活跃阵列”)。双尾Mann-Whitney， * P = 0.0281(不育)，* P = 0.0455(男性频率)。gydF4y2BacgydF4y2Ba．piRNAi反对gydF4y2Badcr-1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba野生型动物(N2)。转基因L4期动物分别在20°C和25°C下孵育，并对其后代的致死性和雄性进行评分。gydF4y2Badcr-1gydF4y2Ba基因突变体对温度敏感，在高温下不育。双尾Mann-Whitney, ns P = 0.1320， ** P = 0.0065。gydF4y2BadgydF4y2Ba．piRNAi反对gydF4y2Bapie-1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba在AID::PRG-1菌株中保持1 mM生长素(PRG-1耗尽)。将来自稳定的、独立的转基因系的幼虫期动物转移到有或没有生长素的培养板上，并在25°C下对后代数量进行评分。双尾Mann-Whitney， ** P = 0.0079。数据以均值+ /- SEM表示，每个数据点对应于一个独立衍生的转基因菌株。样本量(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba) n = 4 (' - ')， n = 4 (gydF4y2Baspe-8gydF4y2Ba)， n = 3 (gydF4y2Baspe-12gydF4y2Ba), (gydF4y2BabgydF4y2Ba) n = 6 (gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba)， n = 5 (gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba+gydF4y2Bames-4gydF4y2Ba), (gydF4y2BacgydF4y2Ba) n = 6(所有条件)，(gydF4y2BadgydF4y2Ba) n = 5个生物独立的转基因菌株。gydF4y2Ba
扩展数据图2有效的piRNA沉默规则。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba．sg-piRNA簇示意图gydF4y2BaEgydF4y2Ba．gydF4y2BabgydF4y2Ba．显示静音效果的图表gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba一个、两个或三个sg- pirna在集群中重新编码gydF4y2BaEgydF4y2Ba．gydF4y2BacgydF4y2Ba．柱状图显示沉默密码子优化的效果gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba表达于种系(PgydF4y2Bamex-5gydF4y2Ba：：gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba)，从集群中获得0、1、2、3或6个sg- pirnagydF4y2BaEgydF4y2Ba．独立的生物菌株(每个菌株至少11只动物)在基因型盲的解剖显微镜上进行定性评分。gydF4y2BadgydF4y2Ba．上面。设计原理图gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba(D1086.4a.1)基因结构和sg-piRNAs的位置。底部。使用集群的piRNAigydF4y2BaEgydF4y2Ba针对gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba外显子或5 '和3 '未翻译区域(utr)或内含子(“非编码”)。对照=随机化的sg-piRNAs。gydF4y2BaegydF4y2Ba．三个版本的piRNA集群gydF4y2BaEgydF4y2Ba使用不同的sg- pirna进行测试gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba沉默。集合1对应于图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba集合2和集合3中的piRNAi转基因靶向与集合1相同的外显子，但使用不同的sg-piRNAs。gydF4y2BafgydF4y2Ba．“set 1”中的6个sg-piRNA被洗牌(“shuffle 1”和“shuffle 2”)，因此每个sg-piRNA在piRNA集群中由不同的启动子表达。引导piRNA目标位置在gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba成绩单显示为彩色椭圆。菌株在25℃下培养。gydF4y2BaggydF4y2Ba．转基因动物进行了测试gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba通过piRNAi沉默(piRNA簇gydF4y2BaEgydF4y2Ba)在不同温度(15°C, 20°C, 25°C)下超过12代。gydF4y2BahgydF4y2Ba．两种靶向sg-piRNAs的转基因动物的繁殖gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba(左)和gydF4y2Bahim-8gydF4y2Ba(右)一开始男性在人口中的比例很低。两株繁殖12代，每6代定量一次雄株频率。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba．gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2BapiRNA集群gydF4y2BaEgydF4y2Ba以基因为目标gydF4y2Bacbr-him-8gydF4y2Ba在gydF4y2Bac . briggsaegydF4y2Ba(AF16)。Control(' - ') =未注入gydF4y2Bac . briggsaegydF4y2Ba．带有韦尔奇修正的双尾t检验。** p = 0.0236。数据以+/−SEM的平均值表示，每个数据点对应于一个独立衍生的转基因菌株。样本量(gydF4y2BabgydF4y2Ba) n = 5 (1), n = 2 (2), n = 4 (3), n = 6(4)、n = 4 (5), n = 6 (6), n = 4(“1 + 5”),n = 5(“2 + 4”),n = 4(“3 + 6”),n = 6(“1 + 4 + 5”),n = 4(“2 + 3 + 6”),(gydF4y2BacgydF4y2Ba) n = 4(阴性。控制),n = 6 (1), n = 8 (2), n = 10 (3), n = 9 (4), n = 7 (5), n = 10 (6), n = 8(“1 + 5”),n = 7(“3 + 4”),n = 5 (5 + 6), n = 2(“2 + 3 + 6”),(gydF4y2BadgydF4y2Ba) n = 3(控制),n = 6(外显子2 - 4),n = 6(外显子4),n = 5(外显子5 - 6),n = 3(跨越外显子),n = 6 (5 ' UTR), n = 6(内含子),n = 4(3’UTR), (gydF4y2BaegydF4y2Ban = 3(集合1)，n = 3(集合2)，n = 2(集合3)，(gydF4y2BafgydF4y2Ban = 3(洗牌1)，n = 1(洗牌2)，(gydF4y2BaggydF4y2Ba) n = 3(条件),(h) n = 1(所有条件),n = 3(控制),n = 3 (gydF4y2Bacbr-him-8gydF4y2Ba)生物独立的转基因菌株。gydF4y2Ba
扩展数据图3 piRNAi依赖于质粒结构和拷贝数。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba．通过将piRNA簇注入线性dsDNA (1.5 kb)或将相同DNA克隆到质粒主干(高拷贝氨苄青霉素pTwist载体)产生的转基因株系。DNA转基因是由集群产生的gydF4y2BaEgydF4y2Ba针对gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba而且gydF4y2Bahim-8gydF4y2Ba有6个sg- pirna。双尾Mann-Whitney检验。*** P = 0.0006, ns =不显著(0.0659)。gydF4y2BabgydF4y2Ba．gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba用切入细菌载体主干(左)或未消化(右)的限制性内切酶消化的piRNAi质粒(来自图a)诱导沉默。质粒样品被同样处理(在有或没有限制性内切酶的限制性内切酶缓冲液中孵育，并在旋转柱上纯化)，并以相同的浓度注射。双尾Mann-Whitney检验。*** p = < 0.0001。gydF4y2BacgydF4y2Ba．由线性(绿色)或圆形(紫色)质粒形成的染色体外阵列的转基因系的全基因组测序转基因拷贝数的比较。gydF4y2BadgydF4y2Ba．sg-piRNA表达靶向的比较gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba来自携带线性化和圆形piRNAi转基因基因的转基因菌株。gydF4y2BaegydF4y2Ba．一个“非活性”多路piRNAi菌株(图中蓝色圆圈)。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba)繁殖6代，对种群中的雄性进行评分，并沉默生殖系GFP荧光。“0代”对应于初始注入后的2-3代。gydF4y2BafgydF4y2Ba．对图e所示的菌株进行全基因组测序，以确定在早期(第1代)和晚期(第6代)时间点外染色体阵列中所有质粒的拷贝数。以线粒体DNA (mtDNA)拷贝数作为对照。拷贝数是相对于整个测序的平均覆盖率计算的gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba基因组。数据以均值+ /- SEM表示，每个数据点对应于一个独立衍生的转基因菌株。样本量(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba）gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba: n = 8(线性)，n = 8(圆形)，gydF4y2Bahim-8gydF4y2Ba: n = 7(线性)，n = 7(圆形)，(gydF4y2BabgydF4y2Ban = 6(消化)，n = 6(未消化)，(gydF4y2BacgydF4y2Ba) n = 3(所有条件)，(gydF4y2BadgydF4y2Ba) n = 2(线性)，n = 2(圆形)，(gydF4y2BaegydF4y2Ba) n = 1， (gydF4y2BafgydF4y2Ba) n = 1株生物独立的转基因菌株。gydF4y2Ba
扩展数据图4条件的时间过程gydF4y2Bacdk-1gydF4y2Ba使用生长素消音。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba．带有piRNAi靶向的动物的Brightfield图像gydF4y2Bacdk-1gydF4y2Ba在AID::PRG-1菌株的生长素上(左图)或生长素下(右图)。虚线黄色描绘的是雌雄同体子宫中的受精卵。箭头表示外阴和胚胎。gydF4y2Bacdk-1gydF4y2Ba编码细胞分裂和胚胎在单细胞阶段停滞所必需的周期蛋白依赖性激酶gydF4y2Bacdk-1gydF4y2Ba突变体。来自十多个胚胎成像的代表性图像。比例尺bar = 25µm。gydF4y2BabgydF4y2Ba．piRNAi反对gydF4y2Bacdk -gydF4y2Ba1在AID:PRG-1株。注射动物维持在1 mM生长素板上(以耗尽PRG-1)。将L4期动物转移到添加生长素或不添加生长素的培养皿中，通过首先计算产卵数来记录存活后代的数量，三天后计算成年后代的总数。阴性对照=野生型动物(N2)。Kruskal-Wallis方差分析P = 0.0036, Dunn的多重比较* P = 0.0146, ns P = 0.3594。gydF4y2BacgydF4y2Ba．从生长素中去除后的piRNAi激活。为了确定去除生长素后需要多长时间才能“开启”pirna介导的沉默，在每个幼虫阶段和年轻成虫时每隔3小时将动物转移到非生长素板上。对成年动物(至少11只动物)的子宫进行了单细胞阻滞胚胎的评分。数据以+/−SEM的平均值表示，每个数据点对应于一个独立衍生的转基因菌株。样本量(gydF4y2BabgydF4y2Ba) n = 3 (N2)， n = 3(生长素，两种情况)，(gydF4y2BacgydF4y2Ba) n = 1(所有条件)生物独立的转基因菌株。gydF4y2Ba
扩展数据图5 piRNAi沉默最多可容忍三次不匹配。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba．sg-piRNA错配公差使用piRNA集群gydF4y2BaEgydF4y2Ba．6个sg-piRNAs靶向gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba每个都包含0到5个不匹配。图中显示了错配在piRNA种子序列(红框，位置2到7的核苷酸)或piRNA剩余部分(白框，位置8到21)中的位置。对于所有的sg-piRNA(包括对照)，前导的“U”没有被修改，因为这个碱基是piRNA转录所必需的。在一些转基因中，错配的总数是恒定的，但在每个sg-piRNA中的位置是随机的(用灰色阴影表示)。负控制包含反转gydF4y2Ba他5gydF4y2Basg-piRNAs。gydF4y2BabgydF4y2Ba．基于Wu计算的piRNA总分与男性频率的关系gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．(2018)，其中考虑了错配位置和摆动碱基配对。面板a.左:所有pirna。右图:聚类中4个表达最高的导向piRNAgydF4y2BaEgydF4y2Ba(其余两种sg-piRNAs很少通过小RNA测序检测到)。简单的线性回归。RgydF4y2Ba2gydF4y2Ba=拟合度。gydF4y2BacgydF4y2Ba．各导向piRNA中雄性频率与错配数之间的关系。面板a.左:所有pirna。右图:聚类中4个表达最高的导向piRNAgydF4y2BaEgydF4y2Ba．简单的线性回归。RgydF4y2Ba2gydF4y2Ba=拟合度。数据以均值+ /- SEM表示，每个数据点对应于一个独立衍生的转基因菌株。样本量(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)控制:n = 6, n = 6, n = 7, n = 8, n = 8, n = 5(负面),n = 5, n = 9, n = 7, n = 7, n = 6, n = 6, n = 9(积极的),1不匹配:n = 9, n = 7, n = 8, n = 7, n = 6, n = 10(技术和生物复制),n = 7, n = 8, 2不匹配:n = 5, n = 10, n = 8, n = 7, n = 6, n = 8, n = 6, n = 6, 3不匹配:n = 7, n = 5, n = 8, n = 9, n = 5, 4不匹配:n = 9, n = 6, n = 8, n = 8, n = 5, 5不匹配:n = 7, n = 6, n = 7, n = 5, n = 7, n = 9, n = 8, n = 6, n = 9, n = 7, n = 5, n = 5,从上到下所有值(gydF4y2BabgydF4y2Ban = 382， (gydF4y2BacgydF4y2Ba) n = 343株生物独立的转基因菌株。gydF4y2Ba
扩展数据图6 Web应用程序允许简单的piRNAi转基因设计。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba．截图的gydF4y2Bawww.wormbuilder.org/piRNAigydF4y2Ba．简单模式，目标单一基因与预定义的标准。gydF4y2BabgydF4y2Ba．先进的模式。在高级模式下，几个不同的piRNA集群可以用自定义的20-mers重新编码(例如，靶向gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba)或在给定的编辑距离上选择所有20-mers映射到所选基因亚型。gydF4y2BacgydF4y2Ba．输出文件与piRNAi转基因注释在GenBank格式。该序列显示在“A质粒编辑器”(ApE)中。gydF4y2Ba
图7内源性沉默gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba标记gydF4y2Ba他的- 72gydF4y2BapiRNAi。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba．一株具有内生菌的菌株的Brightfield和荧光图像gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba标记gydF4y2Ba他的- 72gydF4y2Ba轨迹。图像显示非目标控制(gydF4y2BamCherrygydF4y2Ba)，或sg-piRNAs靶向gydF4y2Ba他的- 72,gfpgydF4y2Ba,或gydF4y2Ba他的- 72gydF4y2Ba+gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba．使用油浸物镜在40倍放大倍率下获取图像。来自50多只成年动物的代表性图像。白色比例尺bar = 25µm。gydF4y2BabgydF4y2Ba．我们使用ImageJ (NIH)定量了精囊前“最后”三个卵母细胞细胞核中的GFP荧光。数据以均值+ /- SEM表示，每个数据点对应于一个独立衍生的转基因菌株。样本量(gydF4y2BabgydF4y2Ba) n = 62 (N2)， n = 59(非瞄准)，n = 64 (gydF4y2Ba他的- 72gydF4y2Ba)， n = 62 (gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba)， n = 62 (gydF4y2Ba他的- 72gydF4y2Ba+gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba)荧光图像来自生物上相同的转基因菌株在每个条件下的三个技术重复。gydF4y2Ba
图8从基质寡聚池中扩增piRNAi短基因。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba．两个不同的300 bp piRNAi转基因的示意图，每个基因编码3个sg-piRNAs。在低聚物芯片上大规模合成的300 bp低聚物作为排列的子池交付，在384口井中，每口井中有121个独特的低聚物。piRNA转基因两侧是正交的正向和反向引物位点，允许从复杂低聚物池中“拨出”转基因PCR (Kosuri等，2010)。每个寡核苷酸池包含121个不同的寡核苷酸，最大长度为300个碱基对(Matrix oligo Pools, Twist Bioscience)。沉默需要两个piRNAi转基因(编码6个sg- pirna)。因此，每个池可以靶向60个基因，单个piRNAi转基因可以使用16个正交引物(8个正向* 8个反向= 64个独特组合)“拨出”。限制性内切位点(DraI或EcoRV)可以对成对扩增的piRNA转基因进行Sanger测序。gydF4y2BabgydF4y2Ba．96孔扩增60个不同的piRNA转基因对靶向gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba用了两轮PCR第一个PCR是同时使用所有16个扩增引物对池中所有低聚物进行批量扩增。60个特异性piRNA转基因在第二轮PCR中扩增，所用的正交引物为上述孔中所列(预期大小为300 bp，箭头所示)。对照反应不包含评估污染物背景放大的模板。在没有优化的情况下，我们能够扩增60个piRNA转基因中的51个(9个孔在300 bp处条带较弱或没有条带)。梯子= 100-10,000 bp VersaLadder (GoldBio)。对于大规模文库(例如，全基因组文库)，在第一次批量扩增和将扩增后的低聚物池转化为细菌后的亚克隆步骤将保持低聚物池的长期完整性，并促进低聚物池作为冻干质粒池的分布。gydF4y2BacgydF4y2Ba．从低聚物池中pcr扩增的piRNA转基因的桑格测序的代表性例子。12个PCR测序产物中有12个包含预期的3个独特的sg-piRNAs。从测序轨迹来看，可以看到低水平的串扰(三个sg- pirna下面的小峰)，可以通过减少PCR循环次数和使用亚克隆文库作为PCR模板来最小化串扰。gydF4y2Ba
扩展数据图9抑制性染色质修饰在对piRNAi的响应中扩散。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba．ChIP-seq抗体针对Pol II, H3K9me3和H3K23me3两株携带piRNAi转基因靶向gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba(红色痕迹)和gydF4y2Bahim-8gydF4y2Ba(蓝色的痕迹)。虚线表示piRNAi靶基因。gydF4y2Bazim-1gydF4y2Ba，gydF4y2Bazim-2gydF4y2Ba，gydF4y2Bazim-3gydF4y2Ba,gydF4y2Bahim-8gydF4y2Ba是单个操纵子的一部分(CEOP4384，绿色条)。gydF4y2BabgydF4y2Ba．未被piRNAi靶向的控制位点。gydF4y2BacgydF4y2Ba．gydF4y2BamCherrygydF4y2Ba而且gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba共同表达在一个操纵子下gydF4y2Bamex-5gydF4y2Ba启动子(PgydF4y2Bamex-5gydF4y2Ba：gydF4y2Ba: mCherrygydF4y2Ba:: H2B -gydF4y2Bagpd-2gydF4y2Ba操纵子-gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba：：gydF4y2Bah2bgydF4y2Ba：：gydF4y2Bacye-1gydF4y2Ba3'UTR)作为单个副本插入gydF4y2BattTi5605gydF4y2Ba(Frøkjær-Jensen et al.， 2008)。荧光团被单独靶向或一起靶向(对照)，使用piRNA集群进行piRNA转基因沉默gydF4y2BaEgydF4y2Ba．数据以+/−SEM的平均值表示，每个数据点对应于一个独立衍生的转基因菌株。样本量(gydF4y2BacgydF4y2Ba）gydF4y2BamCherrygydF4y2Ba: n = 3 (- / -), n = 5 (+ / -), n = 7(−/ +),n = 5 (+ / +),gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba: n = 3 (- / -), n = 5 (+ / -), n = 7(−/ +),n = 5(+ / +)生理上独立的转基因品种。gydF4y2Ba
图10 pirnai诱导的跨代沉默。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba．原理图显示测定方法gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba而且gydF4y2Bahim-8gydF4y2Ba继承了沉默。为了量化自受精产生的雄性比例(与交配产生的雄性杂交后代相反)，我们在每一代中选择4到6只未交配的L4动物到新盘子中，并为它们的雄性后代打分(100只动物)。该方法有一个“过渡代”(GgydF4y2Ba0gydF4y2Ba)，其中一部分动物被允许失去染色体外的pirnai -阵列。由于共享的种系细胞质，随后G1代的非转基因动物在胚胎发育早期暴露于sg-piRNAs。菌株没有暴露在gydF4y2Ba新创gydF4y2Basg-piRNAs在L4期蜕皮时产生，此时精子被制造出来，雌性卵母细胞开始产生。gydF4y2BabgydF4y2Ba．的持续时间gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba而且gydF4y2Bahim-8gydF4y2Ba继代继承。我们通过计算在种群中男性比例<= 1%之前失去piRNA阵列后的代数来量化跨代遗传。面板数据汇总图gydF4y2Ba公元前4年gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba．Kruskal-Wallis方差分析，P=<0.0001, Dunn事后检验*** P= 0.0007。gydF4y2BacgydF4y2Ba．跨代沉默的持续时间gydF4y2Bahrde-1gydF4y2Ba突变体。双尾Mann-Whitney检验，* P = 0.0286， ** P = 0.0079。gydF4y2BadgydF4y2Ba．piRNAi靶向的遗传沉默gydF4y2Baspe-8gydF4y2Ba而且gydF4y2Baspe-12gydF4y2Ba在一个gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba（gydF4y2Bae1490gydF4y2Ba)突变体背景。未交配的L4雌雄同体在存在(黑色实心条)或不存在(白色实心条)sg-piRNAs靶向的情况下对存活后代进行评分gydF4y2Baspe-8gydF4y2Ba而且gydF4y2Baspe-12gydF4y2Ba,分别。控制=gydF4y2Ba他5 (e1490)gydF4y2Ba随机的piRNAi聚类动物。使用湿霉素来选择转基因动物，包括对照组，导致动物在非选择性培养皿上生长后，对照组的窝数增加。统计学:每一代的单因素方差分析。* P = 0.0057(-1代)，* P = 0.0127(0代)，ns P = 0.8312(+1代)。数据以均值+ /- SEM表示，每个数据点对应于一个独立衍生的转基因菌株。样本量(gydF4y2BabgydF4y2Ba) n = 6(对照)，n = 14 (gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba)， n = 8 (gydF4y2Bahim-8gydF4y2Ba), (gydF4y2BacgydF4y2Ba）gydF4y2Ba他5gydF4y2Ba: n = 5 (N2) n = 5 (gydF4y2Bahrde-1gydF4y2Ba)，gydF4y2Bahim-8gydF4y2Ba: n = 4 (N2) n = 4 (gydF4y2Bahrde-1gydF4y2Ba), (gydF4y2BadgydF4y2Ba) n = 2(对照)，n = 2 (gydF4y2Baspe-8gydF4y2Ba)， n = 2 (gydF4y2Baspe-12gydF4y2Ba)生物独立的转基因菌株。gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充图1-13，讨论，方法，协议和参考文献。gydF4y2Ba
补充表1gydF4y2Ba
补充图和寡核苷酸序列的源数据。gydF4y2Ba
补充数据1gydF4y2Ba
所有转基因基因的注释GenBank文件。gydF4y2Ba
源数据gydF4y2Ba
图1 .来源数据gydF4y2Ba
Excel电子表格中的图表数据。gydF4y2Ba
图2 .来源数据gydF4y2Ba
Excel电子表格中的图表数据。gydF4y2Ba
图3 .源数据gydF4y2Ba
Excel电子表格中的图表数据。gydF4y2Ba
图4 .来源数据gydF4y2Ba
Excel电子表格中的图表数据。gydF4y2Ba
图1 .源数据扩展数据gydF4y2Ba
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图2 .扩展数据gydF4y2Ba
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图3 .扩展数据gydF4y2Ba
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图4 .扩展数据gydF4y2Ba
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图5 .源数据扩展数据gydF4y2Ba
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图7 .源数据扩展数据gydF4y2Ba
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图9 .源数据扩展数据gydF4y2Ba
Excel电子表格中的图表数据。gydF4y2Ba
图10 .源数据扩展数据gydF4y2Ba
Excel电子表格中的图表数据。gydF4y2Ba
权利和权限gydF4y2Ba
关于本文gydF4y2Ba
引用本文gydF4y2Ba
Priyadarshini, M.， Ni, J.Z.， Vargas-Velazquez, A.M.gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba重编程piRNA通路用于多路和跨代基因沉默gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba．gydF4y2BaNat方法gydF4y2Ba19gydF4y2Ba， 187-194(2022)。https://doi.org/10.1038/s41592-021-01369-zgydF4y2Ba
收到了gydF4y2Ba：gydF4y2Ba
接受gydF4y2Ba：gydF4y2Ba
发表gydF4y2Ba：gydF4y2Ba
发行日期gydF4y2Ba：gydF4y2Ba
DOIgydF4y2Ba：gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/s41592-021-01369-zgydF4y2Ba
这篇文章被引用gydF4y2Ba
基督教Frøkjær-JensengydF4y2Ba
自然方法gydF4y2Ba(2022)gydF4y2Ba
