四种性别大小二态鱼的比较转录组资料

许多鱼类表现出性别二态性，其中最常见的是性别大小二态性，其中一个性别比另一个性别大，但表现出物种特异性。例如，鲤鱼(鲤属carpio)、虹鳟鱼(雄鱼mykiss)、日本飞鱼探测仪(Paralichthys olivaceus)、半光滑舌底(Cynoglossus semilaevis)表现出最极端的性别大小二态性，雌性比雄性更大，长得更快^1，2，3.．相反，有些鱼类，例如尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、黄鲶(Pelteobagrus fulvidraco)和沟鲶(Ictalurus蜥)时，雄性的生长速度和体型都比雌性更快、更大^4，5，6．脊椎动物的生长受下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴和其他组织分泌的生长激素/胰岛素样生长因子的调节⁷．目前关于鱼类性别大小二态性的研究主要集中在与HPG轴相关的基因和激素方面^8，9，10．众所周知，大多数复杂的性状都是由多个基因控制的，因此只关注与HPG轴相关的一两个基因和激素的研究并不能完全揭示性别大小二态的调控机制。因此，鱼类性别大小二态的分子机制尚不清楚。

性别之间基因表达的差异被认为是显着表型差异的关键因素^11，12．因此，为了了解性别大小二态的原因，许多研究都集中在女性和男性之间的差异表达基因(DEGs)上。比较转录组分析可以帮助人们在全基因组水平上发现DEGs，并已广泛应用于研究包括鱼类在内的动物性别偏倚基因^13，14，梭子蟹¹⁵、猪¹⁶、牛¹⁷，和鸡肉¹⁸．然而，现有的转录组研究大多集中在单一物种水平上一个或几个特定器官的表达模式。性别偏向的表达在物种谱系中的保守程度以及在不同组织和器官系统中的保守程度是未知的。评估跨物种性别偏倚基因的表达将有助于全面理解调节表型性别差异的分子机制¹⁹．到目前为止，还没有研究全面、准确地阐明在大范围性大小二态鱼种和组织中性别间基因表达的差异，性别二态鱼雌雄生长差异调控机制的普遍性仍不清楚。

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)、半滑舌底(Cynoglossus semilaevis)、黄鲶(Pelteobagrus fulvidraco)和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)都是水产养殖中重要的经济鱼类^{20.，21，22，23}．然而，它们都有性别差异的生长模式，在女性和男性个体之间有显著的生长差异。m . anguillicaudatus而且c . semilaevis在雌性中有生长优势吗p . fulvidraco而且o . niloticus雄鱼是否有生长优势，影响这些养殖品种的产量和经济价值²⁴．目前尚不清楚性别生长二态鱼(包括雌雄生长均占优势的鱼类)中调节雌性和雄性生长差异的分子机制是否存在共性。因此，探索这4种代表性鱼类雌、雄之间的共同调控基因和通路，将有助于我们进一步了解鱼类性别大小二态的分子机制，为养殖中选育快速生长、均匀的品种提供重要的理论依据。

在本研究中，我们通过RNA-seq对四种具有代表性的鱼类(泥鳅、半滑舌鳎、黄鲶和尼罗罗非鱼)在雌性和雄性生长显著差异期间的组织进行了转录组测序，包括2个组织(大脑和肌肉)和48个文库(每个样本中有3个生物重复)。使用FastQC进行质量控制，以评估我们的转录组数据的质量，并提供了一个高质量的数据集。此外，我们对四种性别大小不同的鱼类进行了比较转录组学分析，目的是确定四个物种中雌性和雄性之间的差异。研究设计或工作流程概述示意图如图所示。1．我们的工作是一种宝贵的资源，可重复利用，并将为进一步研究性别大小二态鱼在调节雌性和雄性生长差异方面的共性提供基础信息。

道德的声明

所有实验均按照国家卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行，并获得中国武汉华中农业大学研究伦理委员会批准(批准号:SYXK2015-0084)。所有手术均在MS-222 (Sigma，圣路易斯，密苏里州，美国;100mg /L)麻醉，并尽一切努力减少痛苦。

实验鱼类和样本采集

m . anguillicaudatus实验所用的动物均采自本实验室人工繁殖种群c . semilaevis购自山东青岛。p . fulvidraco而且o . niloticus分别由海达集团研究中心台山基地和南京农业大学无锡水产学院提供。每一种鱼都是从一个完整的兄弟科中挑选出来的。测量体重和体长并用学生t检验进行比较。女性和男性的平均体重m . anguillicaudatus分别为5.42±0.66 g和2.77±0.36 g，女性体重比男性重95.67% (P <0.005)。在c . semilaevis，女性平均体重为42.43±15.65 g，男性平均体重为12.06±6.80 g，女性体重为男性的3.5倍(P <(图0.05)。2)．这两个物种的雌性和雄性之间的体长比较也表明，雌性比雄性长得快(图2)。2 b)．然而,在p . fulvidraco而且o . niloticus在美国，男性比女性长得快，尤其是在p . fulvidraco，女性与男性的差异明显(P <0.0001)，男性体重是女性的9.57倍，身高是女性的2.23倍。从每个鱼种中选择9条健康的雌性和雄性进行转录组采样，并建立3个生物重复，每个重复包含3条鱼。用100 mg/L MS-222麻醉后，快速解剖鱼的大脑和肌肉组织，在液氮中冷冻，并保存在−80°C下，以便后续提取RNA。

图书馆建设与排序

用trizol和制造商的方案(Ambion)从每个样品中提取总RNA。RNA完整性评估由Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)进行。RNA纯化和文库构建使用TruSeq搁浅mRNA LTSample Prep Kit (Illumina)按照制造商的说明进行。简单地说，用高质量的mRNA合成双链cDNA，用AMPure XP珠(Beckman Coulter, Beverly, USA)纯化。之后，将纯化的cDNA片段在3 '端进行修复和腺苷化，然后连接到测序适配器上。随后对文库进行纯化，PCR富集，再次纯化得到最终文库。最后在Illumina测序平台(HiSeqTM 2500)上对文库进行测序，得到150 bp的配对末端reads。

转录组组装和基因表达水平分析

质量控制和读数统计由Trimmomatic确定²⁵_．同时计算clean reads的Q30和GC含量，所有下游分析均基于clean reads，且质量较高。的高质量干净数据m . anguillicaudatus然后从头组装使用三位一体软件min_kmer_cov设置为2默认和所有其他参数设置为默认²⁶，然后使用BUSCO (Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs)对转录组组装进行评估。以及最后的干净读数c . semilaevis，p . fulvidraco,o . niloticus用hisat2²⁷．每个转录本的表达水平以预期的每百万碱基对测序的转录本序列的片段数(expected number of Fragments Per Kilobase)计算²⁸，通过袖扣和htseq-count计算各基因的FPKM值和读取计数²⁹,分别。

微分表达式分析

为了鉴定各物种大脑和肌肉组织中的差异表达基因(DEGs)，采用DESeq R包和估计尺寸因子(estimate Size Factors)和nbinom检验(nbinom Test)对两个表达谱进行定量表达^30.．unigenes withP-value < 0.05和|log2(fold-change)| >1被认为是显著的deg。在大脑的比较中，泥鳅、半滑舌鳎、黄鲶鱼和尼罗罗非鱼分别有1132、1290、4732和748个deg。在肌肉的比较中，这四个物种分别鉴定出1108、1102、4266和192个deg。Figshare上有4种鱼的deg信息。

实时定量PCR (qRT-PCR)确认

为了验证RNA-seq的结果，我们选取了4条鱼的大脑和肌肉组织中的几个DEGs进行实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)定量分析。大脑和肌肉组织的总RNA来自两性m . anguillicaudatus，c . semilaevis，p . fulvidraco,o . niloticus使用PrimeScriptRT试剂盒(Takara)按照制造商的协议进行反转录。引物使用Primer Premier 5.0软件设计，并在补充表中列出1．每20 μL反应体积含有10 uL 2 × Hieff^®qPCR SYBR Green Master Mix (Yeasen, Shanghai, China)， 1.0 uL稀释cDNA模板，阳性和反向引物各0.8 uL, ddH 7.4 uL₂O.使用Applied Biosystems QuantStudio 6 Flex Real-time PCR系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)进行qRT-PCR反应，程序如下:95°C持续30秒，然后在95°C持续5秒，60°C持续30秒和72°C持续30秒进行40个循环。每个反应进行5个生物重复。的表达式β肌动蛋白作为内部标准化的参考，对Ct值进行归一化，进行2^−ΔΔCt方法³¹．

所有测序数据m . anguillicaudatus，c . semilaevis，p . fulvidraco,o . niloticus被上传到国家生物技术信息中心的序列阅读档案(SRA)，登录号为SRP313711、SRP313744、SRP314481和SRP313936^{32，33，34，35},分别。的unigenes的注释信息m . anguillicaudatus，在Figshare上可以找到四种鱼的deg信息³⁶．

四种鱼类的原始读数相似，从46,481,320到60,661,760不等(补充表2)．修剪后的干净reads总数为45,718,052 ~ 57,733,120，这些reads与相应物种参考基因组的总体作图效率为88.43 ~ 97.89%，表明测序数据的质量足以进行后续分析。BUSCO分析m . anguillicaudatus从头组装数据显示，BUSCO文库中完全匹配的基因总数为86.32%(4,584个基因中有3,957个)(图。3)．其中，完整且单拷贝的BUSCOs占80.27%(4584个BUSCOs中有3677个)，完整且重复的BUSCOs占6.11%(4584个BUSCOs中有280个)。虽然完整比对的比例没有之前泥鳅转录本组装的比例高，但完整和单拷贝的BUSCOs比例高于之前的70.6%³⁷．中unigenes的GC含量和长度分布图m . anguillicaudatu如图所示。3 b, c．总的来说，这表明泥鳅转录组组装质量很高。对于有参考基因组的物种(半滑舌鳎、黄鲶、尼罗罗非鱼)，将所有的清洁reads映射到相应的参考基因组上后，计算唯一映射reads和多次映射reads的数量和百分比，并在表中显示1．样本间基因表达水平的相关性是验证实验可靠性的重要指标，Pearson相关系数(r)的平方值大于0.85是进行差异表达分析的前提条件(补充图)。1和无花果。2)．此外，虽然转录组分析和qRT-PCR分析的log2(fold-change)值不同，但qRT-PCR所选择的这些基因的差异表达水平与RNA-seq观察到的差异表达水平高度一致(图2)。4)．

综上所述，我们的研究结果提供了一个高质量的转录组数据集，描述了性别大小二态鱼中雌性和雄性转录水平的差异，有助于探索调节性别大小二态鱼中雌性和雄性生长差异的常见基因。