槲皮素与超顺磁性氧化铁纳米颗粒结合，通过与LTP相关的蛋白质相互作用，比游离槲皮素更好地改善学习和记忆gydF4y2Ba

长期增强作用(Long-Term Potentiation, LTP)是一种细胞机制，通过这种机制，神经细胞的突触可塑性被加强，从而导致记忆的保存。学习和记忆是最重要的认知功能之一，随着年龄的增长，这些功能会逐渐丧失。学习和记忆主要依赖于突触的可塑性，长期的信号转导导致神经元之间的突触增强。这个过程被称为LTPgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba而其受高血脂、氧化应激等多种因素的影响gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}．因此，为了防止记忆障碍和神经退行性疾病的发展，维持LTP似乎是必要的gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba．神经营养素信号通路与LTP密切相关，LTP的诱导可在神经元之间组织新的信号转导，抑制记忆损伤和神经退行性变gydF4y2Ba^{6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}．另一方面，学习和记忆的改善也可以归因于防止细胞凋亡。此外，研究还表明，除了抑制神经细胞凋亡外，预防神经退行性疾病还可以恢复LTPgydF4y2Ba^{8 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

黄酮类化合物在中枢神经系统(CNS)中的生物活性是由于它们能够保护敏感神经元，增加现有神经元的功能，刺激神经元再生和诱导神经发生gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba}．槲皮素(QT)(2-(3,4-二羟基苯基)-3,5,7-三羟基- 4h - chromene -4-one，图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)是日常饮食中最丰富的类黄酮化合物之一，已知它可以保护神经元免受氧化应激和细胞凋亡的影响gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba．有人认为槲皮素对蛋白质具有抑制作用，但这一特性尚未得到充分的研究。但是，QT的主要缺点是gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba其生物利用度较低，因此对诱导LTP没有显著影响gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

QT与各种信号通路中涉及的蛋白质的相互作用之前已经有报道gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba．在这方面，也有研究表明QT可以减少作为空间记忆处理中心的海马体的细胞凋亡，这一特性可以被认为是对氧化应激的预防性治疗gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}．此外，QT在神经细胞中作用的确切分子机制迄今尚未揭示;因此，我们决定寻找QT的细胞靶点，通过使用生物信息学工具，QT治疗可以改善学习和记忆。为此，除了使用实验测试以确认QT在无氧化因子时对学习和记忆的有益作用外，还对接了软件包括gydF4y2Ba十六进制gydF4y2Ba，gydF4y2BaAutoDockgydF4y2Ba,gydF4y2BaLigandScoutgydF4y2Ba用于寻找QT与考虑信号通路的蛋白质之间的相互作用。QT对接位点在某些情况下也有研究，如对肌浆网atp酶的抑制作用gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba，蛋白质二硫异构酶gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba，通过与CLUT1结合抑制葡萄糖外排gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba，抑制Akt活性导致细胞存活gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba， Cs抑制gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}- - - - - - atp酶gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba等。然而，在细胞内并没有明确发现槲皮素的特异靶点。作为这一目标的第一项研究，我们决定计算评估槲皮素与神经营养素和LTP信号通路中所有蛋白质的相互作用。首先，我们应该确定槲皮素对健康机体学习和记忆的有益作用。因此，使用完整的大鼠来评估QT在没有任何氧化剂的情况下对学习和记忆的影响，QT的主要有益作用将依赖于QT与蛋白质的相互作用。此外，由于槲皮素的生物利用度较低，我们还评估了先前提出的提高其生物利用度的传递系统的效率。为了提高槲皮素的生物利用度，已经提出了许多方法。gydF4y2Ba

使用槲皮素衍生物，如槲皮素苷元gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba,乳化剂gydF4y2Ba^{24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba},配合gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}在可及性和生物利用度方面显示出令人满意的结果。纳米技术是一种输送治疗性化合物的新方法。制造槲皮素包括纳米结构，包括缀合物gydF4y2Ba^{29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba},碳纳米管gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba为了提高槲皮素的生物利用度和溶解度而进行了研究。然而，很少有关于使用含有槲皮素的纳米颗粒将这种化合物运送到脑组织的研究。gydF4y2Ba

纳米颗粒(NPs)之所以重要，是因为它们具有独特的特性，如高表面质量比、吸收能力，以及携带其他化合物，这些化合物使NPs能够有效地携带药物、蛋白质和探针gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba．然而，NPs也限制了从血脑屏障(BBB)的通过速度。gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba．在这方面，已经研究了鼻脑法，以增加脑组织中的药物浓度，防止药物在胃肠道中的破坏。该方法已被引入，药物输送到大脑的成功率高，但其主要缺点是药物化合物的渗透性低gydF4y2Ba^{35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}．另一方面，纳米颗粒的使用有助于克服某些疾病的耐药性，这些疾病的治疗化合物无法穿过血脑屏障(BBB)等屏障。超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)在生物医学应用中引起了广泛的关注。SPION具有高自旋极化率、高导电性和超顺磁性等独特特性gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba．SPION作为一种纳米颗粒载体体系，具有许多优于其他纳米颗粒载体体系的优点。氧化铁NP具有生物相容性、可生物降解性和超顺磁性，因此可以通过外部磁场控制。这种具有不同涂层的纳米颗粒具有各种生物应用，包括高灵敏度诊断测试、药物传递、基因传递、磁共振成像、细胞跟踪、组织工程、磁热疗、磁共振成像(MRI)、热治疗、靶向脑动脉中的β淀粉样蛋白(Aβ)、抑制微胶质细胞和DNA检测gydF4y2Ba^{38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba}．然而，它们可能是有毒的，并可能破坏细胞的主要细胞器和大分子的功能，如DNA、细胞核和线粒体gydF4y2Ba^{42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba}．SPIONs的毒性取决于重要因素，如纳米颗粒的大小、暴露时间、NP涂层的类型和组织类型gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba．我们之前的研究表明，葡聚糖包裹的氧化铁纳米颗粒在高剂量下具有轻微的细胞毒性gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba．在另一项研究中，我们发现SPIONs可以增强槲皮素在大脑中的生物分布gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba．小体积、低毒和通过磁场靶向给药的可能性是SPION人群最重要的优势之一gydF4y2Ba^{46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba}．我们使用槲皮素- siopn偶联系统来提高槲皮素的生物利用度，同时也有助于槲皮素对蛋白质的抑制作用，特别是在大脑中的抑制作用。QT-SPION (QT-FegydF4y2Ba_3.gydF4y2BaOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba)已被用于改善记忆障碍大鼠的学习和记忆gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba．此外，Najafabadi已经证明了这种递送系统的生物利用度的提高gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba．然而，目前还没有关于其对完整大鼠学习和记忆的影响的报道。gydF4y2Ba

在此，我们研究QT和QT- spion对完好大鼠学习记忆的影响，以证实QT和设计的给药系统对改善学习记忆的有益作用。为了找到槲皮素抑制活性的特异性靶点，我们还对槲皮素对学习记忆相关信号通路蛋白的潜在抑制作用进行了全面筛选。gydF4y2Ba

QT- SPIONs的表征gydF4y2Ba

右旋糖酐包被SPIONs、QT和QT共轭超顺磁性纳米颗粒(QT- spion)的FTIR光谱如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．葡聚糖包被SPIONs的光谱在3378 cm处有宽峰gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}为羟基的OH拉伸振动，在573 cm处有强吸收带gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}为图中磁铁矿尖晶石结构Fe-O振动频率。gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba．槲皮素的FTIR在1657 cm处显示出C=O吸收的特征波段gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}， OH在3388 cm处成团gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}， C-O对应区域为1150-1070 cmgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．此外，峰顶933厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}图中为芳香基团的C-H弯曲振动。gydF4y2Ba2 a (b)gydF4y2Ba．QT-SPION光谱在3386 cm处显示出较宽的吸收带gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}，表示羟基和其他特征带的拉伸振动，证实了槲皮素在图中超顺磁纳米颗粒上的成功偶联。gydF4y2Ba2 (c)gydF4y2Ba．进行XRD测量，以确定样品中存在的晶体相。数字gydF4y2Ba2 b (a - c)gydF4y2Ba为QT、葡聚糖包被SPIONs和QT共轭超顺磁性纳米颗粒的粉末XRD谱图。这揭示了一种类似于晶体磁铁矿铁的模式gydF4y2Ba_3.gydF4y2BaOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba并在2Ѳ = 30.1°、35.4°、43.9°、53.4°、57.0°和62.6°处均有相应的主要峰，证实了磁铁矿晶体结构的存在。纯QT的XRD图谱显示出大量明显的高结晶性峰gydF4y2Ba^49gydF4y2Ba但与纯QT相比，QT- spions中没有观察到衍射峰。这一发现提供了证据，证明QT- spions中的游离QT确实从晶体态转变为无定形态gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba．通过FE-SEM对QT偶联SPIONs的外部形态进行了表征，结果表明槲皮素偶联NPs呈球形(图2)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．采用动态光散射法(DLS)测量了磁铁矿纳米颗粒的水动力尺寸。如图所示。gydF4y2Ba2 (E, F)gydF4y2Ba结果表明，槲皮素与葡聚糖包被SPIONs偶联后，QT-SPIONs在水溶液中的粒径分布均匀，平均水动力直径为60 nm，增大到69.5 nm。gydF4y2Ba

莫里斯水迷宫(MWM)试验gydF4y2Ba

利用每天4轮训练的数据计算每个训练日的平均逃逸延迟。各组的平均逃逸潜伏期比较采用单因素方差分析，差异无统计学意义(P = 0.4848，图。gydF4y2Ba3 a, BgydF4y2Ba)．第二个训练日也获得了类似的结果。然而，在训练第三天，SPION (50 mg/kg和100 mg/kg)组表现出明显高于对照组和假手术组的逃逸潜伏期(分别P < 0.01和P < 0.001)。此外，双向方差分析结果显示，在5天的训练中，QT和QT- spions治疗比对照组的逃逸潜伏期更短。相比之下，其他组与对照组相比没有显著差异(图2)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．50 mg/kg (p < 0.05)和100 mg/kg (p < 0.001)的QT间期和50mg /kg的QT间期- SPION (p < 0.05)在训练天数内与对照组相比显著缩短(p < 0.05)，而其他各组与对照组相比无显著差异。本研究评估的另一个参数是路径长度(动物总行走距离)，这是在训练天数内获得的(图。gydF4y2Ba3 c, DgydF4y2Ba)．结果显示，在训练期间，各组的路径长度均有所缩短。双因素方差分析结果显示各组间无显著性差异。gydF4y2Ba

探头试验日测量的第三个调查参数为在靶区停留的时间，靶区为训练日的含板区。将在目标区域(本研究中将Z3区域视为目标区域)所花费的时间与在相反区域(本研究中将Z1区域视为目标区域)所花费的时间进行比较。结果显示，与其他组相比，QT-SPION-50和QT-SPION-100 mg/kg组在靶区停留的时间显著延长(p < 0.05和p < 0.01)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

此外，研究组在探针试验当天记录了板交叉的数量(6gydF4y2Ba^thgydF4y2Ba天)。得到的结果显示，QT (100 mg/kg, p < 0.05)和QT- SPIONs (50 mg/kg, p < 0.01)处理大鼠的板交叉数显著高于其他各组，但该参数与其他各组比较，差异无统计学意义(图5)。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

组织学分析和定量组织铁测定gydF4y2Ba

普鲁士蓝染色结果显示，对照组脑组织铁浓度不明显(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．然而，经SPION和QT-SPION治疗组的脑组织中可见铁聚集(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．对对照组、SPION组和QT-SPION组的肾脏和肝脏组织进行普鲁士蓝染色，得到的结果显示，与对照组相比，SPION组和QT-SPION组的肝脏中发现了更多的铁聚集(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．肾组织的结果也显示了与肝脏相似的结果，因此SPION和QT-SPION处理组比对照组观察到更多的铁聚集(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）gydF4y2Ba

这些结果与ICP分析结果一致。观察到SPION治疗组脑组织铁浓度显著高于QT-SPION治疗组和对照组(P < 0.001)(图。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．此外，QT和QT- spion组肝组织铁浓度均高于对照组，但对照组和QT- spion组间差异无统计学意义(图2)。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．与其他结果相反的是，与SPION组和对照组相比，QT-SPION组铁浓度显著升高(图2)。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

利用生物信息学工具评估QT对神经细胞信号通路相关蛋白的影响gydF4y2Ba

利用Hex软件计算所制备数据库的蛋白质与QT和SPIONs作为不同配体之间的自由能。计算QT和SPIONs与数据库中所有蛋白质的相互作用能，并记录在表中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．利用单因素方差分析比较了SPIONs和QT与蛋白质相互作用所获得的能量。结果显示两组间差异有统计学意义(P = 0.000)。因此，与QT相比，SPIONs不能被认为是配体。gydF4y2Ba

利用Hex软件对QT与所制备数据库的蛋白质进行对接，结果表明与MSK1相互作用能最低，为−310 Kcal/mol。由于从其他蛋白质和QT得到的相互作用能与MSK1-Q没有显著差异，另外由于类似研究的结果存在差异，缺乏确定化合物抑制作用的标准，另一方面所得到的能量已经低到合适的程度，可以将QT视为抑制剂，因此下一步相互作用能的评价和对接使用gydF4y2BaAutoDockgydF4y2Ba（gydF4y2BaAutoDock 4gydF4y2Ba．gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba6）gydF4y2Ba软件根据该软件得到的结果，FegydF4y2Ba_3.gydF4y2BaOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba由于相互作用能低，也不能被认为是一种抑制剂。MSK1-Q配合物也具有最低的相互作用能，但同样的问题尚未解决。由于QT与各种蛋白质的相互作用能量之间缺乏显著差异，因此将几种蛋白质作为QT抑制导致学习和记忆改善的候选蛋白质似乎并不合理。同时，得到的结果具有一致性gydF4y2BaAutoDockgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba十六进制gydF4y2Ba软件因此，两种软件得到的QT与每个候选蛋白之间相互作用能的差异是相似的。gydF4y2Ba

为了获得QT在大脑(主要是海马)中导致机制学习和记忆改善的最可能靶点，我们决定将QT和候选蛋白质的相互作用能与之前作为每种蛋白质的有效抑制剂引入的蛋白质及其特定抑制剂的相互作用能进行比较。由于实验研究了抑制剂的作用，并证明它们是针对靶蛋白的合适治疗方法，因此比较QT与每种蛋白的特定抑制剂之间的相互作用能，有助于判断QT抑制作用是否显著有效。因此，如果QT与各蛋白质之间的相互作用能低于蛋白质与其特定抑制剂之间的相同指数，且抑制剂的ki值低于QT，则可以认为QT是该蛋白质较好的抑制剂。如果不是，那么QT作为特异性抑制剂，不能被认为是有效的抑制剂，与其他蛋白相比，QT的作用可以忽略。gydF4y2Ba

因此，我们搜索了PubChem数据库、PubMed数据库和PDB数据库，以找到用于治疗几种疾病的最有效的蛋白质抑制剂。由于凋亡信号通路中的许多蛋白质是癌症治疗的靶点，因此发现了几种化合物作为抑制剂。在本研究中，我们试图评估所有抑制剂的相互作用状态，尽管它们可能不包括所有可用的抑制剂。然后报告最佳对接结果的抑制剂与QT进行比较gydF4y2Ba1gydF4y2Ba还介绍了具有PubChem id的抑制剂。但是，通过比较蛋白质抑制剂和蛋白质- QT的相互作用能可以发现，在某些情况下，蛋白质抑制剂的计算能量低于蛋白质- QT，因此，在这些情况下，QT主要不被认为是一种抑制剂。gydF4y2Ba

得到的结果包括8种蛋白质gydF4y2BaMSK1gydF4y2Ba，gydF4y2BaRSK2gydF4y2Ba，gydF4y2BaP53gydF4y2Ba，gydF4y2BaCdc42gydF4y2Ba，gydF4y2BaCRKgydF4y2Ba，gydF4y2BaFADDgydF4y2Ba，gydF4y2BaApaf1gydF4y2Ba,gydF4y2BaCytCgydF4y2Ba还使用gydF4y2BaLigandScoutgydF4y2Ba它研究QT的药效团特征和每种蛋白质的抑制剂，并确定边界的数量和类型。由于该软件的观点是评估配体作为治疗性化合物，因此重新检查化合物的结合状态是很重要的。gydF4y2Ba

第一个作用能明显低于蛋白质抑制剂的蛋白质是丝裂原应激激酶1，它是一种激酶，存在于各种细胞的几个亚细胞位置，包括成年大鼠的神经细胞gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba．该激酶作为MAPK信号通路的关键成员，通过神经营养素或凋亡信号通路参与多种蛋白的磷酸化和激活，从而导致细胞的存活或死亡gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba．通过对接分析得到配体与配合物侧链相互作用的MMFF94能量最小化后，QT作为一个药效团，在a链上与Gly433形成3个氢键，与Ser438形成2个氢键，这些氢键位于一个由38个氨基酸组成的疏水袋中的蛋白激酶结构域，其中大部分氨基酸具有疏水侧链(图)。gydF4y2Ba6 a、bgydF4y2Ba)．这一发现强调了QT通过其OH基团形成各种氢键的能力。相比之下，由于LiganScout获得的结果，MSK1和抑制剂可以与MSK1 B链上的Ser624形成氢键，并与B链上的Val 711、Ile 730和Ala 710形成三种疏水相互作用，构成核糖体蛋白S6激酶结构域(图。gydF4y2Ba6 c, dgydF4y2Ba)．可以观察到，QT-MSK1相互作用获得的较低的相互作用能是由于更多的氢键和参与相互作用的氨基酸数量。在本研究中，QT与RSK2的Lys72和Ala374氨基酸形成了4个氢键，均参与蛋白激酶结构域1。此外，RSK2-Q配合物的比较(图;gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)与rsk2抑制剂(图;gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba)复合物显示QT是一个更有效的相互作用和抑制该蛋白的候选者(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

细胞分裂周期42是一个重要的激酶，是CamK||-Cdc42-PAK2信号级联的关键成员gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba．QT通过三个氢键和一个疏水相互作用与该蛋白结合，其中GTP核苷酸结合域中的Val93, Val98, Ile101, Thr102, Pro106, Phe110和Leu149的氨基酸(图。gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba而该蛋白的抑制剂通过三种疏水相互作用与同一结构域结合(图。gydF4y2Ba7 dgydF4y2Ba)，导致两个配体之间的相互作用能量有显著差异，证明QT的相互作用和抑制作用更强。gydF4y2Ba

P53- QT复合体由5个氢键和1个疏水相互作用组成，其中QT的OH基团和P53的氨基酸(包括Leu230和Gln58)起作用。gydF4y2Ba7 egydF4y2Ba)．另一方面，P53-inhibitor复合物是基于3种疏水作用，以及QT芳香环与Leu137、Arg292、Ala2.3、Met312、Tyr285、Phe282等氨基酸的2种相互作用而形成的。gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba)．所有参与这两种配合物的氨基酸都位于二磷酸核糖核苷还原酶亚基上;但P53- QT相互作用主要由氢键组成，而P53-抑制剂复合体主要由疏水相互作用组成，这一差异与两个复合体相互作用能的差异是一致的。此外，与激酶类似，QT也能结合到P53的核糖糖苷结合域(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

细胞凋亡通路的关键成员CytC、Apaf1、CRK和FADD的结果也显示QT与CytC、Apaf1、CRK和FADD的相互作用包括3个氢键(His18、Leu35、Thr49、Trp59、Tyr67、Met80，均位于CytC结构域)(图)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)、3个氢键和1个疏水相互作用(Gln924、Asn1219和Lys1221均位于凋亡蛋白酶激活因子结构域)(图。gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba)， 5个氢键(Tyr14, Gly66, Ser85和Asp95位于SH2结构域)(图。gydF4y2Ba8 egydF4y2Ba)，以及一个氢键和一个疏水相互作用(Ala68、Arg72、Leu76均位于该蛋白的DED结构域)(图。gydF4y2Ba8 ggydF4y2Ba分别)。gydF4y2Ba

此外，CytC、Apaf1、CRK和FADD蛋白与其抑制剂的相互作用包括一个氢键(Tyr67位于CytC上)(图2)。gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba)， 1个氢键和2个疏水键(Ile603, Thr604, Leu606, Lys916，分配在凋亡蛋白酶激活因子区域)(图。gydF4y2Ba8 dgydF4y2Ba)、3种疏水相互作用(Tyr14、Tyr47、Leu87和Leu97位于pn SH2结构域)(图。gydF4y2Ba8 egydF4y2Ba)和两个疏水相互作用(Ala68和leu76位于该蛋白的DED结构域)(图。gydF4y2Ba8 hgydF4y2Ba分别)。gydF4y2Ba

根据以往的研究，这三种蛋白与LTP之间均未见相关报道，而我们的研究结果显示QT与这三种蛋白之间具有较高的相互作用亲和力，特别是与Ki值低于其特异性抑制剂的FADD之间。基于这一发现，可以认为QT改善学习和记忆的作用机制不仅依赖于信号可塑性的维持，还依赖于抑制参与凋亡过程起始和进展的蛋白质的活性，从而抑制神经细胞的损失，帮助维持记忆。gydF4y2Ba

QT作为一种重要的类黄酮存在于蔬菜和水果中，如红茶和绿茶，至少在动物模型中具有预防认知功能低下的潜力gydF4y2Ba^{53gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba}．QT对学习和记忆的有益作用存在矛盾的发现。张和同事们报道了槲皮素在减少氧化应激方面的神经保护作用，以及暴露在PM2.5中的受试者的特征gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba．Liaquat和他的同事们发现QT可以有效地防止氧化应激引起的记忆损伤，并提高记忆力gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba．此外，Mehta还报道了通过增加海马体中GLUT4的产生来减少大鼠胰岛素抵抗引起的记忆障碍gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba．Pei和同事的研究结果还揭示了槲皮素通过增强Akt信号通路抑制记忆障碍gydF4y2Ba^61gydF4y2Ba．另一方面，Dong和他的同事指出，槲皮素增强了d -半乳糖治疗大鼠的记忆缺陷gydF4y2Ba^62gydF4y2Ba．同样，Jung和同事们通过减少Akt和CREB蛋白的产生，证明了槲皮素对正常小鼠的学习和记忆的不利影响gydF4y2Ba^63gydF4y2Ba．其他研究小组讨论了QT的抑制作用，QT对MAPK信号通路的影响已被研究，因此WarggydF4y2Ba等gydF4y2Ba，报道QT可通过抑制MAPK和炎症信号通路抑制肝纤维化进程gydF4y2Ba^64gydF4y2Ba．另外，Kim等通过MAPK信号通路研究了QT对癌细胞凋亡的影响。而他们的结论是，这一信号通路和凋亡是通过调控MSK1和随后的H3去乙酰化来调控的gydF4y2Ba^65gydF4y2Ba．对QT和黄酮类化合物及其与蛋白质特别是酪氨酸激酶家族相互作用的研究表明，黄酮类化合物能够通过与腺苷结合袋结合并模拟其结合来抑制酪氨酸激酶gydF4y2Ba^66gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

然而，QT的溶解性差和难以通过血脑屏障限制了其在中枢神经系统中的作用gydF4y2Ba^{67gydF4y2Ba，gydF4y2Ba68gydF4y2Ba}．通过制造QT的水溶性衍生物，已经使用了许多方法来提高QT的溶解度gydF4y2Ba^69gydF4y2Ba，使用二甲基亚砜(DMSO)gydF4y2Ba^70gydF4y2Ba并与环糊精和脂质体络合gydF4y2Ba^{71gydF4y2Ba，gydF4y2Ba72gydF4y2Ba}．DMSO具有血管收缩和神经毒性作用gydF4y2Ba^73gydF4y2Ba，而合成的QT水溶性衍生物的生物利用度有限gydF4y2Ba^69gydF4y2Ba．此外，使用环糊精可能有肾毒性作用，QT的脂质体储存可能降低其稳定性gydF4y2Ba^74gydF4y2Ba．这些限制促使研究人员寻找一种安全、稳定、高效的传递方法来提高QT的溶解度和生物利用度，新型杂化纳米材料被广泛认为可以克服这些限制。本研究合成的QT- spion偶联剂是一种最新的增加QT血液循环周期、增加脑内QT浓度的给药系统。gydF4y2Ba

卡尼亚gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．据报道，肝脏和肾脏参与了小鼠体内SPION的移除gydF4y2Ba^75gydF4y2Ba．在这方面，据报道，使用SPION在肝脏、肾脏和心脏组织中未观察到明显的毒性gydF4y2Ba^{76gydF4y2Ba，gydF4y2Ba77gydF4y2Ba，gydF4y2Ba78gydF4y2Ba}．与我们的结果一致，在Silva和同事的研究中，SPION治疗的动物肝脏组织未观察到坏死gydF4y2Ba^{79gydF4y2Ba，gydF4y2Ba80gydF4y2Ba}．另一方面，也有研究表明，包括SIOPN在内的NPs可以通过包括肝脏在内的组织并传递到靶器官gydF4y2Ba^81gydF4y2Ba．在这方面，由于我们使用了比上述研究更高浓度的SPION和QT-SPION，普鲁士蓝染色中出现蓝点，肝脏和肾脏组织中铁浓度也明显较高可能是由于给药浓度较高所致。而大脑中铁浓度较高也显示QT进入脑组织，而在荧光显微镜照片中没有观察到毒性。考虑到在使用SPION将药物化合物输送到组织的研究中未观察到毒性，应进行更多的研究以调查SPION的组织分布。gydF4y2Ba

在我们最近发表的论文中gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba讨论了合成方法、尺寸、表面包覆、偶联工艺等因素对spion药代动力学和生物分布的影响。在另一篇论文中，我们发现SPIONs可以提高血浆和大脑中槲皮素的含量gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba．本研究结果表明，SPION作为一种载体，增加了脑组织中槲皮素的含量。SPIONs的毒性取决于许多因素。影响SPIONs的药代动力学和生物分布的因素几乎相同。总的来说，大小、结构、形状和涂层对SPIONs的细胞摄取、细胞毒性、分布和清除有重要影响。gydF4y2Ba

一旦SPIONs进入胃肠道，上皮细胞吸收它们，SPIONs进入体循环。这是一种有用的方法，特别是在慢性病的情况下。我们研究中的SPIONs在胃肠道中被吸收正如我们之前展示的那样gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba．在本研究中，我们证实了SPIONs释放槲皮素，同时组织学和旁临床结果表明SPIONs具有毒性gydF4y2Ba^{45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba82gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

关于QT对蛋白质及其介导预防作用的靶蛋白的抑制作用有许多不明确的观点，也没有或很少有关于QT对完整/健康生物体的学习和记忆的影响的研究，进行了一项对半研究。首先，我们研究了QT和QT- spion作为传递系统对完整/健康大鼠学习和记忆的影响。gydF4y2Ba

本研究的MWM结果显示QT对完整Wistar大鼠的学习记忆有显著改善作用，这与以往的实验研究不一致gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba83gydF4y2Ba，gydF4y2Ba84gydF4y2Ba}．与对照组相比，QT组(50 mg/kg和100 mg/kg)和QT- spion组(50 mg/kg)训练期间的逃逸潜伏期显著缩短，表明治疗大鼠的认知功能得到改善。这些结果得到了探针试验日结果的证实，与其余6组相比，QT- spion (50 mg/kg)和QT (100 mg/kg)在靶区停留的时间和板交叉数量显著增加。与此同时，QT (50 mg/kg)与QT- spion (50 mg/kg)相比，并没有显示出我们预期的预期结果。槲皮素的低生物利用度导致其在改善学习和记忆方面的不足，正如我们在之前的生物利用度评估中所显示的那样gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba．然而，与我们的预期相反，与对照组相比，QT-SPION (100 mg/kg)在认知功能方面也没有表现出明显的改善。根据以往的研究，SPION可以通过Fenton反应干扰细胞的氧化还原平衡。因此，在这种结合形式的治疗中使用的高浓度可能对神经元有害，这主要是由于SPION在脑组织中的积累gydF4y2Ba^{85gydF4y2Ba，gydF4y2Ba86gydF4y2Ba，gydF4y2Ba87gydF4y2Ba}．因此，使用SPION并不完全安全，高剂量时可能会引起细胞毒性gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba．然而，根据我们课题组的结果，SPION对完整/健康大鼠造成肝毒性，并引起MDA升高，而QT组和QT-SPION组(50 mg/kg和100 mg/kg)均未显示GSH、MDA水平和CAT活性的变化gydF4y2Ba^82gydF4y2Ba．另一方面，QT (100 mg/kg)和QT- spion (50 mg/kg)也得到了类似的结果，通过这些结果可以确认所制造的偶联物的有效性。本课题组前期研究中对QT-SPION的加载试验结果为42%，可见QT-SPION中槲皮素的浓度(50 mg/kg)甚至低于50 mg/kggydF4y2Ba^45gydF4y2Ba．基于这些结果，QT- spion的使用消除了使用高剂量QT的需要，因为它增加了这种天然化合物的生物利用度。gydF4y2Ba

槲皮素一直被认为是一种非常有效的抗氧化剂类黄酮，但我们在我们的治疗中没有使用任何氧化剂。因此，槲皮素和所设计的传递系统的有益作用是由于其与蛋白质结合的潜力。gydF4y2Ba

对QT和黄酮类化合物及其与蛋白质特别是酪氨酸激酶家族相互作用的研究表明，黄酮类化合物能够通过与腺苷结合袋结合并模拟其结合来抑制酪氨酸激酶gydF4y2Ba^66gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

然而，根据我们的搜索，目前还没有关于槲皮素结合的确切蛋白质靶点的一般性研究。由于实验研究对我们的研究小组来说是昂贵的，并且对这个问题很感兴趣，所以决定进行硅片筛选。在我们的研究中，RSK2、MSK1、Cdc42和CRK具有酪氨酸激酶活性。抑制Src激酶家族也表明黄酮类化合物与蛋白质的酪氨酸激酶结构域结合gydF4y2Ba^88gydF4y2Ba．然而，有趣的是，与msk -1抑制剂相比，MSK1-QT的相互作用能更低，这也与我们的结果不一致。尽管抑制MSK1和RSK2导致细胞存活，是治疗几种肿瘤和进行性疾病的有效干预措施;然而，抑制神经细胞死亡是预防神经退行性疾病发展的最重要机制之一，也是改善学习和记忆的重要机制之一，这与递质的持续产生和LTP的维持直接相关。因此，MSK1和RSK2的抑制或下调与LTP和学习记忆中断相关信号通路的激活有关gydF4y2Ba^89gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

此外，多项研究结果表明，MAPK信号通路相关蛋白的上调在tau磷酸化作为阿尔茨海默病的主要标志中起着重要作用gydF4y2Ba^{90gydF4y2Ba，gydF4y2Ba91gydF4y2Ba}．相反，研究MSK1/2基因突变的影响会导致缺血细胞增殖的减少，这可以被认为是这种疾病的一种治疗方法gydF4y2Ba^92gydF4y2Ba．根据这些研究的结果，抑制MSK1和RSK2作为神经细胞增殖的关键调节激酶，可以作为预防神经退行性疾病发展和阻止这些疾病进展的一种治疗方法，最重要的是有助于LTP的维持。gydF4y2Ba

由于cdc42在预防神经退行性疾病以及LTP的发展和维持方面的作用，该蛋白的过表达被认为是预防神经退行性疾病的一种治疗方法gydF4y2Ba^93gydF4y2Ba．Yang和同事已经证明Cdc42的激活依赖于胍区交换域发生的结构变化gydF4y2Ba^94gydF4y2Ba．因此，阻断该结构域可以被认为是抑制该蛋白的一种治疗方法。也有人强调，为了激活Wnt信号中的Cdc42和Rac蛋白，调控Cdc42是必要的gydF4y2Ba^95gydF4y2Ba．对LTP相关信号通路的研究结果表明，Cdc42作为激活MMP9和5-HT7R的靶点激活，可导致树突重塑，从而导致信号可塑性，进而破坏LTP，同时可能对逆转学习有积极影响gydF4y2Ba^96gydF4y2Ba．因此，抑制Cdc42可能产生两种矛盾的结果，一种是抑制神经细胞再生，另一种是LTP损伤。考虑到在本研究中，QT和QT- spion缀合物以剂量依赖的方式改善了学习和记忆，那么可以说QT可能是Cdc42的候选调节因子，通过剂量依赖机制调节Cdc42来维持LTP，从而使剂量高于一定范围可能无效甚至产生不良反应。gydF4y2Ba

P53通过调控LTP相关基因的表达，在突触可塑性调控中发挥重要作用gydF4y2Ba^97gydF4y2Ba．此外，已有研究表明，LTP缺乏导致海马细胞P53表达水平升高。与我们的结果一致，抑制p53导致LTP和突触可塑性的增强，同时也抑制记忆中断gydF4y2Ba^98gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相反，从记忆损伤中获得的结果显示，LTP损伤的治疗通过抑制P53的氧化引起P53的恢复gydF4y2Ba^99gydF4y2Ba．P53乙酰化也被认为是抑制神经退行性疾病进展的重要阶段gydF4y2Ba^{One hundred.gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

根据我们的结果和休斯提出的作用机制gydF4y2Ba^101gydF4y2Ba细胞P53水平升高导致神经元细胞凋亡，导致神经退行性变，因此抑制该蛋白可能参与抑制神经退行性变gydF4y2Ba^101gydF4y2Ba．虽然，这些结果与我们对QT对P53的抑制作用的发现是一致的，但由于没有对神经细胞施加损伤，结果表明P53对LTP的维持是重要的，那么可以得出QT改善学习记忆的作用机制与QT对P53的抑制作用无关。gydF4y2Ba

QT的相互作用已在各种研究中进行了调查gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba．一项研究结果表明，QT与钙调神经磷酸酶的相互作用限制了该蛋白与其底物的相互作用，从而抑制了小鼠脾脏组织中细胞因子基因的表达gydF4y2Ba^102gydF4y2Ba．QT对叶绿体ATP酶复合物抑制作用的实验研究表明，QT通过与CF和F0相互作用抑制叶绿体中氢转移和ATP的产生gydF4y2Ba^103gydF4y2Ba．QT与酿酒酵母α-葡萄糖苷酶的相互作用能量小于QT衍生物与同一蛋白质的相互作用能量，因此可以利用生物信息学软件进行类似的研究gydF4y2Ba^61gydF4y2Ba．QT与白蛋白和卵清蛋白的相互作用已在多项研究中报道gydF4y2Ba^104gydF4y2Ba．QT被认为是昆虫精氨酸激酶的抑制剂，它与位于该酶活性位点的色氨酸氨基酸相互作用gydF4y2Ba^105gydF4y2Ba．与我们的研究一致，关于黄酮类化合物包括QT对神经损伤的治疗作用的研究表明，QT与IR3, 2PRG形成稳定的复合物，相互作用能在7-8 kCal/mol范围内使用gydF4y2BaAutoDockgydF4y2Ba与国际标准能源相比，软件和这些能源被认为是可取的gydF4y2Ba^106gydF4y2Ba．通过研究该黄酮与Cox-2的相互作用，研究了QT的抗炎作用，得到的结果表明，QT的高dock分数是由于该蛋白活性位点与氨基酸的两个氢键;然而，获得的分数还没有与该蛋白的其他已知抑制剂进行比较gydF4y2Ba^107gydF4y2Ba．QT对学习和记忆或神经损伤的影响的研究表明，QT在硅预测中是一种非常有效的抑制剂。gydF4y2Ba

Lockshmi和同事评估了7- o - β- d -葡萄糖苷与Akt1的相互作用能量，同时预测了适当的抑制作用，这一发现通过降低凋亡蛋白的表达水平得到证实gydF4y2Ba^108gydF4y2Ba．然而，没有与该蛋白的其他抑制剂进行比较。gydF4y2Ba

作为炎症途径的重要成员，IKKβ也被研究了QT的抑制潜力，而与其他研究相似，所获得的结果没有与该蛋白的治疗抑制剂进行比较gydF4y2Ba^109gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

QT与类黄酮的对接分析也发现，QT与酪氨酸在Src家族激酶的活性位点上通过形成多个氢键形成更稳定的相互作用，这与我们的结果一致gydF4y2Ba^88gydF4y2Ba．由于乙酰胆碱酯酶(AchE)的诱导活性已被证明是阿尔茨海默病作为一种普遍的神经退行性疾病的标志，QT和一些黄酮类化合物对这种酶的抑制作用进行了研究，并预测了与这种酶的高效相互作用，这也在后续研究中得到了证实gydF4y2Ba^110gydF4y2Ba．同样，在gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba对记忆障碍的研究表明，QT和黄酮类化合物对AchE具有良好的抑制作用，因此可以考虑作为AD的治疗方法gydF4y2Ba^111gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

所有的结果也都是使用Q-SAR软件得出的，并在2013年研究了QT抑制AchE的潜力，其中QT的结合亲和力(−8.8 kCal/mol)与AD药物Deponzil(−7.9 kCal/mol)进行了比较，这是由于其氢键数量高于药物，这与我们的研究结果一致，表明QT的结合亲和力高于拟药物，形成更多的氢键gydF4y2Ba^112gydF4y2Ba．然而，我们的研究是第一个综合比较评价QT通过干扰LTP、神经营养因子和凋亡信号通路来改善完整大鼠学习记忆的作用机制的研究。gydF4y2Ba

考虑到我们的结果是在正常寿命的完整大鼠中获得的，也由于MWM的结果表明，与对照组(对照组、假手术组和SPION组)相比，QT和QT-SPION治疗组大鼠的空间学习和记忆得到了改善，因此可以表明，自由和共轭形式的QT，特别是QT-SPION形式，通过调节神经营养、细胞凋亡等关键激酶来改善学习和记忆。和LTP信号通路，因此除了改善学习和记忆外，它还可以被视为预防神经退行性疾病发展的候选治疗方法。值得注意的是，QT与包括MSK1、RSK2、P53、Cdc42、CytC、FADD、APAf1和CRK在内的许多蛋白质的复合体(MSK1- q: 94.82, MSK1-inhibitor: 74.61;RSK2-Q:31.97, RSK2-Inhibitor: 8.52;P53-Q: 32.77, P53-Inhibitor:28.08;CytC-Q: 59.24, CytC-Inhibitor: 46.44;Apaf1-Q:443.27, Apaf1-Inhibitor:426.47)的Ki值高于这些蛋白的特异性抑制剂;而QT与Cdc42、FADD、CRK相互作用的ki值(Cdc42- q:141.32, Cdc42- inhibitor:141.63;FADD-Q: 13.42, FADD-Inhibitor:13.63;CRK-Q:15.09, CRK-Inhibitor: 22.25)均低于这些蛋白的抑制剂。 Ki value is an indicator of inhibitor determining its effective concentration in which half of the protein activity is inhibited. In addition, low compatibility of QT is a barrier against the effectiveness of this valuable compound that leads to its degradation in a few hours after administration and its effects become non- significant, in contrast, enhancing the bioavailability of QT using conjugated nanostructures such as Fe_3.gydF4y2BaOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba在我们的研究中观察到，与自由QT治疗组相比，通过QT- spion偶联增强QT可以显著改善学习和记忆。在实验研究中，QT与蛋白质的相互作用主要被引入作为QT的潜在目标。将QT与糖原磷酸化酶与没食子酸和二甲双胍的结合能进行比较，发现QT与靶蛋白结合能较低;然而，没有与糖原磷酸化酶特异性抑制剂进行比较gydF4y2Ba^113gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

综上所述，QT可以被认为是一种新型的MAPK和凋亡信号通路蛋白抑制剂，通过干扰蛋白的主要活性域，并通过增强信号可塑性和LTP来维持学习和记忆。gydF4y2Ba

然而,由于所需的QT浓度高于特定抑制剂,和共轭纳米粒子的使用导致学习和记忆获得更好的结果的健康老鼠就可以建议QT-SPION nano-conjugate即使在低浓度比QT可以导致更好的结果由于生物利用度和循环时间增强QT的血流量会导致更高的抗氧化活性和更高效的QT与蛋白质的相互作用。gydF4y2Ba

本研究的主要局限性是缺乏对QT与学习记忆相关蛋白质相互作用的实验研究。然而，我们试图在年轻且没有记忆障碍的大鼠中模拟QT和蛋白质的所有潜在相互作用。为此，我们收集了大鼠责任蛋白的PDB格式，并研究了它们与QT的相互作用，但为了完善我们的发现，并为QT治疗疾病寻找新的靶点，我们还需要进行实验筛选，我们希望这些初步的发现能够帮助其他研究者甚至更详细地研究QT对任何一种蛋白的抑制作用。gydF4y2Ba

实验程序gydF4y2Ba

QT- SPION纳米颗粒的制备与表征gydF4y2Ba

QT以无水粉状形式从Sigma - Aldrich化学公司(Sigma - Aldrich Co.，圣路易斯，密苏里州)购买。QT-SPIONs的制备方案与之前的报道一致gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba，但做了一些修改。简要地，用化学共沉淀法合成了葡聚糖包被SPIONs。无水FeClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba(3 mmol, 0.48 g)， FeClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(1.5 mmol,0.29 g)和葡聚糖T-10 [50 ml, 0.5% (w/w)]溶解于去离子水中，混合后放入配有机械搅拌器的三颈烧瓶中。接下来，在混合物中加入氨溶液，直到溶液的pH值达到9。将该溶液在90°C下保持2小时，并不断搅拌，然后使用强大的外部磁铁收集所产生的沉淀物。上清液用去氧水和乙醇冲洗多次，在烤箱中70°C干燥过夜。为了制备QT共轭磁铁矿纳米颗粒(QT- spion)，通过EDC/NHS法将QT添加到葡聚糖包被的spion中。为此，将100 mg右旋糖酐包裹的磁铁矿纳米颗粒、NHS (6 mg)和EDC (4 mg)在100 ml醋酸盐缓冲液(0.1 M, pH 5.0)和去离子水中超声处理15分钟。然后，将所得的沉淀物添加到槲皮素(100 mg)中，溶解在100 ml DMSO中，在室温下搅拌一夜。然后用外永磁体从悬浮液中分离出槲皮素共轭磁铁矿纳米颗粒，用DMSO、去离子水和丙酮洗涤多次，最后用冷冻干燥机干燥。用各种分析技术对所合成的qt - spion进行了表征。gydF4y2Ba

FT红外光谱记录在Jasco 6300分光光度计上，在传输模式下使用KBr球团，从400到4000厘米的波数操作gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．在室温下，使用PANalytical X 'PERT PRO粉末X射线衍射仪上的Cu K1 (k = 1.54056 Å)辐射收集了磁铁矿纳米颗粒的XRD图谱。形态特征是在日立S-4700场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)上获得的，配有能量色散x射线分析(EDAX)探测器。利用动态光散射(DLS) (VASCO Instruments, FRANCE, CORDOUAN TECHNOLOGIES)测定了所制备的磁性纳米颗粒的粒径分布。gydF4y2Ba

槲皮素含量测定gydF4y2Ba

在377 nm处用紫外可见分光光度计测定了QT-SPIONs中槲皮素的含量。为此，将1 mg槲皮素共轭磁铁矿纳米颗粒溶解在10 ml PBS中，并在8000 rpm下离心30分钟。由下式计算出载药量为42%:gydF4y2Ba

动物gydF4y2Ba

成年雄性Wistar大鼠，体重180-230 g，购自Royan研究所(伊斯法罕，伊朗)。动物被随机分为8组，每个笼子饲养3至5只动物，温度为25±2°C，光照/黑暗周期为12小时(早上07:00亮灯)。为了适应环境，所有大鼠在实验室中饲养两周，并提供无限量的食物和水，笼子的地板上铺有木刨花，每3天更换一次。伊朗设拉子大学国家动物伦理委员会批准了实验方案(IACUC no: 4687/63)。此外，所有实验都是按照《实验动物护理和使用指南》(美国国家卫生研究所出版物第80-23号，1996年修订)进行的，并得到伊斯法罕大学动物伦理委员会的审查和批准。gydF4y2Ba

口服时，QT、SPIONs(粉状)和QT- spion(粉状)在给药前立即悬浮于去离子水(DI)中。在实验过程中，为了防止槲皮素和纳米颗粒可能的团聚，分散体保持在振动筛上。gydF4y2Ba

动物被随机分为8组，每组6只大鼠。gydF4y2Ba

第1组:对照组大鼠不服用任何药物和载体。gydF4y2Ba

第2组:假手术组大鼠给予QT(分散于去离子水中)灌胃7 d。gydF4y2Ba

第三组:大鼠给予50mg /kg/d游离QT(分散于蒸馏水中)治疗7天。gydF4y2Ba

第4组:大鼠给予100mg /kg/d游离QT(分散于蒸馏水中)治疗7天。gydF4y2Ba

第5组:大鼠给予SPIONs 50 mg/kg/d(分散于蒸馏水中)，连续7 d。gydF4y2Ba

第6组:大鼠给予SPIONs 100 mg/kg/d(分散于蒸馏水中)，连续7天。gydF4y2Ba

第7组:大鼠给予QT-SPIONs 50mg /kg/d(分散于蒸馏水中)，连续7天。gydF4y2Ba

第8组:大鼠给予QT-SPIONs 100mg /kg/d(分散于蒸馏水中)，连续7天。gydF4y2Ba

所有配方都以每日剂量口服，为期七天。在治疗过程中进行行为评估。gydF4y2Ba

莫里斯水迷宫(MWM)gydF4y2Ba

空间记忆测试使用gydF4y2Ba莫里斯水迷宫gydF4y2Ba（gydF4y2BaBorjSanatgydF4y2Ba，gydF4y2Ba德黑兰gydF4y2Ba，gydF4y2Ba伊朗gydF4y2Ba)按上述程序gydF4y2Ba^114gydF4y2Ba．老鼠被训练游泳到达一个隐藏在圆形水池(直径180厘米，高60厘米)的平台，这个水池位于一个黑暗的测试室内。通过安装在水池中央上方天花板上的摄像机和计算机跟踪系统(由BorjSanat公司设计的VideoTracking Software)，研究人员测量了逃生延迟、移动距离、在象限内花费的时间和通过平台的次数，作为学习和记忆的指标。池中注满水(23±2°C)至50厘米深。水池边缘有四个等距点，分别为N(北)、E(东)、S(南)和W(西)。一个直径8厘米的无色圆形平台被放置在水面以下1厘米处，位于池的NE象限中间的固定位置(称为区域3，图3)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．水被涂上了奶粉的颜色，以隐藏被淹没的平台的位置。所有大鼠均采用gydF4y2Ba微波加工gydF4y2Ba从治疗第二天开始连续5天。每只老鼠每天训练四次。gydF4y2Ba

在每个回合中，大鼠被释放在四个象限中的一个，面对池壁，这样在训练结束时，所有的老鼠都在所有象限中被释放一次。每次训练持续60秒。老鼠继续游着，直到他们找到了第三区的平台。如果他们找不到平台，实验者就引导他们穿过平台，让他们在上面停留15秒。下一轮训练开始时，所有的大鼠都在这一轮训练。记录的标准是:逃跑潜伏期为在试验日找到隐藏平台的潜伏期，路径长度为大鼠在每个训练回合中移动的距离。gydF4y2Ba

作为最后一步，在第6天，移除平台并进行探针试验，以评估参考内存。记录两个标准:在训练期间，在放置平台的目标区域所花费的时间，以及在探针试验日，当隐藏的平台被移除时，大鼠越过探针位置上方的板交叉次数。gydF4y2Ba

组织学分析及铁含量测定gydF4y2Ba

进行组织学研究以确定SPION组织分布。首先将检查大鼠的脑、肝、肾等器官分离，在10%中性缓冲福尔马林中保存24h。然后，将组织包在石蜡中，用块切割薄层组织。组织切片首先用苏木精和伊红染色，然后用Perl的普鲁士蓝染色。然后用荧光显微镜对制备好的样品进行拍照(IndiaMart)。gydF4y2Ba

为了测定组织中铁的浓度，采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)。准备了相同重量的脑、肝和肾组织片段。接下来用HNO处理gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba(65%)在室温下浸泡16小时，过滤至透明溶液。采用ICP-MS对样本进行评估。在这种技术中，液体样品被转化为气溶胶形式。气溶胶形成的样品在氩气产生的非常高的压力下通过射频场分解。离子被提取并送入检测器。ICP-MS通常用于测量金属浓度。gydF4y2Ba

计算方法gydF4y2Ba

为对接计算准备蛋白质结构gydF4y2Ba

本研究使用KEGG数据库(http://www.kegg.jp/keggbin/highlight_pathway?scale=1.0&map=map04722&keyword=neurotrophin)将所有参与神经营养蛋白信号通路及凋亡相关信号通路的蛋白输入数据库。然后使用KEGG数据库中蛋白质的输入号来搜索gydF4y2Ba蛋白质数据库gydF4y2Ba（gydF4y2BaPDBgydF4y2Ba) (gydF4y2Bahttp://www.rcsb.org/pdb/home/gydF4y2Ba)．gydF4y2BaPDBgydF4y2Ba除去水分子和其他分子后，研究所有蛋白质的文件，然后用PDB格式保存纯蛋白质的结构gydF4y2BaMolegro分子查看器gydF4y2Ba（gydF4y2BaMMVgydF4y2Ba)软件。蛋白质列表已在表中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．另外，QT在sdf格式下的结构由(gydF4y2Bahttps://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/gydF4y2Ba)与gydF4y2BaPubChemgydF4y2BaCID的5280343,C的分子式gydF4y2Ba_15gydF4y2BaHgydF4y2Ba_10gydF4y2BaOgydF4y2Ba_7gydF4y2Ba，分子量为302.238 g/mol(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．各蛋白抑制剂的sdf文件也从gydF4y2BaPubChemgydF4y2Ba在搜索之后gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba，gydF4y2BaScienceDirectgydF4y2Ba,gydF4y2BaPubChemgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

所有得到的结构，包括蛋白质和配体，然后用gydF4y2BaLigandScoutgydF4y2Ba在使用MMFF94力场获得对接产品之前，软件以最小化结构的能量gydF4y2Ba^115gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

对接的计算gydF4y2Ba

十六进制gydF4y2Ba

利用Hex对接软件实现QT与凋亡、神经营养蛋白等信号通路蛋白的对接。gydF4y2Ba十六进制gydF4y2Ba利用快速傅立叶变换(FFT)相关技术，通过分析各种相互作用模式在最短时间内得到的最小自由能，开发了计算最佳相互作用模式下的最小自由能的软件。该软件假定配体刚性，在每个对接过程中可以计算约1000个对接预测gydF4y2Ba^116gydF4y2Ba．为此目的设置的参数包括:gydF4y2Ba

相关类型:仅形状;FFT模式:3D;网格尺寸:0.6;感受器范围:180;配体范围:180;扭转范围:360;距离范围:40;翻译步骤:0.8;盒子尺寸:15个;解决方案:2000。gydF4y2Ba

此外，没有pdb查询完整结构的蛋白质没有被登记到数据库中。gydF4y2Ba

汽车码头gydF4y2Ba

AutoDockgydF4y2Ba是一个用拉马克遗传算法计算蛋白质与配体之间相互作用的对接程序，利用经验自由能力场计算结合能。gydF4y2BaAutoDockgydF4y2Ba4.2.6认为受体蛋白和配体是相对灵活的，通过使用并显示最佳状态作为输出来评估与侧链的几种相互作用状态gydF4y2Ba^{117gydF4y2Ba，gydF4y2Ba118gydF4y2Ba}．在本研究中，我们选择了网格，从而计算了配体之间所有可能的相互作用，并得到了最佳状态。这是一个耗时的步骤。gydF4y2Ba

配体童子军gydF4y2Ba

LigandScoutgydF4y2Ba是一种药效团识别软件，根据配体和蛋白质侧链之间形成的相互作用来评估蛋白质和配体的相互作用，并提供氢键受体和供体基团的信息，显示亲脂区，芳香和电荷转移相互作用gydF4y2Ba^119gydF4y2Ba．这有助于用户识别相互作用，并找到配体中所需的变化，以便设计更有效的抑制剂。在本研究中，我们使用的特征gydF4y2BaLigandscoutgydF4y2Ba以发现QT与蛋白质的相互作用，并比较抑制剂与蛋白质的相互作用。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

六个独立实验的结果以均数±均数计算。采用单因素方差分析，然后进行tukey,s多重比较检验、双因素方差分析或配对t检验，作为多重比较检验来估计差异(gydF4y2BaGraphPad棱镜gydF4y2Ba软件版本6)，P < 0.05认为差异有统计学意义。gydF4y2Ba