福尔马林固定石蜡包埋标本中SARS-CoV和SARS-CoV-2免疫组化和原位杂交检测方法的建立gydF4y2Ba

2019年底，一种新型冠状病毒SARS-CoV-2在中国中部出现，主要导致一种名为COVID-19的呼吸道疾病gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。这种病毒在全球迅速传播，并于2020年3月11日被世卫组织宣布为大流行。截至2020年10月，全球已造成4000万例感染，其中100万人死亡gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

SARS-CoV-2是gydF4y2BaBetacoronavirusgydF4y2Ba按命令分类gydF4y2BaNidoviralesgydF4y2Ba和家人gydF4y2BaCoronaviridaegydF4y2Ba其RNA基因组与sars冠状病毒密切相关gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba。SARS-CoV-2和SARS-CoV进入细胞依赖于受体血管紧张素转换酶2 (ACE2)。在细胞启动蛋白酶TMPRSS2和组织蛋白酶激活刺突蛋白后，病毒包膜和细胞膜发生融合，使病毒基因组进入宿主细胞gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba。刺突蛋白由S1和S2亚基组成，是抗体介导的中和作用的主要靶标，其中免疫原性表位位于S1结构域gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba}。在冠状病毒复制过程中，核蛋白是表达最丰富的蛋白质，其次是刺突gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba。此外，在病毒复制周期中，双链RNA (dsRNA)作为中间产物产生gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

SARS-CoV-2的致病性和传播动力学与SARS-CoV不同gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba迫切需要利用人类疾病和易感动物物种的动物模型来解决病毒学和病理学问题。虽然不是一个详尽的清单，但实验研究已经在动物模型中进行了，包括雪貂gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba，食蟹猴gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba，恒河猴gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba、非洲绿猴gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba埃及果蝠gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba金色的叙利亚仓鼠gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba，转基因hACE2小鼠gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba、猫gydF4y2Ba^{17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba}和狗gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba。目前，利用免疫组织化学(IHC)和原位杂交(ISH)靶向病毒抗原和基因，在体内实验后确定病毒-宿主相互作用的报道有限gydF4y2Ba^{11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}由于缺乏用于测试开发的合适试剂和组织。gydF4y2Ba

本文报道了抗体和RNA探针分别用于检测福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)标本中存在的SARS冠状病毒的适用性。此外，还描述了用于测试开发和质量保证的控制材料的选择。随后，这些优化的测定方法在感染动物的组织和病毒成分的细胞分布上的比较效用被证明。gydF4y2Ba

SARS-CoV和SARS-CoV-2抗原的检测gydF4y2Ba

使用热(ph6或9)和酶介导的表位揭露技术评估几种市售的SARS-CoV抗体，以检测FFPE原生病毒感染细胞颗粒中病毒抗原的存在(表1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.兔单克隆(mAb;经鉴定，中国生物公司40150-R007刺突抗体和兔多克隆核蛋白抗体(中国生物公司，40143-T62)适合在FFPE细胞颗粒上进行免疫组化，其中在SARS-CoV和SARS-CoV-2感染的细胞中观察到特异性的细胞质色素颗粒，而在未感染的细胞上则没有(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baf)。兔单克隆(mAb;中国生物公司40150-R007)刺突抗体与pH9或pH6的检索方法兼容，而兔多克隆核蛋白抗体(中国生物公司，40143 - t62)可以应用于用加热的pH6缓冲液或蛋白酶检索的病毒抗原(表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.在不同的机构(EMC)使用相同的抗体和抗原检索方法检测核蛋白也证明了可重复的免疫标记(补充图gydF4y2Ba1gydF4y2Baa、b)。gydF4y2Ba

除了开发检测SARS-CoV特异性抗原的免疫组化技术外，还评估了免疫组化检测dsrna -病毒复制中间体的效果。在评估的三种抗体中，小鼠和家兔培养的J2重组克隆都能够检测到带有细胞质色素沉积的感染细胞颗粒中的dsRNA(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bag h;增刊。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac, d)。然而，与SARS特异性抗原检测方法相比，免疫标记的数量并不丰富。另一个克隆，9D5，在IHC中没有产生色素沉积。用抗猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的冠状病毒抗体评估细胞颗粒的非特异性结合。使用FIPV抗体在未感染和SARS-CoV感染的细胞中未检测到染色体(未显示)。gydF4y2Ba

SARS-CoV和SARS-CoV-2刺突蛋白编码RNA的检测gydF4y2Ba

评估了一种RNAScope®探针在FFPE细胞颗粒中检测SARS冠状病毒RNA的能力。V-nCoV2019-5探针未对SARS-CoV产生标记(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa)但成功地标记了SARS-CoV-2感染的细胞颗粒(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab).未感染的细胞微球未见标记(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac)。gydF4y2Ba

SARS-CoV和SARS-CoV-2伪病毒在生产细胞中的检测gydF4y2Ba

为了确定FFPE体外生成的表达重组刺突蛋白的伪病毒是否适合用于免疫反应检测，使用上述鉴定的刺突单抗对表达SARS-CoV、SARS-CoV-2或MERS刺突蛋白的慢病毒伪病毒的生产细胞进行了免疫反应检测。在该试验中，刺钉单抗能够检测SARS-CoV和SARS-CoV-2，显示特异性的细胞质和膜色素沉积(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa、b)。表达MERS尖峰的细胞未检测到免疫标记(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac)或未转染的细胞(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad)。gydF4y2Ba

IHC和ISH在动物组织中的应用gydF4y2Ba

在实验获得的SARS-CoV-2感染雪貂的鼻甲骨上，对建立并优化的FFPE细胞微球的IHC和ISH方法进行了测试。使用刺突抗体，观察到免疫标记特异性地标记嗅觉上皮粘膜的腔细胞(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).核蛋白标记(图2)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba与穗标记相比，B)在细胞质中更为普遍。dsRNA免疫标记仅限于核周区域的细胞质(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2BaC)，对应于冠状病毒的复制位点gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba。对于抗穗基因ISH，染色原在感染的上皮细胞细胞质内弥散沉积(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad)用核蛋白、spike或dsRNA抗体进行免疫标记的序列切片(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa、c)或刺突ISH在受感染细胞群中显示一致的标记，证实了在动物组织中检测SARS-CoV-2的特异性。gydF4y2Ba

在本报告中，我们对FFPE标本中存在的SARS-CoV和SARS-CoV-2的抗原和RNA检测方法进行了优化。利用针对SARS-CoV刺突和核蛋白的抗体，我们能够检测到感染细胞中存在的SARS-CoV和SARS-CoV-2抗原，并对其进行组织学处理。此外，RNAScopegydF4y2Ba^®gydF4y2Ba专为SARS-CoV-2设计的探针，专门标记同源病毒株。病毒复制产物dsRNA的检测在免疫组化上也很明显。此外，我们利用FFPE伪病毒产生细胞进行SARS- cov刺突免疫嵌合，并证明了对两种SARS病毒株的免疫标记特异性。gydF4y2Ba

在免疫组化或ISH应用中，需要为病理调查开发和验证阳性对照材料，以确保所产生结果的质量。感染了原生病毒的易感细胞系可以在不需要动物组织的情况下产生。然而，对于缺乏进行体外工作所需的高密封设施的实验室来说，这可能是有问题的。作为替代方案，具有相关基因工程专业知识的机构可以通过转染和伪型系统在细胞培养中产生表达的蛋白质gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba，可作为活病毒工作的替代方案，以证明福尔马林固定和石蜡包埋后表达的病毒蛋白的检测。gydF4y2Ba

虽然福尔马林可以可靠地灭活感染因子，但固定可导致表位交联并阻碍抗体结合。酶或热介导(pH 6或9缓冲液)抗原回收可用于重新暴露表位，尽管这些方法的生化影响尚未得到评估gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba。通常，只有一种抗原回收方法，通常是热介导的回收，用于检测SARS-CoV-2病毒抗原gydF4y2Ba^{22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba}。在我们目前的研究中使用的刺突抗体之前被报道不适合FFPE切片的IHCgydF4y2Ba^24gydF4y2Ba。在这里，pH 9的检索被证明比pH 6在试图揭示刺突表位时更有效。至于核蛋白检测，pH 6抗原检索在两个独立的机构设置中是可重复的。此外，在我们的研究中证明了蛋白酶抗原检索检测核蛋白的适用性。核蛋白抗原的热或酶介导的抗原检索的多功能性可以为研究者提供更大的灵活性，以针对其他感兴趣的抗原进行多标记。gydF4y2Ba

由于比较SARS-CoV和SARS-CoV-2的发病机制的科学兴趣越来越大，我们评估了抗体对两种病毒株交叉反应的能力。刺突S1受体结合域(RBD)特异性抗体能够检测SARS-CoV原生病毒的刺突抗原和表达的刺突蛋白。尽管SARS-CoV和SARS-CoV-2的rbd只有76%的氨基酸相同gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba，用单一抗体制备的检测表明，所评估的两株菌株之间存在表位保守性。相反，SARS-CoV刺突S1抗体未与MERS刺突蛋白发生交叉反应和结合，可能是由于SARS-CoV-2与MERS- cov之间的氨基酸同源性较低(33%)gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

相反，SARS冠状病毒核蛋白氨基酸在SARS- cov和SARS- cov -2之间高度保守，氨基酸同源性为90%gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba。我们发现核蛋白抗体与两种病毒发生交叉反应，证实了这一事实。除了检测病毒特异性蛋白外，病毒复制中间体dsRNA还可用于检测包括冠状病毒在内的RNA病毒gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba。除了如前所述的检测sars冠状病毒的能力之外gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba在美国，SARS-CoV-2也可以通过免疫组化检测，使用dsRNA抗体。然而，这需要被感染的细胞作为阳性对照，因为dsRNA只在病毒复制期间合成。gydF4y2Ba

在检测实验感染的SARS-CoV-2动物组织中的病毒产物时，也证明了这些检测方法的实用性。在鼻鼻甲上皮细胞中，dsRNA存在于核周细胞质中。早期病毒复制涉及负链基因组模板和dsRNA复制中间体的合成，其中dsRNA先前使用免疫金染色技术在位于核周区域的修饰ER膜的双膜囊泡中观察到gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba。我们的研究证实在呼吸上皮细胞的顶端可以检测到尖峰糖蛋白。该定位与最近报告的SARS-CoV-2感染肠道类器官相似gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

总之，我们已经证明了琼脂糖包埋的表达靶蛋白的感染或转染细胞颗粒，固定并常规处理用于组织病理学，在开发用于动物模型研究的原位检测方法方面的适用性。组织切片病毒检测的初步评估证明了免疫组化和ISH在FFPE组织上的适用性，重要的是通过常规光学显微镜提供了病毒成分的空间细胞分布的知识。在细胞颗粒平台中检测SARS冠状病毒抗原和核酸也允许快速开发病理工具，可用于未来评估SARS- cov -2发病机制和干预研究。gydF4y2Ba

细胞和病毒gydF4y2Ba

Vero E6细胞在添加10%胎牛血清(FCS)、HEPES、碳酸氢钠、青霉素(100 IU/mL)和链霉素(100 IU/mL)的Dulbecco改良Eagle’s培养基(DMEM, Gibco)中维持。人胚胎肾(HEK) 293T-17细胞在添加FCS、青霉素(100 IU/mL)和链霉素(100 IU/mL)的DMEM中生长。细胞在37°C的潮湿CO中生长gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba孵化器。sars冠状病毒(分离株HKU-39849)gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba和SARS-CoV-2分离株BetaCoV/Munich/BavPat1/2020;欧洲病毒档案全球#026V-03883)gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba用于体外实验，而SARS-CoV-2 (nCoV/Victoria/1/2020)用于体内实验gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba。SARS-CoV和SARS-CoV-2均在VeroE6 (ATCC)上传播gydF4y2Ba^®gydF4y2BaCRL 1586TM)细胞在Opti-MEM I (1X) + GlutaMAX (Thermofisher)中，在37°C加湿CO中补充青霉素(100 IU/mL)和链霉素(100 IU/mL)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba孵化器。以感染倍数(MOI)为0.01的条件感染VeroE6细胞，培养72 h (h)。培养上清经离心清除，在- 80°C等分液中保存。使用传染性病毒的调查是在荷兰伊拉斯谟医疗中心生物安全3级实验室内进行的。gydF4y2Ba

病毒感染细胞的生成gydF4y2Ba

用SARS-CoV和SARS-CoV-2分别接种Vero E6细胞，MOI为0.3。感染24小时后，用10%中性缓冲福尔马林(NBF)固定细胞，同时用另一个未感染细胞的烧瓶固定细胞。gydF4y2Ba

病毒假颗粒在产生细胞中的产生gydF4y2Ba

如前所述，将重组刺突蛋白假型化为慢病毒核心gydF4y2Ba^{31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba}。这是在APHA的BSL2实验室进行的。简单地说，用p8.91 (gag-pol)、pCAGGS-s(全长SARS-CoV、SARS-CoV-2或MERS spike)和pCSFLW转染HEK 293T-17细胞。转染后5天，用10%的NBF固定细胞。gydF4y2Ba

准备用于组织学处理的细胞gydF4y2Ba

将体外感染或转染的固定单层细胞从烧瓶上刮下，1500℃离心gydF4y2BaggydF4y2Ba。去除上清后，将细胞颗粒重新悬浮在2%琼脂糖(Sigma)中，并使其凝固。琼脂糖包埋细胞微球用常规组织学方法在组织学处理机上处理gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

动物实验感染gydF4y2Ba

根据1986年动物(科学程序)法案，在英国APHA危险病原体咨询委员会3级(ACDP3)认证的动物复合体内进行体内实验。动物实验经APHA动物福利与伦理审查机构(AWERB;HOL-PP3405816/1/001)。用1 ml 2 × 10的SARS-CoV-2经鼻接种雪貂gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba组织培养感染剂量50gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba）.在预先确定的时间点对动物进行人道安乐死，并将组织收集到10%的NBF中。gydF4y2Ba

免疫组织化学(包含IHC)gydF4y2Ba

4个微米厚的切片分别用二甲苯和梯度醇脱蜡和再水化，用3%过氧化氢在甲醇(VWR International)中淬灭内源性过氧化物酶，室温(RT)下淬灭15分钟，然后用pH6 (10 mM柠檬酸缓冲液，用1 M氢氧化钠调至pH6)揭开表位;， pH9目标检索缓冲液(Envision FLEX，高pH;Dako)在97°C下保存10分钟，或蛋白酶XXIV (Sigma-Aldrich)在RT下保存15分钟。载玻片用正常山羊血清在RT中阻断30分钟(1/66稀释;病媒实验室)并组装成盖板，以便使用山东Sequenza系统(山东)进行免疫组化。然后用一抗在4°C下过夜或在室温下孵育1小时，然后用小鼠或兔特异性Envision™聚合物(Dako)在室温下孵育30分钟，用3,3-二氨基苯丙胺(DAB) (Sigma Aldrich)在室温下孵育10分钟。Tris缓冲盐水中加入Tween (145 mM NaCl, 5 mM Tris(羟甲基)甲胺，0.1% w/v Tween®20，用1 M HCl调节到pH7.6;费舍尔科学;VWR International)用于在孵育之间冲洗切片。随后，切片用Mayer’s haematoxylin (Surgipath)反染，用乙醇和二甲苯脱水，用邻苯二甲酸二丁酯二甲苯固定玻璃盖。gydF4y2Ba

原位杂交(ISH)gydF4y2Ba

针对SARS-CoV-2 (V-nCoV2019-5)刺突基因的20对双Z专有RNA探针。848569)由Advanced Cell Diagnostics (ACD, USA)合成。使用RNAScope进行ISHgydF4y2Ba^®gydF4y2Ba2.5高清棕色检测试剂盒(ACD)，按照制造商的说明。组织分别通过二甲苯和酒精脱蜡和水化，RNAscope处理gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba过氧化氢(ACD)在室温下加热10分钟，用目标提取液(ACD)在97°C下加热18分钟，蛋白酶加液(ACD)在40°C下加热10分钟。然后将RNA探针添加到切片中，在40°C下杂交2小时，然后在40°C下使用Hybridise Amp (ACD)进行6轮扩增，在HybEZ™烘箱(ACD)中交替培养30至15分钟。在孵育之间用1倍洗涤缓冲液(ACD)在RT下洗涤2分钟。用DAB检测信号。切片用Mayer氏血红素(Surgipath)反染，用乙醇和二甲苯脱水，玻璃盖上Cytoseal (ACD)。gydF4y2Ba