血红素作为新候选物通过血红素加氧酶-1诱导治疗COVID-19gydF4y2Ba

自中国武汉首次报告新型冠状病毒病(COVID-19)疫情以来，全球累计报告病例超过1.43亿例，目前全球死亡率为2.13%gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。COVID-19是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)引起的，主要症状包括发烧、干咳、胸痛、疲劳，少数病例还会出现头痛、头晕、腹痛和腹泻gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba。迄今为止，针对人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、埃博拉病毒、肝炎病毒、巨细胞病毒(CMV)和单纯疱疹病毒有效的抗病毒药物已被用于治疗COVID-19;然而，由于对病毒的治疗效果不一，尚未批准用于治疗COVID-19的特异性药物gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba。因此，由于COVID-19在全球范围内的快速传播，不仅需要开发新的疫苗，还需要考虑先前已知的抗病毒药物是否可以抑制SARS-CoV-2的复制gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

血红素加氧酶-1 (HO-1)，由gydF4y2BaHmox1gydF4y2Ba是一种细胞保护酶，可以抑制炎症反应，减少氧化应激gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba。血红素、CoPP-9和穿心莲内酯可诱导HO-1表达gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}。HO-1将血红素催化成一氧化碳、胆绿素和铁，这些物质也被认为可以抑制各种病毒的增殖gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba。HO-1也被证明与干扰素(IFN)调节因子3相互作用，独立于其酶活性，激活I型IFN反应，抑制甲型流感病毒感染gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba。血红蛋白是具有代表性的HO-1诱导剂，对包括甲型肝炎病毒在内的多种病毒具有抗病毒作用gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}。用其他化学物质诱导HO-1对乙型和丙型肝炎病毒、埃博拉病毒、艾滋病毒、登革热病毒、寨卡病毒和人类呼吸道合胞病毒具有抗病毒活性gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}。最近的研究讨论了HO-1作为SARS-CoV-2候选抗病毒药物的适用性gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

在本研究中，我们主要使用血红蛋白诱导HO-1表达，导致体外SARS-CoV-2复制减少。我们还试图确定HO-1抗病毒作用的基本机制，以及其酶和非酶功能。gydF4y2Ba

血红素诱导HO-1及抗sars - cov -2活性gydF4y2Ba

用不同浓度的血红蛋白预处理Vero76细胞1 h，然后感染SARS-CoV-2。感染后24 h采集细胞，分析细胞内病毒RNA或病毒蛋白含量。如预期的那样，用血红蛋白预处理(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa)以剂量依赖的方式成功地增加了HO-1 mRNA和蛋白质的含量(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab, c). Hemin也显示出对SARS-CoV-2的抗病毒活性。Hemin以剂量依赖的方式诱导SARS-CoV-2 RNA和病毒核蛋白含量的消耗(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab, c)。因此，血红素浓度的逐渐增加导致HO-1 mRNA和蛋白质合成的增加，同时导致SARS-CoV-2 RNA和核衣壳蛋白的消耗(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab, c).进行添加时间实验以确定病毒复制被抑制的时间点。在病毒感染前1小时用hemin预处理组监测其效果，以确定病毒感染是否在进入期被抑制。在治疗后感染病毒，然后用血红蛋白治疗2 hpi的组中，监测效果，以确定病毒进入细胞后，在细胞内复制阶段病毒复制是否受到抑制。在两组中都观察到病毒复制受到抑制，表明血红素处理可以在细胞内复制阶段抑制病毒(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad).免疫荧光试验(IFA)(图4)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae)显示含SARS-CoV-2刺突蛋白的细胞数量随着血红蛋白浓度在24 hpi时的增加而减少。gydF4y2Ba

体外细胞毒性及有效血红蛋白浓度gydF4y2Ba

由于hemin对SARS-CoV-2具有抗病毒作用，我们进行了细胞毒性试验，以确认病毒载量的减少是否归因于其细胞毒性。细胞连续稀释血红素，2天后比较细胞存活率。根据细胞毒性结果，将50%的细胞毒性浓度(CCgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba)为169.9217 μM(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).有效浓度为50% (EC)gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba感染后2天(dpi)通过测量上清液中的病毒RNA滴度来计算细胞毒性。欧共体gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba血红素抑制病毒生长的浓度为0.6805 μM(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab).血红素的选择性指数(SI)约为249.701gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。这些结果表明血红素作为一种治疗药物是安全有效的。gydF4y2Ba

HO-1过表达可减弱SARS-CoV-2复制gydF4y2Ba

利用基因合成技术构建猴HO-1基因pcDNA 3.1(+)载体(GeneBank登录号:XM028827760)，瞬时表达外源HO-1 (pcDNA/ mho -1)。将pcDNA/ mkho1和空pcDNA 3.1(+)载体(pcDNA/MOCK)转染Vero76细胞。猴HO-1蛋白在CMV启动子pcDNA/ mho -1下在Vero76细胞中表达。转染2天后，细胞被SARS-CoV-2感染。24 hpi时收获细胞，检测HO-1蛋白表达。如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba在转染pcDNA/ mkho1的细胞中明显检测到HO-1，而在转染pcDNA/MOCK的细胞中未检测到HO-1。正如之前的结果所观察到的，HO-1的短暂过表达抑制了SARS-CoV-2的复制。gydF4y2Ba

HO-1催化血红素代谢产物对SARS-CoV-2具有抗病毒作用gydF4y2Ba

已知HO-1对血红素的催化作用产生游离铁、胆绿素和一氧化碳(CO)作为代谢物gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba。我们用CO释放分子(CORM，诱导CO生成)FeCl处理Vero76细胞gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba(诱导游离铁生成)和胆绿素。将处理后的细胞感染SARS-CoV-2，并评估病毒的复制能力。免疫印迹和qPCR结果显示gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba和胆绿素以剂量依赖性的方式显著抑制SARS-CoV-2 RNA和核衣壳蛋白的表达，而CORM则没有(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa, b).此外，三种化学物质CORM, FeClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba和胆绿素未在Vero76细胞中观察到(补充图2)。gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)。这些结果表明，由HO-1催化血红素产生的游离铁和胆绿素可以抑制SARS-CoV-2的复制。gydF4y2Ba

HO-1对SARS-CoV-2的非酶活性抗病毒作用gydF4y2Ba

为了确定HO-1的抗病毒活性是否仅与其酶活性相关，我们将HO-1酶活性抑制剂锌原卟啉-9 (ZnPP-9)与血红蛋白一起或单独处理细胞。与单独使用hemin相比，hemin和ZnPP-9同时处理细胞时，观察到SARS-CoV-2 RNA和蛋白质含量的降低幅度更大。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa, b)。相反，用HO-1特异性的短干扰RNA (siRNA)短暂敲除HO-1的表达可显著消除HO-1对SARS-CoV-2的抗病毒作用。gydF4y2BaS2gydF4y2Ba)。这些结果表明，抑制HO-1的酶活性并不会降低HO-1的抗病毒活性。此外，我们观察到在10 μM ZnPP-9单独处理的细胞中，HO-1的表达水平较低，并且抑制了SARS-CoV-2的复制(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa, b).已有研究表明，ZnPP-9降低HO-1酶活性，但增加HO-1蛋白的表达。ZnPP-9上调HO-1蛋白可通过IFN途径间接促进抗病毒状态gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba}。我们证实血红素诱导的HO-1表达可以促进ifn刺激基因(ISG)蛋白(OAS1、Mx1和ISG15)的表达。在SARS-CoV-2感染细胞、血红素处理细胞和经血红素处理的SARS-CoV-2感染细胞中，OAS1、Mx1和ISG15蛋白的产生均增加(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac).虽然在没有血红蛋白的情况下，在感染SARS-CoV-2的细胞中产生了三种ISG蛋白，但检测到了病毒核衣壳蛋白(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac)。然而，在感染SARS-CoV-2并用血红蛋白处理的细胞中，三种ISG蛋白均有表达，且未检测到病毒核衣壳蛋白(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac).这表明在病毒诱导下产生的isg不能充分抑制SARS-CoV-2的复制。gydF4y2Ba

目前有几种抗病毒疗法用于治疗病毒感染，其中一些已被发现对COVID-19有效gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba}。目前正在研究病毒RNA聚合酶抑制剂(remdesivir/favipiravir)、病毒蛋白合成抑制剂(利托那韦/洛匹那韦)、病毒进入抑制剂(羟氯喹/氯喹)和免疫调节剂(nitazoxanide/伊维菌素)的抗病毒作用;然而，HO-1的抗病毒作用，特别是对SARS-CoV-2的抗病毒作用尚未得到彻底研究gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba。已知HO-1通过其副产物表现出细胞保护和抗炎活性，这些作用可能有助于调节各种疾病中的炎症gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba。已报道了HO-1对呼吸道病毒(包括流感病毒和呼吸道合胞病毒)的免疫调节和抗病毒特性gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba。最近发表的一篇研究文章假设，血红素诱导的HO-1可能通过刺激抗炎途径来控制SARS-CoV-2感染gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba。然而，作者没有提供HO-1对SARS-CoV-2抗病毒活性的证据。gydF4y2Ba

在这项研究中，我们首次证明了HO-1可以在体外系统中抑制SARS-CoV-2的复制。我们使用了高效的HO-1诱导剂hemin，这是一种含铁的卟啉，众所周知，它可以诱导HO-1表达，副作用率低gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba}。结果表明，在6.25 μM (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)，浓度大于12.5 μM (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001)有效诱导HO-1表达，并在24 hpi内显著抑制病毒复制。当使用CoPP-9或穿心莲内酯治疗病毒感染的细胞时，观察到类似的抗病毒结果。即使在病毒进入细胞后用血凝素处理，病毒蛋白表达仍被抑制，这一事实表明血凝素可能能够在细胞内复制阶段抑制病毒复制，类似于瑞德西韦gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba。然而，最近的一项研究表明，血红素诱导的HO-1不能抑制SARS-CoV-2感染gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba。他们证明了细胞培养上清液中病毒RNA水平不变，而我们确定了用血红蛋白处理后细胞中病毒RNA和病毒蛋白的减少。我们和他们研究结果的矛盾可能是由于实验条件和方法不同造成的。gydF4y2Ba

血红蛋白具有细胞保护作用和低细胞毒性。在商业上，hemin的名称为PANHEMATIN®，于1983年获得美国食品和药物管理局批准，其安全性得到保证gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba}。在这项研究中，CCgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba血红素(hemin)值约为169.9217 μM，为细胞毒性指标gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba值约为0.6805 μM，表示使病毒RNA载量降低50%的药剂浓度。CCgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba价值大约是欧盟的249.7012倍gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba值，SI为249.7012。与其他fda批准的化学品相比，血红素的SI表明其作为治疗剂的安全性和有效性gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

为了确定HO-1对SARS-CoV-2抗病毒活性的特异性，我们通过表达载体过表达猴HO-1。在转染猴HO-1基因表达载体的Vero76细胞中成功表达了HO-1，并证实了细胞对SARS-CoV-2复制的抑制作用。这意味着抗病毒作用可能归因于HO-1，而不仅仅是血红素的卟啉作用，它可以阻断病毒的进入，就像在HIV抑制的情况下观察到的那样gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba。为了研究HO-1抗病毒作用的机制，我们用CORM、FeCl处理细胞gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba和胆绿素，以评价HO-1分解血红素代谢副产物的抗病毒作用。这些代谢物已被证明对几种病毒具有抗病毒作用gydF4y2Ba^{27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba}。在我们的研究中，用FeCl处理细胞gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba或胆绿素，而不是CORM，显著降低了SARS-CoV-2 RNA和蛋白质滴度(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001)，表明HO-1的酶促作用抑制了病毒的生长。然而，当用hemin和选择性HO-1酶活性抑制剂ZnPP-9处理细胞时，对SARS-CoV-2复制的抑制并未逆转。这些结果与siRNA敲除实验不同，siRNA敲除实验抑制了HO-1蛋白的表达，逆转了SARS-CoV-2的抑制。这表明HO-1的抗病毒活性可能是由其酶活性以外的其他作用诱导的。虽然已知ZnPP-9抑制HO-1的酶促作用，但它诱导HO-1蛋白的表达，如我们的结果所示(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一)gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba。表达的HO-1通过与IFN调节因子3相互作用间接帮助建立抗病毒状态，从而促进ISGs OAS1、Mx1和ISG15的表达gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba。I型IFNs (IFN-α和IFN-β)和III型IFNs (IFN-λ)通过ISG蛋白表达对SARS-CoV-2提供有效的抗病毒免疫gydF4y2Ba^{30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba}。然而，在较高的病毒载量下，SARS-CoV-2的复制比抗病毒干扰素反应更快gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba。在这些条件下，IFN反应不能限制病毒复制，并可能诱发炎症反应，从而引起组织损伤gydF4y2Ba^31gydF4y2Ba。在本研究中，我们证明了虽然SARS-CoV-2感染在24 hpi时诱导细胞中ISG蛋白的表达，但病毒的增殖已经完成(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac). HO-1可以促进IRF3磷酸化和核易位，IRF3介导的途径似乎与早期诱导ISG蛋白和抑制SARS-CoV-2复制有关gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

综上所述，血红蛋白在体外对SARS-CoV-2感染有较好的控制作用。hemin处理细胞诱导HO-1表达，通过铁和胆绿素等代谢物直接抑制SARS-CoV-2复制，并通过ISG蛋白间接抑制。HO-1诱导的两种抗病毒机制似乎在体外抑制病毒生长。我们相信这些发现将对COVID-19治疗药物的开发做出重大贡献。gydF4y2Ba

细胞系、病毒和化学物质gydF4y2Ba

Vero76细胞从韩国细胞系库获得，并在含有5% CO的气氛中，在Dulbecco 's modified Eagle 's培养基(DMEM)中添加10%热灭活胎牛血清(FBS, Gibco)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba37℃。SARS-CoV-2 S株(NCCP43326)来自国家病原体培养库。Vero76细胞感染NCCP43326的倍数为0.001。将接种病毒的细胞保存在添加2% FBS的DMEM中。氯高铁血红素,FeClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba、CORM、穿心莲内酯、CoPP-9和ZnPP-9购自Sigma-Aldrich，胆绿素购自Cayman Chemical Company。gydF4y2Ba

细胞毒性试验gydF4y2Ba

血红素、CORM-3、FeCl的细胞毒性gydF4y2Ba_3.gydF4y2BaMTT法检测Vero76细胞对胆绿素的影响。将Vero76细胞以1 × 10的比例接种于96孔板的每孔中gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba细胞/。24 h后，连续用血红素处理细胞48 h。去除上清后，加入MTT (5 mg/mL)和新鲜无血清培养基，在5% CO气氛中孵育gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba37℃。3 h后，加入150 μL的二甲亚砜进行增溶。用分光光度计读板，在540nm处观察活细胞。细胞毒性按CC进行分析gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba使用未经处理的细胞作为100%活力对照进行比较。gydF4y2Ba

逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)gydF4y2Ba

使用RNeasy Mini RNA分离试剂盒(Qiagen)从细胞裂解液中提取细胞内病毒RNA和mRNA，根据制造商的说明使用Patho Gene-spin DNA/RNA试剂盒(内含子)提取上清中的病毒RNA。RT-qPCR采用One Step TB Green®PrimeScript™RT-PCR试剂盒(Takara)和Light Cycler仪器(Roche)进行。利用含有M基因靶序列的质粒DNA生成的标准曲线计算病毒GE拷贝数。病毒基因组拷贝数除以gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba计算每个细胞所含病毒数，并利用2gydF4y2Ba^{−ΔΔCtgydF4y2Ba}方法。所有实验重复三次以获得可靠的结果。使用的引物序列如下:gydF4y2Ba

sars - cov - 2m基因:正向引物，5 ' -GGYTCTAARTCACCCATTCA-3 ';反向引物，5 ' -TGATACTCTARAAAGTCTTCATA-3 '。gydF4y2BaHO-1gydF4y2Ba:正向引物，5 ' -CTTCAAGCTGGTGATGGC-3 ';反向引物，5 ' -TGGAGCCGCTTCACATAG-3 '。gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba:正向引物，5 ' -GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG-3 ';反向引物，5 ' - GAGCCCCAGCCTTCTCCATG-3 '。gydF4y2Ba

短干扰RNA (siRNA)转染gydF4y2Ba

为了瞬时敲除HO-1，将Vero76细胞以6 × 10的剂量接种于6孔板中gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba根据制造商的说明，使用Lipofectamine RNAiMax转染试剂转染30 pmol ho -1特异性siRNA (AM16708，检测ID 11152, Thermo Fisher Scientific)或对照siRNA (AM4611, Thermo Fisher Scientific)。siRNA转染1天后，用SARS-CoV-2感染细胞或用25 μM血红蛋白处理细胞。gydF4y2Ba

Western blot分析gydF4y2Ba

接种24 h后，用PBS洗涤细胞3次，收获细胞。细胞裂解使用2× laemmli样品缓冲液(S3401, Sigma)， 95°C煮沸。然后将细胞裂解液离心(9000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba1分钟)，上清液上载于sds -聚丙烯酰胺凝胶。电泳后，将分离的蛋白转移到硝化纤维素膜上，在含0.05% Tween 20 (PBS- t)的PBS溶液中，用5%脱脂牛奶在4℃下封闭过夜。膜用抗ho -1抗体(SAB1405949, Sigma)、抗gapdh抗体(ab8245, Abcam)或抗sars - cov - 2n抗体(GTX632269, GeneTex)在2.5%脱脂牛奶pbs - t中室温处理1小时。每轮用PBS-T洗涤3次，每次洗涤10分钟，用标记有辣根过氧化物酶的二抗在2.5%脱脂牛奶-PBS-T溶液中处理1小时，每轮用PBS-T洗涤3次，每次洗涤10分钟。使用SuperSignal™West Pico PLUS化学发光底物(Sigma)对蛋白条带进行可视化。gydF4y2Ba

IFAgydF4y2Ba

用IFA法检测SARS-CoV-2刺突蛋白。在24 hpi时，去除上清，用4%多聚甲醛在PBS中固定细胞，在25℃下固定10分钟。将固定的细胞用冰冷的PBS洗涤三次。为检测细胞内病毒蛋白，用含0.5% Triton X-100的PBS对细胞进行透性处理10分钟。透性处理后，每轮PBS洗涤3次，每次5分钟。然后用1%牛血清白蛋白(BSA)在PBS-T中在25℃下阻断细胞30分钟。接下来，将抗sars - cov -2刺突蛋白抗体(GTX632604, GeneTex)用1% BSA稀释PBS-T，将被阻断的细胞作为一抗，在25°C的湿室中处理1小时。一抗反应结束后，将溶液滗出，在PBS中洗涤3次，每次洗涤5分钟。对于二抗反应，细胞用Alexa Fluor 488结合的抗小鼠IgG抗体在PBS-T中与1% BSA在25℃下黑暗处理1小时。随后，将溶液倒入，在PBS中洗涤细胞3次，每次洗涤5分钟。用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚进行反染色。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

实验至少进行三次，数据以均数±标准差表示。绘制了剂量-反应曲线，并绘制了学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba采用PRISM 8.0.1 (GraphPad Software)软件进行检验。差异被认为是显著的gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba