介绍

自在中国武汉首次报告以来，严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)及其衍生疾病2019冠状病毒病(covid - 19)迅速传播，已成为具有全球重要性的公共卫生威胁1，2．根据世界卫生组织的数据，截至2021年2月1日，全球有超过3000万例病例，仅美国就有2600万例病例，死亡人数超过44万。这种多产的病毒是一种正义单链RNA，属于冠状病毒属。

SARS-CoV-2有四个关键的结构蛋白。核衣壳蛋白(N蛋白)存在于病毒核心3.．刺突蛋白(S蛋白)、基质蛋白(M蛋白)和包膜蛋白(E蛋白)3.都存在于病毒的外表面。S蛋白是病毒宿主范围和感染性的关键决定因素4．针对S蛋白产生的免疫球蛋白G (IgG)被认为是一种中和性抗体免疫反应，目前是covid - 19疫苗试验的主要目标。M蛋白是病毒表面最丰富的蛋白，被认为在病毒从宿主细胞膜出芽过程中起作用5，6．E蛋白是最小的蛋白，其功能尚不明确，但它被认为有助于细胞内病毒运输和病毒蛋白组装7．

尽管N蛋白的功能尚不清楚，但它已在SARS-CoV1中得到了很好的研究8．N蛋白与病毒RNA的结构和功能密切相关，在病毒转录和组装中起着至关重要的作用，同时作为RNA伴侣9．RNA的N段有3个不同的区域;一个负责N蛋白氨基酸长度的基序，一个summoylation基序(lysin残基)，一个丝氨酸残基负责被周期蛋白依赖的激酶复合物磷酸化8．

中和抗体(Ab)可以阻断病毒蛋白与宿主受体的相互作用10．然而，非中和的Ab甚至可能通过抗体依赖性增强(ADE)使某些病毒感染的发病机制复杂化。ADE是一种在包括冠状病毒在内的病毒感染中得到很好描述的现象11．ADE代表了一种矛盾的Ab效应，即病毒利用抗体进入宿主免疫细胞。具体地说，病毒利用Ab附着在免疫细胞上，从而通过对宿主免疫细胞的细胞毒性作用加重感染12．ADE也可能与较高的病毒血症有关13．未中和的病毒颗粒也可能导致促炎细胞因子的广泛释放和抗炎细胞因子的抑制，引起免疫病理12．

SARS-CoV2的N蛋白与其他高致病性冠状病毒家族成员具有高度同源性，分子量约为46-kDa14．先前暴露可导致非中和性抗体的产生，并通过ADE建立压倒性的促炎状态15．在疾病早期具有较高水平的非中和性IgG的患者可能由于ADE而经历更严重的感染。

我们推测针对N蛋白的IgG抗体可能与ADE现象和较高水平的病毒血症有关。冠状病毒抗N蛋白IgG水平升高可能与较差的预后相关，如住院时间延长、入住ICU的可能性增加、入住ICU的时间延长以及住院期间死亡率增加。为了验证这些假设，我们对迈阿密大学医院住院的rt - pcr确诊的covid - 19患者进行了一项前瞻性研究，以确定与不良预后相关的临床因素。此外，本研究旨在确定血清SARS-CoV2抗n蛋白IgG水平与covid - 19疾病临床结局的关系。此外，我们对从n蛋白IgG阴性、低浓度和高浓度受试者全血中提取的RNA进行RT-PCR检测病毒血症。

材料与方法

研究人群

2020年3月至6月底在迈阿密大学医院(University of Miami Hospital)急诊室(ER)就诊或入住covid - 19病房的患者均被同意并纳入本研究。所有方法均按照相关指南和规定进行。

研究设计和外周血取样

研究人群包括迈阿密大学医院通过鼻咽拭子RT-PCR确诊的covid - 19感染患者。招募了400名RT-PCR确诊的covid - 19患者。在400名COVID-19患者中，有100人同意参加COVID-19生物库。数字1给出了学习算法。血清检测n蛋白IgG，全血检测SARS-CoV2 RT-PCR。

图1
图1

给出了学习算法。

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所有100份血清样本均进行IgG检测。测定了所有样品的单截止比(S/Co)。

随机抽取15例患者进行全血RNA提取。在入组时选取5例IgG滴度高的患者(定义为S/Co比值bbb1.5)， 5例IgG阳性但S/Co比值< 1.5,5例IgG水平检测不到的患者。

入组后采集外周血标本，1800 g离心30 min。血清和全血分别加入2 ml低温管中，-80℃保存，留待后续分析。

数据收集和结果

从电子病历系统中收集每位患者的人口统计、临床和结局数据。Charlson合并症指数(CCI)使用合并症和年龄数据计算。主要结局为ICU入院、ICU住院时间和住院死亡率。住院死亡率定义为住院期间发生的死亡。

ELISA试验

采用表位诊断公司(Epitope Diagnostics)的IgG ELISA试剂盒检测血清样品的SARS-CoV-2 IgG抗体和抗n蛋白IgG水平16根据制造商的协议。计算阴性对照(xNC)吸光度平均值。阳性试验的截止值由制造商的公式[1.1 X (xNC + 0.18)]确定。为了保证结果的有效性，每个分析必须包括阴性对照和阳性对照。阴性对照吸光度平均值小于0.25，阳性对照吸光度平均值不小于0.30。此外，除本试剂盒提供的对照外，所有检测还包括实验室自己的对照17．计算每个样本的信号截止比。

RNA隔离

根据制造商的建议，使用ZymoResearch (Orange, CA, USA)的试剂盒从全血样本中分离RNA。

rt - pcr

使用表达基因SARS- cov2 RT-PCR诊断试剂盒检测血样中提取的RNA上的SARS C。Express Gene SARS-CoV2 RT-PCR诊断试剂盒已获FDA (EUA200423)授权用于COVID-19检测。为防止污染，所有试剂均在无扩增子工作站制备。在使用过程中，所有RNA样品和成分均保存在冰上。TaqPad Combo试剂盒用于COVID-19检测中N基因、S基因和ORF1ab靶点的检测。RT-PCR板上有1个阳性对照(1 × 104拷贝/μL)和1个阴性对照。将RNA样品在冰上解冻，然后将总RNA为15 ng的2.5µl RNA样品与引物和探针一起用于RT-PCR主混合物。RT-PCR反应采用一步反应混合物(ThermoFisher)。所有样品一式三份。Express Gene SARS-CoV2 RT-PCR诊断试剂盒每反应体积可检测低至2拷贝N基因、4拷贝ORF1ab和10拷贝S基因。 This information is part of our approved FDA Emergency Use Authorization (EUA200423) and can be found on the FDA website.

统计分析

分类变量以数字和百分比表示，并用Mantel-Haenszel检验进行检验。使用学生t检验(正态分布)和Wilcoxon秩和(非正态分布)变量比较连续变量。随后进行单变量分析，比较每个结果的分类变量和连续变量的差异。为了确定每个结果的危险因素，采用逐步逻辑回归模型进行多变量分析。采用Cox回归分析确定与院内死亡率相关的危险因素。根据本研究和其他研究发现临床相关因素并加入模型中18，19，20.，21．我们使用Charlson共病指数是因为我们预期每个结果变量的结果数量很低，并且只能包括模型(CCI)中共病中有限数量的潜在混杂因素。22．当p值小于0.05时，认为有统计学意义。采用IBM SPSS version 26进行统计分析。

道德声明

本研究已获得迈阿密大学机构审查委员会(IRB)的批准。

获得了所有参与者的知情同意。

结果

在研究期间，共有400名患者被诊断为covid - 19感染。患者的人口学和临床资料见补充表S1．急诊医生接收了248例(62%)患者，其余患者出院。

入院患者平均(SD)年龄为63岁(17.2岁)，男性141例(57%)，白人147例(61%)，西班牙裔白人65例(44.4%)。62例(24.5%)住院患者为非裔美国人，其余为多种族。

住院期间，76例(30%)患者入住MICU。在单变量分析中，如果患者正在接受化疗，胸部图像有实变或双侧阴影，或实验室发现白细胞计数较高，血小板计数较低，BUN水平较高，血清il - 6, CRP, LDH或血清白蛋白水平较低，则更有可能入住MICU(表1)S2）.以呼吸困难、发热、腹痛(不包括胸痛)为主诉的患者更有可能被送入MICU(表1)S3）.MICU患者的平均CCI高于非MICU患者，分别为3.67 vs 2.99 (P = 0.047)。糖尿病患者(OR = 2.4)入icu的风险较高。入住MICU的患者住院死亡的几率更高(OR = 7.85)。在CRP水平、IL6水平、CCI和呼吸困难中，使用多变量logistic回归模型发现，只有呼吸困难与MICU入院风险增加独立相关。(表1）.

表1新冠肺炎患者入院MICU的多变量回归模型。
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30例(26%)患者在住院期间死亡。单变量分析将以下因素与较高的死亡率联系起来:高龄;在养老院居住;更高的CCI;有HTN、HF、CAD、AMS或DM病史;入院前是否使用ACE2药物;表现为胸部图像包含高水平WBC、il - 6、BUN、LDH的实变;入读MICU;无创通气(NIV)需求(表S4, S5)。住院死亡率的Cox回归模型显示，在CCI、高浓度LDH和IL6、入院前使用ACE抑制剂之间，只有CCI和IL6与住院死亡率独立相关(表6)2）.

表2 covid - 19患者住院死亡率的Cox回归模型。
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血清IgG分析

在248例入院的COVID-19患者中，有100人同意参加血清学研究。平均(SD)年龄为63岁(16.9岁)，中位年龄为64岁，男性49岁(49.5%)。61人(62%)是白人，50人(82%)是西班牙裔白人。

55例(55%)患者入院时抗n蛋白IgG阳性。表3.和4显示研究人群的人口学和临床数据。

表3抗N蛋白IgG S/Co比高患者的人口学特征。
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表4抗N蛋白IgG S/Co比高患者的合并症及临床转归。
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单因素分析发现，S/Co比值大于1.5与出现呼吸困难(p = 0.01, OR = 4.57)和咳嗽(p = 0.041, OR = 3.10)的住院可能性增加有关。S/Co比值为bbb1.5的患者入院时更容易发生双侧浸润(p = 0.036, OR = 2.87)。S/Co比值为bbb1.5的患者(M = 35.40±7.63)与S/Co比值较低的患者(M = 38.98±6.81)的平均血细胞比容百分率差异有统计学意义(p = 0.035)。S/Co比值为bbb1.5(3.67±0.50 g/dl)和非bbb1.5(3.35±0.53 g/dl)患者的白蛋白水平也有显著差异(p = 0.017)。S/Co比值为1.5的患者的平均淋巴细胞水平(2.42±4.90 × 10)也有显著差异(p = 0.022)3.细胞/ml)，无S/Co比值为1.5(1.06±0.67 × 10)3.细胞/毫升)。S/Co比值bbb1.5与ICU住院可能性增加相关(p = 0.047, OR = 2.63天)。S/Co > 1.5还与住院时间超过16天(p = 0.006, OR = 4.06)和MICU住院时间超过8天(p = 0.004, OR = 32.50)的可能性增加相关(表1)4）.IgG S/Co比值与MICU的天数有显著相关性，如图所示。2．

图2
图2

显示SARS-CoV-2 IgG N蛋白与MICU入院时间相关。R = 0.554, p值= 0.002。

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MICU入院的多变量logistic回归模型显示，在非裔美国人、CCI、淋巴细胞计数和S/Co比值bbb1.5之间，只有S/Co比值与MICU入院独立相关(表5)5）.在住院时间超过16天的多变量分析中，S/Co比bbb1.5 (p = 0.047, OR:2.63)再次成为上述变量中唯一的独立因素(p = 0.006 OR:4.1)(表1)6）.

表5高抗n蛋白IgG患者MICU入院天数的多变量logistic回归模型。
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表6抗n蛋白IgG高值患者住院bb0 ~ 16 d的多变量logistic回归模型
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全血RT-PCR

RT-PCR反应显示，从IgG阴性、低浓度和高浓度受试者制备的RNA样品中，未确定N基因、S基因和ORF1ab核苷酸序列的水平。RT-PCR数据见补充Excel文件。

讨论

该研究表明，老年男性新冠肺炎患者和合并症评分较高的患者更容易住院。在住院患者中，我们发现只有高水平的呼吸困难独立预测MICU入院。我们还证明，较高的CCI和较高的il - 6水平与住院死亡率独立相关。

因低氧血症入院的新冠肺炎确诊患者很可能产生了高浓度的针对SARS-CoV2 N蛋白的IgG。高IgG水平与入住MICU的高风险和更长的住院时间有关。我们在住院的covid - 19患者中也没有发现病毒血症的证据。

本研究首次报道了高浓度抗N蛋白IgG与covid - 19预后不良之间的关联。先前的研究报告称，在发病的第一周，covid - 19患者体内可检测到总IgG水平23，24．我们发现，高浓度的抗n蛋白IgG导致入院风险增加三倍。从理论上讲，N蛋白IgG可能在感染过程中倾向于更高的炎症反应。中和抗体通常是针对病毒进入蛋白产生的25，26，27．针对完整S蛋白或S蛋白S1亚基的IgG被认为是对抗SARS和covid的中和抗体28，29，30.．针对S蛋白的IgG可能具有保护作用，已成为新冠病毒疫苗开发的首要目标31．没有证据表明S蛋白IgG(通过疫苗或被动IgG输注)通过ADE效应诱导肺病理32．尽管ADE在covid - 19中的潜在作用尚不清楚，但目前的研究表明，非中和核蛋白IgG水平可能是covid - 19受试者预后不良的一个原因。ADE在SARS-CoV-2感染中的作用机制尚不清楚。大相在SARS-CoV-2感染期间病毒传播、过度炎症和激活诱导的淋巴细胞死亡中的作用被认为是covid - 19的特洛伊木马。covid - 19死亡患者死后肩胛下淋巴结和脾脏中严重淋巴细胞凋亡提示了covid - 19重症患者淋巴细胞减少的潜在机制。Feng等在脾脏和淋巴结的ACE2 +细胞、CD169 +巨噬细胞中发现了病毒核鞘蛋白，但在CD3 + T细胞和B220 + B细胞中没有发现。在含有SARS-CoV-2核蛋白抗原的脾边缘区和淋巴结边缘窦中检测到CD68 + CD169 +巨噬细胞，可诱导IL-6上调。受感染的免疫细胞产生细胞因子和自噬反应33．有趣的是，在严重的covid - 19患者中，报告的肺栓塞和血栓发生率更高34，35，36可能归因于直接感染病毒后血小板活化和继发性自噬37，38．

另一种可能的病理机制可能是抗体介导的细胞壁表达N蛋白颗粒的感染细胞的细胞毒性。自然杀伤细胞、中性粒细胞和巨噬细胞与IgG相互作用，消灭靶细胞39，40，41．针对N蛋白的免疫复合物发育是一种令人着迷的潜在机制。Berger和他的同事们表明，免疫复合物诱导免疫细胞分泌IL6，激活促炎细胞因子网络和深刻的全身炎症反应42．针对N蛋白的免疫复合物可能有助于covid - 19报道的高炎症反应43．

ADE在登革热发病机制中的作用已被回顾44．在研究登革热病毒发病机制的动物模型中，ADE与较高的病毒血症有关45，46，47．然而，目前的研究表明，SARS-CoV2的发病机制可能与ade相关的高病毒血症无关。我们的观察可能表明，SARS-CoV2可能停留在淋巴系统中，避免进入血液。迫切需要进一步的调查来证实我们的发现。

本研究的主要限制是我们没有测量总非中和性IgG和非中和性抗s和其他蛋白质。此外，由于样本量的限制，我们无法在多变量分析中显示IgG靶向N蛋白对covid - 19患者死亡率的影响。此外，这种限制也可能是我们研究的患者中缺乏病毒血症的一个促成因素。这项研究尚未在另一组covid - 19患者中得到验证。

covid - 19重症患者中n蛋白IgG的病理机制有待进一步研究。特别是，应开展更大规模的多中心研究，研究IgG靶向N蛋白在covid - 19死亡率中的作用。更好地了解ADE在血小板活化中的作用可能有助于揭示covid - 19的高凝状态，并产生新的治疗方式。

综上所述，本研究建议在对covid - 19患者进行初步评估时，应将针对SARS-CoV2 n蛋白的IgG纳入检测措施。高浓度的这种免疫球蛋白可能预示着不良的预后，尽管需要进一步的验证。