法莫替丁对SARS-CoV-2蛋白酶和病毒复制的体外影响

目前针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV)-2的治疗方法发现工作的很大一部分集中在药物再利用上¹．在这些药物中，迄今为止只有瑞德西韦显示出抗病毒作用的临床证据²，而其他一些在各种临床研究中没有达到其主要终点^3.，4．最近，法莫替丁作为一种治疗SARS-CoV-2的选择引起了人们的关注，最初是基于它对中国COVID-19患者有积极作用的轶事证据。法莫替丁(PEPCID®)是一种组胺-2受体(H2R)拮抗剂，是FDA批准用于治疗胃食管反流病(GERD)和胃溃疡的药物⁵．

最近，一项涉及1620名美国患者的回顾性临床研究支持了法莫替丁在中国有益作用的早期报告，该研究指出，住院的COVID-19患者每天口服或静脉注射一次，总中位剂量为136毫克，持续6天，死亡或插管的风险降低⁶．另一项涉及10名非住院患者的研究将使用大剂量口服法莫替丁(每天240毫克，中位数为11天)与患者报告的呼吸短促和咳嗽等症状的改善联系起来⁷．这两份报告的结论是，使用大剂量法莫替丁可能与COVID-19轻度和重度症状的改善有关。虽然一项大型多中心临床试验正在进行中，以证实这些观察结果，但法莫替丁据称改善COVID-19患者临床结果的机制尚不清楚。计算机模拟和分子对接研究分别表明，两种SARS-CoV-2蛋白酶中的任何一种都是法莫替丁活性的潜在靶点^8，9．在一项计算研究中，Wu等人将批准的药物库与3-凝乳胰蛋白酶样蛋白酶(3CL)的x射线晶体结构对接^箴)，确定法莫替丁是可能作用于蛋白酶的药物之一⁸．其他计算报告预测法莫替丁是木瓜样蛋白酶(PL)的抑制剂^箴)，第二种SARS-CoV-2蛋白酶⁹．总之，这些研究提出了法莫替丁对SARS-CoV-2复制具有直接抗病毒作用的前景。虽然这两种蛋白质都是SARS-CoV-2药物开发的有吸引力的靶点^{10，11，12，13，14，15，16，17，18，19}目前还没有针对这两种蛋白的临床阶段或批准的药物。法莫替丁是一种已获批准的药物，其作用于SARS-CoV-2蛋白酶的可能性具有重要的临床意义。在这个体外在本研究中，我们进行了一系列生化、生物物理和抗病毒实验，以测试法莫替丁是否是SARS-CoV-2蛋白酶的效应物，以及它是否能抑制培养细胞中的病毒复制。

法莫替丁不是SARS-CoV-2蛋白酶的抑制剂

SARS-CoV-2多蛋白的加工对于产生功能性病毒复制复合体至关重要^{11，18，20.}．为了实现这一基本的蛋白质水解功能，SARS-CoV-2基因组编码两种半胱氨酸蛋白酶，称为PL^箴和3氯^箴18．由于它们在病毒多蛋白加工和病毒增殖中的关键作用，这两种蛋白酶被认为是药物发现的有吸引力的靶点^{10，11，13，14，15，16，17，21}．自硅对接研究预测这些蛋白酶作为假定的法莫替丁的分子靶点^6，8，9，我们系统地研究了法莫替丁对各蛋白酶催化功能的影响。

首先，我们开发了一个体外PL活性测定^箴．PL^箴是在SARS-CoV-2编码的大型多结构域nsp3蛋白中发现的蛋白酶结构域。虽然许多冠状病毒编码两个木瓜蛋白酶样蛋白酶，但SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2只有一个PL^箴它处理病毒多蛋白的氨基末端，释放nsp1、nsp2和nsp3^19，21．此外,PL^箴通过切割LXGG的一致基序使宿主细胞蛋白去泛素化^18，19已知能有效水解二泛素和合成肽底物¹⁹．我们利用了PL的去泛素化性质^箴利用泛素- amc(一种可被PL切割的荧光底物)建立功能活性测定^箴．用PL孵育后^箴，泛素被识别并在c端裂解以释放AMC(氨基-4-甲基香豆素)荧光团，导致荧光增强，使用355/460 nm的激发和发射波长读取。我们评估了法莫替丁抑制PL蛋白水解活性的能力^箴在广泛的药物浓度范围内vis-à-vis化合物6一种先前报道的PL抑制剂^箴活动²¹．实验条件包括蛋白质和底物浓度、缓冲液组成和分析动力学化合物6．而化合物6抑制PL^箴活动与预期的低个位数μ IC₅₀值，法莫替丁没有降低PL^箴活性在0.01 ~ 200 μM滴定范围内(图2)。1一个)。

接下来，我们测试了法莫替丁是否能抑制3CL的酶活性^箴这是由SARS-CoV-2基因组编码的第二种蛋白酶。这种蛋白质，也被称为主蛋白酶(M^箴)或nsp5，在11个独特的位点上切割病毒多蛋白¹¹．这种蛋白水解活性产生多种单独的功能蛋白，这些蛋白是组装SARS-CoV-2复制/转录复合体所需的，从而驱动病毒基因组复制^20.．由于其在冠状病毒生命周期中的核心作用，3CL^箴作为一种药物靶点，是否发现了几种有效的抑制剂^{10，14，15，17}．本机3氯^箴作为同型二聚体存在，其蛋白水解活性需要二聚体¹¹．3CL的催化机理^箴活性是典型的半胱氨酸蛋白酶，其中Cys-His催化双偶驱动底物的位点特异性切割。我们评估了3CL的酶活性^箴然而，使用可淬灭其完整形式荧光的fret肽底物，肽底物被3CL切割^箴产生的荧光可以在490/535 nm的激发/发射波长测量。包括ML188，之前报道的3CL^箴抑制剂作为对照，也有助于实验的建立和优化。FRET测定的结果为各种ML188法莫替丁和法莫替丁的浓度见图。1b.两种化合物的测试范围为0.01-200 μM。而ML188产生了剂量依赖性的3CL抑制作用^箴具有预期IC的活动₅₀2.4 μM时，法莫替丁对3CL无抑制作用^箴活动。

当单独测试时，法莫替丁和其他被测试的化合物分别在355/460 nm和490/535 nm波长处产生自身荧光。这两项实验表明，法莫替丁不会干扰两种SARS-CoV-2蛋白酶的催化活性。

法莫替丁不直接作用于PL^箴或3氯^箴的SARS-CoV-2

许多酶的功能，如蛋白酶和激酶，可以扩展到它们的催化作用之外，包括广泛的非催化活性，如变构调节、支架、蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质- dna相互作用²²．为了排除法莫替丁是否可以从两种病毒蛋白酶的活性位点结合，并通过干扰非蛋白水解功能发挥作用，我们询问法莫替丁是否能够直接与两种SARS-CoV-2蛋白酶中的任何一种结合。为此，我们采用了两种不同的生物物理技术，即表面等离子体共振(SPR)和差示扫描荧光法(DSF)，这两种技术通常用于探测药物-蛋白质的结合。

在我们的SPR研究中，生物素化的病毒蛋白酶通过neutravidin在传感器芯片上高密度捕获，允许实时检测与目标病毒蛋白酶结合的小分子。在测定过程中，小分子化合物的参与被记录为剂量依赖性反应单位(RU)的增加。在进行法莫替丁研究之前，使用对照化合物对缓冲液组成和温度等实验条件进行了优化。平衡解离常数(K_d)的值是通过动力学分析和与剂量响应数据的结合等温线的拟合来确定的(图2)。2）.观察到的K_d已知3CL的值^箴和PL^箴(补充信息表S1)与已发表的IC一致₅₀数据^14，21表明我们的分析方法的稳健性。在此优化条件下，法莫替丁在100 μ m的浓度范围内未发现与两种病毒蛋白酶相互作用。

为了验证SPR分析的结果，我们采用了正交DSF试验。DSF是一种荧光监测的热变性技术，其中熔化温度(T_米当样品温度在疏水染料的存在下逐渐升高时，通过荧光跟踪蛋白质。已知药物与其靶蛋白结合可以稳定(或破坏)蛋白质结构，从而导致蛋白质的变化T_米无药或有药时的侧写。随着热展开温度的增加，DSF提供了目标接触的明确确认(Δ)T_米只有当化合物与蛋白质的折叠态结合时才能实现。Δ的T_米正比于K_d化合物的相互作用和浓度。我们测试了法莫替丁和对照抑制剂改变PL热稳定性的能力^箴和3氯^箴．在7 μM PL下获得了最优的信号分布^箴或3氯^箴．两种蛋白分别在DMSO (-ve对照)、各自的对照抑制剂和法莫替丁浓度为1、2.5和5 mM的情况下进行测试。与SPR数据一致，对照抑制剂产生了观察到的定量增加T_米(无花果。3.）.而化合物6，已知PL^箴稳定PL抑制剂^箴由一个T_米位移6.6°C(图1)3.一个),ML1883CL^箴抑制剂产生了T_米偏移5.3°C(图1)3.B)，法莫替丁没有改变T_米两种病毒蛋白酶中的一种。综上所述，生物物理数据决定性地排除了法莫替丁对PL产生影响的可能性^箴或3氯^箴通过干扰催化或非催化蛋白的功能，因为它不能与两种蛋白酶中的任何一种结合。

法莫替丁不抑制培养细胞中的SARS-CoV-2复制

在确定法莫替丁不抑制SARS-CoV-2蛋白酶之后，我们研究了法莫替丁在细胞培养中阻断病毒复制的能力。为此，我们感染了Vero E6细胞，这是一种来自非洲绿猴肾脏的SARS-CoV-2感染的常用细胞模型。通过多重正交读数，包括实时荧光定量PCR (qRT-PCR)、菌斑形成和免疫荧光，定量检测感染效率。瑞德西韦抑制病毒复制的估计最大抑制浓度为一半(IC)₅₀)值为3.3 μM，通过免疫荧光测定(图2)。4a).相比之下，法莫替丁在感染72 h后，在高达200 μM的浓度下没有产生任何可测量的抑制作用。当使用斑块形成法检测传染性病毒粒子产生或使用qRT-PCR在细胞培养基中定量病毒RNA拷贝数来检测病毒复制时，也获得了类似的结果S1和S2）.

为了在生理上更相关的SARS-CoV-2感染细胞模型中证实这些结果，我们评估了法莫替丁在人肺A549细胞中的抗病毒活性。这些细胞被改造成表达必需的SARS-CoV-2进入因子ACE2和TMPRSS2²³．这些细胞被SARS-CoV-2感染，并在没有或存在对照或测试化合物的情况下培养。测量并报告了病毒复制(感染)效率作为化合物浓度的函数(图2)。4）.而瑞德西韦则以剂量依赖的方式与IC强烈抑制病毒复制₅₀值0.43µM时，法莫替丁没有可测量的效果(图2)。4b).我们的结果与先前报道的研究一致，即瑞德西韦对人肺A549细胞的抗病毒作用大于对Vero E6细胞的抗病毒作用²⁴．法莫替丁不能抑制拥有丝氨酸蛋白酶TMPRSS2的A549细胞中SARS-CoV-2的复制，这一事实也可能表明它对参与病毒进入的宿主蛋白酶没有影响。

在Vero E6和A549细胞中进行的平行细胞毒性试验表明，法莫替丁在最高测试浓度为200 μM时没有毒性(图2)。4）.另一方面，雷姆德西韦在较高浓度时表现出剂量依赖性细胞毒性，远高于其最低剂量₅₀．总之，这些结果表明，法莫替丁不能抑制培养细胞中的SARS-CoV-2复制，其所谓的临床益处可能是由于另一种作用机制。

两项计算机研究分别预测了3CL^箴或PL^箴作为法莫替丁的潜在分子靶点^8，9这意味着法莫替丁相关的COVID-19患者的改善可能是由于直接的抗病毒作用机制⁶．尽管计算技术最近取得了进展，但使用分子对接来准确预测蛋白质-配体相互作用仍存在一些挑战。其中一些挑战来自于靶蛋白的灵活性，缺乏对药物结合位点的先验知识，以及靶氨基酸的质子化状态²⁵．虽然分子对接得到的结果可以作为新的假设的基础，但还需要实验验证。我们使用SPR和DSF进行的配体结合实验不支持之前法莫替丁与SARS-CoV-2蛋白酶直接结合的计算机预测。我们进一步使用了一系列实验方法来证明法莫替丁对SARS-CoV-2蛋白酶功能或总体上对病毒复制没有影响。必须指出的是，由于临床研究将假定的临床获益与使用更高剂量的法莫替丁联系起来，我们测试了法莫替丁在明显更高的剂量下体外浓度高于两项临床研究中患者血液中达到的峰值血浆浓度(0.5-2µM)^6，7．我们的数据强烈表明，法莫替丁可能的临床益处可能独立于抗病毒作用机制而产生。

COVID-19并发症与感染患者肺部严重的促炎反应有关²⁶．炎症引起的“细胞因子风暴”是COVID-19的一个关键病理特征，也是导致呼吸衰竭和死亡的主要原因²⁷．重症病例以肺浸润和广泛肺水肿为特征，引起肺泡间隙炎症细胞渗出，导致肺广泛实变，导致肺炎和成人呼吸窘迫综合征(ARDS)。^{28，29，30.，31}．两份法莫替丁相关的COVID-19临床报告的结果，当合并在一起时^6，7研究表明，法莫替丁可能有助于缓解从呼吸短促到插管等中度至重度呼吸道症状。我们的数据不排除法莫替丁相关的COVID-19患者改善是通过抗炎作用的可能性。例如，COVID-19患者细胞因子风暴的发展以促炎I型细胞因子升高为特征，这些细胞由多种细胞分泌，如多形核细胞、自然杀伤细胞、内皮细胞等²⁷．因此可以想象，法莫替丁在控制呼吸道症状方面的相关益处可能是由于其抗炎机制的作用。

值得注意的是，H2R是法莫替丁的既定分子靶点，它参与了适应性免疫反应的几种介质的激活，如Th1淋巴细胞，它与促炎细胞因子的产生有关³²．组胺，H2R配体，也调节支气管收缩、气道炎症和血管舒张³²．肥大细胞是组胺的主要来源，它们在呼吸道病毒感染后被激活^33，34，35．因此，肥大细胞可能是COVID-19患者释放促炎细胞因子的一个未被充分认识的来源³³．更好地了解H2R通路在COVID-19中的作用将有助于阐明法莫替丁如何降低疾病严重程度的分子细节。

我们的体外这项研究重新定位了法莫替丁潜在有益作用背后的机制，从抗病毒作用转向了COVID-19患者可能的抗炎作用。鉴于有一项正在进行的随机临床试验(NCT04370262)，我们的结果可能有助于研究者重塑他们的介入性研究，以包括炎症相关的结果。此外，应该指出的是，虽然法莫替丁是相对安全的药物之一，但它的使用并非没有风险^36，37，38特别是在老年患者(COVID-19的高危人群)中，法莫替丁的使用与中枢神经系统并发症有关³⁹．如果正在进行的临床试验产生了有希望的结果，那么在将该药物用于COVID-19疾病管理(很可能作为联合治疗的一部分)之前，将需要进一步研究法莫替丁及其在不同年龄组中的安全性。

化合物

法莫替丁收购自Sigma Aldrich(密苏里州，美国);猫。不。F6889)。化合物6,先前报道的SARS-CoV-2 PL抑制剂^箴函数²¹收购自MedChem Express, Inc. (New Jersey, USA);猫没有。hy - 17542)。ML188,一种已知的3CL化合物^箴抑制活性¹⁵也从MedChem Express, Inc.收购。没有hy - 136259)。同样,remdesivir。(猫。No HY-104077)是SARS-CoV-2复制抑制剂²都是从同一个卖家那里买的。所有化合物溶解在100% DMSO中，100mm。

克隆、表达和蛋白质纯化

编码3CL的完整序列^箴PL残数746 ~ 1060^箴(wu - hu -1分离株，GenBank登录号NC_045512)克隆到自制的电荷修饰SUMO融合表达载体中。融合蛋白在Rosetta-2 (DE3) pLysS中于ZYP-5052自诱导培养基中于18℃下表达24 h。将收获的细胞重悬于50 mM Hepes pH 7.5中，含150 mM NaCl，超声裂解。澄清后的上清液上传到HiTrap HP SP柱(Cytiva, Massachusetts, USA;猫没有。17115201)，通过阳离子交换层析步骤捕获目标融合蛋白，并使用NaCl梯度洗脱。将SUMO水解酶加入到混合馏分中以释放目标蛋白，样品在20 mM Tris, 10% v/v甘油，5 mM DTT pH 7.0条件下在4°C下透析过夜。将蛋白重新装上HiTrap HP SP柱，通过减法步骤去除SUMO蛋白和水解酶。流经，含3CL^箴或PL^箴采用hrap HP Q柱(Cytiva;猫。不。17115401)用NaCl梯度洗脱蛋白质。在20 mM Tris pH 7.4、150 mM NaCl和5 mM DTT条件下，通过粒径排除层析进一步纯化混合馏分。最终蛋白浓缩至4mg /mL进行PL检测^箴3CL为5mg /mL^箴然后瞬间冻结成等份。

体外病毒酶测定

PL^箴泛素- amc蛋白水解活性测定

PL^箴活性在384孔板格式(康宁#3574)中使用荧光底物Ubiquitin-AMC (Boston Biochem, Inc.)进行动力学测定。美国马萨诸塞州;猫。不。U-550)，激发和发射波长为Ex355nm/Em:460 nm。该方案遵循先前报道的条件，并进行了轻微修改^13，16．在Victor X5 (Perkin Elmer)多模平板阅读器中，在25°C下，每5分钟监测一次荧光，持续50分钟。最佳酶和底物浓度为550 nM PL^箴在0.2 ~ 3 μM范围内滴定衬底。实验缓冲液(20 μL)含有25 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1 mg/ml BSA, 550 nM PL^箴．试验抑制剂法莫替丁和PL^箴控制抑制剂(化合物6)均在0.01 μM ~ 200 μM的浓度范围内滴定。在加入1 μM Ub-AMC开始反应之前，化合物与酶在板上25°C孵育30分钟。所有样品一组重复运行，并使用AMC标准曲线将其初始斜率从相对荧光单位(RFU)/ min转换为μmol AMC/min，并根据所测化合物浓度绘制。

3氯^箴蛋白水解活性测定

3氯^箴用3CL在384孔板上测定活性^箴FRET衬底(AnaSpec, Inc.)美国加州;猫。不。AS-65599)，激发和发射波长为Ex: 490 nm/Em: 535 nm。先前报道的方案经过一些修改后被使用^12，17．每分钟监测荧光变化动力学，持续25分钟。3CL的最佳浓度^箴底物分别为150 nM和600 nM。A先前报道的3CL^箴抑制剂¹⁴，ML188在0.01 μM ~ 200 μM的浓度范围内滴定对照和被试化合物。使用HiLyte Fluor488 amine, TFA salt的标准曲线将RFU/min的初始斜率转换为μM水解底物/min。

生化数据分析

减去背景荧光读数后，使用GraphPad Prism 8，分别用Michaelis-Menten (y = (Vmax*x)/(Km + x))和四个参数logistic (4PL)方程(y = min + (max-min)/(1 + (x/EC50)^Hillslope)拟合实验数据，得到Km和EC50的值。

动态扫描荧光法(DSF)

在20 uL体积的Micro-Amp EnduraPlate光学384孔透明反应板(ThermoFisher: cat no. 5)中监测蛋白质的热展开。4483285)。反应条件为50 mM HEPES pH 7.5, 62.5 mM NaCl, 7 μM 3CL^箴或PL^箴5% DMSO, 4 × SYPRO-orange蛋白凝胶染色(ThermoFisher Scientific, Massachusetts, USA;猫没有。S6651)。法莫替丁和阳性对照ML188和化合物63氯^箴和PL^箴分别与蛋白孵育15 min，然后加入SYPRO橙汁。用Micro-Amp光学胶膜覆盖平板(ThermoFisher Scientific, Massachusetts, USA;猫没有。4360954)，并在Applied Biosystems 7900HT (California, USA)实时PCR仪上运行。样品在25°C下孵育2分钟，然后以1°C/min的速度升温至95°C。连续监测荧光。每个样品一式三份，在1 mM、2.5 mM和5 mM处测试化合物。熔化温度(T_米）从原始热变性数据的一阶导数得到确定和平滑，以计算熔化温度(T_米)值⁴⁰．

表面等离子共振(SPR)

SPR研究在Biacore 3000仪器(Cytiva, Massachusetts, USA)上进行，温度为10°C。PL的^箴和3氯^箴用EZ-LINK磺化- nhs - lc - lc -生物素试剂(ThermoFisher Scientific, Massachusetts, USA;猫没有。A35358)，并将其固定在中性蛋白涂层的CM5传感器芯片上，达到4000响应单位(RU)的水平。固定化过程中使用的蛋白在PL为1 μM^箴3CL为1 μM^箴．在测定过程中，注射不同浓度的化合物。化合物在25 mM HEPES pH 7.0, 200 mM NaCl, 2 mM TCEP, 0.005% P20和1% DMSO的流动缓冲液中连续稀释(2倍)。法莫替丁和对照抑制剂化合物6和ML188最大剂量分别为100 μM、50 μM和5 μM。通过减去空白通道(不含蛋白质)和在样品通道上注射缓冲液来获得最终响应。通过将原始数据拟合到简单的1:1平衡和动力学模型，在scber2程序(BioLogic软件)中分析原始数据。

抗病毒药物化验

病毒和滴定

采用SARS-CoV-2的2019-nCoV/USA- wa1 /2020分离株(NCBI登录号:MN985325)进行病毒感染性检测，该分离株来自美国疾病控制与预防中心和BEI资源(Virginia, USA)。病毒库在Vero E6细胞中繁殖，使用空斑形成试验测定病毒滴度，如前所述⁴¹．

抗病毒药物化验

表达SARS-CoV-2进入因子的人肺A549细胞和非洲绿猴肾Vero E6细胞在添加10%胎牛血清(FBS)的DMEM中维持。细胞以每孔15000个细胞的密度接种到聚l -赖氨酸包被的96孔板中。然后用法莫替丁5倍连续稀释(0.32µM至200µM)处理细胞4小时。DMSO作为阴性对照，瑞德西韦连续稀释5倍，范围在0.1µM到62.5µM之间，作为阳性对照。然后以0.1的感染倍数(multiplicity of infection, MOI)感染细胞。为了感染细胞，取出含化合物的培养基，将细胞与病毒在37℃下孵育1小时。然后去除病毒接种物，用1X PBS冲洗细胞单层两次。将化合物加入后孵养72 h，收获细胞培养基进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)和斑块检测，同时用4%多聚甲醛固定细胞进行免疫荧光显微镜观察。

病毒RNA提取及实时定量PCR (qRT-PCR)

使用Quick-RNA病毒试剂盒(Zymo, California, USA cat no. 5)从sars - cov -2感染细胞的细胞培养上清中分离RNA。R1035)根据制造商的说明。采用qScript一步RT-qPCR试剂盒(Quantabio, Massachusetts, USA;猫没有。95058)，引物和Taqman探针靶向sars - cov - 2e基因，如前所述⁴²．使用quantistudio3 Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)在以下条件下获得数据:55°C 10 min, 94°C变性3 min, 94°C变性15 s, 58°C退火30 s, 45个循环。使用的引物和探针如下:E_Sarbeco_Forward: ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT;E_Sarbeco_Probe: FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ;E_Sarbeco_Reverse: ATATTGCAGCAGTACGCACACA。利用NEB PCR克隆试剂盒(New England Biosciences, Massachusetts, USA;猫没有。E1202S)。克隆的片段是在那时体外使用mMessage mMachine SP6转录试剂盒(ThermoFisher, Massachusetts, USA;猫没有。AM1340)生成qRT-PCR标准品。

免疫荧光显微镜

用4%多聚甲醛固定感染病毒的细胞30分钟。去除固定剂，用1X PBS洗涤细胞单层2次。然后将细胞渗透并用抗sars冠状病毒核衣壳(N)抗体(Rockland Inc.， Pennsylvania, USA;猫。不。200 - 401 a50;下稀释)。与一抗在4℃下孵育过夜。然后用1X PBS洗涤5次，用Alexa 568偶联抗兔抗体(1:1000稀释)在室温下黑暗染色1小时，用DAPI反染色。使用EVOS M5000成像系统(ThermoFisher Scientific, Massachusetts, USA)采集图像。使用MuviCyte活细胞成像系统(PerkinElmer, Massachusetts, USA)对固定细胞图像进行定量和分析。 At least 7–10 microscopic fields were imaged per well using a 10X objective lens, the number of cells positive for the SARS-CoV-2 N protein and the nuclear DAPI stain, were counted. For each image, the percentage of DAPI-positive cells expressing the viral N protein were calculated, and the mean ± SD of multiple images for each condition was plotted.

细胞毒性/细胞活力测定

CellTiter-Glo发光细胞活力测定(Promega, Wisconsin, USA);猫没有。采用G7570)测定化合物的细胞毒作用。简单地说，将细胞用5倍连续稀释的法莫替丁或瑞德西韦孵育72小时，之后将CellTiter-Glo试剂加入到每孔中，体积等于培养基的体积。在轨道摇床上摇板2分钟，然后在室温下孵育10分钟，混合内容物。使用Varioskan LUX多模板读取器(ThermoFisher Scientific, Massachusetts, USA)记录发光。