基于pca的无监督特征提取技术用于COVID-19患者基因表达分析

2019冠状病毒病(COVID-19)是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)引起的传染病。它于2019年12月在中国湖北武汉首次被发现，并导致了持续的大流行^1，2，3.．COVID-19是一种潜在的人畜共患疾病，死亡率中等(2-5%)，主要通过飞沫和与感染者或潜伏期携带者的直接接触传播⁴．大量轻症和无症状病例被认为是SARS-CoV-2的一个特征^5，6，7．然而，它会严重影响肺部，COVID-19幸存者可能会遭受长期健康影响。虽然对COVID-19进行了大量研究，但我们对它的认识还远远不够全面。目前没有明确有效的COVID-19预防或治疗方法。COVID-19患者别无选择，只能接受支持性护理以缓解症状⁸．因此，阐明COVID-19的发病机制，寻找有效的治疗方法是当务之急。

“银弹”方法需要分析包含从样本中提取的RNA的RNA- seq数据。通过比较COVID-19患者与非患者的基因表达，我们可以获得更多关于传染病病理的信息。使用机器学习的数据驱动方法是预测机制的有效策略，这些机制难以通过生物学中传统的基于知识的分析应用来阐明。虽然获取COVID-19的各种组学数据并不困难，但由于这些数据往往包含数万个候选基因，样本很少，因此分析起来很困难。

近年来，基于主成分分析(PCA)的无监督特征提取方法被提出用于基因选择。这种方法被称为PCAUFE^{9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20.，21，22，23，24，25，26，27}，可以分析具有少量样本和许多变量的数据集。该算法基于线性代数，计算量小，已被证实能很好地解决各种基因选择问题。例如，与创伤后应激障碍(PTSD)介导的心脏病相关的mRNA/miRNA表达的综合分析¹⁷以及各种癌症¹²发现了一个可能与这些疾病相关的候选基因。最近，通过使用PCAUFE对登革出血热患者血液进行整合基因表达分析，确定了46个对疾病进展至关重要的基因，而其他生物信息学分析方法无法获得这样的结果²⁷．此外，对PCAUFE方法的理论论证已经在以前的研究中得到了发展(更多细节，请参见²⁷)．

在本文中，我们通过将PCAUFE应用于COVID-19患者和健康对照组的RNA表达谱，鉴定了与COVID-19相关的基因。数字1展示了我们的研究大纲。我们从生物学和机器学习的角度证实了所识别基因的可靠性。此外，我们使用生物信息学工具来识别调控上层选择基因的转录因子和组蛋白修饰。本文的新颖之处在于，与以下部分描述的其他典型基因选择方法相比，PCAUFE应用于基因表达谱提供了最少数量的基因，这些基因可以从机器学习和生物学角度合理解释COVID-19的发展。

PCAUFE在COVID-19患者基因表达中的应用

本节描述了我们如何使用PCAUFE分析多个COVID-19患者的基因表达模式。

第一个例子(数据集1,GSE152418)由**am等人获得²⁸．分为重症监护患者(IP)、重症患者(SP)、中度患者(MP)、恢复期患者(CP)和健康对照组(HC) 5类。通过对IP + SP + MP组(16例患者)与CP + HC组(18例非患者)的主成分(PC)负荷进行统计分析，我们发现了第二和第三个PC (PC2和PC3)。的P使用t-test拒绝了IP+SP+MP组内和CP+HC组内的平均负荷相同的零假设:9．69 × 10⁻⁵PC2和pc3．67 × 10^−3.生物。虽然患者与非患者之间的PC1负荷有显著差异，但患者与非患者之间的PC1负荷有显著差异P值(1．83 × 10⁻²)的大小比pc2和pc3的大。如图S1所示，第2和第3 PCs比第1 PCs更清楚地将样本分为患者和非患者。这就是为什么我们选择了pc 2和pc 3，而不是pc 1。在这个平面上，我们选择嵌入PC分数的141个探针作为异常值，根据aχ²使用P由Benjamini和Hochberg (BH)准则调整的值²⁹．表格1列出与141个探针相关的123个基因。

为了确认我们成功地选择了代表样本之间关系的关键基因，我们仅从PCAUFE选择的123个基因中构建了预测COVID-19患者的模型。我们使用数据集2，其中包括100名COVID-19患者和26名非COVID-19患者，来计算曲线下面积(AUC)。^30.．我们使用逻辑回归(LR)³¹，支持向量机(SVM)^32，33，随机森林(RF)³⁴作为分类模型。表格S1显示三个模型的每个超参数。我们通过对三个分类器的数据集2的样本进行随机洗牌来进行5次交叉验证。数字2(a)为受试者工作特征(ROC)曲线^35，36每种模型。如图所示，每个模型的平均AUC都在0.9以上。从这些结果中，我们可以使用123个选定的基因来预测COVID-19的结果。

与其他基因选择方法的比较

为了证实我们结果的稳健性，我们用另外两种经典方法进行了基因选择:微阵列显著性分析(SAM)³⁷微阵列数据线性模型(LIMMA)³⁸．通过将SAM和LIMMA应用于数据集1 (GSE152418)，我们鉴定了与调整相关的基因P-值小于0.01。我们证实PCAUFE选择的大部分基因都包含在SAM和LIMMA选择的基因中。每次应用SAM，所选择的基因都会发生变化。因此，SAM的结果没有在本报告中显示。对于LIMMA，所选择的探针包含了PCAUFE所选择的所有基因。值得注意的是，PCAUFE可以将候选基因限制在比普通基因表达分析工具更少的数量;例如，LIMMA选择了18458个探针。通过进一步将18458个探针从最小调整到几乎与PCAUFE相同的数量P-值，我们还使用数据集2对LIMMA选择的基因进行了患者/非患者分类。使用LR、SVM和RF的结果如图所示。2(b).我们确认各模型的分类性能与PCAUFE的分类性能相当。

为了增加我们结果的稳健性，我们还选择了使用一些最近的R包的基因:edgeR³⁹和DESeq2⁴⁰．与SAM和LIMMA一样，通过对数据集1应用edgeR和DESeq2，我们识别了与调整相关的基因P-值小于0.01。edgeR和DESeq2选择的探针数分别为4452和5696。因此，这些方法比PCAUFE选择了更多的基因。edgeR和DESeq2筛选的基因分别包含PCAUFE筛选的59个和64个基因。3种方法共筛选出57个共同基因。为了进一步与PCAUFE进行比较，我们根据edgeR和DEseq2选择的基因进行分类分析，预测样本是否为COVID-19患者。在分类分析中，我们限制edgeR和DEseq2各自选择的探针数量相同，并调整最小的探针数量P- PCAUFE中的值(即141)，因为两种方法都选择了太多的基因，无法将其用作预测模型的解释变量(即4452和5696)。edgeR和DEseq2的相关基因数分别为111个和113个。数据2(c)和(d)显示了使用有限探针的患者预测模型的ROC曲线。他们的auc与PCAUFE的auc大致相等。如前所述，我们发现PCAUFE选择的基因数量比其他方法更少，对于预测COVID-19患者是否显著。

作为本小节的最后一部分，我们进行了加权基因共表达网络分析(WGCNA)。采用的分析程序⁴¹而且⁴²，我们应用了WGCNA R包⁴³到数据集1。我们在这里选择了幂β= 7作为构建无标度网络的软阈值。S2(A))。我们得到共表达网络中的99个模块，如图所示。S2(B).这些模块包括18882个探针，远远多于中金财经选择的141个探针。此外，PCAUFE选择的基因中有近一半(即58个)包含在WGCNA的基因中。作为参考，由前3个模块中最小的基因组成的蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络P这些基因的值和富集分析结果也显示在补充图中。S3和表S2,分别。

如前所述，我们验证了我们的方法，采用PCAUFE进行基因选择，比WGCNA、edgeR和DEseq2等普通方法更有效地缩小候选基因的范围。

在这项研究中，我们首先使用PCAUFE鉴定了123个与COVID-19患者相关的基因。我们通过以下补充分析来证明线性降维方法的使用:为了与PCAUFE进行比较，我们还应用了线性降维方法t-分布式随机邻域嵌入(t-SNE)⁴⁴均匀流形近似与投影(UMAP)^45，46，47，两种典型的非线性降维方法，对数据集1进行基因选择。以与PCAUFE算法相同的方式，我们尝试搜索通过的探测χ²使用P由BH准则调整的值。然而，如图S4所示，我们没有发现调整后的探针P平面上的值小于0.01。PCAUFE的第一个算法搜索主成分(即轴)，其负载在统计上将患者和非患者等两组分开。因此，异常值通过χ²PCAUFE第二算法中的test可视为部分患者与非患者相比异常上调或下调的探针。另一方面，t-SNE和UMAP强调在将高维数据集缩减为二维时，将探针的相似性保留为距离，低维空间中的轴并不总是对应于这两组。因此，单纯使用这些非线性降维方法进行基因选择并不合适，因为这并不意味着低维空间中远离原点的探针就可以作为COVID-19诊断的生物标志物。

此外，应该指出的是，在COVID-19等新型疾病的基因表达分析中，使用最先进的深度学习技术并不总是成功的:我们还应用了最近发表的一种名为使用分层自编码器(scDHA)的单细胞分解方法。⁴⁸，该方法被描述为可靠地提取每个单元的代表性信息，以数据集1与PCAUFE进行比较。补充图S5为数据集1样本在scDHA降维空间中的散点图。如图所示，scDHA完全不能根据pbmc的基因表达谱将COVID-19患者与非患者区分开。原因可能是这个数据集的样本太少，而用于训练自动编码器的变量太多。PCAUFE比其他方法计算成本更低，因为它只需要以一种特殊的方式对基因表达矩阵应用一次PCA。因此，它已被成功地用于解决各种基因选择问题(详情见:⁴⁹)．如上所述，我们证明了这种非新颖但功能强大的基因选择方法对COVID-19患者基因表达谱数据集的有用性，并提出了COVID-19发展的新机制。

其次，我们根据PCAUFE筛选的123个基因，分别采用LR、SVM和RF三个独立模型对COVID-19患者和非患者进行分类，并证实所有模型的auc均高于90%。我们没有对分类模型使用最先进的深度学习技术的原因是用于交叉验证的数据集中的样本量(即126)不够大，不足以容纳解释变量的数量(即123)。例如，可以通过增加样本数量来构建深度学习分类模型，如⁵⁰．Liu等。⁵¹我们使用卷积神经网络(cnn)根据海马体的fMRI图像来预测阿尔茨海默病患者，但我们没有使用它们，因为我们的患者预测模型中的解释变量是基因表达水平，其中不能假设图像中位置接近的元素之间的相似性。然而，如上所述，PCAUFE选择的基因的统计相关性已经得到了保证，因为我们发现传统的机器学习模型具有足够的预测精度。

为了进一步证明我们结果的稳健性，我们还使用数据集2进行基因选择，并使用数据集1进行聚类分析以验证所选基因的可分离性。PCAUFE、LIMMA、edgeR和DESeq2从数据集2中筛选出的基因数量分别为145、7360、4809和5018。LIMMA、edgeR和DESeq2分别包括PCAUFE使用数据集2选择的145个基因中的79个、82个和82个。另一方面，PCAUFE选择的123和145个基因之间重叠的基因数为38个。对于聚类分析，我们采用了一种无监督学习模型UMAP，因为数据集1只包含34个样本，太少了，无法使用它来训练和测试监督学习模型。结果见补充图。S6表明PCAUFE选择的基因与LIMMA、edgeR、DESeq2一样可以对COVID-19患者进行分类。最后，即使我们切换了基因选择和患者/非患者分类的数据集，我们也得到了类似的结果。

由于我们成功地证实了我们的结果的稳健性，我们接下来研究了123个选定基因的生物学可靠性。首先，我们将123个基因上传到3个富集分析服务器GeneSetDB⁵², Metascape⁵³和TargetMine⁵⁴，以补偿每个个体的丰富所带来的偏差。检测到多种免疫相关富集。例如，基因本体(GO)生物过程(BP)术语GO:0019221(细胞因子介导的信号通路)、GO:0060333(干扰素- γ介导的信号通路)和GO:0060337 (I型干扰素介导的信号通路)被三台服务器共同识别。GO细胞成分(CC)术语GO:0042613 (MHC II类蛋白复合物)通过GeneSetDB和TargetMine鉴定。反应组通路R-HSA-877300(干扰素γ信号)、R-HSA-6785807(白介素-4和白介素-13信号)、R-HSA-449147(白介素信号)和R-HSA-1280218(适应性免疫系统)通过metscape和TargetMine鉴定(更多细节，见补充)S1带有_File)。

其次，我们通过检查它们之间的相互作用来确认所识别基因的生物学验证。基因之间的紧密关系表明基因选择是可靠的，因为单个蛋白质很少在不与其他蛋白质合作的情况下发挥作用。因此，我们将123个基因上传到STRING服务器⁵⁵他们在这些基因的产物中检测到了659种蛋白质之间的相互作用。因此，这123个基因由于其产物之间的功能协作，也丰富了蛋白质-蛋白质相互作用。这些富集分析表明，PCAUFE可以成功识别出一组生物学上可行的与COVID-19相关的基因。

为了研究调控PCAUFE选择的123个基因的上游转录因子(tf)，我们还将它们上传到了富贵网^56，57，一个多功能的丰富分析服务器。在浓缩铀给出的结果中，NFKB1和RELA的调整较小P-“trust转录因子2019”的值，如图。3.．我们还注意到“ENCODE TF ChIP-seq 2015”中排名最高的三个TF绑定:NELFE, RELA和KAT2A(更多细节，参见图2)。S7在补充部分S2带有_File)。

这123个基因也进行了多组蛋白修饰富集，结果见表2．此外，如图。4，组蛋白修饰相关基因与TF靶基因大量重叠。

核因子B (NF-κB) tf在触发和协调先天和适应性免疫反应中起着进化上保守和关键的作用⁵⁸．NF -κB转录因子家族由5个成员组成:p50、p52、p65 (RelA)、c-Rel和RelB，分别由NFKB1、NFKB2、RelA、REL和RelB编码⁵⁹．典型NF-的主要介质κB活性是异源二聚体RelA-p50，由RelA转录激活物和nfkb1蛋白p50组成^60，61．

Nakshatri等人。⁶²认为NF-κB活性被H3K36me3抑制，这与在这123个基因中观察到的NFKB1-和rela结合位点的富集一致。许多研究也报道了COVID-19患者鼻/口咽拭子和外周血单个核细胞(pmcs)中免疫信号相关基因的表达水平下调。米克等人。⁶³与其他病毒性急性呼吸道疾病相比，COVID-19的特征是先天性免疫反应减弱，与toll样受体和白介素信号、趋化因子结合、中性粒细胞脱粒以及与淋巴样细胞相互作用相关的基因表达减少。Meckiff等人。⁶⁴显示sars - cov -2反应性CD4⁺与流感反应细胞相比，T细胞表达的免疫相关转录物水平明显较低。欧阳等。⁶⁵报道重度病例中表达不足的基因主要涉及th17细胞分化、细胞因子介导的信号通路和t细胞激活。李等人。⁶⁶报道称，在严重的COVID-19 pbmc中，介导t细胞受体信号转导的蛋白质下调。

研究无花果中5个重叠基因的表达变化。4，我们通过如图所示的散点图确认数据集1的PC2和PC3分数。5．PC2和PC3阴性定位的探针在COVID-19中主要上调。另一方面，在两种pc上定位为阳性的探针在COVID-19中主要被下调。如图中红色方块所示。5，即Fig中的重叠基因。4对两台电脑都有积极的定位。因此，这些重叠的基因在COVID-19中被下调。这些分析结果与上述文献一致^{62，63，64，65，66}．

NF -κB作为抗癌治疗的靶标，在制药公司中进行了许多积极的研究⁶⁷．NFKB1和RELA的异常表达是通过mRNA的修饰介导的⁶⁸．N4-乙酰胞苷(N4A)在RNA表达方面的最新进展也在癌症发展中发挥着关键作用⁶⁹．段杰等。⁷⁰据报道，核苷代谢物N4A通过诱导HMGB1信号通路激活小胶质细胞并维持NLRP3炎性小体的激活。通过N4A激活NF-释放HMGB1κB和诱导NLRP3表达⁷⁰．NLRP3炎性小体被适当激活并能够释放成熟的IL-1β^71，72，73．il - 1β是炎症反应的重要介质，参与多种细胞活动，包括细胞增殖、分化和凋亡^74，75．

虽然我们通过PCAUFE和富集分析鉴定了123个与COVID-19相关的基因和上游转录因子，但我们尚未评估这些基因是否对COVID-19的发展具有潜在的因果影响。孟德尔随机化^{76，77，78，79，80}方法已广泛用于研究基因与疾病结局之间的因果关系。例如，Zhang等。⁷⁹使用MR方法调查PTSD和抑郁表型之间的因果关系。在另一项研究中⁸⁰MR分析结果表明，遗传变异在神经质对心理健康和心血管疾病的因果影响中起中介作用。该方法使用遗传多态性信息作为操作变量，但不幸的是，我们使用的数据集不包括该信息。此外，多态性可能有几种与疾病相关的表型效应。因此，我们将MR方法应用于COVID-19患者的基因表达谱作为未来的工作。

综上所述，我们将PCAUFE应用于COVID-19患者和健康受试者外周血单核细胞的基因表达水平，筛选出123个COVID-19相关基因。然后，通过富集分析，我们确定了调控这些基因表达的转录因子和组蛋白修饰。这123个基因的表达可能涉及NELFE、RELA、KAT2A和NFKB1四种转录因子和组蛋白修饰H3K36me3。NFKB1、RELA和H3K36me3在调控表达的基因中被发现重叠。这两个转录因子与NF-有关κB, H3K36me3可以抑制它。事实上，当我们比较COVID-19患者和健康受试者之间GSE152418中NFKB1、RELA和H3K36me3重复基因的表达水平时，我们观察到COVID-19患者的表达水平下降。这些结果表明，典型的NF-κH3K36me3抑制了COVID-19患者外周血质的B活性。

基因表达谱

两个在活的有机体内基因表达数据集，GSE152418²⁸和GSE157103⁸¹，从基因表达Omnibus下载⁸²．下面，我们将它们分别表示为数据集1和数据集2。PCAUFE应用于数据集1，该数据集描述了每个受试者pbmc中每种mRNA的表达水平。探针数量为60683个。然后使用数据集2来确认PCAUFE选择的基因的统计有效性。该数据集还描述了每个受试者pbmc中每个基因的表达水平。数据包括COVID-19患者和患有与SARS-CoV-2无关的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的非COVID-19患者。基因数量为19472个。每个基因的表达水平我(= 1，2……N)为PCAUFE标准化，即我们设定\(\frac{1}{N}\sum_{i} x_{ij} = 0\)而且\(\frac{1}{N}\sum_{i} x_{ij}^{2} = 0\)．这些基因表达谱中包含的样本的详细信息见表S3在补充部分S2带有_File。

PCAUFE

下面简要解释本研究中使用的PCAUFE程序(更多详细信息，请参见^{9，12，17，27，49})．让x_我j表达我的-th mRNA探针jTh样本，让\(\frac{1}{N}\sum_{i} x_{ij} = 0\)而且\(\frac{1}{N}\sum_{i} x_{ij}^{2} = 0\),在那里N为m-RNA探针的数量。首先，我们对行和列分别为基因和样本的数据集应用主成分分析。与通常使用的PCA相比，其中样本是嵌入的，而基因是嵌入在这个实现中。通过使用t-test中，我们指定了两种主成分(PCs)，其负载按最小顺序将患者与健康对照样本进行统计学上的区分P价值。注意，与普通的PCA不同，该操作并不保证前两台pc将被选中。第二，通过使用χ²使用P由BH准则调整的值²⁹，我们确定了异常值PC评分(即与调整后的基因相关的基因)P-值小于0.01)以及指定的pc作为疾病相关基因的候选。请注意，PCAUFE中的PC评分与特征(即mRNA探针)相关，而不是与样本相关，这与PCA的普通用法相反。

患者/非患者分类模型

为了验证PCAUFE选择的基因对COVID-19患者的诊断有用，我们使用三种标准预测模型，根据所选基因进行患者/非患者分类:logistic回归(LR)³¹)，支持向量机(SVM^32，33)和随机森林(RF³⁴)．三种模型各超参数的详细说明请参见补充表S1．根据非COVID-19患者和COVID-19患者的不同，每个样本的目标变量分别为0或1。解释变量为与PCAUFE、edgeR或DESeq2选择的基因相关的探针的基因表达。我们随机将数据集2的80%分配给训练集，剩余的分配给测试集。绘制各模型的受试者工作特征(ROC)曲线，计算曲线下面积(AUCs)。