体外研究PHELA功效,对SARS-CoV-2非洲传统药物

冠(严重急性呼吸系统综合症冠状病毒)和MERS-CoV(中东呼吸道综合症冠状病毒)在2002年和2012年,全球主要构成健康风险。2019年,冠状病毒的形式取得了第三个幽灵SARS-CoV-2,小说菌株致病性极高的冠状病毒¹。SARS-CoV-2是一个不分的包膜beta-coronavirus积极意义RNA²。它感染人主要通过呼吸系统,它使用与冠相同的受体,血管紧张素转换酶2 (ACE2)^1,2。病毒表面的峰值(S)糖蛋白,膜蛋白(M)、小信封糖蛋白(E),核衣壳(N)糖蛋白都被视为重要的治疗目标^1,3。因此,科学家们把精力集中发展有效和可靠的SARS-CoV-2治疗选择³。

疫苗和候选疫苗不仅令人印象深刻的数量,但也在多样性方面,他们包括标准(灭活病毒粒子、减毒活疫苗和蛋白质+辅助)、创新(信使rna, DNA复制和non-replicating病毒载体)平台⁴。这一事实没有任何防护相关高致病性冠状病毒已被确认^5,6,以及前景,这种相关疫苗之间可能有所不同⁷使局势进一步复杂化。尽管如此,预期,体液免疫和细胞免疫能预防冠状病毒^8,9。非人灵长类动物已经验证了受感染的抗体反应对峰值(S)的蛋白质^10,11,康复的等离子体高anti-S抗体滴度似乎在一些患者治疗的潜力¹²。体液反应在无症状或轻微症状的人可以轻微且短暂,消失在几个月内感染^13,14,15看到SARS-CoV-1暴发期间2002 - 2003¹⁶。从COVID-19不仅复苏,而且对长期的免疫力,可能有效的T细胞反应是必要的。T细胞已被证明对SARS-CoV-1表现出持久的免疫反应^15,17。

植物产品可能是一个好地方开始寻找和开发anti-COVID-19治疗。植物已经被世界各地的人们利用作为药物从古代,尤其是在亚洲国家,如印度、中国和日本,以及在几个非洲国家¹⁸。这些草药的广泛可用性和低成本导致了土著居民中流行的使用¹⁹。这给了希望COVID-19药物从天然产物可以通过各种有效的方式^{20.,21,22,23,24}。草药也被用于治疗病毒性疾病如冠。根据可用的数据,草药疗法可能是有用的治疗和减少COVID-19的风险。中国国家健康委员会认识到使用草药作为COVID-19治疗选择西医,产生了大量的草药治疗指南²⁵。植物化学物质等药用植物生物碱、黄酮、多酚、单宁、木质素、香豆素、萜类、芪,据说被绑定到有助于减轻感染病毒蛋白质和酶的活动,防止病毒细胞内渗透和复制¹⁹。许多调查发现,植物的生物活性化合物可能对小说SARS-CoV-2抗病毒活动^19,26。

PHELA被公认为四个奇异的草药组合即非洲药用植物,Clerodendrum glabrum大肠最大经济产量。唇形科,剑兰dalenii范加尔,Rotheca myricoides(Hochst)。Steane & Mabb,塞纳occidentalis(l)链接。这些植物历来被用作治疗浪费的情况下,作为一个能源助推器,最近,一些传统的卫生从业者声称准备可以帮助艾滋病患者²⁷。在临床研究涉及500名艾滋病患者,利用PHELA作为免疫助推器显示增加食欲,体重增加23%,减少80%的病毒载量,CD4细胞计数增加200% (HIV阳性的一项观察性研究获得的信息和艾滋病患者服用PHELA,传统医学,在Mabopane Philisa医疗中心,西北省,从2003年到2005年由南非Matsabisa et al .,²⁸]。PHELA是由结合这些不同的植物在一个精确的特定部分的比例组成的植物^{27,28,29日,31日}。这些植物的结合历史上一直用于治疗一种古老的疾病被称为“Muyaga”。病人感染Muyaga的特点是以下症状和体征:咳嗽、发烧和头痛哆嗦,减肥和食欲不振、胃肠障碍,身体僵硬和疼痛,口腔溃疡。PHELA大学目前正在开发的自由州作为HIV的免疫助推器及其配方已经证实immune-modulating属性^30.。PHELA逆转减少白细胞计数、中性粒细胞、淋巴细胞和胸腺重量drug-suppressed模型大鼠的免疫系统并没有有害影响测试动物的长尾黑颚猴subchronic毒理学研究^29日。没有毒性的报道在第一阶段临床试验在健康人体(医学研究委员会、本土知识体系领导计划报告,2009)。在另一项研究中,我们进行了PHELA逆转地塞米松和环孢霉素诱导免疫抑制研究老鼠和被发现没有影响正常的免疫系统。

积累PHELA先前的报道,在这个研究中我们调查PHELA特制产品作为一个候选人在体外研究和治疗COVID-19硅片对接研究评价其细胞毒性,功效,亲和力SARS-CoV-2蛋白质。基于这些数据,我们提出PHELA被用来COVID-19。

PHELA

植物,Clerodendrum glabrum大肠最大经济产量。唇形科(凭证标本。:BLFU MGM004),剑兰dalenii范加尔(凭证标本。:BLFU MGM001a MGM001b),Rotheca myricoides(Hochst)。Steane & Mabb(凭证标本。:BLF / MGM0013),塞纳occidentalis(l)(凭证标本没有链接。:BLFU/MGM0012) were collected with permission from the University Farm, Pannar Experimental Farm in Bainsvlei Bloemfontein, where the plants have been cultivated under controlled conditions. It was produced and supplied using strict good manufacturing standards by the Medical Research Council's Indigenous Knowledge Systems (IKS) Lead Programme (GMP). The relevant plant parts were dried and ground into a uniformly sized homogenous powder, which was subsequently sterilized using gamma radiation. PHELA was extracted in 70/30 ethanol/water with constant shaking over 24 h. PHELA is formulated in a specific ratio of the 4 plants part, stored for further uses and all the procedures were performed in accordance with the institutional and national guidelines and regulation.

化合物的分析和检测

水域超高液相色谱(UPLC)用连字符连接的水域Synapt G2 QTOF仪器被用来分析。1.7分析与Acquity UPLC本·C18µm(2.1×100毫米列),UPLC梯度流动相:一个;水:0.1%甲酸和B;甲醇+ 0.1% HCO₂h·列操作流速为0.300毫升/分钟。

细胞系和试剂

293 - t ACE2。MF细胞,enriched for the expression of human ACE2 receptor were a kind donation from Dr. Mike Farzan of Scripps Research Institute. Vero cells were obtained from the American Type Culture Collection. The cells were cultured in growth media (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) supplemented with 10% Fetal bovine serum and penicillin/streptomycin; and cells monolayer were disrupted at confluence by treatment with 0.25% trypsin in 1 mM EDTA. SARS-CoV-2 pseudovirus was made from a plasmid encoding SARS-CoV-2 envelope and a plasmid encoding the luciferase reporter gene (pNL4-3.luc.RE). The SARS-CoV-2 envelope genes used were from the Wuhan virus (GeneBank: MT039874.1), and first wave South Africa Virus (GeneBank: MT324062.1). The N501Y.V2 variant was made by introducing the mutations listed in Table1在武汉病毒使用Bioedit版本5.0.9.1软件和化学合成了Genscript(美国新泽西州Genscript,皮斯卡塔韦)。冠(资源库:DQ182595.1)和MERS-CoV(资源库:NC_019843.3)假让SARS-CoV-2解释一样。

代SARV-CoV-2和MERS-CoV假

SARS-CoV-2、冠状和MERS-CoV co-transfection生成的信封包含一个质粒,质粒携带的荧光素酶报告基因被魏et al。³²。co-transfection完成在2×10⁶293 - t的王牌。MF细胞/10 ml of growth media using the Fugene transfection reagent (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). The TCID₅₀病毒的股票被感染量化维洛细胞连续四倍稀释的上层清液一式四份的DEAE右旋糖酐(37.5μg /毫升)(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)。明亮的如果™试剂(Promega,麦迪逊,WI)是用来测量72 h后感染的组织文化,根据制造商的指示。发光是光度计测量Tecan无限F500。

不同菌株的抑制冠状病毒感染的靶细胞

293 - t的王牌。MF细胞株用于研究调查病毒受体的相互作用,并且有一个稳定的ACE2表达受体在CMV启动子。这些细胞已经证实表达ACE2在持续高水平跨多个通道和有效地感染SARS-CoV-2假。我们测试的能力PHELA中和SARS-CoV-2感染的细胞使用293 - t的王牌。MF细胞作为目标。96板是用于抑制研究,实验是在一式三份完成。单元控制、以及病毒控制井都包括在内。三倍系列稀释是由添加50µl提取100µl增长的媒体。稀释后系列、50µl SARS-CoV-2、冠状或MERS-CoV添加到所有井除细胞控制井。其次是孵化在37°C 1 h允许样本与病毒。 Afterward 30,000 cells/100 µl/well of 293-T ACE.MF cells or Vero cells (for MERS-CoV) were added and centrifuged at 3500 rpm for 3 h and 30 min. After centrifugation, the plate was incubated at 37 °C, 5% CO₂72 h和95%湿度。潜伏期之后,除去150µl增长的媒体以及100µl Bright-Glo荧光素酶底物的井。然后板在室温下孵化了2分钟。之后,150年µl被转移到相应的井的96 -黑色板,发光是阅读使用光度计Tecan无限F500。集成电路₅₀值计算造成的抑制浓度减少50%的相对光单元(RLU)相比,病毒控制(井没有抑制剂)减法后的背景(井没有病毒和抑制剂)。

293年PHELA t-ace的细胞毒性。MF细胞

293年PHELA t-ace的细胞毒性。MF细胞were, carried out by first seeding 30 000 cells/well/100 µl of the cells in a 96 well plate for 24 h at 37 °C, 5% CO₂和95%的湿度。24小时后,三倍系列稀释PHELA提取和100年执行µl被转移到盘子里含有细胞,细胞中除了控制井。细胞培养72 h。孵化后,在媒体被删除,取而代之的是新的180µl增长的媒体和20µl 3 - (4 5-Dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)试剂(5毫克/毫升)。其次是3 h孵化37°C,删除所有的媒体,除了150µl triton X-Isopropanol 0.1%。板是在室温下培养15分钟。之后,100年µl 4毫米的盐酸加板是读的波长620 nm使用Tecan无限F500光度计。

分子对接

分子对接进行了确定的绑定能力质鉴定化合物的晶体结构,2019年sars - x - 2蛋白从蛋白质数据库(检索http://www.rcsb.org/pdb)(PDB标识;6 m0j)。AutoDock工具³³1.5.4被用来确定合适的网格框大小为潜在的结合位点。Gasteiger指控是计算使用AutoDock工具球型投手中实现图形用户界面工具³⁴。确定维度是X = 24 Y = 24 Z = 24以1.00为网格间距。使用高斯09年的结构进行了优化³⁵,配体的对接与每个目标都使用AutoDock七弦琴³⁶。分子对接协议验证通过re-docking Baricitinib(参考药物)与选定的蛋白质。

统计分析

为了测试的有效性得到数据,统计分析是使用图表垫prism7软件完成的。

PHELA化合物分析

UPLC女士色谱进行分析化合物。结果见表2(显示选中的活性化合物)。

SARS-CoV-2 PHELA不同菌株的抑制效果

我们使用了SARS-CoV-2武汉应变,发起了2019年的大流行^37,38,应变隔离在南非在第一波,以及501 y。V2变异株。如无花果所示。1,提取抑制SARS-CoV-2进入293 - t的王牌。MF细胞。此外,在最高浓度PHELA测试我们观察到100%的抑制压力测试。比较每个应变的抑制剂的敏感性,南非应变是最敏感的集成电路₅₀值为0.00134毫克/毫升,而武汉和501 y。V2菌株有集成电路₅₀值为0.0100毫克/毫升和0.0241毫克/毫升,分别(表3)。PHELA还显示低水平的细胞毒性,MTT比色作为试验,TC₅₀值为0.476毫克/毫升(也见图。2);在这项研究中,使用时浓度提取是无毒的。然而,这些数据表明PHELA积极反对SARS-CoV-2 IC₅₀微克范围值低。

抑制作用的PHELA冠状病毒的家庭

事实上,基因相似性SARS-CoV-2冠有80%,而MERS-CoV是这种病毒基因相似的50%左右。我们测试了这些病毒的易感性PHELA使用293 - t的王牌。MF MERS-CoV非典冠状和维洛细胞的细胞。我们观察SARS-CoV-2、冠状和MERS-CoV,这些病毒敏感PHELA 100%抑制观察到的最高浓度(图使用的提取。3)。此外,抑制冠实现集成电路₅₀值为0.00348毫克/毫升,MERS-CoV抑制IC₅₀0.05900毫克/毫升(表4),这意味着前16倍比后来PHELA更加敏感。上述数据表明,PHELA有潜力用于对冠状病毒家族的其他成员,也会引发严重急性呼吸系统综合症。

分子对接

单个化合物的分子对接结果从提取获得展示在表5。对接模拟显示compound-amino酸相互作用,如氢键,介子堆,范德瓦耳斯相互作用(无花果。4和5)。化合物1和5的地与氨基酸残基形成氢键PHE338而其他氨基酸残基形成的范德华相互作用(无花果。4和5)。化合物5显示最高的亲和力SARS-CoV-2蛋白质与其他化合物的结合能−6.8千卡摩尔⁻¹这可能是追溯到其高稳定酶在绑定的绑定的口袋比其他化合物。除了化合物1和2的一些研究化合物停靠到活动网站但结合能较低而有些不适当结合,可能是由于这些化合物在绑定的绑定构象的口袋。分子对接协议验证通过re-docking Baricitinib(参考药物)与选定的蛋白质相同的蛋白的结合位点(图。6)。结果显示类似的结合能一些化合物的研究特别是化合物5。也观察到类似交互模式但介子键相互作用通过氨基酸残基PHE338。

本研究表明,SARS-CoV-2和冠状病毒家族的其他成员对PHELA很敏感。然而,我们也观察到的差异这些病毒的易感性PHELA, SARS-CoV-2野生型以及冠状显示提取N501Y相比更高的灵敏度。和MERS-CoV V2变体。质分子对接分析确定不同的化合物的提取硅结合病毒包络峰值所示。这些数据支持的持续发展PHELA作为潜在药物治疗COVID-19和其他冠状病毒感染,因为这可能是提取有效对抗病毒的不同这个家庭的成员。

对病毒与IC PHELA显示抑制活动₅₀在低微克范围。值得注意的是即使在PHELA测试的最低浓度仍有至少30%抑制活动对野生型或武汉SARS-CoV-2。此外,提取能够抑制其他菌株SARS-CoV-2包括第一波感染引起的应变在南非,和显著突变N501Y。V2变体,负责第二波在南非的感染。此外,PHELA提取以及活跃与其他冠状病毒家族的成员,即冠状,导致2003年在中国流行³⁹,MERS-CoV负责流行病在2017年在中东⁴⁰。这些数据表明,PHELA可能会有一个广泛的活动对不同SARS-CoV-2病毒,这也可能是对冠状病毒家族的其他病毒。注意,我们的分子对接数据表明PHELA可能抑制病毒感染的细胞通过与包络峰值蛋白质交互。MERS-CoV是许多折叠不敏感PHELA冠相比,以及不同菌株的SARS-CoV-2测试,可能是由于这些病毒的包络峰值的差异。此外,众所周知,冠和SARS-CoV-2基因更接近对方比MERS-CoV^38,41。以上的观察是N501Y也支持的事实。V2的重要年代蛋白突变还显示显著减少敏感性PHELA与野生型相比SARS-CoV-2病毒。

这将是有趣的做直接比较PHELA提取活动对SARS-CoV-2其他已知抗体和凝集素等进入抑制剂。这也是对凝集素格里菲斯等,他们已经测试了与其他冠状病毒与SARS-CoV-2密切相关^42,43。PHELA活动可以改善的方法之一是由其进一步净化。这是因为原油或semi-purified提取可能是一些元素可能阻碍病毒的抑制活性化合物。PHELA可能协同和净化的植物化学物质可能集中这些化合物,使提取更加活跃。这么小的净化也可以帮助消除毒性观察与PHELA在高浓度时,使用时所显示的TC₅₀价值。

PHELA对SARS-CoV-2的抑制活性表明,它有可能进一步发展对COVID-19使用。这些数据还表明,提取潜在包含的化合物有活动与其他冠状病毒,如MERS-CoV⁴¹。注意,有些研究人员已经显示出的潜在使用草药治疗COVID-19和其他病毒感染,如流行性乙型脑炎病毒和hiv - 1^42,42,44。这尤其重要,因为目前大部分对COVID-19治疗是基于缓解症状,而除了抗体的血浆以前感染者⁴⁵,没有药物,直接清除病毒或阻止其进入靶细胞。

研究发现,PHELA体外抑制SARS-CoV-2和冠感染的增长和MERS-CoV含义的进一步发展PHELA这些病毒的感染控制。在硅片的对接研究化合物中确定PHELA显示很强的结合能SARS-COV-2蛋白质相互作用。化合物1和5显示绑定亲和力最高SARS-CoV-2蛋白质与其他化合物及其类似药物(Baricitinib)的引用。这些研究可以帮助我们直接瓦解的可能作用机理PHELA COVID-19或SARS-COV-2感染。我们的数据显示,PHELA COVID-19治疗进一步发展的潜力。这种草药产品可以开发成一个治疗COVID-19补充治疗。PHELA可以作为一个独立的开发或辅助治疗COVID-19标准的护理。然而,这些需要进一步实验验证模型和COVID-19 SARS-Cov-2感染患者以及SARS-Cov-2的不同变体,尤其是那些变异的担忧。