对SARS-CoV-2和多重耐药细菌具有双重抗菌活性的半合成替柯planin衍生物gydF4y2Ba

自2019年12月出现严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS - CoV - 2)以来，这场大流行迄今已在全球造成5.37亿例COVID-19病例和630万人死亡。即使在疫苗接种覆盖率高的国家，SARS-CoV-2仍在迅速传播，这与免疫力迅速下降和新病毒变体频繁出现有关。显然，需要抗病毒药物来早期治疗有严重疾病风险的sars - cov -2感染者。一些国家已经批准了一些药物类别，即针对病毒刺突蛋白的抗体(通常具有变异依赖性活性)和病毒3CL的小分子抑制剂gydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba蛋白酶(Paxlovid®)gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba或者病毒聚合酶(莫诺匹拉韦和瑞德西韦)gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

我们团队早期的研究表明，一些糖肽抗生素的亲脂衍生物具有良好的抗菌和抗病毒活性gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}这一特性对临床开发非常有吸引力。其中一些分子对两种呼吸道病毒(流感病毒和冠状病毒)具有双重活性，进一步增强了它们的潜力gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba。一种重要的糖肽类药物是teicoplanin，这是一种副作用少、血浆半衰期长的抗生素，通常用于治疗耐甲氧西林等多重耐药革兰氏阳性细菌gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)。我们的小组是第一个研究teicoplanin在细胞培养中抑制SARS-CoV-2复制的功效的小组gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba。在COVID-19大流行早期，有人建议将替可普兰用于双重治疗SARS-CoV-2和SARS-CoV-2gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba重复感染gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba。在一组感染SARS-CoV-2的危重患者中，Ceccarelli等gydF4y2Ba。gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba观察到替柯planin在预防革兰氏阳性重复感染方面有效，但没有明显的抗病毒作用。尽管未经修饰的teicoplanin似乎无法在临床中发挥双重抗菌活性，但该分子仍然是设计具有适当修饰的更有效衍生物的相关先导结构。gydF4y2Ba

在机制上，teicoplanin有效地抑制了SARS-CoV-2假病毒进入细胞gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba支持其抗病毒作用与抑制SARS-CoV-2进入过程有关。当病毒刺突蛋白与血管紧张素转换酶2 (ACE2)受体结合后，病毒粒子可以通过两种途径进入细胞:在细胞表面融合或内吞作用，然后在核内体融合。虽然第一种途径在表达高水平TMPRSS2(跨膜丝氨酸蛋白酶2)的细胞中更受青睐，但在缺乏这种蛋白酶但富含组织蛋白酶B/L的细胞中，内体途径是有效的gydF4y2Ba^{12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba}。在这两种途径中，都需要蛋白水解裂解来释放刺突蛋白内的融合肽。在SARS-CoV-1假病毒进入试验中，一些糖肽抗生素(如替柯planin、达尔巴文星、奥立万星和特拉万星)的抑制作用归因于对组织蛋白酶L的抑制gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba。另一方面，替柯普兰也有抑制sars - cov - 23cl的报道gydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba蛋白酶在酶分析中，表明它可能针对病毒复制周期的不同步骤gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba。这与我们自己的研究结果一致，表明teicoplanin及其具有亲脂性类胡萝卜素侧链的更有效的衍生物通过联合抑制组织蛋白酶L和3CL来抑制SARS-CoV-2的复制gydF4y2Ba^{箴gydF4y2Ba9gydF4y2Ba}。该衍生物对MRSA和肠球菌菌株保持抑菌活性。gydF4y2Ba

在过去的十年中，我们和其他人已经充分证明糖肽抗生素的抗菌或抗病毒活性可以通过合成修饰显着增强gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba}。然而，只有某些合成修饰对两种类型的病原体(即病毒和细菌)产生显著的联合效应。我们发现将替柯planin假苷元连接到一个双尾亲脂基团上gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba}或者双脂疏水全氟烷基链gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba根据链的长度不同，具有良好的抗rna病毒或抗菌活性。此外，在teicoplanin的肽核中引入超碱性胍基，对糖肽类耐药葡萄球菌和肠球菌具有良好的活性gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba。我们假设，结合上述三种类型的合成修饰可能会产生具有对SARS-CoV-2和细菌双重活性的半合成替柯蛋白，这是与COVID-19管理高度相关的特征。为了验证这一假设，我们选择了先前制备的teicoplanin衍生物的原型，这些衍生物具有双亲脂性尾部(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba);全氟烷基链(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba;或者胍基(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba)，此外还准备了三种新的类似物(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。进行了彻底的调查，以确定它们对SARS-CoV-2和多重耐药细菌的活性，以及潜在的生物学机制。gydF4y2Ba

合成gydF4y2Ba

复合gydF4y2Ba1gydF4y2Ba是基于其高抗rna病毒活性而被选中的gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba}。从之前描述的全氟烷基取代系列gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba。我们选择了导数gydF4y2Ba2gydF4y2Ba与全氟丁基链和化合物gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba全氟辛基链。复合gydF4y2Ba2gydF4y2Ba对包括MRSA在内的一组细菌表现出令人印象深刻的活性(MIC 0.5-1µM)，并且也显示出广泛的抗病毒活性，尽管对人类冠状病毒229E (HCoV-229E) (EC)没有抗病毒活性gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba> 100µm)。另一方面，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba具有中等抑菌效果(MIC 4-32µM)，但对HCoV-229E (ECgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba: 4.9µm)gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba。为了研究如何通过改变全氟烷基链或连接区域的长度来调节其抗病毒和抗菌活性，我们设计了化合物gydF4y2Ba4gydF4y2Ba含有中等长度全氟己基链及其衍生物的gydF4y2Ba5gydF4y2Ba其中三唑环和连接体区域的四乙烯部分省略。复合gydF4y2Ba6gydF4y2Ba是否已经发现有很强的抗菌活性gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba但迄今尚未对其抗病毒活性进行评估。此外，三苯胺衍生物gydF4y2Ba7gydF4y2Ba准备评估是否生物活性增强倍增胍组。gydF4y2Ba

我们以合成替柯普兰衍生物开始我们的工作gydF4y2Ba4gydF4y2Ba含全氟己基分子(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。一个光促进的原子转移自由基加成反应gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba市售的全氟己基碘化物对烯丙醇的双键产生gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，并通过催化加氢去除其碘取代基gydF4y2Ba9gydF4y2Ba产量适中。后者与丙炔溴反应产生gydF4y2Ba10gydF4y2Ba偶联的替柯planin伪糖苷元叠氮化物gydF4y2Ba11gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba通过叠氮化炔烃环加成反应提供所需的咔嗒反应gydF4y2Ba4gydF4y2Ba携带一个全氟己基侧链，通过三唑环连接到肽核上。gydF4y2Ba

阐明生物活性如何gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba依赖于连接区域，由一个三唑环和四乙二醇单元组成，我们制备了相关的全氟辛基衍生物(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)由简单的gydF4y2BaNgydF4y2Ba-酰化反应(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。酒精gydF4y2Ba13gydF4y2Ba采用光诱导全氟辛基碘化烯丙醇加成并催化加氢制备。接下来，TEMPO-BAIB介导的氧化gydF4y2Ba13gydF4y2Ba产生了羧酸衍生物gydF4y2Ba14gydF4y2Ba然后转化为活性酯gydF4y2Ba15gydF4y2Ba用于gydF4y2BaNgydF4y2Bateicoplanin假糖苷元的酰化gydF4y2Ba16gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba}生产gydF4y2Ba5gydF4y2Ba其中全氟辛基链通过酰胺键连接到肽核上。gydF4y2Ba

为了合成gydF4y2Ba7gydF4y2Ba含三个胍基团的没食子酸苄酯与烯丙基溴反应得到三价支架gydF4y2Ba18gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。紫外光诱导自由基加成gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba在光引发剂2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DPAP)的存在下，半胱胺盐酸盐在gydF4y2Ba18gydF4y2Ba提供gydF4y2Ba19gydF4y2Ba显示三个伯胺基。胍的运动是通过反应形成的gydF4y2Ba19gydF4y2Ba用现成的1-吡唑羧基脒试剂gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba。三苯胺衍生物的羧酸函数gydF4y2Ba21gydF4y2Ba经催化氢解(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)转化为活性酯gydF4y2Ba23gydF4y2Ba通过治疗gydF4y2BaNgydF4y2Ba-羟基琥珀酰亚胺在EDC的存在下。最后，对teicoplanin假糖苷元的一级氨基进行酰化gydF4y2Ba16gydF4y2Ba与gydF4y2Ba23gydF4y2Ba生产gydF4y2Ba7gydF4y2Ba显示三个胍基团在gydF4y2BaNgydF4y2Ba-末端氨基酸。gydF4y2Ba

为了测试三胍侧链是否gydF4y2Ba7gydF4y2Ba单独具有抗病毒活性，没食子酸苄酯衍生物gydF4y2Ba24gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)制备并纳入抗病毒评价。gydF4y2Ba

Anti-coronavirus评价gydF4y2Ba

细胞分析中的活性gydF4y2Ba

我们通过几种基于细胞的方法来测定抗冠状病毒活性:在VeroE6和Calu-3细胞中使用SARS-CoV-2降低细胞病变效应(CPE)，在HEL细胞中使用HCoV-229E;以及在Vero和A549- at细胞(即表达ACE2和TMPRSS2的A549细胞)中进行的SARS-CoV-2假病毒进入试验。结果总结于表中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

非洲绿猴肾VeroE6细胞系在感染SARS-CoV-2时表现出较强的CPEgydF4y2Ba^25gydF4y2Ba。由于缺乏TMPRSS2，病毒通过内体途径进入这些细胞，其中刺突由组织蛋白酶l激活。全氟丁基偶联物除外gydF4y2Ba2gydF4y2Ba结果表明，所有替柯planin衍生物都能有效降低SARS-CoV-2的CPE。亲脂性的导数gydF4y2Ba1gydF4y2Ba全氟烷基缀合物gydF4y2Ba3 - 5gydF4y2Ba，胍类衍生物gydF4y2Ba6gydF4y2Ba未加修饰的替柯planin显示ECgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba值在10 ~ 20µM范围内，而三苯胺修饰衍生物gydF4y2Ba7gydF4y2Ba有一个ECgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba53µM。修改组gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba和gydF4y2Ba24gydF4y2Ba他们自己并不活跃。氟羧酸衍生物gydF4y2Ba14gydF4y2Ba确实显示出抗病毒活性，尽管它也有很大的毒性。gydF4y2Ba

我们还在人Calu-3细胞中测试了这些化合物，Calu-3细胞是一种肺癌来源的上皮细胞系，表达TMPRSS2并支持病毒通过细胞表面途径进入gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba。teicoplanin共轭gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba修改组gydF4y2Ba14gydF4y2Ba再次证明有活性，有化合物gydF4y2Ba4gydF4y2Ba有ECgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba值为20µM。未修饰的替柯planin和两种胍衍生物gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba是不活跃的。gydF4y2Ba

最后，我们测试了这些化合物对HCoV-229E(一种普通感冒冠状病毒)的作用。而未经修改的teicoplanin，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba不活跃gydF4y2Ba6gydF4y2Ba仅显示出适度的活性，共轭gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba对HCoV-229E CPE产生强大的抑制作用gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba值分别为17、4.9、12、13µM。感染sars - cov -2的Calu-3细胞和感染hcov - 229e的HEL细胞的活性明显相似。gydF4y2Ba

接下来，我们选择了五种化合物进行假病毒实验，以确定组织蛋白酶依赖的内体途径(在Vero细胞中活跃)和tmprss2介导的细胞表面摄取(在A549-AT细胞中)对刺介导的进入的抑制作用。Teicoplanin轭合物gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba对Vero细胞(EC)非常有效gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba值分别为1和2µM)，并且在A549-AT细胞中也有活性，但效力较弱(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。未修饰的替柯planin和胍衍生物gydF4y2Ba6gydF4y2Ba在Vero细胞中有中度活性，而在A549-AT细胞中无活性。修改组gydF4y2Ba14gydF4y2Ba抑制两个入口路径。gydF4y2Ba

综上所述，这些基于细胞的数据表明，糖肽衍生物通过抑制病毒通过内体途径进入VeroE6细胞(CPE试验)来抑制SARS-CoV-2复制(假病毒试验)。通过生成teicoplanin偶联物来实现对表面进入途径的额外活性gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，解释了它们对Calu-3细胞的功效。化合物比较gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba表明抗病毒活性由全氟烷基链的长度决定。这些冠状病毒进入抑制剂并不局限于SARS-CoV-2，因为HCoV-229E也被证明是敏感的。最后，我们发现未经修饰的teicoplanin在Calu-3细胞中没有抑制SARS-CoV-2，这种糖肽抗生素迄今尚未在Calu-3细胞模型中进行评估。gydF4y2Ba

生化分析中的活性gydF4y2Ba

我们最近对类伪胡萝卜素侧链的teicoplanin类似物的研究表明，组织蛋白酶L抑制是其主要机制，具有抑制病毒3CL的作用gydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba酶作为辅助机制gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba。另一组报道，结构相关的糖肽dalbavancin与ACE2受体结合，从而阻止ACE2与病毒刺突蛋白的受体结合域(receptor-binding domain, RBD)相互作用gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba。因此，我们测试了teicoplanin缀合物gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba在三个生化试验中测量组织蛋白酶L或3CL的抑制gydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba酶活性，或ace2 -穗相互作用(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

与我们之前的研究一致gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba我们观察到IC对组织蛋白酶L的抑制作用gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba值在中等微摩尔范围内，化合物低至4.5µMgydF4y2Ba7gydF4y2Ba(剂量-响应曲线见图S15)。不像我们之前报道的结构相关的类似物gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba化合物,gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba无明显的3CLgydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba抑制率(200µM时抑制率< 50%;65%的抑制作用gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。对ace2 -穗相互作用的抑制作用较弱，只有化合物gydF4y2Ba7gydF4y2Ba在浓度为100µM时达到50%的抑制作用。gydF4y2Ba

因此，对于亲脂衍生物gydF4y2Ba1gydF4y2Ba还有全氟烷基缀合物gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba在VeroE6细胞中，组织蛋白酶L的抑制可能有助于它们的抗冠状病毒作用。复合gydF4y2Ba1gydF4y2Ba这与文献结果一致，表明含有亲脂基团的糖肽抗生素通过与组织蛋白酶L的酶结构域相互作用来发挥抗sars - cov -2的作用gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}。同时，对化合物的组织蛋白酶抑制数据进行了分析gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba揭示了亲脂基团不是抑制组织蛋白酶所必需的，具有疏脂和疏水双重特性的全氟烷基也能起到这种作用。亲脂偶联物的抗冠状病毒活性gydF4y2Ba1gydF4y2Ba还有全氟烷基化合物gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba在缺乏组织蛋白酶L的Calu-3细胞中，可能可以通过它们抑制TMPRSS2蛋白的能力来解释。值得注意的是，全氟丁基衍生物的无活性gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在所有抗病毒实验中观察到的结果清楚地表明，疏水性基团的大小对于与介导病毒进入的蛋白质的相互作用至关重要;在所测试的侧链中，全氟己基似乎是激发抗病毒活性的最佳基团。gydF4y2Ba

对于胍类衍生物gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba对内吞病毒进入的抑制与对组织蛋白酶L.化合物的抑制作用呈反比关系gydF4y2Ba6gydF4y2Ba没有被证明是组织蛋白酶L的抑制剂，但有效地阻止了内体假病毒的进入，可能是由于其高度碱性的胍部分增加了内体的pH。trigguadine -teicoplanin缀合物gydF4y2Ba7gydF4y2Ba可能没有足够的细胞渗透性来发挥抗病毒活性。gydF4y2Ba

抗菌评价gydF4y2Ba

我们用万古霉素、未修饰的替柯planin、达尔巴伐星和奥立万星作为参比化合物，测定了替柯planin偶联物对大量革兰氏阳性细菌菌株的最小抑制浓度(MIC)。我们按照EUCAST ISO标准20776-1采用肉汤微量稀释法，根据EUCAST临床断点读取已知糖肽类抗生素的MIC结果(EUCAST, 2019)。细菌菌株(见附录)。表格gydF4y2BaS5gydF4y2Ba对所有细节的选择是为了实现多药耐药的最大多样性，并包括在临床使用中对糖肽具有已知耐药机制的菌株。的gydF4y2Ba美国epidermidisgydF4y2Ba和gydF4y2Ba美国haemolyticusgydF4y2Ba从对糖肽类抗生素敏感的临床分离株中分离出对达尔巴万星和奥利塔万星耐药的菌株。gydF4y2Ba

除了化合物gydF4y2Ba6gydF4y2Ba在美国，所有衍生品都不活跃gydF4y2Ba大肠都有效gydF4y2Ba和gydF4y2Ba粪大肠gydF4y2Ba表达VanA抗性表型的菌株(表2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。这是肠球菌中最常见的糖肽抗生素耐药性。它通过编码的酶导致细胞壁重编程gydF4y2BavanHAXgydF4y2Ba产生肽聚糖前体的基因簇gydF4y2BadgydF4y2Ba丙氨酸-gydF4y2BadgydF4y2Ba乳酸(gydF4y2BadgydF4y2Ba阿拉巴马州- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Balac)或gydF4y2BadgydF4y2Ba丙氨酸-gydF4y2BadgydF4y2Ba-serine代替gydF4y2BadgydF4y2Ba丙氨酸-gydF4y2BadgydF4y2Ba丙氨酸(gydF4y2BadgydF4y2Ba阿拉巴马州- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba-Ala)和降低糖肽抗生素对肽聚糖的亲和力gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba。同样，奥利塔万星，唯一被批准的糖肽类抗生素，可以克服VanA耐药性，单胍衍生物的teicoplaningydF4y2Ba6gydF4y2Ba对我们的收藏表现出强烈的反感gydF4y2Ba大肠都有效gydF4y2Ba菌株。这意味着这两种化合物都不依赖于肽聚糖前体的修饰。复合gydF4y2Ba6gydF4y2Ba也被证明对gydF4y2Ba美国epidermidisgydF4y2Ba和gydF4y2Ba美国haemolyticusgydF4y2Ba对四种糖肽抗生素都有耐药性。因此,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba它的抑菌作用机制似乎与奥立万星和达尔巴万星不同。gydF4y2Ba

在导致住院COVID-19患者重复感染的细菌中，也有革兰氏阴性病原体(最常见的是gydF4y2Ba肺炎克雷伯菌gydF4y2Ba)。考虑到众所周知的胍离子的膜渗透能力gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba，我们假设teicoplanin衍生物gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba分别含有一个和三个胍基团，可能对革兰氏阴性菌株有效。然而，不幸的是，它们对四种临床相关的革兰氏阴性菌株没有活性(表S6)。gydF4y2Ba

荧光结合试验gydF4y2Ba

为了进一步明确抗菌性能，我们使用荧光实验gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba评估化合物逆转万古霉素和替可普兰蛋白与原液表面结合的能力gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba。万古霉素通过与细胞壁肽聚糖前体结合发挥抗菌作用gydF4y2BadgydF4y2Ba阿拉巴马州- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba-Ala，导致细菌转肽酶的物理抑制gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba。替柯planin的机制更为复杂，但尚未完全阐明gydF4y2Ba^{29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba}即通过亲脂脂肪酸侧链附着在细菌膜上gydF4y2Ba^31gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

结果表明，单胍gydF4y2Ba6gydF4y2Ba在与荧光万古霉素的竞争中非常有效(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba(左图)，表明对细菌细胞壁具有良好的结合亲和力。三苯胺衍生物gydF4y2Ba7gydF4y2Ba还有全氟烷基化合物gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba在这个实验中没有作用。未修饰的替柯planin和达巴万辛以与非荧光万古霉素和二肽相似的效价战胜了荧光万古霉素gydF4y2BadgydF4y2Ba阿拉巴马州- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba阿拉巴马州。对于oritavancin来说，竞争不那么明显。在与荧光teicoplanin的结合试验中(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba(右图)，共轭gydF4y2Ba6gydF4y2Ba再次是最活跃的竞争对手，这可能是由于其阳离子胍基团与带负电的细菌膜之间的静电相互作用。全氟烷基衍生物gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba与未标记的teicoplanin本身相比，荧光teicoplanin具有更高的效力，表明这些偶联物与细胞膜的结合能力更强。gydF4y2Ba

综上所述，结果与导数一致gydF4y2Ba6gydF4y2Ba当糖肽抗生素结合细胞壁前体与细胞膜亲和力时，达到最高的抗菌活性。的性质gydF4y2Ba6gydF4y2Ba解释了它的活动gydF4y2Ba葡萄球菌gydF4y2Ba甚至对奥利塔万辛有抗药性的菌株。全氟烷基改性teicoplanin衍生物gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba与细胞膜结合，但不与细胞壁前体结合，解释了它们较低的抗菌活性。对于万古霉素、替柯planin和达巴文星，只在肽聚糖前体上观察到高效结合，这解释了为什么这些药物不能克服修饰gydF4y2BadgydF4y2Ba阿拉巴马州- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba-Ala单位在细菌中携带VanA抗性标记。gydF4y2Ba

在一系列的七种替柯planin衍生物中，全氟烷基缀合物gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和胍衍生物gydF4y2Ba6gydF4y2Ba发现具有良好的抗sars - cov -2活性和出色的抗菌活性。Perfluorohexyl模拟gydF4y2Ba4gydF4y2Ba成为最有效的抑制剂。对SARS-CoV-2和革兰氏阳性菌的双重活性与具有细菌重复感染风险的COVID-19疾病管理具有高度相关性。gydF4y2Ba

在机制上，这些teicoplanin偶联物抑制了SARS-CoV-2刺突介导的进入过程，特别是依赖于组织蛋白酶L的内体途径。基于我们的酶学研究结果，我们提出直接抑制组织蛋白酶L有助于抗冠状病毒的作用。然而，考虑到未修饰的替柯planin和胍缀合物，其他机制也适用gydF4y2Ba6gydF4y2Ba在VeroE6细胞中证明对SARS-CoV-2有活性，尽管对组织蛋白酶L酶无活性。此外，亲脂缀合物gydF4y2Ba1gydF4y2Ba以及全氟烷基化衍生物gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba在感染活病毒的Calu-3细胞和感染假病毒的A549-AT细胞中，表现出通过tmprss2介导的细胞表面途径适度抑制病毒进入。这种作用的基础目前尚不清楚，但排除了ACE2-spike相互作用的抑制作用。gydF4y2Ba

在抗菌效果方面，胍类衍生物具有高效能gydF4y2Ba6gydF4y2Ba在所有(耐药)细菌菌株的测试面板中，证明其与细胞壁前体二肽以及细菌膜的强结合亲和力有关。gydF4y2Ba

综上所述，研究了三种不同的合成修饰(双亲脂尾、全氟烷基链和胍基)，胍段或全氟辛基/己基结合到肽核可以有效提高母体teicoplanin抗生素对SARS-CoV-2和耐药细菌的活性。对这些化合物针对不同变体SARS-CoV-2的进一步测试将决定哪种修饰为开发治疗CoVID-19的双作用药物提供最有效的先导化合物。gydF4y2Ba

一般信息gydF4y2Ba

采用Kieselgel 60 F254 (Merck)薄层色谱法，采用浸在钼酸铵-硫酸溶液中加热或保利试剂检测。采用硅胶60 (Merck 0.040-0.063 mm)进行闪蒸柱层析。的gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH NMR(500和400 MHz)gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba用Bruker DRX-400和Bruker Avance II 500光谱仪在298 K或300 K下记录C核磁共振(125和100 MHz)和2D核磁共振光谱。化学变化与我有关gydF4y2Ba_4gydF4y2BaSi (0.00 ppm为1H)和溶剂残留信号。MALDI-TOF质谱测量使用配备飞行时间(TOF)质谱仪的布鲁克Autoflex速度质谱仪进行。在所有情况下，使用19 kV(离子源电压1)和16.65 kV(离子源电压2)。对于反射模式，分别用21 kV和9.55 kV作为反射电压1和反射电压2。采用工作频率为500 Hz的固相激光(355nm，≥100 μJ/脉冲)进行激光解吸，共产生3000次激光。以2,5-二羟基苯甲酸(DHB)为基质，FgydF4y2Ba_3.gydF4y2Bacocoa在DMF中作为阳离子剂。ESI-QTOF质谱测量在maXis II UHR ESI-QTOF质谱仪(Bruker)上进行，在正电离模式下进行。电喷雾离子源采用以下参数:毛细管电压:3.5 kV;端板偏置:500v;雾化器压力:0.8 bar;干气温度:200℃，干气流量:4.5 L/min。对每个光谱进行恒定的背景校正，在每个样品前通过注入空白样品基质(溶剂)记录背景。在每个样品后注入甲酸钠校准剂，以便在数据评估期间进行内部校准。质谱采用otofControl 4.1版本(build: 3.5, Bruker)记录，Compass DataAnalysis 4.4版本(build: 200.55.2969)处理。反相高效液相色谱分析采用Waters 2695分离模块(Waters Corp, Milford, USA)。 The separations were carried out on a VDSphere PUR 100 C18-M-SE, 5 µm, 150 × 4.6 mm column at an injection volume of 10 µL, using a flow rate of 1.0 mL/min with a Waters 2996 DAD set at 254 nm and a Bruker MicroTOF-Q type Qq-TOF MS instrument (Bruker Daltonik, Bremen, Germany) as detectors. All compounds are > 95% pure by HPLC analysis. The following system was used for the elution: Solvent A: water: MeCN 9:1 + 0.0025%v/v TFA and Solvent B: MeCN. Gradient elution: from 20% of B to 80% from 0 to 40 min and 80% of B from 40 to 50 min. The MicroTOF-Q mass spectrometer was equipped with an electrospray ion source. The mass spectrometer was operated in positive ion mode with a capillary voltage of 3.5 kV, an endplate offset of − 500 V, nebulizer pressure of 1.8 bar, and N_2gydF4y2Ba在200℃下，流速为9.0 l/min作为干燥气体。质谱用数字化仪记录，采样率为2ghz。质谱在外部使用团的精确质量进行校准[(NaTFA)]。gydF4y2Ba_ngydF4y2Ba+组织]gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba从三氟乙酸钠(NaTFA)溶液中提取用Bruker公司的DataAnalysis 3.4软件对光谱进行评估。光诱导反应在硼硅酸盐容器中进行，用低压汞灯(欧朗Supratec UV, HTC 150 - 211, 150 W, 230 V, R7s)照射，最大发射波长为365 nm。gydF4y2Ba

化学gydF4y2Ba

化合物8gydF4y2Ba

将烯丙醇(585 μl, 8.61 mmol)溶于abs，甲醇(5 mL)，全氟己基碘(2.24 mL, 10.33 mmol, 1.2等量)和二苯甲酮(17 mg, 0.09 mmol)溶于abs，甲醇(1 mL)。氩气在溶液中起泡10 min，反应混合物用紫外光照射20 min。蒸发溶剂，用闪柱色谱法(正己烷/丙酮95:5)纯化产物gydF4y2Ba8gydF4y2Ba(3.54 g, 82%)为白色固体。gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba= 0.35(己烷/丙酮9:1);gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH NMR (500 MHz，甲醇-dgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba(ppm) 4.30-4.22 (m, 1H, 2)CgydF4y2BaHgydF4y2BaI)， 3.84 (dd, 1H, J = 11.9, 5.1 Hz, C-1 C)gydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Baa)， 3.68 (dd, 1H，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 11.9 Hz, 7.3 Hz, C-1 CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Bab)， 3.26-3.11 (m, 1H, C- 3c)gydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Baa)， 2.79-2.63 (m, 1H, C-3 C)gydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Bab);gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC NMR (100mhz, CDClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba(ppm) 120.5, 118.8, 117.9, 115.9, 113.8, 111.1, 108.4 (6C，gydF4y2BaCgydF4y2BaFgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和gydF4y2BaCgydF4y2BaFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba)， 68.1 (1c, c-1)gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 37.6 (t, 1C, C-3)gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 21.8 (1c;gydF4y2BaCgydF4y2Ba嗨)。gydF4y2Ba

化合物9gydF4y2Ba

复合gydF4y2Ba8gydF4y2Ba(3.54 g, 7.02 mmol)溶解于abs中，甲醇(20 mL)，氩气使溶液起泡10 min。10%钯加活性炭(708 mg)和NaHCOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba加入1.47 g, 17.56 mmol, 2.5 equiv)，在HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba然后通过Celite过滤，溶剂被蒸发。经闪蒸柱层析(正己烷/丙酮9:1和8:2)纯化，得536 mg (20%)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba一种无色的糖浆。gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba= 0.34(己烷/丙酮8:2);gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH NMR (500 MHz, CDClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba3.75 (t, 2H，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 6.1 Hz, C-1 CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 2.29-2.15 (m, 2H, C- 2cgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 1.92-1.83 (m, 2H, C- 3c)gydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba);gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC NMR (100 MHz，甲醇-dgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba(ppm) 120.0, 117.2, 116.1, 112.6(6℃，gydF4y2BaCgydF4y2BaFgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和gydF4y2BaCgydF4y2BaFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba)， 61.5 (1c, c-1)gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 28.6 (t, 1C, C-3gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 24.4 (1c, c-2)gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

化合物10gydF4y2Ba

化合物gydF4y2Ba9gydF4y2Ba(200 mg, 0.53 mmol)溶解于abs. THF (2 mL)中，氩气下冰浴冷却。加入na51 mg(50%分散于矿物油中)(1.06 mmol)，搅拌30 min，再加入丙炔溴(80%甲苯溶液)(57 μL, 0.636 mmol, 1.2当量)。室温搅拌过夜，加入甲醇(2 mL)和蒸馏水(1 mL)搅拌15 min，蒸发溶剂，经闪蒸柱层析纯化(己烷/丙酮99:1)得gydF4y2Ba10gydF4y2Ba(115毫克，53%)作为无色糖浆gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba= 0.78(己烷/丙酮98:2);gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH NMR (400 MHz, CDClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba(ppm) 4.18-4.13 (m, 2H，丙炔CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba) 3.6 (t, 2H，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 6.0 Hz, C-1 CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 2.45-2.41 (m, 1H，丙炔CgydF4y2BaHgydF4y2Ba)， 2.29-2.11 (m, 2H, CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 1.95-1.86 (m, 2H, C)gydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba);gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC NMR (100mhz, CDClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba(ppm) 121.2, 118.8, 116.0, 111.2 (6C，gydF4y2BaCgydF4y2BaFgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和gydF4y2BaCgydF4y2BaFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba)， 79.6 (1C，丙炔Cq)， 74.6 (1C，丙炔CH)， 68.5, 58.3 (2C，gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 28.2 (t, 1C;gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 20.9 (1c，gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

化合物4gydF4y2Ba

的解gydF4y2Ba11gydF4y2Ba(143 mg, 0.1 mmol)，二甲基甲酰胺(3ml)gydF4y2Ba10gydF4y2Ba在abs. dimethylformamide (1ml)中加入62 mg, 0.15 mmol。在氩气气氛下搅拌15 min，加入三乙胺(28 μL, 0.2 mmol)和Cu(I)I (0.04 mmol)。反应混合物搅拌一夜，然后NagydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在水中加入S (10 mg) (1 mL)，搅拌15 min，蒸发溶剂，用闪蒸柱层析(甲苯/甲醇6:4，含0.1 v/v%乙酸)纯化产物gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(98毫克，53%)呈棕白色固体。gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba= 0.45(甲苯/甲醇4:6含1.0 v/v%醋酸);,8经(ESI):gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba呼叫CgydF4y2Ba_78gydF4y2BaHgydF4y2Ba_64gydF4y2BaClgydF4y2Ba_2gydF4y2BaFgydF4y2Ba_13gydF4y2BaNgydF4y2Ba_10gydF4y2BaOgydF4y2Ba_24gydF4y2BaNa + NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba: 1887.3054 [gydF4y2Ba米gydF4y2Ba-H + 2Na]gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba;发现:1887.3054。反:RTgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba= 21.60 min, RTgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba= 22.17，纯度为95.7%。gydF4y2Ba

化合物12gydF4y2Ba

将烯丙醇(585 μL, 500 mg, 8.61 mmol)溶于abs. methanol (5 mL)中，然后加入全氟辛基碘(2.765 mL, 10.33 mmol, 1.2 equiv)和二苯甲酮(17 mg, 0.09 mmol)于abs. methanol (1 mL)中。氩气在溶液中起泡10 min，反应混合物用紫外光照射20 min，蒸发溶剂，用闪蒸柱层析(己烷/丙酮9:1)纯化产物得gydF4y2Ba12gydF4y2Ba(4.5 g, 87%)为白色固体。gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba= 0.78(己烷/丙酮98:2);gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH NMR (400 MHz, CDClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba4.50-4.38 (m, 1H, CgydF4y2BaHgydF4y2BaI)， 3.91-3.73 (m, 2H, C- 1c)gydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 3.14-2.90 (m, 1H, C- 3c)gydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Baa)， 2.89-2.66 (m, 1H, C-3 C)gydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Bab)， 2.16 (t, 1H, O)gydF4y2BaHgydF4y2Ba);gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC NMR (100mhz, CDClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba(ppm) 120.5, 118.7, 117.9, 115.8, 110.9, 108,5 (8C，gydF4y2BaCgydF4y2BaFgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和gydF4y2BaCgydF4y2BaFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba)， 68.1 (1c, c-1)gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 37.7 (t, 1C, C-3)gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 21.9 (1c，gydF4y2BaCgydF4y2Ba嗨)。gydF4y2Ba

化合物13gydF4y2Ba

复合gydF4y2Ba12gydF4y2Ba(2.2 g, 3.64 mmol)溶解于abs中，甲醇(20 mL)，氩气通过溶液起泡10分钟。10%钯活性炭(440 mg)和NaHCOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba加入0.77 g, 9.16 mmol, 2.5 equiv)，在H下搅拌过夜gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba然后通过锡石过滤，用二氯甲烷洗涤，溶剂蒸发。产品经闪蒸柱层析(正己烷/丙酮9:1和8:2)得到gydF4y2Ba13gydF4y2Ba(1.0 g, 57%)作为无色糖浆。gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba= 0.34(己烷/丙酮8:2);gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH NMR (500 MHz, CDClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba3.74 (t, 2H，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 6.1 HzgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOH)， 2.30-2.12 (m, 2H, CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 1.92-1.81 (m, 2H, C)gydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 1.66 (s, 1H, OgydF4y2BaHgydF4y2Ba);gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC NMR (100mhz, CDClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba(ppm) 118.7, 116.2, 111.0 (8C，gydF4y2BaCgydF4y2BaFgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和gydF4y2BaCgydF4y2BaFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba)， 61.6 (1c, c-1gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 27.8 (t, 1C, C-3gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 23.5 (1c, c-2)gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba);gydF4y2Ba

化合物14gydF4y2Ba

的解gydF4y2Ba13gydF4y2Ba加入TEMPO(2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧)(30 mg, 0.188 mmol, 0.18当量)和BAIB((二乙酰氧基)苯)(1.01 g, 3.137 mmol, 3当量)，搅拌5 h，然后用10%的Na水溶液中和gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba(4.5 mL)，用二氯甲烷(200 mL)稀释，分离。水相用二氯甲烷(100ml)萃取，结合后的有机相在Na上干燥gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba，过滤溶液，蒸发溶剂。产品经闪蒸柱层析(正己烷/丙酮85:15)得到gydF4y2Ba14gydF4y2Ba(440毫克，85%)为白色粉末。gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba= 0.35(己烷/丙酮7:3);gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH NMR (400 MHz，甲醇-dgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba2.47-2.30 (m, 4H, CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba);gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC NMR (100 MHz，甲醇-dgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba(ppm) 175.5 (1 C, C = O), 119.7, 117.4, 114.6, 112.0, 109.3 (8 C,gydF4y2BaCgydF4y2BaFgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和gydF4y2BaCgydF4y2BaFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba)， 27.5 (t, 1C;gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 26.0 (1c;gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

化合物15gydF4y2Ba

复合gydF4y2Ba14gydF4y2Ba(389 mg, 0.79 mmol)溶解于abs.二氯甲烷(10 mL)和abs. THF (5 mL)的混合物中，氩气环境下gydF4y2BaNgydF4y2Ba加入-羟基琥珀酰亚胺(100 mg, 0.869 mmol, 1.1当量)，冷却至0℃。10分钟后，EDC (gydF4y2BaNgydF4y2Ba(3-dimethylaminopropyl)gydF4y2BaN 'gydF4y2Ba加入-乙基碳二亚胺盐酸盐(166 mg, 0.869)，搅拌反应混合物过夜。溶剂蒸发，产物纯化得到gydF4y2Ba15gydF4y2Ba(436毫克，94%)为白色粉末。gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba= 0.38(己烷/丙酮7:3);gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH NMR (400 MHz, CDClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba3.04-2.93 (m, 2H, CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 2.86 (s, 4H，琥珀酰亚胺CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 2.67-2.48 (m, 2H, CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba);gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC NMR (100mhz, CDClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba(ppm) 168.8 (2C，琥珀酰亚胺gydF4y2BaCgydF4y2Ba= 0)， 166.9 (1c，gydF4y2BaCgydF4y2Ba= 0)， 26.4 (t, 1C，gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 25.7 (2C，琥珀酰亚胺gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 23.0 (1c, cgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)。,8经(ESI):gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba呼叫CgydF4y2Ba_15gydF4y2BaHgydF4y2Ba_8gydF4y2BaFgydF4y2Ba_17gydF4y2BaOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba+钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba: 612.0074 [gydF4y2Ba米gydF4y2Ba+ Na]gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba;发现:612.0075。gydF4y2Ba

化合物5gydF4y2Ba

Teicoplanin pseudoaglyconegydF4y2Ba16gydF4y2Ba加入二甲基甲酰胺(3ml)和三乙胺(21 μL, 0.15 mmol, 1.5当量)。氩气环境下gydF4y2Ba15gydF4y2Ba加入77 mg, 0.13 mmol, 1.3当量)，搅拌反应混合物过夜。然后蒸发溶剂，用闪蒸柱层析纯化产物，得到产物gydF4y2Ba5gydF4y2Ba(91毫克，48%)为肮脏的白色固体。gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba= 0.19(甲苯/甲醇1:1含1.0 v/v%醋酸)。,8经(ESI):gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba呼叫CgydF4y2Ba_77gydF4y2BaHgydF4y2Ba_60gydF4y2BaClgydF4y2Ba_2gydF4y2BaFgydF4y2Ba_17gydF4y2BaNgydF4y2Ba_8gydF4y2BaOgydF4y2Ba_24gydF4y2BaNa + NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba: 1919.2616 [gydF4y2Ba米gydF4y2Ba-H + 2Na]gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba;发现:1919.2624。反相高效液相色谱:RT = 21.60 min，(纯度:~ 100%)。gydF4y2Ba

化合物18gydF4y2Ba

没食子酸苄酯gydF4y2Ba17gydF4y2Ba(3.5 g, 13.4 mol)溶于abs，二甲基甲酰胺(30 mL)和KgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba添加丙烯溴(3.02 mL, 48 mmol)和丙烯溴(8.29 g, 60 mmol)。将反应混合物搅拌过夜，然后用二氯甲烷稀释，搅拌20 min。用4% NaOH水溶液(2 × 50 mL)和饱和NaCl水溶液(3 × 50 mL)洗涤，用Na干燥有机相gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba过滤，蒸发溶剂。产品经柱层析纯化(己烷/乙酸乙酯98:2)得到gydF4y2Ba18gydF4y2Ba(3.0 g, 60%)制成淡黄色糖浆。gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba= 0.53(己烷/乙酸乙酯8:2);gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH NMR (400 MHz, CDClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba(ppm) 7.45-7.30 (m, 7H，芳香CgydF4y2BaHgydF4y2Ba)， 6.14-5.99 (m, 3H，烯丙基CgydF4y2BaHgydF4y2Ba)， 5.44 (q, 1H，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 1.6 Hz，烯丙基= CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 5.40 (q, 1H，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 1.6 Hz，烯丙基= CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 5.36-5.30 (m, 3H，苄基CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，烯丙基= CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 5.29 (q, 1H，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 1.5 Hz，烯丙基= CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 5.26 (q, 1H，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 1.5 Hz，烯丙基= CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 5.18 (ddt, 1H，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 10.3, 2.0, 1.1 Hz，烯丙基= CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 4.63 (t, 2H，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 1.3 Hz，烯丙基CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 4.61 (t, 2H，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 1.5 Hz，烯丙基CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 4.59 (t, 2H，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 1.6 Hz，烯丙基CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba);gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC NMR (100mhz, CDClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba(ppm) 166.1 (1C)gydF4y2BaCgydF4y2Ba= 0)， 152.4 (2C, quat。gydF4y2BaCgydF4y2Ba)， 142.1 (1C, quat)。gydF4y2BaCgydF4y2Ba)， 136.2 (1C, quat)。gydF4y2BaCgydF4y2Ba)， 134.3, 133.1 (3C，烯丙基)gydF4y2BaCgydF4y2BaH)， 128.7, 128.3, 128.2 (5C，芳香gydF4y2BaCgydF4y2BaH)， 125.1 (1C, quat)。gydF4y2BaCgydF4y2Ba)， 118.0, 117.8 (3C，烯丙基)gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 109.0 (2C，芳香gydF4y2BaCgydF4y2BaH)， 74.1, 70.1, 66.8 (4c，gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)。,8经(ESI):gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba呼叫CgydF4y2Ba_23gydF4y2BaHgydF4y2Ba_24gydF4y2BaOgydF4y2Ba_5gydF4y2Ba+钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba: 403.1516 [gydF4y2Ba米gydF4y2Ba+ Na]gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba;发现:403.1510。gydF4y2Ba

化合物19gydF4y2Ba

的解gydF4y2Ba18gydF4y2Ba加入甲醇(15 mL)盐酸半胱胺(1.136 g， (10 mmol)和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DPAP, 77 mg, 0.3 mmol)。将反应液冷却至0℃，用紫外光照射4次，每次照射循环前加入DPAP (77 mg, 0.3 mmol) 15 min。将溶剂蒸发，将残留物溶解于蒸馏水(60ml)中，饱和水KgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba加入100 mL溶液，用3 × 100 mL二氯甲烷萃取。结合的有机相在Na上干燥gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba过滤，溶剂在真空中蒸发。采用柱层析法纯化产物gydF4y2Ba_2gydF4y2BaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba/MeOH6:4含0.1% EtgydF4y2Ba_3.gydF4y2BaN .屈服;屈服gydF4y2Ba19gydF4y2Ba(1.1 g, 69%)为黄色液体。gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba= 0.10 (ch)gydF4y2Ba_2gydF4y2BaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba/甲醇/等gydF4y2Ba_3.gydF4y2BaN 5:5:0.1);gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH NMR (500 MHz, CDClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba(ppm) 7.46-7.27 (m, 7H，芳香CgydF4y2BaHgydF4y2Ba)， 5.33 (s, 2H，苄基CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 4.10 (t, 6H，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 6.0 Hz, OCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 2.84-2.69 (m, 12H, CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 2.63 (t, 6H，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 6.6 Hz, CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 2.06(奎恩，4H，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 6.4 Hz, CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 1.97(奎恩，2H, J = 6.3 Hz, CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC NMR (100mhz, CDClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba(ppm) 167.4 (1C)gydF4y2BaCgydF4y2Ba= 0)， 153.9 (2C, quat。gydF4y2BaCgydF4y2Ba)， 143.3 (1C, quat。gydF4y2BaCgydF4y2Ba)， 137.6 (1C, quat)。gydF4y2BaCgydF4y2Ba)， 129.7, 129.3, 129.3 (5C，芳香gydF4y2BaCgydF4y2BaH)， 126.5 (1C, quat)。gydF4y2BaCgydF4y2Ba)， 109.2 (2C，芳香gydF4y2BaCgydF4y2BaH)， 72.9, 68.6, 67.9 (4c, 0)gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 41.7, 41.7 (3c, cgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 35.6 (3c, cgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 31.6 (1c, cgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 30.6 (2c, cgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 29.1, 29.0 (3c, cgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)。,8经(MALDI):gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba呼叫CgydF4y2Ba_29gydF4y2BaHgydF4y2Ba_45gydF4y2BaNgydF4y2Ba_3.gydF4y2BaOgydF4y2Ba_5gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba+钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba: 634.2414 [gydF4y2Ba米gydF4y2Ba+ Na]gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba;发现:634.2402。gydF4y2Ba

化合物21gydF4y2Ba

的解gydF4y2Ba19gydF4y2Ba二甲基甲酰胺(20ml)、三乙胺(2.7 mL, 0.02 mol)、二甲基甲酰胺(1.0 g, 1.6 mmolgydF4y2Ba20.gydF4y2Ba加入1.64 g, 5.28 mmol，搅拌过夜。溶剂蒸发，产品经闪蒸柱层析(正己烷/丙酮8:2)得到gydF4y2Ba21gydF4y2Ba(700毫克，33%)作为淡黄色糖浆。gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba= 0.40(己烷/乙酸乙酯7:3);gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba氢核磁共振(400 MHz)，甲醇-gydF4y2BadgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba+ CDClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba(ppm) 7.48-7.30 (m, 7H，芳香CgydF4y2BaHgydF4y2Ba)， 5.36 (s, 2H，苄基CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 4.21-4.12 (m, 6H, OC)gydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 3.59 (t, 6H，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 6.6 Hz, CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 2.88-2.72 (m, 12H, CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 2.19-2.08 (m, 4H, CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 2.07-1.97 (m, 2H, CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 1.55-1.44 (m, 54H, CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba)。HRMS (MALDI):(发生BOC保护基团裂解)gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba呼叫CgydF4y2Ba_32gydF4y2BaHgydF4y2Ba_51gydF4y2BaNgydF4y2Ba_9gydF4y2BaOgydF4y2Ba_5gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba+钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba: 760.3067 [gydF4y2Ba米gydF4y2Ba+ Na]gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba;发现:760.3064。gydF4y2Ba

化合物22gydF4y2Ba

复合gydF4y2Ba21gydF4y2Ba将500 mg, 0.373 mmol)溶于二氧六环(18 mL)和水(2 mL)的混合物中，冷却至0℃。加入0.5 M NaOH溶液(3.7 mL, 1.876 mmol, 5 equiv)，室温搅拌反应混合物过夜。Serdolit red HgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba加入离子交换树脂搅拌至中和。过滤树脂，真空蒸发溶剂，经柱层析(己烷/丙酮7:3)纯化得到产物gydF4y2Ba22gydF4y2Ba(317毫克，68%)为白色固体。gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba= 0.42(己烷/丙酮6:4);gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH NMR (400 MHz, CDClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba8.71-8.60 (m, 3H, NgydF4y2BaHgydF4y2Ba)， 7.35 (s, 2H，芳香CgydF4y2BaHgydF4y2Ba)， 4.21-4.07 (m, 6H, OC)gydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 3.71 ~ 3.59 (m, 6H, NHC)gydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 2.86-2.68(米，12H, SCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 2.13(奎恩，4H，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 6.5 Hz, CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 2.01(奎恩，2H, J = 6.5 Hz, CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC NMR (100mhz, CDClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba(ppm) 170.6、163.5、163.4、156.1、153.1、152.4、142.2、125.0、83.2、79.3 (20C，gydF4y2BaCgydF4y2Ba= O,皮疹。gydF4y2BaCgydF4y2Ba)， 108.6 (2C，芳香族gydF4y2BaCgydF4y2BaH)， 71.7, 67.3 (3c, 0)gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 40.0 (3c, ngydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 31.1 (3, 5)gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 30.3 (1c;gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 29.1 (2c;gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 28.3, 28.1 (18c，gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba)， 28.2 (c, sgydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)。HRMS (MALDI):(发生BOC保护基团裂解)gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba呼叫CgydF4y2Ba_25gydF4y2BaHgydF4y2Ba_45gydF4y2BaNgydF4y2Ba_9gydF4y2BaOgydF4y2Ba_5gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba+钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba: 670.2598 [gydF4y2Ba米gydF4y2Ba+ Na]gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba;发现:670.2581。gydF4y2Ba

化合物23gydF4y2Ba

的解gydF4y2Ba22gydF4y2Ba(335 mg, 0.268 mmol) abs.二氯甲烷(15 mL)gydF4y2BaNgydF4y2Ba加入-羟基琥珀酰亚胺(34 mg, 0.295 mmol, 1.1当量)，冰浴冷却至0℃。加入EDC (52 mg, 0.27 mmol)后，室温搅拌反应混合物过夜。溶剂蒸发，产品经闪蒸柱层析(正己烷/丙酮8:2)得到gydF4y2Ba23gydF4y2Ba(237毫克，66%)为白色固体。gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba= 0.34(己烷/丙酮7:3);gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH NMR (400 MHz, CDClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba11.48 (s, 3H, NgydF4y2BaHgydF4y2Ba)， 8.66-8.59 (m, 3H, N)gydF4y2BaHgydF4y2Ba)， 7.36 (s, 2H，芳香CgydF4y2BaHgydF4y2Ba)， 4.19-4.11 (m, 6H, OC)gydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 3.64 (q, 6H，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 6.3 Hz, NHCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 2.91 (s, 4H，琥珀酰亚胺CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 2.84-2.71(米，12H, SCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 2.13(奎恩。4 h,gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 6.6 Hz, CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 2.01(奎恩。2 h,gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 6.5 Hz, CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 1.52-1.46 (m, 54H, CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba);gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC NMR (100mhz, CDClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba(ppm) 169.2、163.5、161.4、156.1、153.1、152.8、143.7、119.6、83.1、83.1、79.2 (22C，gydF4y2BaCgydF4y2Ba= O,皮疹。gydF4y2BaCgydF4y2Ba)， 109.1 (2C，芳香族gydF4y2BaCgydF4y2BaH)， 71.8, 67.5 (3c, 0)gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 40.0, 40.0 (3c, nh)gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 31.2, 31.1 (3, 5)gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 30.2, 29.0 (3c，gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 28.3 (9c);gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba)， 28.2 (c, sgydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 28.1 (9c);gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba)， 25.7 (2C，琥珀酰亚胺gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)。,8经(ESI):gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba呼叫CgydF4y2Ba_59gydF4y2BaHgydF4y2Ba_96gydF4y2BaNgydF4y2Ba_10gydF4y2BaOgydF4y2Ba_19gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba+钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba: 1367.5908 [gydF4y2Ba米gydF4y2Ba+ Na]gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba;发现:1367.5905。gydF4y2Ba

化合物7gydF4y2Ba

将Teicoplanin假糖苷元(175 mg, 0.125 mmol)溶于abs.二甲甲酰胺(3ml)中，然后用三乙胺(27 μl, 0.188 mmol, 1.5当量)gydF4y2Ba23gydF4y2Ba加入220 mg, 1.163 mmol, 1.3 equiv，搅拌反应混合物过夜。然后蒸发溶剂，用闪柱色谱法(甲苯/甲醇7:3,0.1%醋酸)纯化产物，得到纯度为190.5 mg, 58%的棕白色粉末gydF4y2Ba叔gydF4y2Ba-丁氧羰基保护产物。将前一反应产物(180 mg, 0.0684 mmol)溶解于三氟乙酸(2 mL)中，加入苯甲醚(15 mg, 0.137 mmol, 2等分)，对胍基进行脱保护。搅拌2 h后，用ab .乙醚沉淀，过滤干燥至产品gydF4y2Ba7gydF4y2Ba(151毫克，93%)为肮脏的白色固体。gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba= 0.38(甲苯/甲醇55:45，含1.0 V/V%乙酸)gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba= 0.28(乙腈/水9:1gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。,8经(ESI):gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba呼叫CgydF4y2Ba_91gydF4y2BaHgydF4y2Ba_101gydF4y2BaClgydF4y2Ba_2gydF4y2BaNgydF4y2Ba_17gydF4y2BaOgydF4y2Ba_27gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba+ 2 hgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba: 1015.7869 [gydF4y2Ba米gydF4y2Ba+ 2 h]gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba};发现:1015.7917。反相高效液相色谱:RT = 21.60 min(纯度:~ 100%)。gydF4y2Ba

化合物24gydF4y2Ba

的解gydF4y2Ba21gydF4y2Ba加入300 mg, 0.244 mmol二甲基甲酰胺(4ml)三氟乙酸(3ml)。搅拌4h后，蒸发溶剂，加入甲苯(4ml)，真空蒸发。将残留物溶解于清水(6ml)和Amberlite IRA 400 Cl中gydF4y2Ba^-gydF4y2Ba加入离子交换树脂，搅拌4h，过滤，蒸发溶剂得gydF4y2Ba24gydF4y2Ba(190毫克，100%)作为黄色糖浆gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba= 0.40 (chgydF4y2Ba_2gydF4y2BaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba/甲醇的宣告);gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba氢核磁共振(400 MHz)，甲醇-gydF4y2BadgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba(ppm) 8.34 (d, 6H，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 2.7 Hz, NgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 7.48-7.31 (m, 7H，芳香CgydF4y2BaHgydF4y2Ba)， 6.85 (t, 2H，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 2.7 Hz, NgydF4y2BaHgydF4y2Ba)， 5.35 (s, 2H，苄基CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 4.14 (t, 6H，gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 5.9 Hz, OCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 3.48-3.40 (m, 6H, NCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 2.88-2.74(米，12H, SCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 2.10(奎恩)。4 h,gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 6.5 Hz, CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 1.99(奎恩。2 h,gydF4y2BaJgydF4y2Ba= 6.4 Hz, CgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC核磁共振(100 MHz，甲醇-gydF4y2BadgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba）:gydF4y2BaδgydF4y2Ba(ppm) 167.1, 158.4, 158.4, 153.6, 142.9, 137.6, 126.2 (9C，gydF4y2BaCgydF4y2Ba= 0和quat。gydF4y2BaCgydF4y2Ba)， 129.6, 129.2, 129.1 (5C，芳香苄基)gydF4y2BaCgydF4y2BaH)， 109.0 (2C，自动)gydF4y2BaCgydF4y2BaH)， 72.8, 68.4, 67.8 (4C)，苄基gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿,gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 42.2, 42.1 (3c, ngydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)， 31.7, 31.3, 30.3, 29.2, 29.2 (9c, 5)gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，gydF4y2BaCgydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)。,8经(ESI):gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba呼叫CgydF4y2Ba_32gydF4y2BaHgydF4y2Ba_51gydF4y2BaNgydF4y2Ba_9gydF4y2BaOgydF4y2Ba_5gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba+ 2 hgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba: 369.6660 [gydF4y2Ba米gydF4y2Ba+ 2 h]gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba};发现:369.6655。gydF4y2Ba

CPE还原试验的抗冠状病毒活性和细胞毒性gydF4y2Ba

我们使用了以下病毒和细胞系:SARS-CoV-2(株hCoV-19/捷克共和国/NRL_6632_2/2020，进化支G，谱系B.1);HCoV-229E病毒(来自ATCC的VR-740);VeroE6、Calu-3和HEL细胞(均来自ATCC)。对于SARS-CoV-2检测，将化合物从100µM稀释至0.78µM，然后在384孔板(每孔含5000个VeroE6细胞)或96孔板(每孔含40000个Calu-3细胞)中添加三份。培养基由DMEM加2% FBS、青霉素和链霉素组成。孵育1 h后，以感染倍数分别为0.04 IU/mL和0.05 IU/mL加入SARS-CoV-2。37℃孵育3天后，采用基于甲醛的细胞活力测定法定量检测病毒诱导的细胞病变效应。加入XTT溶液(Sigma-Aldrich)并孵育4 h后，使用EnVision平板读取器(Perkin Elmer)测量450 nm处的吸光度。在绘制细胞存活率与对数的百分比后gydF4y2Ba_10gydF4y2Ba浓度，降低50%病毒细胞病变效应所需的化合物浓度(EC)gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba)，采用GraphPad Prism软件进行非线性回归计算。gydF4y2Ba

HCoV-229E采用了类似的检测方法gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba。在96孔板中培养HEL细胞至融合后，细胞暴露于化合物的连续稀释中。随后立即加入HCoV-229E, MOI为100 CCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba每口井。35℃孵育5天后，加入MTS试剂(CellTiter 96 AQ)gydF4y2Ba_{ueousgydF4y2Ba}MTS试剂来自Promega)。24小时后，在平板阅读器上测量490 nm处的吸光度。欧共体gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba数值的计算方法如上所述。gydF4y2Ba

为了评估复合细胞毒性，将VeroE6、Calu-3和HEL细胞的模拟感染培养物暴露于上述复合稀释物中。VeroE6和Calu-3细胞孵育3天后进行XTT实验，HEL细胞孵育5天后进行MTS程序。化合物浓度导致细胞活力(CC)降低50%gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba)由Graphpad计算，方法与EC的解释相同gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba计算。gydF4y2Ba

抑制SARS-CoV-2刺突介导的假病毒进入gydF4y2Ba

据报道，产生了携带SARS-CoV-2 S蛋白的表达萤火虫荧光素酶(fLuc)的MLV假病毒(2020年初分离物的D614G变体，NCBI登录号为YP_009724390.1)gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba。简单地说，将6孔板中的HEK293T细胞转染3个编码MLV gag-pol和fLuc报告基因的质粒(来自S. Pöhlmann，德国)和S蛋白。在33°C下孵育3天后，收集含假病毒的上清液并冷冻。对于进入抑制实验，Vero细胞或A549- at细胞(即表达ACE2和TMPRSS2的A549细胞;编码a549d-cov2r(来自Invivogen))，每孔7500个细胞接种在白色半面积96孔板上。1天后，用系列复合稀释液(无血清培养基)在37℃下预孵育细胞20分钟，加入假病毒，在453倍离心下进行旋殖gydF4y2BaggydF4y2Ba在37°C下放置45分钟。在培养箱中放置两小时后，取出上清液，用含有10% FCS的培养基代替。在33°C下孵育3天后，使用荧光素酶测定系统试剂盒和GloMax®Navigator Microplate Luminometer(均来自Promega)监测fLuc活性。欧共体gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba使用Graphpad软件计算化合物的值，如“gydF4y2BaCPE还原试验的抗冠状病毒活性和细胞毒性gydF4y2Ba”。gydF4y2Ba

酶抑制试验gydF4y2Ba

组织蛋白酶L抑制的评估与报道一致gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba。简单地说，重组人组织蛋白酶L在gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba。在100 mM醋酸缓冲液(pH 5.5)中测定酶活性，缓冲液中含有0.1% PEG 8000, 5 mM半胱氨酸和1.5 mM EDTA。酶首先在37°C的实验缓冲液中活化5分钟，然后将其添加到含有z - ph - arg - amc底物(Bachem)和化合物的黑色微孔板的孔中。荧光裂解产物的形成在37°C下监测50分钟，使用Tecan Infinit M1000荧光光谱仪，发射波长为460 nm，激发波长为380 nm。所有检测混合物均含有5% (v/v) DMSO和0.01% Triton X-100，以防止因形成化合物聚集体而产生假阳性抑制gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba。所有测量一式三次，重复两次。相对抑制作用计算公式为:gydF4y2Ba相对抑制度(%)gydF4y2Ba=gydF4y2Ba100(1−v .gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba/ vgydF4y2Ba_ogydF4y2Ba）gydF4y2Ba,在那里gydF4y2BavgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba和gydF4y2BavgydF4y2Ba_ogydF4y2Ba分别标出有抑制剂和没有抑制剂时的反应速度。集成电路gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba从不同抑制剂浓度下的9个数据点确定数值。gydF4y2Ba

对SARS-CoV-2主要蛋白酶的抑制如最近所述gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba。简单地说,3 clgydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba(GenBank序列MN908947.3，密码子经Thermo Fisher Scientific优化)在Rosetta2细胞(Novagen)中表达。我们使用FRET底物(Hilyte™Fluor-488-ESATLQSGLRKAK-(QXL®-520)- nh2, Cat。AS-65599(来自Anaspec)gydF4y2Ba^35gydF4y2BapH 7.5含0.1 M NaH的缓冲液gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba1 mM EDTA和100 mM NaCl。荧光监测在黑色384孔板使用维克多gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba1420多标签计数器(Perkin Elmer)设置在485 nm发射和520 nm激发波长。在200µM浓度下对化合物进行测试，每个样品一式两份。gydF4y2Ba

为了评估SARS-CoV-2刺突受体结合域(S-RBD)与人ACE2受体(hACE2)结合相互作用的抑制作用，我们使用了RayBio®COVID-19刺突-ACE2结合检测试剂盒(RayBiotech)。将hace2包被的孔与100 μM的化合物在4℃下孵育16 h。加入S-RBD蛋白后，按照制造商的方案进行。简单地说，在通过洗涤去除未结合的S-RBD后，让酶标IgG与结合的S-RBD蛋白相互作用，然后暴露于TMB(3,3 '，5,5 ' -四甲基联苯胺)底物。用Stop Solution停止HRP-TMB反应，用SpectraMax®iD5阅读器(Molecular Devices)测量450 nm处的吸光度。在两个独立的重复中获得数据点，并计算百分比抑制值为gydF4y2Ba(一个gydF4y2Ba_0gydF4y2Ba−)/gydF4y2Ba_0gydF4y2Ba×gydF4y2BaOne hundred.gydF4y2Ba,在那里gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba复合样品的吸光度是和gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba_0gydF4y2Ba为无化合物对照的吸光度。gydF4y2Ba

抗菌评估gydF4y2Ba

我们按照EUCAST ISO标准20,776-1采用肉汤微量稀释法，根据EUCAST临床断点读取已知糖肽类抗生素的MIC结果(EUCAST, 2019)。菌株采集自中科院微生物研究所。万古霉素、替柯planin和奥利塔万辛购自Sigma-Aldrich公司，达尔巴万辛购自MedChemExpress公司。万古霉素- bodipy偶联物购自ThermoFisher Scientific。荧光标记的teicoplanin合成如前所述gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

荧光结合试验按前面所述进行gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba。简单地说,gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2BaATCC29213在MH培养基中培养至AgydF4y2Ba_{630海里gydF4y2Ba}= 0.4。细胞在5000 rpm下成球10分钟，用50 mM Tris-HCl pH 7.4洗涤两次，并在缓冲液中重悬至AgydF4y2Ba_{630海里gydF4y2Ba}= 1。加入终浓度为1 mg/mL的FL-VAN或终浓度为10 mg/mL的FL-TEI，室温孵育10 min。接下来，将它们制成颗粒，用Tris-HCl缓冲液冲洗两次，然后在1ml缓冲液中重悬，分成6份100µL。非荧光抗生素或gydF4y2BaNgydF4y2Ba乙酰-gydF4y2BadgydF4y2Ba阿拉巴马州gydF4y2Ba- dgydF4y2Ba分别加入不同浓度(1、10、20、40、100、500、1000µg/mL)的α二肽(Sigma-Aldrich)，室温孵育10 min。细胞离心后，用Tecan Infinite 200Pro测量上清中释放的荧光。FL-VAN的激发波长为485 nm，发射波长为528 nm; FL-TEI的激发波长为530 nm，发射波长为590 nm。每个实验进行2次，3个重复。gydF4y2Ba