交配策略对蟹类精物质投入的影响

由于异种配婚，人们已经认识到两性之间在生殖方面的投资是不平衡的，然而，许多动物群体中的雄性在精液生产方面表现出了很高的投资，成本也不低¹．在无脊椎动物中，生殖活动通常涉及与配子产生和行为的生理方面相关的大量能量消耗^2，3.，4．例如，在甲壳类动物中，生殖行为需要消耗能量，例如雄性在交配前保护配偶⁵或雌性主动产卵(即通过腹部拍打进行通气)⁶．修订后的文献得出结论，男性精子生产的成本被低估了，因为他们被认为体积小，数量不限^7，8．精物质由精子和精液组成，其生产可能涉及较高的能量成本¹而缓慢的恢复(例如:⁹)．在无脊椎动物中，射精的成分通常是复杂的，非精子成分可以承担重要的功能^10，11．在一些昆虫中，精液蛋白与各种功能有关，如雌性花托中精子的长期储存，交配塞的形成和射精的有效性^11，12，13．脂肪酸也可能与精子塞有关，比如大黄蜂的精子塞Bombus terrestris¹⁴．

在十足动物中，雄性生殖系统由成对的睾丸、输精管和射精导管组成¹⁵．在睾丸中，精子全部或部分发育，而在输精管中，精子被包裹在精子囊中，嵌入精液中，并在交配前储存起来^15，16．因此，在交配过程中，精子物质被储存在输精管中。因此，输精管的含量代表了男性的潜在繁殖能力，能量投入的直接测量应考虑其组成。在十足类动物中，雄性在交配时向雌性输送的精液具有多种作用，如滋养精子、促进精子运输、控制微生物或形成精子塞^{17，18，19，20.，21，22}．在短尾鱼种中，精子包囊和精液似乎主要由蛋白质和少量的碳水化合物和脂类组成^23，24，25．尽管精液起着许多作用，输精管生化成分的定量测定仅限于极少数物种^23，24，26．

短柄蟹的交配策略变化很大，这与一夫多妻制的不同程度有关。发生在雌性精囊内的精子竞争的激烈程度，可能是雄性生殖努力的强大驱动力²⁷．例如，一妻多夫的物种有更重的生殖系统²⁸在鱼类，鲨鱼和蟋蟀中检测到的^29，30.相比之下，一夫一妻制的蜘蛛在成年后会出现永久性的精子耗尽³¹．以螃蟹为例，在最后一个雄性优先受精的物种中³²在美国，雄性之间的竞争加剧，以及雄性确保父权的策略。雄性竞争性交配策略(即形态、生理和行为适应以避免精子竞争)，如配偶保护、多次交配和精子堵塞，在精子竞争激烈时经常出现³³．精子竞争的强度取决于雌性的接受期、雌性精囊的形态特征和雄性间的竞争能力^34，35，36．螃蟹雌性-雄性生殖系统的共同进化²²提示在交配过程中转移的生化成分的组成和数量可能与雌性精子储存器官的形态和复杂性以及它们在雌性交配后发挥的主要功能密切相关。反过来，男性生殖系统也应该补充女性对精液物质数量和特征的需求。

因此，我们预计，经历高水平的一夫多妻制和激烈的精子竞争的物种(即女性接受精子的时间较短)会表现出较大的输精管和在精子物质上的大量能量投资，因为这些适应可能有助于雄性在精子竞争发生时进行竞争。在温带地区，海洋无脊椎动物繁殖结构的能量投入有预期的变化，以使后代的释放与温度和生产力等环境因素的周期相匹配，因此繁殖的季节性变化非常普遍³⁷．短尾鱼是理想的模式生物，以评估男性的精力投资在精液物质，因为他们表现出广泛的生殖特征和交配策略，这必然与能量相关的发展这些策略。通过对不同蟹种的比较，可以确定不同蟹种之间与雄性精力投入有关的模式。

四种短臂蟹，紫蟹Homalaspis举办，大闸蟹Romaleon setosum(同义癌症setosus，c . polyodon而且r . polyodon)、大理石蟹Metacarcinus edwardsii还有海带蟹Taliepus dentatus是智利沿海最重要的手工渔业资源之一。关于男性的研究几乎没有，而且主要是描述性的^26，38，39虽然他们是渔业的主要目标。螃蟹的种类r . setosum而且m . edwardsii属于同一科(蟹科)。我们的模式种来自其他科，表鳞科(t . dentatus)及板栗科(h .术后)，在系统发育上与癌科相距甚远，如brachyuran科的系统发育树所示⁴⁰．这四个物种被选为模式种，因为它们表现出不同的交配策略，代表了连续的交配期和短暂的交配季节之间的梯度，以及不同水平的交配前和/或交配后的配偶保护，或在交配期间形成精子塞(繁殖相关信息的比较见表1)．还有，男性和女性的周期同步⁴¹这一点并不明显，因为短尾鱼有一个精囊，雌性在交配后可以长时间储存精子，但这可能取决于交配策略(连续交配或季节性交配)。本研究旨在研究四种短腿鱼生殖周期中主要能量基质和每根输精管能量投入的季节变化规律，并将其与交配策略联系起来。

输精管重量、生化成分及能量含量

血管递延h .术后(无花果。1a和Table1),r . setosum(表1)是非常复杂的(即复杂的)。血管递延m . edwardsii(无花果。1b和表1)，特别是t . dentatus(表1)的形态较为简单。年平均血管延迟h .术后而且r . setosum都比m . edwardsii而且t . dentatus，相对较小(图;1c)。

在h .术后蛋白质和脂类数量的显著季节性变化也显示出类似的模式:冬春两季值下降，随后夏秋两季值持续增加(表2)2和无花果。2a).每个季节蛋白质的数量一般至少是脂类数量的两倍;除秋季外，两种成分的数量基本相同。在r . setosum蛋白质和脂类的数量没有明显波动(表2)．然而，从冬季到夏季，脂质数量有增加的趋势，而在秋季，脂质数量似乎减少了(图。2a).蛋白质含量从冬季到夏季保持相对稳定，在秋季降至零。在m . edwardsii只有脂类的数量有明显的季节性波动(表2)．脂质含量由冬至夏依次减少，秋季增加(图2)。2a).蛋白质的数量在春季略有减少，在夏季有所增加，在秋季再次下降(图。2一个)。t . dentatus蛋白质和脂质的数量有明显的季节性变化(表2)．蛋白质和脂类的数量在春季减少，而在夏季增加。2a).与夏季相比，秋季脂类含量保持不变，蛋白质含量增加。

在h .术后能量含量有明显的季节变化(表2)．中能量含量h .术后在冬季和春季很低，在秋季达到最大值，为34,618 J。2b)。r . setosum没有发现明显的季节性能量波动(表2)．能量含量从冬季的25,415 J逐渐增加，直到夏季达到最高值39,177 J。2b).与夏季相比，秋季能量下降约三分之二，最低平均值为13138 J. inm . edwardsii没有发现能量含量的季节性波动(表2)，其中弹簧能量值略低(图;2b)。t . dentatus每根血管的能量投入有显著的季节性变化(表2)．在春季，与其他季节相比，能量减少了一半以上。2b)。

物种间的比较

在nMDS中h .术后显示为一个相对独立于其他物种的群体(图;3.)．相对分散的点簇对应于r . setosum并可能归因于价值的巨大季节性波动。这两个物种，m . edwardsii而且t . dentatus，可能是由于较小的季节变化而聚集在一起。

在研究的螃蟹中，两组输精管和能量投资的复杂性差异很大，这表明雄性生殖系统的进化和发展策略不同。螃蟹的种类h .术后而且r . setosum与雌性生殖系统相比，雄性精子储存结构更大、更复杂，在能量方面投入较高m·爱德华他们和t . dentatus．有趣的是，有两个物种(r . setosumvs。m . edwardsii)来自同一个科(即癌科)，在雄性生殖系统的大小上表现出相反的进化，证明在这个问题上没有系统发育限制。输精管形态的最大差异是来自同一科(癌科)的物种之间的差异，这表明进化史的影响不影响结果。此外，雄性生殖的精力投入似乎与由几种交配策略组成的特定交配策略密切相关1)．

为了避免精子竞争，雄性蟹已经开发了几种策略，例如精子塞和射精分层，这两种方法都大量使用了非精子物质。精子塞作为一种父权保证装置，可以防止其他雄性随后授精^17，42，43．这似乎是一种非常有效的策略，即使在一妻多夫的情况下，也可以导致遗传一夫一妻制⁴⁴．雌性交配后的种子容器h .术后而且r . setosum特点是存在一个大精子塞^26，39而雄性精子物质中相当一部分的生化成分可能参与了它的形成。在一些十足类物种中，精子塞本身的生化成分是已知的⁴⁵．例如，在portunid中Arenaeus cribrarius,交配雌性的精囊内的精塞由糖蛋白组成⁴⁶．另一个例子是精子塞c·达娜厄它是由三种类型的分泌物组成的一层一层的，每一种化学成分都是不同的蛋白质和多糖，它们是由男性通过三个输精管区域的联合分泌物产生的⁴⁷．在不同种类昆虫的精子塞中，已经检测到蛋白质和脂质^14，48，49．例如，在果蝇蛋白质有助于栓子的形成⁴⁹，但在大黄蜂b . terrestris活性物质是脂肪酸^14，48．精子塞的存在可能会增加亲子关系的可能性³²雄性可能会通过增加对单个雌性的投资而受益。然而，在精子塞上的投资和只与一只雌性交配可能会导致射精耗尽。最近，有人认为男性的h .术后由于女性精囊接收大量的射精，在生殖期间可能只能交配一次²⁶．在m . edwardsii由雄性转移的精液形成一个非常分散的精子塞，只堵塞狭窄的阴道腔，以避免与竞争对手的进一步交配⁵⁰．相比之下，男性t . dentatus不出插头⁵¹．

精液可能在精子分层中发挥重要作用，这是另一种机制，雄性可以通过明确分离不同配偶转移的射精和减少精子混合来影响有利于自己的受精^52，53．螃蟹精子凝胶的确切生化成分研究很少。例如，在主要植物的种子容器中Stenorhynchus seticornis分层的精子包被主要由蛋白质、酸性和中性多糖组成的分泌物包围⁵⁴．在m . edwardsii输精管中的蛋白质和脂类可能在以精子凝胶的形式避免精子竞争中发挥重要作用，精子凝胶将不同男性收到的精子分开，从而使精子在容器中形成清晰的分层⁵⁰．在植物的腹侧型种子花托中m . edwardsii新的射精取代旧的射精，朝向容器的盲端，并在更靠近输卵管连接的地方沉积，促进最后一个男性优先³²．在r . setosum射精在精囊中的储存模式尚未被研究，但在雌性可能与各种雄性交配的癌科中，精子分层已在几个物种中报道过，而且似乎很普遍^50，55．在t . dentatus所转移的生化底物可形成精囊内的精子凝胶，以包埋和储存游离精子⁵⁶．在t . dentatus目前还没有研究精子团在双腔容器的背腔内是否混合或分层。在被分析的种子容器中h .术后在囊的盲端观察到精子凝胶和精子包囊的连续，这表明射精没有分层(LMP, pers。观察)。

输精管中储存的每种生化成分和能量的数量可能受到一次交配事件中射精量的影响，特别是交配频率。男性的h .术后在繁殖季节可能只交配一次²⁶从而将它们的全部繁殖能量倒转到一只雌性身上。在m . edwardsii在生殖季节，输精管脂质下降;然而，减少的数量很小，可能是因为雄性在一次交配中平均只分娩了15%的盲肠重量⁵⁷并将他们的精液分给不同的女性(高水平的一夫多妻制⁴⁴)．在t . dentatus在美国，雄性在一次交配中平均要转移最初精液物质储备的37%⁵¹．即将到来的精子竞争的高风险和父系关系的不确定性可能解释了与男性相比，每个女性分配相对较少的能量和较小比例的初始精子物质库存的策略h .术后通过在不同的女性之间分配精子材料来增加父权的机会(高水平的一夫多妻制:42%的男性配偶在女性偏向的性别比例下繁殖⁵⁸)．因此,在t . dentatus蛋白质和脂类的减少可能与多次交配有关，表明生殖活动增加，特别是在春季。这表明一夫多妻制(m . edwardsii而且t . dentatus)可能与在每只雌性身上投入很少精力，但频繁交配有关。雄性交配的频率r . setosum还没有被调查。

除了避免精子竞争的解剖适应外，配偶保护也是一种有效的行为适应，以确保父权。交配后的保护经常被观察到，在一些物种中，雌性的接受能力被限制在蜕皮后的短时间内(即交配期间的雌性“软壳”)^44，59．在这种脆弱的状态下，雌性也可能受益于雄性的保护，免受捕食者、同类相食或其他雄性的伤害⁵⁹．守护配偶也可能与保护所投入的宝贵能量的必要性有关。守护在癌症家族中尤其常见^44，55，59，例如r . setosum而且m . edwardsii．男性的r . setosum在雌性蜕皮前一周和交配后2-3天进行交配保护⁶⁰．尤其是男性r . setosum它们在繁殖上花费了大量的精力，通过防守来保护它们的投资可能是至关重要的。在m . edwardsii交配前和交配后的配偶保护延长了⁴⁴．在有雄性竞争对手的情况下，雄性的守护时间m . edwardsii增加;因此，这是一种对抗精子竞争的策略，为它们投入的能量提供了更好的保护。在这种情况下h .术后在美国，只有交配前的保护被检测到，可能在这个物种中存在的大精子塞足以确保父权。在t . dentatus交配前和交配后的配偶保护都是短暂的⁵¹．可能在t . dentatus相对低能量的繁殖投资不需要在交配后射精的长期保护，而且雌性全年都有接受能力，这可能会放松雄性和雄性之间的竞争。与“硬壳”的雌性交配，精力充沛的短配偶保护，以及没有代价高昂的竞争预防措施(例如没有精子堵塞)，可能会有利于雄性t . dentatus快速恢复精液储备(15天内)⁶¹并增加交配频率。尽管男性h .术后在四种被研究的物种中，这种物种在繁殖过程中不进行交配后保护(LMP, pers。观察)。可能大的内部精子塞足以有效地保护射精，防止进一步的配对，并确保亲子关系。

Homalaspis举办而且r . setosum在他们的输精管中投入了非常高的能量，分别达到了近40000 J的最大值(秋季和夏季)。在这两个物种的能量峰值之后，两个物种的能量都急剧下降。季节性能量波动的模式可以指示一个物种的繁殖周期。能量的突然下降可能与交配期或交配期的结束相吻合。在h .术后冬季与秋季相比减少了80%的能量，这可能表明在此之前不久就发生了交配。春季能量较低，夏季和秋季能量依次升高。在r . setosum秋天与夏天相比，能量突然减少了三分之二，这可能表明雄性在这个时期之前将精液物质转移给了雌性，并从冬天到夏天恢复了能量。产卵的雌性的存在r . setosum在南方的整个冬天一直观察到幼虫在春天在类似的纬度孵化⁶⁰，因此，在这两种螃蟹中，交配发生在卵巢发育周期开始的时候(正如在其他螃蟹物种中发现的那样)^46，50，62)，而输送到女性精囊的精液中含有大量蛋白质，这可能是性腺发育的线索。在雄性生殖系统中产生的精液蛋白(SFPs)被公认为能诱导雌性昆虫交配后的许多生理和行为变化，如产卵¹³．然而，在十足动物中对sfp的研究很少⁶³．与输精管中大量生化成分相关的其他关键功能特性可能与增加生殖回报的机制有关。在r . setosum在雌性精囊内长期储存的雄性精液可能参与增强精子活力，因为该物种能够在不重新交配的情况下产生几个可行的卵⁶⁰．有来自女性的证据m .高地”,在它们的精囊中储存至少2年半的存活精子，可以用来授精多个卵团⁶⁴．特别是蛋白质以前在昆虫中与这一功能有关¹²；然而，脂质由于其高能量价值，在延长精子储存中也可能有价值。除此之外，脂质还可以为女性提供能量h .术后而且r . setosum由于大量的这种高能量成分。在昆虫中，雄性通常在求爱和交配期间向雌性传递含有许多不同的非配子物质的礼物⁶⁵．通过这种方式，沉积在女性生殖道中的营养物质得以供应。

而h .术后而且r . setosum分配了同样高的能量，投入的能量h .术后与大量蛋白质和脂质的产生有关，与之相反的是r . setosum产生高能量的富含脂质的输精管。在h .术后盲肠干重占螃蟹全身干重的比例高达近6%，是迄今为止螃蟹中最大的VSI之一²⁶(无花果。4)．这强调了大量的能量消耗，这可能是由于输精管产生和储存大量蛋白质和脂质的能力造成的。在这个物种中，特别是输精管的体积较大的后部区域已被确定为精液生产的主要部位，具有非常高的能量含量²⁶．主要的高能底物h .术后是蛋白质和脂类，在冬季，脂类和蛋白质的数量分别比秋季下降了近90%和三分之二。这些季节性的波动表明，雄性在与雌性交配时提供了大量的这两种成分。特别是在h .术后蛋白质和脂类的数量在冬季和春季保持相对较低。交配后的恢复可能需要很长一段时间，这表明这些大量蛋白质和脂类的形成可能会增加能量消耗。在这种情况下，未来可能会出现一些有趣的研究问题，例如特定成分的形成或种子储备的组成是否会影响交配后的恢复期。

螃蟹的种类m . edwardsii而且t . dentatus显示每个血管的低能量投入。它们具有相似的投资模式，在整个季节中具有相对恒定的能量值，除了在南方春季记录的最低能量值(约900 J)。在m . edwardsii能量的减少与众所周知的10月至1月的交配季节(即南方的春季和夏季)相吻合。⁵⁰．在t . dentatus春季能量含量的显著下降与先前描述的连续繁殖模式相对应，但春季交配强度更大⁵¹．雄性能量投入低的两个物种的特征是输精管尺寸较小，输精管体积中等(图2)。4)．年平均血管延迟干重m . edwardsii而且t . dentatus仅占的10%左右h .术后而且r . setosum．虽然这两种螃蟹在能量方面表现出相似的投入，但这可能与交配策略有关。

在螃蟹的进化过程中，复杂而发达的雄性生殖系统似乎在不同的时间进化，这可以从一个科内输精管的组成和大小的对比以及系统发育上不密切相关的物种之间的相似性中看出。因此，螃蟹输精管的组成和大小与每个物种的交配策略和一夫多妻制的水平有关。综上所述，生殖系统的形态功能性状和竞争回避策略可能相互作用决定了最佳交配频率和生化成分的数量，这也可以反映在投入的能量上(表1)3.)．能量分配也可能与一个物种的一夫多妻制的强度有关。我们认为，一夫多妻制的强度存在一个梯度，与精力投入有关:精力投入大，交配频率低，而精力投入低，交配次数多。有趣的是，我们关于生殖过程中能量投入的发现与瓦赫德和帕克提出的关于大睾丸进化的两个不同假设相似²⁸:数量精子竞争假说可能对应h .术后而且r . setosum与男性交配率假设相匹配的结果m . edwardsii而且t . dentatus．特别是在面对精子限制(精子数量不足以使雌性产生的所有oöcytes受精)时，由大小选择性男性渔业管理引发⁶⁶在美国，作为一个整体来评估射精是至关重要的，因为男性可能会耗尽精液物质的特定生化成分¹¹．不同生化成分的消耗可能降低特定成分的功能，影响繁殖成功。因此，影响鱼类的不是精子限制，而是射精限制。此外，在水产养殖业中，各组分的生化组成和数量可能是精料质量的重要指标。我们的研究是确定雄蟹精液储存结构投资的第一步，这突出了短尾蟹交配策略的多样性，甚至反映在生理层面上。

物种取样和实验程序

以下四种螃蟹的雄性，海苔草，海苔草，m . edwardsii而且t . dentatus采自智利南部Los Molinos湾(39°51′16.7”S;西经73°23′40.3”)，从2016年6月至2017年5月，运送到智利南方大学(universversidad Austral de Chile)的Costero de Recursos实验室Acuáticos de Calfuco。螃蟹在实验室中饲养，并提供流动的海水、空气和随意的食物(贻贝)。所有螃蟹都是沿着它们的大身体轴测量的;甲壳宽度(CW)在h .术后，r . setosum而且m . edwardsii和甲壳长度(CL)t . dentatus．均值±SE的大小h .术后，r . setosum，m . edwardsii而且t . dentatus分别为94.3±1.4 mm CW、128.6±3.1 mm CW、133.9±2.9 mm CW和102.7±1.6 mm CL。各物种的大小在季节间没有差异，除了m . edwardsii(单因素方差分析，季节:F_3、15= 10.05,P< 0.001;夏天的小螃蟹)。每个蟹种和季节由5个重复组成(除了n=每人4个m . edwardsii在冬天,h .术后在冬天，和r . setosum在冬天和秋天)。

对蟹进行麻醉(热休克- 20°C 15分钟)，并提取成对的延迟血管。样品立即冷冻并储存在预称重的小瓶中，在- 80°C的超冷器(Thermo Scientific™，Forma Series 700)中，直到进一步分析。左侧输精管用于生化分析，右侧输精管用于测定干重，以便将每种生化成分的数量与之联系起来。正常情况下，两支输精管的重量差不多⁶⁷．干重通过烤箱在70°C下干燥右侧输精管4天确定，称重精度为0.00001 g。双输精管总干重(即右输精管干重的两倍)称为VDW。计算血管体指数(VSI，以百分数表示):VSI = (VDW/BDW) × 100, BDW为体干重(70℃烘箱干燥4天，称重精度为0.01 g)，为了提高VSI的估算精度，采用无肢无螯蟹的干重^22，57．

生化分析

样品在智利蒙特港的智利南方大学Ecofisiología de Crustáceos实验室进行了总蛋白质和脂质含量分析。将储存的样品(Labconco, FeeZone 2.5)冻干48小时，并测定干重(精度为0.00001 g)。样品在磷酸盐缓冲液和milliq超纯水中均质，使其浓度达到~ 10 mg mL⁻¹采用机动均质机(Ultra-Turrax);在这个过程中，样品被保存在冰上。补充超声(Branson, Sonifier, Cell Disruptor B 15)在难以均质的组织上应用4秒脉冲和4秒休息(循环重复最大4次以避免升温)。每个匀浆被细分为新的冷冻瓶(蛋白质:10µL (Lowry法每重复3µL)和脂类:50µL(磺基-磷酸-香草醛法)，并在−80°C冷冻保存，直到分别分析。

用Lowry法测定蛋白质含量⁶⁸使用商业试剂盒(DC Protein Assay kit, Bio Rad;BSA;750海里)。用磺胺-磷-香兰素法测定总脂质含量(标准胆固醇;530海里)⁶⁹，由Torres等人修改为微孔板格式。⁷⁰．所有比色方法均使用PowerWave HT分光光度计(BioTek)。根据测定曲线和吸光度值计算生化成分。右侧输精管生化成分数量和干重加倍，以表示成对输精管。结果以每一对输精管中每种生化成分的平均数量表示。根据蛋白质和脂肪的数据，估算出蟹类输精管的能量含量，并将其转换为热量当量(焦耳)，对应于23.64 J/mg蛋白质和39.54 J/mg脂肪⁷¹．在初步分析中，碳水化合物的数量是根据DuBois等人适用于微孔板格式的苯酚-硫酸法估计的．⁷²(标准葡萄糖;490海里)。碳水化合物的数量非常少，因此没有在后续的样品中进行估计。

数据分析

以季节为固定因素，雄性大小为协变量，进行单向排列的ANCOVAs，以检测各物种输精管生化成分数量和能量投入的季节变化。然而，当协变量不显著时，则进行单向方差分析，并进行置换。选择分析是因为它们是无分布的，并且允许用相对较小的样本量进行分析。使用了' lmPerm '包中的' avp '函数⁷³．为了检查季节之间的大小相似性，对每个物种进行了单向方差分析。

采用非度量多维标度(Non-metric多维标度，nMDS)方法对种子物质的能源投资模式进行了可视化，并对具有相似投资策略的物种进行了识别。它是一种在考虑多个变量时评估样本之间相似性的工具。数据包括四种短臂鱼的季节值。nMDS中包含的变量包括蛋白质和脂类的数量、VSI和每个血管的总能量含量。使用' MASS '包中的' isoMDS '函数⁷⁴．所有统计分析均在R v. 3.5.3中进行⁷⁵．

在当前研究中生成的数据集可以在Zenodo开放科学存储库中获得，https://doi.org/10.5281/zenodo.5654807⁷⁶．