内含子引物出人意料地揭示了南极海狗的主要组织相容性复合体多样性

主要组织相容性复合体(MHC)是颌骨脊椎动物免疫系统最重要的组成部分之一，包括超过280个基因，跨越人类基因组的几个百万酶^1，2．许多研究已经证明了MHC基因型的功能重要性，它与许多物种的关键适应度成分的变化有关，如寄生虫易感性、生存、繁殖成功和配偶选择^{2，3.，4，5，6}．因此，MHC基因是研究适应性遗传变异的重要候选基因。

由经典MHC基因编码的蛋白质结合来自寄生虫和病原体的外源肽，提交给t淋巴细胞，随后启动适应性免疫反应⁷．MHC基因家族包含两个主要的经典基因亚群，它们编码具有结构和功能相似性的免疫活性分子¹．MHC I类和II类分子分别促进细胞内寄生虫如病毒和细胞外寄生虫如细菌的识别⁷．这两类分子都含有一个肽结合区(PBR)，负责与外来肽结合。在MHC I类蛋白质中，PBR由两个α -链结构域定义，而一个α -链和一个β -链折叠在一起形成MHC II类蛋白质的PBR⁸．这两类MHC分子在大多数物种中都表现出异常的遗传变异性，这被认为是由病原体介导的平衡选择驱动的，在给定的种群中，每个MHC基因通常包含数十或数百个不同的等位变异²．

为了引发免疫级联，需要将MHC的PBR与抗原肽结合，因此单个MHC变体显示出对一系列肽的特异性，这些肽在固定位置上共享共同的氨基酸残基⁹．因此，MHC位点的杂合性可能通过增加可被识别和呈递给t细胞的抗原的多样性来增强对寄生虫和病原体的抵抗力¹⁰．因此，MHC总体上以高度多样性为特征，包括脊椎动物中描述的一些最多态的基因，这并不奇怪¹¹．在人类中，已经有数千个等位基因被描述为最多态的MHC位点，导致核苷酸多样性超过全基因组平均水平两个数量级^12，13，14．

这种模式在经典MHC基因的肽结合域上特别明显，例如MHC II类DQB和DRB位点的第二外显子，它们编码MHC II类PBR的功能重要的β-1结构域⁸．这些位点多态性的维持被认为是由病原体驱动的选择介导的，其中包括杂合子优势的各种机制¹⁵发散的等位基因优势^16，17到负频率相关的选择^11，18．通过MHC依赖的配偶选择进行的性选择似乎也是维持这些基因多样性的重要力量^6，19，20.．

然而，MHC基因的等位基因多样性模式在物种间表现出显著的差异。例如，亚洲黑熊在DRB上具有高度多态性，斯堪的纳维亚棕熊在DQB上具有相对高水平的多态性，而北极熊在两个基因上具有相当的多样性^{21，22，23，24}．此外，包括独角鲸在内的几种海洋哺乳动物²⁵南部和北部的象海豹^26，27、长须鲸和长须鲸²⁸和北极熊²³似乎在DQB和/或DRB携带很少的变异。这一观察结果使一些人认为，海洋哺乳动物在海洋环境中接触到的病原体可能比陆地哺乳动物更少^23，26．然而，包括座头鲸在内的一些物种²⁹，加州海狮^30.和crabeater海豹³¹这意味着物种特异性因素在形成MHC多样性的全球模式中发挥了重要作用。

从技术角度来看，由于用于扩增MHC等位基因的方法多种多样，从PCR引物设计的差异到大量不同的测序方法，比较不同物种间给定位点的多样性也具有挑战性，这些方法都代表着潜在的偏差来源^32，33．引物设计的重要性尤其没有得到充分认识，许多研究者使用PCR引物开发并应用于之前对其他(或多或少相关的)物种的研究³³．然而，这些引物可能并不总是放大感兴趣的物种中存在的所有变异，导致不可靠的基因分型³³．出现这种情况主要有两个原因。首先，使用从部分外显子序列发展而来的引物将产生截断序列，这可能会排除外显子内引物结合位点侧面的可变位置。第二，引物结合位点内的遗传变异会因PCR扩增偏差而无意中导致目标等位基因的不完全检测，引物与模板不匹配会降低某些等位基因的扩增效率，最终导致等位基因多样性被低估^34，35．

对MHC多样性的正确推断对于理解形成物种内部和物种间MHC变异的选择性力量显然是必不可少的^33，36．然而，也有越来越多的人认识到有必要将基因组背景的潜在混淆效应纳入MHC研究。特别是，当种群内存在密切近交时，MHC杂合性可能与全基因组杂合性存在潜在的相关性³⁷．这可能使解开MHC纯合性的影响与近交系个体中有害等位基因的暴露所导致的适应度损失具有挑战性³⁸．此外，MHC基因的选择也会受到相关的有害突变的影响，这些突变可以由于高水平的局部杂合性而免受选择的影响³⁹．最后，比较免疫遗传多样性和中性多样性可以为了解选择机制提供参考⁴⁰．例如，相对于选择性中性位点，平衡选择倾向于增加MHC的群体内多样性，导致前者的群体结构更弱⁴¹而MHC上的多样化选择可能导致相反的模式⁴²．

鳍足类动物非常适合研究MHC的适应性变异。尽管它们的大部分时间都在海上度过，但许多鳍类物种在陆地上高密度繁殖，在那里，由于同质物的密切接近和粪便物质的积累，它们可能会接触到各种寄生虫和病原体。此外，已经报道了鳍足类动物的多种适应度成分的杂合子-适应度相关性，包括寄生虫抗性⁴³通过早期生存^44，45伴侣的选择⁴⁶和生殖成功^47，48．这表明，许多健康因素受到个体遗传质量的影响，尽管其确切机制仍有待商榷^49，50，51．最后，先前对鳍足类动物的研究表明，MHC基因的变异与幼鱼和成年鱼的死亡率有关^52，53，54,寄生虫易感性⁵⁵和生殖成功⁵³这意味着MHC中存在强烈的自然(和潜在的性)选择。

南极海狗是一种高度一夫多妻制的鳍状动物⁵⁶它们在亚南极岛屿上季节性繁殖，主要是西南大西洋的南乔治亚岛⁵⁷．这个物种表现出极端的出生地点忠诚，雌性返回到其出生地点的一个体长内繁殖⁵⁸，而雌雄成虫也会在季节和季节之间忠实于繁殖地⁵⁹．在南乔治亚州的鸟岛进行的一项长期研究，从9个微卫星量化了杂合度与多种健康因素之间的联系，包括生存、体型和繁殖成功^{45，46，48，60}．而基因组数据表明，这些关系可能是由于近亲繁殖萧条^61，62在此基础上，MHC基因型对适应度变化的影响程度尚不清楚。可以说，MHC II类基因可能特别重要，因为细菌感染是领地雄性南极海狗死亡的主要原因⁶³．

鸟岛上的两个南极海狗繁殖地^64，65提供了一个机会来比较和对比MHC和中性分子标记的遗传结构和多样性模式。特别研究泳滩(SSB)与淡水泳滩(FWB)相距仅约200米(图1)。1)，但在SSB繁殖的雌性的密度要高几倍(每米约1.2只vs.约0.3只)²分别)⁶⁶．我们之前已经表明，SSB海豹皮肤微生物群落中致病菌的比例过高⁶⁷这表明病原体驱动的选择压力可能会随着社会密度的变化而变化。因此可以想象，在SSB普遍存在的更拥挤的条件下，对特定MHC等位基因和/或MHC杂合性的选择可能更强。

本研究设计了一对新颖的内含子引物，用于PCR扩增南极海狗MHC II类DQB外显子2全长蛋白编码序列。然后，我们使用经典的克隆和桑格测序方法来表征SSB和FWB的母-子对的等位基因多样性。近亲的加入减少了我们个体的有效样本量，但允许我们测试孟德尔错配，这是一种确定基因分型错误的成熟方法⁶⁸．此外，同样的动物此前已经在41个微卫星上进行了基因分型⁶⁹，使我们能够比较MHC的多样性模式和假定的中性遗传标记。我们假设:(i)密度依赖的选择压力可能导致MHC相对于中性位点的种群结构和/或遗传多样性的对比模式;(ii) MHC杂合性和全基因组杂合性之间的关系可能是我们研究人群中近亲繁殖存在变异的结果^61，62．最后，Hoelzel等人之前的研究。⁷⁰利用DQB外显子2内部的PCR引物扩增部分(141 bp)外显子序列，在鸟岛的13只南极海狗个体中发现了4个等位基因。这为我们在MHC多样性方面的研究设定了预期，尽管我们预计更大的个体样本量和全长外显子序列的结合可能会发现一些额外的等位基因。

内含子PCR引物用于扩增一个459 bp的产物，其中包含完整的267 bp的MHC II类蛋白编码DQB外显子2序列，这些产物来自南乔治亚州鸟岛的两个繁殖群体的44对南极海狗母-后代(图。1)．56只个体获得预期大小的PCR产物，包括20对母-子代，12只母未测序幼崽和4只母未测序幼崽(见补充表)1详情)。克隆和测序这些PCR产物产生了977个全长DQB外显子2序列的数据集。

DQB II等位基因的特征

184个序列(9.3%)在整个数据集中出现过一次(即它们由一个克隆表示)，另外10个序列(1.2%)出现过两次，但总是在同一个个体内。由于这些序列与更常见的序列相差一个(或最多两个)核苷酸，我们将它们归类为假定的人工制品，并将它们从数据集中过滤掉。这样总共剩下771个克隆序列(平均= 13.77，每个个体的范围= 7-32)。在这些序列中，我们鉴定出19个不同的ArGa-DQB等位基因，每个等位基因至少发生在两个个体中，并由至少7个克隆序列表示(平均= 40.6;无花果。2和补充表1)．在我们最终的数据集中，除了两只动物外，所有动物都携带一个或两个ArGa-DQB等位基因(补充表1)，与单个位点扩增一致。此外，对母鼠和幼鼠的基因型的比较显示，大多数配对(17/20,85.0%)至少共享一个等位基因(图1)。3.)，表明这个位点遵循孟德尔遗传。

氨基酸分化与选择模式

所有19个ArGa-DQB等位基因序列转化为独特的氨基酸序列，包括整个外显子的89个氨基酸残基。氨基酸序列的比对显示没有帧移和过早停止密码子。序列比对发现核苷酸和氨基酸位置分别有34个和22个可变位点，后者包括13个可变的假定抗原结合位点(pss;补充图。1)．然而，值得注意的是，pss是从与人类MHC的序列同源性中推断出来的，目前尚不清楚这些位点在抗原结合中的直接参与是否在哺乳动物中是保守的。在这些pABS密码子上，三个等位基因ArGa-DQB*01、ArGa-DQB*06和ArGa-DQB* 16和一对ArGa-DQB08*和ArGa-DQB*13分别是相同的。总体而言，配对氨基酸差异在pABS (d= 0.304, s.e = 0.079)比非pabs密码子(d= 0.066, s.e. = 0.023，t= 28.814,p< 0.001)。此外，非同义替换在pABS上发生的频率明显高于同义替换，而在非pABS密码子上则没有1)，表明ABS是在平衡选择下进化的。根据这一点，最大似然系统发生树(补充图。2)揭示了ArGa-DQB等位基因在一定程度上的聚类，但也有多个南极海狗序列与其他物种的等位基因组合在一起，包括新西兰海狗(ArFo)、加利福尼亚海狮(ZaCa)和海象(OdRo)，表明潜在的跨物种多态性。

菌落和遗传标记的比较

两个繁殖群体在MHC (F_圣= 0.0054,p= 0.527)或41颗微卫星(F_圣= 0.0028,p= 0.497)。两个群体的遗传多样性统计也相似(补充表2)．在个体水平上，我们发现在MHC上的成对UniFrac距离和成对微卫星亲缘性(LME，F₁₅₃₈= 7.908,p= 0.005,无花果。4而MHC杂合度与微卫星杂合度无显著相关性(sMLH, Binomial GLM， χ²_{1, 54}= 64.50,p= 0.155,无花果。4B)。

与之前的研究比较

Hoelzel et al。⁷⁰利用MHC II类DQB外显子2内部的PCR引物扩增了鸟岛13只南极海狗个体的4个部分(141 bp)外显子序列(其中为AFS1-4)。我们在我们的序列数据集中检测到两个这样的等位基因(AFS1 = ArGa-DQB*17和AFS2 = ArGa-DRB*06)，但AFS3和AFS4在等位基因或推定的人工制品中都找不到。为了阐明两项研究在推测MHC多样性方面的差异，我们比较了Hoelzel等人使用的引物结合位点上核苷酸错配(汉明距离)的数量。⁷⁰对于两项研究中共同存在的两个等位基因和仅在当前研究中发现的17个等位基因。数字5A和补充图。3.表明，新描述的等位基因在引物结合位点上的核苷酸错配比两项研究中普遍存在的等位基因多两倍。这可能表明引物结合位点的序列变化可能导致不同等位基因之间的扩增模式有偏差。为了探索核苷酸错配数量和等位基因扩增之间的联系，同时考虑到样本大小的变化，我们通过随机抽样替换的基因型计算我们数据集的等位基因检测曲线。数字5B为设置1-6个引物结合位点错配的不同阈值时，等位基因数与样本量的关系。随着样本量的增加，发现的等位基因总数迅速增加，直到在30-40个个体左右接近一个平台。对于13个个体的样本量，我们发现在检测到的等位基因数量之间显示出3个核苷酸错配与Hoelzel等人的经验值之间有合理的一致性。⁷⁰，同时允许额外的不匹配导致检测到的等位基因数量增加。

我们开发了一对新的内含子PCR引物，用于扩增来自南乔治亚州鸟岛两个繁殖群的南极海狗母-后代MHC II类DQB外显子2的全长蛋白质编码序列。我们在56个个体中发现了19个ArGa-DQB等位基因，发现MHC多样性的水平出人意料地高。等位基因发现曲线表明，我们的结果与Hoelzel等人的结果之间存在差异。⁷⁰不能完全归因于测序个体数量的差异。相反，目前研究中独特的许多等位基因与Hoelzel等人使用的引物结合位点的平均不匹配程度更高。⁷⁰比两项研究中共有的少数等位基因更有效。一种可能的解释是引物结合位点的序列变化可能导致了等位基因扩增的偏态模式。

DQB基因发现

历史上，对非模式生物MHC基因测序的尝试往往依赖于从多个物种的部分外显子序列中设计的PCR引物。相比之下，我们能够使用南极海狗参考基因组设计内含子引物，以PCR扩增和测序全长MHC II类DQB外显子II。这似乎有助于发现比先前研究预期的更大的等位基因多样性⁷⁰．具体来说，我们的研究结果表明，在南乔治亚州人群中至少存在19个ArGa-DQB等位基因。实际上，等位基因多样性可能更高，原因有二。首先，我们丢弃了由一个或两个克隆代表的序列，因为这些序列与更常见的序列主要有一个(或最多两个)核苷酸的差异，这表明它们中的大多数(如果不是全部的话)可能是PCR或测序产物，这是克隆PCR产物时的常见现象，如在MHC基因分型中⁷¹．然而，这种保守的方法可能已经导致排除了罕见的真正的等位基因，这些等位基因可能由于随机抽样效应而在我们的数据集中未被充分代表。其次，虽然我们的56个个体的样本量原则上应该允许等位基因的检测频率降低到1%左右，但真正的阈值可能更高，因为我们数据集中的许多个体都是密切相关的。因此，有可能在更大的不相关个体样本中检测到额外的等位基因，特别是如果我们可以包括来自整个物种全球分布的基因差异群体的样本^62，72．

我们在目前的研究中报告的相对较高的等位基因多样性对于一夫多妻制、殖民繁殖的鳍状目来说并不一定是出乎意料的，在这种情况下，成年(但不是新生儿)死亡的主要原因是细菌感染^63，73．为了研究自然选择是否能够维持这种多样性，有必要测试MHC基因型和适应性成分之间的联系，如生存、体型和繁殖成功，这些已经被认为是受该物种个体基因型影响的^{45，46，48，60}．然而，南极海狗的MHC多样性也有可能与历史上较大的有效种群规模有关⁷⁴．为了支持这一假设，一项对冰上繁殖海豹的比较研究报告称，在世界上最丰富的鳍足类食蟹海豹中，DQA等位基因多样性非常高(30个个体中有39个等位基因)，而在韦德尔海豹和罗斯海豹中，多样性为中等，在豹海豹中最低³¹．此外，尽管由于历史上的封印，南极海狗的种群数量大幅减少，但在瓶颈期，有效种群数量可能保持在数百只^72，75，76．相比之下，有记录的MHC多样性最低的鳍类动物——北方象海豹，被猎杀到只有几十个个体，这可能导致了基因漂移导致MHC等位基因的丢失^27，70．

除了较高的等位基因丰富度外，我们还发现pbp中存在过量的非同义替换，这暗示了长期的平衡选择。这种模式并不出乎意料，并且与通过病原体介导的选择在进化过程中保持的等位基因多样性一致。与长期持有的观点相反，海洋哺乳动物面临较低的病原体压力²⁶在美国，几项研究已经描述了MHC多样性对鳍足类动物的疾病易感性、生存和繁殖成功的强烈影响^{52，53，54，55}．总的来说，这些研究表明自然选择(可能还有性选择)可能是鳍足类动物保持MHC多样性的重要力量。长期的平衡选择和/或对类似病原体的适应可能也有助于解释跨种多态性，这从鳍类物种的等位基因相似模式中可以明显看出。例如，ArGa-DQB*06和新西兰皮海豹的等位基因(AF111044.1)只不同一个核苷酸，并被翻译成相同的蛋白质序列，而一些等位基因已经在进一步的物种对中被交叉鉴定(例如加利福尼亚海狮和加拉帕戈斯海狮[AF503397-398, AF503400-402, AF503406和HE663128]，南方象海豹和澳大利亚海狮[AF111038和KP127614.1])。

单拷贝孟德尔遗传位点的证据

MHC位点经常重复，鳍足类动物似乎也不例外。例如，灰海豹个体在DQB外显子2上携带多达4个等位基因，表明至少存在两个位点⁷⁷而在加州海狮身上至少发现了7个DRB基因座^30.．相比之下，我们发现56个个体中有54个(96.5%)携带一个或两个ArGa-DQB等位基因，指向一个单拷贝的经典DQB位点。对大多数亲子对的孟德尔遗传的观察进一步支持了这一点。目前还不清楚为什么两个个体(都是母亲)各自扩增了三个等位基因。一种可能的解释是样品交叉污染，在这种情况下，有关个体的基因型(见补充表)1)就表明发生了两起独立的污染事件。不管确切的解释是什么，在这两种情况下，至少有一个母亲的等位基因与她的后代共享，这表明一些母亲和后代的等位基因被正确地描述了。另一种可能是MHC II类DQB外显子2的拷贝数变化。来自未来研究的更大的数据集可能会在这方面提供更多的信息。

更普遍地，我们发现母亲和后代之间的孟德尔不匹配率很低，20对中只有3对表现出不兼容的ArGa-DQB基因型。我们可以确信，这些不匹配不是由于母体-后代对在该领域被错误地识别⁷⁸因为在目前的研究中，所有的母亲都在41个微卫星位点上与她们的幼崽相匹配。相反，这三位母亲似乎都是纯合的等位基因，而这种等位基因并没有与她们的后代共享。对这种模式最明显的解释是，这些母亲实际上是与后代共享的等位基因的杂合子，但由于随机等位基因缺失或由于PCR扩增偏倚，这些等位基因在我们的克隆数据集中没有被检测到，这可能导致某些等位基因的优先扩增。在使用能够筛选有限数量克隆的经典方法的研究中，两者都被认为是基因分型错误的来源³⁶．

人口结构

用来推断MHC选择的一种方法是比较MHC基因和中性位点的群体结构强度。例如，在苏格兰灰海豹中，DQB外显子2在种群间表现出更强的分化，但比微卫星更弱的距离隔离模式，这被解释为栖息地特定的选择压力影响繁殖种群的遗传组成的证据⁷⁷．因此，我们测试了两个社会密度不同的南极毛海豹群体之间的遗传差异。因为高的社会密度往往与接触寄生虫和病原体的风险增加有关⁷⁹，我们假设来自这两个地方的动物可能在MHC经历了截然不同的选择压力。然而，我们在MHC和41个微卫星上都没有发现任何遗传差异，在这两种类型的标记上，种群结构可以忽略不计，遗传多样性具有可比性，无论是总体上还是当成人与后代分开考虑时。这种在中性标记上的分化的缺乏暗示了强烈的出生哲学⁵⁸和成人网站的保真度⁵⁹这种物种的数量不足以产生精细的种群结构。此外，来自两个群体的动物在MHC等位基因频率或MHC杂合性上没有任何明显差异，这表明在MHC上的选择强度可能不随社会密度的变化而变化。然而，我们在这方面的推断是有限的，因为我们的个体样本量有限，以及对该物种中病原体接触和免疫活性的密度依赖性模式的知识有限。

MHC基因型与基因组背景的关系

相对较少的非模式生物研究将MHC测序与全基因组分布式、选择性中性标记(如微卫星)的基因分型相结合³⁸．因此，我们对MHC基因型与全基因组亲缘性和杂合性模式之间的关系的了解仍然有限，这对于理解配偶选择和近交系繁殖萧条具有重要意义。我们检测到从微卫星推断的基因亲缘关系和MHC的UniFrac距离之间微弱但显著的关联。这揭示了MHC基因型参与南极海狗遗传亲缘信号传递的可能性，这可能有助于解释该物种的雌性能够对不相关和杂合的伴侣进行择偶的能力⁴⁶．然而，MHC杂合性与微卫星杂合性之间没有明显的关系，尽管微卫星携带着明确的身份不平衡信号⁶⁹这表明它们捕捉到了研究种群内近亲繁殖的变异。尽管来自更多中性标记的数据可以让我们更加确信缺乏相关性，但从表面上看，这一发现表明MHC杂合性与近亲繁殖无关。这可能对解释适合度的变化有影响，因为近交系个体不一定在MHC上更纯合子。因此，如果在MHC上的选择有助于该物种的适应度变化，那么MHC基因型的任何影响都可能独立于近交萧条导致的适应度损失发生。

估计比较多样化

推测的MHC II类DQB外显子2的等位基因多样性大大高于此前报道的该物种⁷⁰．虽然我们对这种差异没有明确的解释，但我们的序列数据清楚地表明，Hoelzel等人的引物结合位点。⁷⁰在鸟岛的南极毛海豹中是不同的。此外，我们新描述的等位基因在Hoelzel等人的引物结合位点平均表现出更多的不匹配。⁷⁰比两项研究中常见的等位基因要多。对这种模式的一种解释可能是偏等位基因扩增，这在目前的研究中似乎相对不重要，因为使用的引物退火到变量较少的侧面内含子。这与一项元条形码研究的发现一致，该研究可以解释不同节肢动物物种放大成功的80%左右的变化，通过物种特异性启动区域和通用引物之间的不匹配的数量³⁵．另外，Hoelzel等人分析样本的确切地点和时间也不清楚。⁷⁰虽然它们似乎来自长期研究群体(SSB)，而且它们必须是在发表年份(即1999年)之前收集的。因此，推测出的MHC多样性的差异可能是来自不同时间点和地点的样本的反映，尽管这似乎不太可能，因为种群结构，至少在局部，看起来相当脆弱^62，69，72．不管确切的解释是什么，我们的研究结果进一步支持了引物设计对多态基因等位基因多样性的准确评估至关重要的论点。重要的是，多物种对齐不一定能提供种内变异的信息。然而，这个问题可以通过预先筛选在预定引物结合位点的种内变异的焦点物种或群体来避免。由于全基因组重测序数据的不断增加，这种方法正变得越来越可行。

未来的视角

虽然克隆和桑格测序不能对大量的个体进行基因分型，但我们所采用的方法在研究的初步阶段是常见的，并产生了一个已知等位基因的目录，可用于验证用其他方法获得的结果³³．我们的ArGa-DQB等位基因目录比我们最初预期的要大一些，但几行证据表明，即使不是所有的特征等位基因，大部分也可能是真实的。最明显的是，它们都是从多个个体中克隆出来的，除了少数例外，它们似乎符合孟德尔遗传。此外，核苷酸分化和系统发育聚类的总体模式与自然选择和跨种多态性的预期模式一致。未来的研究应该着眼于使用更大的个体样本来调查MHC基因型和适应度之间的关系，最好是在控制全基因组效应的同时，例如使用最近开发的85k SNP阵列⁶¹．另一个有前途的研究途径是测试MHC在化学交流中的作用⁶⁹和配偶选择⁴⁶．

我们已经迈出了描述南极海狗MHC多样性的第一步。我们最初聚焦于MHC II类DQB外显子2，使用内含子引物识别了19个支持良好的等位基因。这种高于预期的多样性似乎是通过平衡选择来维持的，这表明MHC多样性可能会影响该物种的适应性，就像其他几种鳍足类动物一样^{52，53，55，80}．我们的结果还具有方法学意义，因为它们强调了对种内变异的引物结合区域进行预先筛选可能是优化非模式生物MHC变异发现的有价值的一步。

组织取样和DNA提取

样本来自南乔治亚州鸟岛(54°00′24.8″S, 38°03′04.1″W)的两个繁殖群落(SSB和FWB)，共88只南极毛海豹个体(44对母幼)。2011年繁殖季节，作为英国南极调查局(BAS)长期监测和调查项目的年度例行程序的一部分进行了采样。Hoelzel等人分析样本的时间和地点尚不清楚。⁷⁰收集的样本，尽管这些样本很可能来自于SSB，而且采样必须在1999年之前进行。在目前的研究中，用仔猪耳切钳从前鳍指间缘取皮肤样本，保存在- 20℃的20%二甲基亚硫酸钠饱和溶液中。随后使用改进的氯仿/异戊醇提取方案提取DNA⁸¹．

dqb特异性引物的开发

从多个鳍类物种中提取MHC II类DQB外显子2序列(见补充表)3.获取详细信息)并在BioEdit中对齐⁸²．结果对齐后修剪到267 bp，对应整个蛋白质编码外显子2序列，并映射到南极毛皮海豹参考基因组(版本1.0)。⁸³使用BLAST e值1e⁸一个字的大小是7。结果显示，该蛋白编码外显子2序列的所有267个核苷酸都匹配成功，且不存在缺口(Contig 48, 1,937,070-1,937,336)。然后设计内含子引物，利用Primer3Plus扩增全长的第二外显子⁸⁴除了将熔化温度的最低和最高分别定义为60°C和65°C，并将GC含量限制在35-65%。该方法在第二外显子序列的保守侧区识别出正向引物和反向引物(ArGa-DQB_F: 5 ' - gctgttggttgggctgag, ArGa-DQB_R: 5 ' - CCACCTCAGCAGGAACAGTG)。这些引物使用BLAST对南极海狗参考基因组进行了唯一的映射，e值为10，单词大小为14，预计可以产生459 bp的单个产物。

PCR扩增、克隆和测序

PCR反应使用5 μL KAPA HiFi HotStart ReadyMix (KAPA Biosystems, Boston, united States)、1 μL基因组DNA和2 μL每个引物(1 μM)，总体积为10 μL。使用TProfessional标准热循环仪(Biometra GmbH, Göttingen, Germany)进行热循环，包括在95°C下进行5分钟的初始变性步骤，然后在95°C下进行30秒变性30个循环;70℃退火1分钟，72℃延伸1分钟。最后一个延伸步骤在72℃下进行7分钟，随后冷却到4℃。所有样本PCR扩增三次，每个PCR产物分别取1 μL在标准的2%琼脂糖凝胶上扩增成功。

PCR产物用NucleoSpin进行纯化^®提取II试剂盒(machery - nagel, Düren，德国)，用1u taq -聚合酶和0.13 mM dNTPs(均为Qbiogene，海德堡，德国)孵育。我们将扩增的MHC片段克隆到电胜任大肠杆菌细胞(ElectrocompTM TOP10细胞，Invitrogen)使用TOPO TA克隆^®测序试剂盒(Invitrogen)。使用标准T3或T7引物和BigDye在ABI 3100或ABI 3130自动测序仪(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)上对细菌质粒插入物进行测序^®终结者v3.1周期测序试剂盒(应用生物系统)。

序列分析

使用MEGA 10.1.8版本对单个克隆核苷酸序列进行比对⁸⁵．每个序列的测序跟踪文件都被手动检查是否有歧义核苷酸，并在必要的地方进行更正。然后将所有的核苷酸序列与南极海狗参考基因组的MHC II类DQB外显子2进行对齐，使用MEGA中的ClustalW实现(缺口打开惩罚15.00;间隙扩展惩罚6.66对两对齐和多次对齐)，随后修剪到270 bp的长度。然后我们使用Biostrings包⁸⁶由Bioconductor项目分发，构建定制函数来处理R中的序列数据。

群体分化与遗传多样性

我们生成了遗传多样性统计数据(私有等位基因的数量，等位基因丰富度，观察到的和预期的杂合度和F_是)为两个使用近亲繁殖的蜂群⁸⁷, adegenet⁸⁸,素食⁸⁹和hierfstat⁹⁰．用计算的方法检测了两个菌落之间的遗传分化F_圣分别为MHC和41颗微卫星，在Weir和cockham之后⁹¹hierfstat之内。通过排列原始数据9999次来确定统计显著性，以创建一个模拟的空分布F_圣值和ade4⁹²．我们对所有个体的MHC UniFrac距离和微卫星相关性进行了成对量化。UniFrac是一种基于系统发育距离的对之间的总未共享分支长度的比例的距离度量。为了进行这一分析，我们首先使用MEGA中的邻居连接模型建立了本研究中识别的MHC II类DQB外显子2等位基因的系统发育树⁸⁵而将p-距离来解析两个序列不同的核苷酸位点的比例。从41颗Queller和Goodnight的微卫星中计算成对的基因亲缘关系r使用Demerelate⁹³．此外，我们利用inbreedR量化了MHC单倍型杂合性(1 =杂合，0 =纯合)以及微卫星的标准化多位点杂合性(sMLH)⁸⁷．为了检验在MHC处的成对UniFrac距离和亲缘性之间的关联，我们构建了一个线性混合效应模型(LME)，在该模型中，我们通过将两个被比较个体的身份作为随机效应来控制成对观察的非独立性。为了检验MHC杂合度和sMLH之间的关系，我们使用了二项广义线性模型(GLM)。统计学意义的确定使用F-test在LME和一个χ²-测试在GLM。

测试选择

核苷酸序列与加州海狮的全长DQB序列对齐，并修剪到Brown等人的第二外显子阅读框。⁸，得到267 bp的DQB外显子2序列。使用改进的带有Jukes-Cantor校正的内- gojobori模型估计MEGA中同义(dS)和非同义(dN)替换率。计算了整个外显子以及单独的假定抗原结合位点(pABS;24个密码子)和非pabs(65个密码子)。以Brown等人为参照，鉴定了paabs的密码子。⁸．然而，应该注意的是，这些假定的抗原结合位点在哺乳动物MHC II类分子之间的同源性仍然是假设的。通过使用基于密码子的z检验(999个自举复制)对中性选择和阳性选择进行检验，评估差异的显著性。

系统发育重建

MHC class II DQB外显子2序列来自南极海狗、各种其他鳍类动物和狗(犬属狼疮后裔)使用MEGA的ClustalW算法进行对齐。然后，我们用最大似然方法和Jukes-Cantor模型构建了一个系统发育树。

引物结合位点错配及等位基因检测模拟

我们将本研究中发现的等位基因的引物结合位点错配与Hoelzel等人发现的等位基因进行了比较。⁷⁰．我们根据核苷酸与引物结合位点不匹配的数量(最大汉明距离)使用不同的阈值对等位基因进行分类。在自举方法中，我们对带有替换的经验基因型进行随机抽样，从1到56个样本，每个样本有999个替换，以计算在允许错配的指定阈值内检测到的等位基因的数量及其平均值和标准差。

动物伦理

根据英国南极考察队在南乔治亚岛实地活动的科学研究许可，并根据《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)收集和保留了样本。所有的现场程序都得到了英国南极调查动物福利和伦理审查机构的批准。PEA6)。