弱视与围产期因素之间的遗传因果推论

弱视是一种常见的视觉障碍，通常在儿童时期被诊断出来。据报道，目前的患病率约为0.7-2.9%，这在不同人群之间有所不同，预计到2040年，其全球患病率将增加两倍以上¹．由于弱视造成的视力损害是终生的，如果不及时治疗，可能会造成严重的影响，因此它正在成为世界范围内一个重要的视力问题。从全球健康的角度来看，弱视已成为一种主要的慢性病，与之相关的社会负担也随之增加。

各种易诱发弱视的危险因素已被记录在案，包括眼部和非眼部因素。常见的眼部危险因素包括屈光不正、斜视和屈光参差^2，3.，4．与弱视相关的非眼部危险因素主要是围产期因素，如早产、外观、脉搏、鬼脸、活动和呼吸(APGAR)评分、孕妇怀孕期间吸烟、新生儿重症监护病房住院和母乳喂养²．有关弱视相关的眼部危险因素的临床研究已有报道;然而，只有少数研究报道了非眼部危险因素。以往研究中出现的大多数非眼部因素与宫内环境密切相关;因此，弱视被认为受到父母-出生地效应的强烈影响。对于受全身和环境影响的非眼部因素，弱视发生的因果关系和遗传推论需要更清楚地阐明。

以往关于非眼部因素的研究大多是观察性的，即使在少数队列研究中，一些非眼部因素对弱视的影响仍存在争议。由于需要长期的数据收集，而且研究设计通常是观察性质的，因此评价弱视与非眼部因素的因果关系在临床上有一定的局限性。需要一种更可靠的方法来确定显著的因果关系，因为传统的观察研究可能有局限性，如混杂和反向因果关系。

孟德尔随机化(MR)已被用于改进因果推理，使用与可修改暴露相关的遗传变异来检测与结果的因果关系⁵．在研究设计方面，MR技术类似于随机对照试验，能够克服观察设计的局限性，为危险因素对结果的因果影响提供比观察研究更可信的证据⁶．使用这种新方法，我们利用英国生物银行(UKBB)的数据，评估了欧洲人群弱视发展的遗传变异因果关系。在此，我们关注从数据中获得的父母-源性围产期因素;然而，直接的因果关系还不清楚。

根据UKBB的全基因组关联研究(GWAS)总结统计数据，为体重(BW)选择工具变量(IVs)的工作流程见补充图。1．汇总统计数据，包括p值，beta，标准误差(SE)，风险等位基因和风险等位基因频率，单核苷酸多态性(SNPs)与BW，母亲吸烟和母乳喂养的UKBB之间的关系见补充表1，2而且3.．

我们获得了18个预测BW的独立snp，具有全基因组意义(p < 1 × 10)⁶)作为IVs从GWAS汇总统计中剔除两个snp (rs9895335和rs4977838)，因为它们与弱视有潜在的联系(补充表)4和表1)。考虑到下游效应，不移动这些snp的结果也在补充图中给出。2．此外，我们从GWAS汇总统计数据中选择了39个与母亲吸烟相关的snp和11个与母乳喂养相关的snp作为具有全基因组意义的IVs。

利用随机效应模型的逆方差加权(IVW)，我们发现了BW与弱视风险之间的因果关系的可能证据。基因预测的BW与弱视呈负相关(beta =−7.31 × 10¹， se = 2.58 × 10¹， p = 4.74 × 10³)(无花果。1而且2)。采用IVW固定效应方法(beta =−7.31 × 10)估计方向相似关联¹， se = 4.80 × 10¹)，简单中位数(beta =−7.96 × 10¹， se = 5.92 × 10¹)，加权中位数(beta =−7.29 × 10¹， se = 6.22 × 10¹）;但敏感性分析结果无统计学意义(均p > 0.05)。此外，通过四种不同的MR方法，遗传预测的母亲吸烟和母乳喂养与弱视风险没有因果关系2)。

通过MR Egger回归分析BW对弱视风险的影响，未观察到水平多视(p = 0.495)。科克伦氏组弱视的BW无明显异质性问检验，使用MR Egger和IVW方法(MR-Egger的p: 0.998, IVW的p: 0.998)。每个IV的f统计量显示仪器强度，见补充表1．当前研究的统计效力为94%。

本研究采用单样本MR方法评估了围产期因素，如体重、孕期母亲吸烟和产后母乳喂养与弱视的因果关系。所有的围产期因素都被报道为弱视的可能危险因素。MR方法使用的单样本包括UKBB的暴露和结果因素数据。MR结果显示，只有体重与弱视有因果关系，而母亲在怀孕期间吸烟和哺乳期间不吸烟。此外，只有通过IVW方法才能发现微弱的因果关系。然而，在其他没有多效性或异质性的方法中也观察到类似的趋势，这可能会导致偏倚。我们的研究结果与以往的临床研究一致，即BW与弱视风险呈负相关，而只有少数大样本量的临床研究阐明了各种围产期因素与弱视风险之间的关系。在英国ALSPAC研究的一项基于人群的队列研究中，孕妇在妊娠早期吸烟显著增加了1.64倍的弱视风险。然而，早产并没有增加弱视的风险⁷．在悉尼儿童眼病研究的2461个6到72个月的儿童中，Amy等人报告弱视与低体重、早产、母亲吸烟或种族之间没有显著的联系⁸．然而，在另一项以6岁儿童为代表性样本的澳大利亚研究中，与母亲吸烟和母乳喂养相比，低体重、早产和新生儿重症监护室(NICU)住院史大大增加了弱视的风险。基于以往的研究，非眼部围产期因素对弱视风险的影响存在争议。然而，这些研究受到了一些混杂因素的限制。社会环境因素，如弱视是否在幼儿诊断时进行了治疗，根据社会阶层和种族进行的筛查率，或研究期间的随访损失，都可能对弱视的识别产生潜在的干扰。以往的研究多集中于斜视、屈光不正等眼部危险因素，对非眼部危险因素的研究没有深入深入。因此，考虑到基因组研究的重要性，有必要进行客观和基础的研究。

在之前的一项GWAS研究中，Shaaban等人发现了内斜视易感性的遗传变异，这表明存在父母-出生地效应⁹．内斜视被认为是GWAS遗传的一种复杂特征。然而，没有研究基于遗传推理证明任何其他因素在弱视发展中的因果关系。因此，我们使用成熟的MR方法评估非眼部危险因素，这是一种客观的分析方法，证明了弱视的显著因果推论。

MR方法连同它的各种优点，已被广泛用于估计可改变的危险因素和疾病之间假定的因果关系。在自然实验中使用遗传变异，并在受孕时随机分配。遗传变异不受行为或环境因素的影响，也不太可能受到混淆和反向因果关系的偏倚的影响。此外，这些影响相当于终生差异，减少了与暴露量短暂波动有关的问题¹⁰．然而，与其他分析方法类似，MR依赖于假设;因此，应该估计它们的合理性。在此，基于先前发表的结果，我们建立了因素与疾病之间的假设。我们还发现MR方法与临床研究之间的相关性是合理的。此外，由于通过弱视儿童血样采集遗传数据有很大的限制，获得大样本量的UKBB遗传数据是有效和有意义的。

值得注意的是，BW可能与弱视直接相关，与弱视风险负相关。据报道，BW越低，与视网膜和神经发育问题的相关性越高，如早产儿视网膜病变(ROP)、脑室出血或脑室周围白血病^11，12，13．可以考虑这些问题之后继发性视觉障碍的可能性;然而，有必要考虑到低体重患者不一定患有这些疾病。Hou等人证实，低体重婴儿在没有可识别的视网膜或神经异常的情况下，对视觉皮质敏感性有显著影响，而视觉皮质敏感性是视觉发育的一个重要因素¹⁴．因此，我们首先尝试通过GWAS源去除所有可能与任何视觉或神经疾病相关的snp，以避免在分析过程中产生任何混杂效应。Rs9895335和rs4977838与认知能力和神经系统疾病相关，通过影响脑功能和独立影响预后而促成弱视的发生，而不通过危险因素。因此，我们从最终的分析中排除了这些snp，然后最终确定了与BW相关的遗传变异，从而导致弱视的易感性，这表明存在亲本效应。因此，BW可能与弱视有较强的初步联系。

本研究的遗传因果关系分析结果可能具有重要的临床意义。众所周知，定期观察视力发育通常是建议的早产儿ROP病例。我们的研究结果还表明，需要定期监测低BW和正常妊娠期(即使没有ROP或其他神经发育疾病)婴儿的视觉发育，以监测弱视风险。这可能表明BW可能是视觉发育不良的一个可能的预测因素，以及定期随访和早期干预在发现和管理弱视的重要性。

这项研究有几个局限性。首先，由于使用汇总数据，无法探索任何潜在的非线性关系或分层效应。其次，我们的研究结果可能无法推广到其他种族群体。因此，在验证基于三个假设的MR研究结果时需要谨慎，这些假设应该在先前的生物学信息背景下仔细检查和解释。其次，MR是一种在观察性研究中估计危险因素因果效应的流行方法;然而，很难完全排除相关的未观察到的潜在混杂因素的影响。最后，在IVW模型中，我们发现BW与弱视之间存在显著的统计学关系。这需要进一步的研究来证实。

这是第一项专注于围产期因素的研究，这些因素在临床研究中难以从遗传学的角度收集。我们使用MR方法，它可以调查因果效应，并在很大程度上避免了其他观察性研究的问题¹⁵．此外，我们还建立了10E−06标准，从与BW相关的基因中包含了一个名为“未知”的新基因。由于GWAS弱视研究的不足，需要进一步强化未知基因的功能，生成相关的snp，在未来的研究中得到充分验证。

总之，我们发现欧洲人群的体重与弱视风险之间存在因果关系。遗传关联的结果可能为父母对弱视风险的影响提供了可能的证据，并建议临床需要仔细筛查低体重婴儿可能的弱视。

数据来源和研究人群

UKBB是一项前瞻性队列研究，从2006年到2010年，在全英国超过50万名年龄在40岁到69岁之间的个体¹⁶．收集了血液、尿液和唾液样本、身体测量数据以及个人对一份关于健康和生活方式的广泛问卷的回答。完整的数据发布包括一个成功的基因分型样本队列。研究人群和质量控制的细节已经在前面描述过¹⁷．这项研究得到了西北多中心研究伦理委员会和国家卫生和社会护理信息治理委员会的批准(11/NW/0382)。

围产期因素(体重、母亲吸烟和母乳喂养)和弱视的遗传关联是从UKBB泛祖先汇总统计(https://pan.ukbb.broadinstitute.org/， 2020年6月16日发布，2021年1月15日评估)，只包括欧洲血统的人¹⁶．对大约262,966名参与者进行了BW的GWAS。GWAS评估的产妇吸烟和母乳喂养的个体分别包括122,201例和267,893例，249,727例和92,087例对照。弱视GWAS在417,030名参与者中进行，其中862例患者和416,168例对照组。

孟德尔随机化分析的假设

我们按照STROBE-MR指南和MR执行指南进行MR分析。MR因果图包括遗传IVs、围产期因素(暴露)和弱视风险(结果，图4)。3.)。我们考虑了三个假设:(1)遗传静脉与围产期因素密切相关;(2)遗传静脉仅通过围产期因素与弱视风险相关;(3)遗传静脉与围产期因素和弱视风险之间存在关联，且不存在混淆。考虑到只有假设1是经验可验证的，仔细考虑假设2的潜在违反(由于连锁不平衡(LD)、通道化或水平多向性)是重要的，以减少偏差¹⁸．违背这些假设的SNP被称为无效IV，将其纳入MR分析可能会使结果产生偏差¹⁹．

接触和结果

利用IVs对具有全基因组意义的围产期因素(体重、母亲吸烟和母乳喂养)相关的snp进行了鉴定，并从UKBB提供的汇总统计数据(beta系数和标准误差)中获得了与弱视的遗传关联，并对性别、年龄和20个主成分进行了调整https://pan.ukbb.broadinstitute.org/downloads/index.html)。多效性是一个基因影响两个或两个以上看似不相关的表型性状的一种基因表达。这种能揭示多种表型表达的特定基因的位置被称为多效基因座。由于它可能同时影响多个性状，为了避免违反MR假设，我们根据表型映射和表达数量性状位点(eqtl)的结果排除了可能是多效位点的snp。我们还选择了与每种围产期因素密切相关的snp，以满足静脉注射的MR假设。为了坚持MR的假设，即遗传变异只通过风险因素影响结果，我们排除了所有可能与结果直接相关的snp。最后，考虑到下游效应，对未去除snp的数据也进行了估计。

数据协调

由于LD聚集，与每种围产期因素相关的snp被排除在外(R²在10000 kb的聚类距离内≥0.001)，等位基因频率呈中间回文。我们通过对齐所有参考等位基因与效应等位基因和效应等位基因频率的回文snp来协调数据。最后，建立了三个数据集:(1)snp -出生体重和snp -弱视的协调数据;(2)统一snp -孕妇吸烟、snp -弱视数据;(3) snp -产后母乳喂养与snp -弱视的数据协调。

统计和敏感性分析

因果估计的计算方法有几种，每种方法都有不同的假设，并提供了测试MR估计有效性的能力。使用snp -弱视风险因素与snp -每个围产期因素的beta系数比值估计主要因果影响，并使用固定效应/随机效应模型的IVW方法和简单的加权中位数回归方法对所有遗传iv进行组合^20.，21．

反方差加权(IVW)方法

这是一种将两个或多个随机变量集合起来以使加权平均值的方差最小化的方法。它是遗传变异的因果效应的加权平均值^20.．IVW是最优的，因为IVW估计量达到最小方差，等价于具有汇总数据的两阶段最小二乘法。当固定效应模型中至少有一个遗传变异无效时，它是有偏差的。假设存在无效静脉注射，对随机效应模型进行分析。

简单的中位数估计量

它计算了分别使用每个遗传变异评估的比率IV估计值的中位数，与MR-Egger方法相比，它对强离群因果估计值具有更强的稳健性。此外，当至少50%的遗传变异是有效的IV时，它提供了一个一致的因果效应估计。然而，与IVW和加权中位数方法相比，它是低效的。

加权中值估计

这种方法类似于简单的中位数法。当至少50%的权重来自有效的iv时，可以将因果效应计算为使用比率估计方差的倒数作为权重的加权比率估计的中位数²¹．与MR-Egger过程相比，它的优点是保持了估计的更高精度。该方法的效率与IVW方法相似。

功率分析和数据可用性

我们使用基于网络的计算器(https://shiny.cnsgenomics.com/mRnd/)，假设显著性水平α为0.05,r方为0.053。根据这些参数，计算统计功率。UKBB数据中关于BW、母乳喂养、母亲吸烟和弱视的全基因组关联研究的汇总统计数据可在网上公开:http://www.nealelab.is/uk-biobank．

道德的声明

本研究依赖于已公开的患者级UKBB表型和遗传数据的去鉴别总结级数据。UKBB数据的使用获得了韩国首尔国立大学机构审查委员会/伦理委员会的批准。