介绍

发展中国家在应对COVID-19大流行方面面临重大挑战。能否获得低成本的办法来评估感染的程度和发生情况，一直是流行病监测的一个主要限制。血清学检测用于测量以前的人群暴露，近似于人群免疫力，并为估计攻击率和致死率提供适当的分母1．

验证血清学测试是充分了解血清患病率的关键。地方性HuCoV和SARS-CoV之间的血清学交叉反应性已得到充分证明2，3.，4;因此，在当前的COVID-19大流行期间，必须考虑以前接触过HuCoV病毒导致的假阳性风险，以验证血清学分析5．除了交叉反应性外，其他因素如病毒抗原和抗体动力学、抗体类别和试剂质量也会影响基于血清学的检测的性能6，因此需要严格的验证和上下文化。

一般来说，当刺突蛋白与其细胞受体相互作用时，冠状病毒的感染就会开始。刺突蛋白是一种由n端S组成的I型病毒三聚体糖蛋白1亚基和一个c端S2亚基。年代1通过受体结合域(receptor Binding Domain, RBD)与细胞受体结合。RBD是宿主细胞趋向性的关键决定因素，也是抗体介导中和的主要靶点7．SARS-CoV与SARS-CoV-2 RBD具有结构保守性和交叉反应性8，9，但与其他HuCoV的RBD的保守性较差，这使得RBD成为开发血清学检测的良好抗原靶点。

另一种广泛使用的SARS-CoV-2既往感染的血清学标志物是针对核蛋白(N)的抗体，核蛋白是一种主要的非结构蛋白。抗N的抗体是非中和性的。许多研究描述了抗s和抗n IgG的不同动力学10，11，12，但这些差异对血清学调查解释的影响仍有待确定。

大多数COVID-19疫苗引发针对刺突蛋白的免疫反应，而SARS-CoV-2自然感染诱导针对几种病毒蛋白的一般免疫反应，这表明在人群水平上使用不同的血清学标记物可以提供疫苗接种工作的相关信息。我们报告了由Amanat等人描述的SARS-CoV-2抗s IgG ELISA的改编版本。13作为单步检测rbd IgG抗体的方法。我们对来自大流行前和确诊COVID-19病例的438份血清样本进行了评估，并将其与商用半自动抗核蛋白IgG抗体检测方法的诊断准确性进行了比较。此外，为了在开始全国疫苗接种之前确定这两种标记物的基线血清阳性率，我们在2020年8月至11月期间实施的全国COVID-19血清学调查的9068份血清样本中平行使用并比较了这两种方法。

结果

血清学试验验证

从391例RT-PCR确诊的COVID-19病例中采集438份血清样本进行分析，其中43例为成对样本，1例为急性期样本，1例为恢复期样本，2例为连续两次恢复期样本。对照组和COVID-19供体的社会人口学特征见补充图S1．

作为测量IgG抗rbd ELISA诊断准确性的初步方法，我们进行了接收机工作特性(ROC)曲线分析，根据症状发作后数周(PSO)，估计ROC曲线下面积(AUC)和95%置信区间作为诊断表现的指标(补充表)S1及补充图S2）.AUC从> 1周PSO (AUC = 0.94, 95% CI 0.92-0.97)到> 7周PSO (AUC = 0.97, 95% CI 0.95-1.0)没有显著增加。这些结果表明，抗rbd IgG ELISA的AUC严重依赖于PSO周，但从> 1周PSO可以获得高特异性和敏感性。

比较抗rbd IgG ELISA的AUC与anti-Nucleoprotein Elecsys®。虽然Elecsys®的AUC值略高，但在任何时间PSO类别中都没有发现统计学上的显著差异(补充表)S2及补充图S3）.两种方法的一致性很高。在所有样本中，无论时间PSO如何，与Cohen 's Kappa = 0.81 (P= < 0.001)(补充表S3)，这与几乎完全一致14．

很明显，两种方法的ROC曲线的模式是不同的，并提出了差异，特别是在更高的特异性和更早的PSO(补充图2)。S3）.在1.0-0.9的特异性区间计算两种方法的部分AUC (pac)15(补充表S4）.正如ROC曲线模式的差异所示，Elecsys®在早期PSO中的pac较大，表明在敏感性方面，Elecsys®系统在早期PSO中的表现略好于RBD ELISA。

最后，我们确定抗rbd IgG ELISA的吸光度截止值。到目前的工作进行时，我们估计全国血清阳性率为25%，这表明需要一种高度特异性的方法来获得最佳的阳性预测值16．因此，我们将吸光度截止值定义为达到≥0.99特异性的最低值。在吸光度为0.4时，我们获得了最佳灵敏度，且特异性不低于0.99。与ROC分析一致，灵敏度、阴性预测值(NPV)和阴性诊断似然比(NDLR)受时间PSO的影响很大(补充图2)。S4A-C)直到b> 3周PSO(表1）.

表1在PSO≥3周时，Elecsys®和IgG RBD ELISA的诊断性能比较。
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在特异性方面，两种方法的特异性相同(0.995)，199份大流行前样本中只有1份假阳性(不同样本)。结果，阳性预测值(PPV)和阳性诊断似然比(PDLR)也是最佳的，并且在很大程度上不受时间PSO的影响(表2)1及补充图S4D-F）.

IgG抗n和抗rbd在全国健康和营养调查中的比较结果

全国抗rbd血清阳性率为23.6% (CI 95% 21.5, 25.6)，略低于抗n IgG血清阳性率(1.3%)16．两种标志物的全国血清阳性率为19.7% (CI 95%， 18.3, 21.3)2）.抗n单阳性血清阳性率为3.72% (CI 95% 3.1, 4.34)，抗rbd单阳性血清阳性率为1.98% (CI 95% 1.58, 2.38)。其中双阳性占77.7%，抗n IgG单阳性占14.1%，抗rbd IgG单阳性占8.1%。

表2根据社会人口学特征，msamicxico人群抗SARS-CoV-2 IgG血清阳性率(%)。
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我们根据社会人口学特征分析了基于两种或单一标记物阳性的血清阳性率(表1)3.）.双阳性的患病率在不同年龄和性别群体中相似。从地区来看，只有墨西哥城似乎具有更高的双阳性患病率(90.4%，95%CI 85.9, 93.6)，而其他地区的范围从中北部的69.7% (95% CI 60.8, 77.4%)到尤卡坦半岛的82.4% (95% CI 77.3, 86.5%)。40-49岁年龄组的单抗- n阳性率为9.8% (95% CI 6.9, 13.8%)至20-29岁年龄组的18.5% (95% CI 13.7, 24.5%);男性为17.0% (95% CI 14.2, 30.1%)，女性为12.3% (95% CI 9.8, 15.2%);从各地区来看，墨西哥城的患病率最低(4.2%，95% CI 2.3, 7.4%)，中北部最高(19.6%，95% CI 14.5, 26.0%)。仅抗rbd阳性的患病率从60岁及以上年龄组的6.2% (95% CI 3.8, 10.0%)到10-19岁年龄组的10.5% (95% CI 6.5, 16.6%);男女患病率相同(7.8%);在各地区中，中太平洋地区的患病率最高(12.3%，95%可信区间6.9,20.9%)，半岛地区最低(3.4%，95%可信区间2.1,5.5%)。

表3按年龄、性别、地区、症状分双阳性(抗n和抗rbd)、仅抗n阳性、仅抗rbd阳性分布。Ensanut-Covid19, 2020，墨西哥。
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为了确定与单阳性和双阳性相关的社会人口因素，我们进行了多项逻辑回归(表1)4）.与男性相比，女性的相对概率是双阳性的0.66倍。pvalue = 0.01)。与墨西哥城相比，所有地区对anti-N阳性的相对概率高于双阳性，而North-Border、Central-Pacific和Central-North对anti-RBD阳性的相对概率高于双阳性。根据自我报告的症状后发病时间，两种单一标记物的血清阳性均无显著差异。

表4与双正(反n和反s)相比，对反n只正、对反s只正的多项式逻辑模型。Ensanut-Covid19, 2020，墨西哥。
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讨论

血清监测是研究流行病动态和为公共卫生干预提供信息的一种非常有价值的方法。因此，所采用的血清学方法的选择决定了检索数据的质量。为了验证一种有效的全国血清监测方法，我们分析了Krammer实验室共享的内部单步适应SARS-CoV-2 RBD IgG ELISA的诊断准确性13，17．

在一组大流行前对照和rt - pcr确诊的COVID-19病例中进行验证后，我们进一步将该方法与用于在全国血清调查中测定抗- n IgG的商业系统的性能进行比较。我们的研究结果表明，两种方法的血清监测性能没有显著差异，尽管发现敏感性略有差异，主要与我们的内部方法在症状发作后早期的敏感性较低有关。对这种差异的合理解释是，Elecsys®是一种分析灵敏度更高的电化学发光免疫分析法(ECLIA)，可以检测到比标准ELISA更低数量的抗原结合IgG。因此，抗rbd酶联免疫吸附试验可以遗漏最近感染的个体，或几个月前感染的个体，当抗rbd反应减弱且抗体量低于检测限时。与我们的结果一致，ECLIA对检测疟疾抗原的血清转化更敏感，线性范围更广18．

内部SARS-CoV-2 RBD IgG ELISA方法对于墨西哥等中等收入国家具有若干优势。首先，它可以使用血清学实验室通常提供的标准设备来实施。其次，试剂成本低，比专有试剂盒更容易生产和/或购买，从而减轻了监测的经济负担。在整个血清调查中，我们使用了~ 1mg重组RBD。最后，可以进行调整以提高效率并减少浪费。在我们的案例中，我们通过避免使用重组稳定S蛋白的第二个验证性ELISA进一步简化了原始方法，这代表了成本和时间的降低。有了这些变化，在引入COVID-19疫苗接种之前，对这两种检测方法进行了验证研究，以评估其诊断性能，并在墨西哥的具体情况下进行评估。墨西哥已经存在地方性冠状病毒，并且经常在流感季节发现;此外，墨西哥是登革热、寨卡病毒和疟疾等病媒传播疾病的流行地。冠状病毒和疟疾与SARS-CoV-2表现出一定程度的交叉反应性，并可能影响内部方法的特异性19，20.，21;因此，需要一个特定于上下文的验证。考虑到我们对特异性的关注，我们从该国所有地区收集了大量对照样本，使用历史血液样本，以便广泛代表先前的病毒暴露情况。我们改编的RBD IgG ELISA的诊断准确性与以色列Indenbaum等人先前描述的相当，他们对Krammer实验室共享的相同方法进行了改编，并且没有显示包含IgA或IgM类检测的敏感性增加22．

据制造商报告，Elecsys®系统的总特异性为0.998 (95%CI 0.996-0.999)。23．在墨西哥原产样品的内部验证中，两种方法都显示出极好的特异性(0.995,95% CI 0.985-1.0)，确保在低流行环境(即大流行早期阶段，农村地区等)具有高PPV。观察到的高特异性表明，墨西哥的交叉反应性较低，增加了我们对评估的信心，然而，在墨西哥太平洋沿岸、中美洲和南美洲疟疾流行疫源地的SARS-CoV-2血清监测应仔细解释。

除了每种方法的诊断准确性外，有证据表明，两种测试提供的定性信息不同。抗rbd IgG滴度与SARS-CoV-2中和的相关性优于抗n滴度10，11，24，抗s抗体的衰变速度似乎比抗n IgG慢12，25，26．有趣的是，儿童通常没有症状，通常比成年人受影响更小27抗s - IgG抗体反应比抗n - IgG抗体反应更强28提示基于n的IgG免疫测定法在儿童中的敏感性可能较低。此外，无症状和轻度COVID-19成人对SARS-CoV-2的抗体反应较弱10，29，30.，31．这项工作中使用的验证方法的一个局限性是，小组中包括的所有COVID-19样本仅来自有症状的成年人，可能低估了大规模血清监测中无症状成人和儿童感染产生的假阴性。

尽管两种方法在抗体动力学、年龄差异和分析敏感性差异方面存在差异，但在全国范围内的调查中获得的血清阳性率估计结果非常相似。然而，单标记物血清阳性在流行病学规模上的影响是不可忽视的。对于未接种疫苗的个体自然感染导致的单一阳性，我们可以想到两种广泛的解释:

(1)真单阳性，意味着由于某种生物学原因，某些个体只服务于一种标记物。如前所述，在儿童中主要的血清转化为S而不是N，可能是因为较少的病毒复制有利于对结构抗原(如Spike)的免疫反应，而不是对非结构蛋白(如(N))的免疫反应。28．虽然经过测试，我们没有发现单S阳性与年龄之间的任何关联。样本量的问题(1405例9岁以下儿童中有14例单S阳性)可以解释缺乏相关性。

(2)假单阳性:个体血清转化为两种标记，但在采样时，只有一种标记为阳性。在这种情况下，不同的动力学，测试灵敏度或两者都可以解释这种情况。在长达8个月的纵向队列中，在第一波大流行期间评估的抗n和抗s的不同动力学得到了充分的记录，表明抗n抗体比抗s抗体衰减得更快12，这至少可以解释一些单抗s阳性的情况。然而，我们的回归模型未能揭示单一阳性与感染后自我报告的月数之间的任何关联。

至于测试灵敏度，在我们的测试验证中，我们描述了抗s在早期PSO中的敏感性略低于抗n(无统计学意义)。然而，在高特异性值下计算部分AUC时，部分AUC存在显著差异(补充表)S2）.因此，内部抗s检测可能在感染早期缺失真阳性，导致抗n单阳性。不出所料，我们的回归模型也未能揭示抗n单阳性与感染后数月之间的任何关联，因为血清转化是以天/周而不是月为单位测量的。妇女对流感疫苗有独特的定性和定量抗体反应32．观察到的女性抗rbd IgG单阳性的差异是有趣的，可能是免疫反应性别二态性的结果。此外，需要注意的是，血清学标志物单阳性的差异也可能是调查采样时间和感染时间的差异造成的，这根据每个地区在调查时所处的流行波阶段而有所不同。

除了验证抗n和抗s IgG的诊断准确性外，这项工作还提供了基于自然感染的血清反应性的有用基线。随着COVID-19疫苗接种覆盖率的增加和新型SARS-CoV-2变体的选择，血清阳性率估计将不得不考虑到大多数疫苗仅引发抗刺突抗体。因此，联合使用抗n和抗s血清学标记可能是区分自然感染和疫苗诱导的血清转化的唯一方法。

总之，内部单步抗rbd IgG ELISA是一种简单、经济、可靠的检测方法，具有最佳的灵敏度和特异性，在人群血清阳性率调查中具有与抗n Elecsys®商业系统相当的诊断性能。随着全球疫苗接种覆盖率的增加，在公共卫生决策中，结合这两种血清学标志物可能比单独使用一种检测更能提供信息。

方法

COVID-19病例和对照血清抗rbd和N IgG检测验证

在2020年4月至8月期间，我们前瞻性地招募了18岁及以上的参与者，他们的临床表现与COVID-19相符，并在墨西哥城大都市区预选的墨西哥社会保障研究所(IMSS)诊所住院。参与者提供书面知情同意书。所有方法均按照墨西哥社会安全研究所(IMSS)研究伦理委员会指南(R-2020-785-065)批准并执行。对于那些同意参加这项研究的人，一旦得到RT-PCR的确认，就立即采集了血清样本。3周后，如有可能，再次抽取血清样本。为了验证，只分析了RT-PCR +样本，与病毒载量无关。排除无症状个体或不记得症状发作日期的个体。抽血后离心，血清- 80℃保存。作为非covid -19样本(对照组)，我们使用了2018年全国卫生调查(ENSANUT 2018)期间获得的199份保存在- 80°C的血清样本，当时没有SARS-CoV-2的传播。根据样本的地理来源，对照样本具有全国代表性，而COVID-19样本来自墨西哥城大都市区(MCMA)。S1A）.病例和对照组之间的年龄和性别分布具有可比性(p值= 0.08)。S1B-C)，尽管在大流行前的控制中有意丰富了儿童样本，以解决与季节性人类冠状病毒感染的潜在抗体交叉反应，这在年轻人群中很常见33．

抗rbd IgG ELISA试剂盒

将SARS-CoV-2方案的第一步(抗rbd筛选)作为单步内部方案的参考13，由于试剂和材料的可用性，只进行了轻微的修改。编码SARS-CoV-2 RBD的质粒由西奈山医学中心的Florian Krammer博士提供，在CHO细胞中稳定转染并冷冻保存。对于大规模生产(50 L)， CHO细胞在37°C, 5% CO条件下连续培养4天2在1000 mL摇瓶(200 mL培养量)中130 rpm搅拌，然后在5 L New Brunswick生物反应器中播种3天，在类似条件下，溶解氧张力控制在饱和度的30%以下。最后，将3.7 L进一步转移到200 L的Biostat CultiBag生物反应器中，再培养一周。采用Cogent M1超滤系统，膜截留10 kDa，对50 L上清进行深度澄清，浓缩至4 L。浓缩上清在AKTA一级色谱仪上用Ni柱亲和纯化，再用Millipak 20过滤器进行透析和无菌过滤。经SDS-PAGE测定，最终RBD纯度在80%以上。

将RBD免疫吸附于高结合96孔ELISA平底板(康宁CLS9018)上，浓度为2 μg/mL, PBS在4°C下过夜，PBS- tween 20中手动洗涤，然后在4°C下PBS-5%牛奶(Difco)中阻断2小时。洗净后，经1:50稀释的血清样品在室温下孵育2小时。洗涤后，用1:5 000稀释的酶标山羊抗人IgG (Sigma)在RT下孵育1小时，用磷酸/柠檬酸缓冲液冲洗和显影。吸光度在ELISA板阅读器(Biotek ELx808)上用450 nm滤光片读取。背景吸光度为16个空白孔的平均吸光度，减去每个样品孔的吸光度。

抗n IgG电化学发光免疫分析法

根据制造商的说明，使用Elecsys®Anti-SARS-CoV-2电化学发光免疫分析法(ECLIA)(罗氏诊断公司)，使用Cobas e 411分析仪检测抗核蛋白IgG。

诊断性能的统计分析

抗原特异性类转换抗体的分泌和血清转化高度依赖于抗原暴露到功能性生发中心发育的时间25．为了考虑暴露时间，我们根据周PSO对COVID-19病例进行分类(补充图2)。S1及补充表S2)，并通过估计诊断性能的不同参数(如ROC曲线的AUC和使用R包的部分AUC)来评估诊断准确性pROC34．为了统计比较AUC和部分AUC，我们使用DeLong35和Bootstrap方法36,分别。ROC分析使我们能够根据≥0.99的预期特异性定义抗rbd ELISA的光密度(od)截止值。

为了评估不同周PSO的敏感性、特异性、预测值和诊断似然比，并比较抗rbd ELISA与Elecsys®抗核蛋白ECLIA的性能，我们使用了统计R包DTComPair37．采用McNemar试验分析不同方法的敏感性和特异性差异38．用广义评分统计来评估预测值的差异39．诊断似然比采用DLR回归模型评估40．使用Cohen 's Kappa统计量估计两种方法之间的一致性41和麦克斯韦RE系数42使用R包irr43．

全国血清学调查

全国健康和营养调查(ENSANUT 2020- covid -19)是一项全国性概率性家庭调查，基于对参与家庭的多阶段分层抽样，于2020年8月至11月实施。包括10216份完整的家庭访谈和9464份生化标志物和COVID-19血清学血清样本44．参与者提供了经国家公共卫生研究所(CI 1679)研究伦理委员会批准的书面知情同意，所有方法均根据《赫尔辛基宣言》和相应的机构指南执行。所有血清样本均独立于验证样本集，使用Elecsys®Anti-SARS-CoV-2 electro- (ECLIA)处理，而使用抗rbd IgG ELISA处理9068份血清样本。

抗n和抗rbd血清阳性率的统计分析

我们以95%置信区间计算了总体和社会人口学特征中仅抗rbd、仅抗n和同时抗rbd和抗n的患病率。通过每个验证试验的敏感性和特异性来调整患病率45．我们将血清阳性个体分为双阳性(抗n和抗rbd)、仅抗n阳性和仅抗rbd阳性。我们按年龄、性别、地区和症状计算分布，置信区间为95%。然后，我们使用包括年龄、性别和地区在内的多项逻辑回归，将三组作为结果。我们报告了指数系数的相对概率，只有反n和反rbd，使用双正作为参考组。我们使用调查说明调查设计的命令。在Stata v14 (StataCorp)中进行分析。