脑转移小细胞肺癌(SCLC)中中枢lncrna和mrna的硅质比较转录组分析

肺癌(LC)是全球癌症相关死亡的主要原因。2020年，近221万患者被诊断为肺癌，估计180万人的死亡与肺癌有关(https://gco.iarc.fr）¹．在小细胞肺癌(SCLC)患者中，脑转移是最遥远的转移部位，在最初诊断两年后存活的患者中，脑转移(BM)增加到50%²；因此，5年的总生存率为1-5%^3.．肺癌的早期诊断是至关重要的，因为手术在晚期是无效的，特别是对有转移的患者。SCLC是一种侵袭性LC，早期发展为广泛转移;这导致SCLC患者预后极低⁴．SCLC与吸烟高度相关，只有2%被诊断为SCLC亚型的患者一生中从未吸烟⁵．Rb1而且Trp53是SCLC最大的基因失活力;然而，最有效的基因组改变尚不清楚^6，7．大约20%的癌症患者发生脑转移，大多数病例发生在肺、乳腺、结肠恶性肿瘤、黑色素瘤或肾细胞癌患者中^{8，9，10，11}．在超过25%的SCLC患者中发现脑转移(BMs)，在全治疗后平均生存期为9个月。

然而，随着影像学方法和全身药物的进步，脑转移的发病率随着患者寿命的延长而逐年增加。在晚期癌症个体中，脑转移的存在继续显著促进癌症总死亡率¹²．虽然更早期的疾病阶段转移是一个伟大的结果，但改变疾病的早期阶段是一个重要的结果;筛查有效性的主要指标是死亡率的降低¹³．现在很清楚，人类基因组的大部分是非编码的。长链非编码RNA (lncRNA)是包含200或更多核苷酸的转录组的通用术语。大约十年前，研究人员发现lncrna在癌症生物学中发挥着重要作用^{14，15，16，17}．lncRNA异常是不同癌症类型中最关键的证据。

例如，lncRNAHOXB-AS3可加剧肺癌的迁移、增殖和侵袭。这些变化背后的机制是通过激活PI3K‐AKT通路。PI3K/Akt/mTOR通路影响肿瘤发生和癌症进展^{18，19，20.}．这一突破帮助我们提出了一种潜在的癌症预测生物标志物。本研究旨在检测SCLC脑转移瘤患者与SCLC无脑转移瘤患者差异表达的基因(mrna和lncRNAs)。我们还进行了富集分析，以发现我们两组癌症患者的特定mrna和lncrna之间的相关性。然而，将基因作为生物标记需要深入、长期、精确和全面的研究。

数据采集与分析

通过基因表达Omnibus (GEO)下载SCLC患者外周血单个核细胞的lncRNA和mRNA芯片阵列数据。²¹．数据设计为脑转移瘤(BM)患者与非脑转移瘤患者比较LC样本中与脑转移瘤相关的lncrna²(加入:GSE161968，平台:GPL20115)。

所有6个重复的样品都用于多次分析。R (v3.5.1)．所有的脚本和算法都上传到GitHub的web服务器上。

在用样本和探针id构建了一个整齐的基因表达矩阵数据集后，我们通过箱线图和热图分析了平均表达量和可能的相关性，以确保非正态化和防止错误的相关性。然后，通过在每个基因的平均表达量上缩放表达矩阵，样本之间的差异表达基因(DEGs)在MA图中出现。并对数据集的样本进行了主成分分析。通过忽略来自BM组和非BM组的6个样本来修剪聚类。随后，我们操作k -均值算法重新聚类我们的数据集，以进行强验证。Limma套餐(v3.52.2)用于计算log2foldchange (LogFC)参数阈值，以获得最多的表达数据²²．因此，我们将LogFC≥1.75和LogFC≤-1.75分别作为上调和下调基因应用于我们的DEG结果。带有a的基因P-值≤0.05为显著性。我们考虑log2foldchange的1.75作为我们的截止值，因为超出这个范围的数字将给我们不合适的候选数。或者，在BM中表达高于非BM样本的基因被分类为上调和下调。本文提供了我们研究方法的工作流程(图。1)．

富集分析

了解各种基因或蛋白质的潜在生物学作用最好通过基因集富集来完成。通过富集分析，增强了生物学见解的可解释性，降低了分子数据的复杂性²³．基因集富集分析(gea)的基本思想是探索在给定的基因列表中与对照基因集相比显著过度代表的基因组。这些基因集通常(但不总是)由在一个公认的生物途径中协作的基因组成²⁴．Enrichr (https://maayanlab.cloud/Enrichr/)，这是一个策划基因集的综合资源和由Maayan Megalab提供的搜索引擎²⁵，并从各种数据库中提取结果进行富集分析。在导出我们的基因数据集的结果后P-value设置为≤0.05。

CBioPortal (https://www.cbioportal.org/)是一个提供可视化、分析和大规模癌症基因组数据集的数据库²⁶．它是一种交互式检查多维癌症基因组数据集的工具，最早是在纪念斯隆-凯特琳癌症中心创建的²⁷．该数据库用于寻找候选基因中的突变;然后，选择所有小细胞肺癌数据集，包括小细胞肺癌CLCGP (Nat Genet 2012)、约翰霍普金斯大学(Nat Genet 2012)、科隆大学(Nature 2015)和Multi-Institute (cancer cell 2017)。发现了这些基因的丰富度和突变类型。

基因与蛋白质网络分析

GeneMANIA (http://genemania.org/)插件在Cytoscape (https://cytoscape.org/)版本3.9.1用于显示候选上调和下调基因之间的关系。GeneMANIA是一个用户友好的在线服务，它允许生成基因功能假设，分析基因列表，并为功能实验确定基因的优先级。GeneMANIA将根据重建查询列表的预测值自动对数据源进行加权，前提是该列表足够大(目前是五个或更多基因)。例如，GeneMANIA会对蛋白质域相似性网络进行重估，并在提供具有相似蛋白质域结构的查询基因时推荐更多具有相似域结构的基因。GeneMANIA经常根据作为蛋白质复合体一部分的查询基因发现蛋白质复合体的新成员，并高度重视实际或预期的物理相互作用²⁸．Cytoscape是一个免费的开源软件项目，它将生物分子相互作用网络、高通量表达数据和其他分子状态结合到一个内聚的概念框架中。

蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)也通过String蛋白质数据库插件(https://string-db.org/)用Cytoscape表示这些基因的蛋白质网络。STRING数据库试图结合所有已知和预期的蛋白质-蛋白质相互作用，包括物理和功能的相互作用²⁹．在过去的19年里，STRING数据库一直在稳步扩展，目前的版本包括了大约2000个物种的蛋白质相互作用数据;尽管如此，所有的互动都是严格意义上的物种内部互动。在本研究中，我们首次将跨物种相互作用纳入STRING数据库。STRING报道PPIs是蛋白质之间的功能连接。这些联系并不限于物理上的相互作用;它们可能涉及转录因子结合等相互作用，或者代表连接蛋白在相同的生物途径中发现^30.．

黑豹(透过进化关系分析蛋白质)(http://www.pantherdb.org/)分类系统对候选蛋白编码基因进行分类。PANTHER是一个蛋白质编码基因(通常被称为蛋白质)之间进化和功能关系的综合知识库，是利用分类分析大规模基因组数据的工具。进化分组(蛋白质类、蛋白质族、亚族)和功能分组是用于对蛋白质进行分类的主要类别(基因本体论和途径)。³¹．得到了蛋白质种类及其所占的百分比。

生存分析

我们使用Kaplan-Meier绘图仪数据库(https://kmplot.com/analysis/)对枢纽基因进行生存分析。这是一个基于网络的工具，通过结合来自癌症生物医学信息网格(caBIG)、GEO和TCGA存储库的不同数据集，允许合并生存分析³²．截至2022年4月24日，该数据库提供了1925例肺癌患者的整体生存分析数据。我们分别输入枢纽基因，然后考虑p-值阈值0.05表示有意义的结果。虽然KM-Plotter有很多过滤器，可以将研究聚焦于特定的标准，如分期、性别、年龄、手术成功、组织学、化疗和放疗，但我们对默认限制进行了分析，使我们的结果更加全面和普遍。

在DEGs评估之后，我们需要了解这些基因组失调会影响的分子机制，以及干扰是如何影响它们的。SCLC -BM和非BM患者中的DEGs与转录因子、非编码rna、突变和信号通路有关。为了了解我们基因数据集中的表达模式，我们在BM和非BM患者中候选了30个上调基因和31个下调基因，包括mrna和lncrna(表2)1)．我们的候选基因与转录因子、miRNAs、组蛋白修饰、信号通路、细胞类型和组织的关系和重叠，以及从每个组的特定数据库中获得的前10个相关疾病。(见表S2、S3、S4、S7、S8和S9)。此外，BM中表达上调(16个蛋白编码基因)和下调(14个蛋白编码基因)的蛋白类别不同，如图所示。6．表S5和表S6显示了up和down基因的每个基因及其类蛋白。

非编码rna可能与SCLC的脑转移直接相关

富集分析显示，我们的候选基因参与基本的细胞信号通路。有些基因非常重要，我们会在讨论部分提到，比如IL5RA，EGR3,ALOX15作为上调表达的基因，和OCLN，MAOB，CTSB,MPO为BM SCLC中表达较低的基因。在上调基因类别中，我们发现LOC100507481和XLOC_l2_000941作为lncRNAs;WHAMMP2，为一个假基因编码5246个核苷酸转录本长度;ADGRE4P，也有一个假基因编码2732个核苷酸的转录本长度;TTC39B是一种蛋白质编码但编码非编码RNA，其核苷酸转录本长度为7023;ZNF827另一种编码3675个核苷酸的蛋白质HSD17B3编码3559核苷酸转录本长度的蛋白质编码基因。对于下调基因，我们发现XLOC_l2_007062和LOC729870为lncRNA;ZIM2是一种蛋白质编码基因，编码四种非编码RNA，长度约为2300个核苷酸转录本;与此类似，ABCA13也是一种蛋白质编码基因，编码5种非编码RNA，长度约15,000个核苷酸转录本;ZNF608编码非编码RNA约6000个核苷酸，ANXA3编码1056个核苷酸转录本和RIOK3大约3500个核苷酸，也是蛋白质编码基因。我们的最终目标是证明SCLC患者中与BM相关的lncrna。为了评估我们的目标lncRNAs，我们使用了lncHUB、基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)途径富集分析，并基于P值(p< 0.05)^33，34，35．由于我们的微阵列数据是针对lncRNA和mrna进行的，所以我们利用多个数据库发现了相关的lncRNA和mrna，从而对相对密切的肺癌脑转移的通路和生物系统进行了全面的研究。

基因本体论及其途径研究

为了研究候选基因在细胞中的功能，必须揭示它们的信号通路，以发现它们在癌症中的作用;KEGG数据库是实现这一目标所必需的。KEGG(2021)途径富集分析显示有3个显著基因;ALOX15，PIGC,PIGW与亚油酸代谢途径和糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚生物合成相关。(表S1显示了KEGG分析的结果)。基因本体论(GO)富集分析通常用于为基因集分配功能，并深入了解它们所参与的生物过程³¹．GO是基因功能控制词汇的集合，被安排为三个本体论:生物过程、细胞成分和分子功能。由于社区倡议，许多基因组已经被注释上了氧化石墨烯关键字，允许对多个基因集进行氧化石墨烯富集分析。例如，一项富集研究确定了在特定的人类基因集合中过度代表的氧化石墨烯关键字，从而允许进行生物学解释。

另一方面，KEGG通路定位提供了更多关于基因或基因产物在通路中如何相互作用的信息，尽管基因的覆盖范围不如GO广泛。从DEGs结果中对候选基因进行GO(2021)富集分析。最受欢迎的五个GO术语P-Value和Combined Scores如表S1所示。此外，在我们的deg上所有GO数据库的结果中，上调和下调基因的前10个分子功能和生物过程项都是由于图中每个项的丰富因子。2．我们使用ggplot2 (v3.3.6)，将重要的生物过程可视化³⁶．

通路，细胞类型和组织分析

表S2和S3简要解释了受这些候选基因影响的途径;SLC14A1，SLC2A5, MAOB，板条箱，ANXA3下来的基因;Pigc, pigw, lpar3, il5ra, hsd17b3, egr3Up基因，涉及不同的基本途径。我们的研究重点是脑转移;因此在表S4中，脑转移瘤患者中与上调和下调基因相关的关键细胞类型和组织显示为TMEM176B，ALOX15，TMEM176A起来,SLC14A1，OSBP2 XK，KRT1Down基因很重要。最后，为了综合分析，表S9列出了与脑转移基因SCLC和无脑转移基因SCLC相关的其他一些疾病LPAR3，TTC39B，TMEM176B，IL5RA表达的基因和ZNF608，DACH2，ZIM2向下表达，是相关的。

PIGW，一个关键的lncRNA

在分析候选人的基因后，我们进行监测IGIP；PCDHGA9，TMEM176B；TMEM176A是向上表达的OCLN；CRB1；PNMA2，ITLN1,ANXA3是表达下降的基因(见表1)与显著的lncrna相关。例如,PIGW与LINC01386共表达关系，可能在肺癌脑转移过程中起重要的分子机制作用。为了调查与候选基因相关的关键lncrna，我们使用了富集分析工具，该工具假设了一个常数p-与输入基因及其数据集相关的值。lncRNA共表达分析在lncHUB数据库中对上调和下调基因进行p-值分别为0.00983(上调基因)和0.010472(下调基因)2）³⁷．

基因网络与PPI分析

对上调和下调基因进行基因网络分析，共表达和共定位，如图所示。3.．

我们使用Cytoscape(版本:3.9.1)中的STRING插件进行蛋白质-蛋白质相互作用，根据我们的DEGs结果在上调和下调的基因之间构建一个网络^38，39．为了得到完整的结果，我们将我们的deg过滤为|log2FC|> 1。因此，得到的图显示了169个节点和300条边。此外，节点的颜色用log2fold变化表示。利用CentiScaPe插件，每个节点的度数大于15的都被认为是枢纽基因，两个基因(猫: 24应用程序: 16)⁴⁰(无花果。4)．我们成功地研究了我们的中心基因生存分析(图。5)．

我们发现20%的BM患者在249个样本中的47个个体中有28个上调基因突变。图S1描述了这一点。MYOM2包含最多的修改(6%)。该基因在I-set:免疫球蛋白I-set结构域和Ig_2:免疫球蛋白结构域有突变。

在77个病例中，32%的被调查者在27个下调基因中有突变。进一步的分析表明MPO在SCLC患者样本中具有最显著的突变(2.5%)，如图S2所示。

猫而且ACC肺癌患者的存活是否与重要基因有关

正如我们之前提到的，猫而且ACC被认为是枢纽基因。初步的KP-Plotter分析表明，由于有顶值，结果是有意义的。总体生存图如图所示。5．猫而且ACC的风险比(HR)分别为0.6和0.81。HR < 1意味着基因上调驱动LC患者的高生存几率。我们的中枢基因在产生这两个潜在生物标记基因的脑转移SCLC患者中有负对数倍的变化。幸运的是，deg和kp - plot之间存在有意义的关系，验证了我们的预测。枢纽基因猫(hr = 0.6，P-value = 2.6e−15,log2FC =−1.3802)和应用程序(hr = 0.81，P-value = 0.0012, log2FC =−1.1716)与肺癌患者不良的总生存期显著相关。

我们候选蛋白的编码基因参与构建代谢互转换酶、跨膜信号受体、细胞粘附分子、蛋白质修饰酶和基因特异性转录调控因子，如图所示。6．了解这类蛋白质可以帮助我们探索BM和非BM肺癌患者之间的差异。

许多lncrna表现为基因印迹、修饰和调控等表观遗传变化。除了lncRNA，还有另一种非编码RNA，与癌症生物学相关的信息少得多。小非编码RNA (snoRNA)有60 ~ 300个核苷酸。最近的研究表明肺癌肿瘤的迁移和进展主要通过lncrna调控的EMT和MMPs。此外，免疫系统具有细胞毒性的CD8 + T细胞，可以限制癌症中肿瘤细胞的生长。此外，过表达促进肿瘤的lncrna可以管理LC细胞的免疫逃避⁴¹．然而，本文将专注于癌症相关的lncrna和mRNAs。

在DEGs结果中，XLOC_l2_000941第三个lncRNA基因上调，log FC = 2.68(表2)1)，根据孙鹏然等的研究，与MYC转录因子(TF)有关⁴²．MYC，又称c-myc，是一种多功能TF，在细胞周期进展、凋亡和细胞转化中起着重要作用⁴³．原癌基因在卵巢子宫内膜异位症囊肿基质细胞中表达也上调，其表达可被miR-196b抑制⁴⁴．乳腺癌患者中c- myc调控基因的表达与较高的脑转移风险相关⁴⁵．本文研究了XLOC_l2_000941在BM SCLC个体中的不同表达。

MYOM2在错义突变率最高的BM患者中，Log FC = 2.60是第四个高表达基因，是一个蛋白质编码基因，通常在合成肌氨酸相关蛋白纤维连接蛋白III型和免疫球蛋白C2结构域中起作用⁴⁶．纤维连接蛋白是一种影响转移的细胞粘附蛋白⁴⁷．MYOM2可能与肿瘤坏死因子(TNF)阻滞剂的药理学有关⁴⁸它是一种多功能细胞因子，在多种细胞事件中起关键作用，如细胞生存、增殖、分化和死亡改变了癌症的转移⁴⁹．如表所示2，MYOM2与LINC01511和LINC00448 lncrna相关。LINC01511在三阴性乳腺癌中表达上调，可能在肺腺癌EGFR外显子19缺失机制中起基础性作用⁵⁰．

WHAMMP2(WAS蛋白同源物与肌动蛋白、高尔基膜和微管假基因2相关)是表S4中提到的脑转移患者中BM SCLC中高表达的假基因，类似于胸腺中的胸腺细胞。

TMEM176B而且TMEM176A与不同的lncrna有广泛的相关性，如表2．其中一些lncrna与癌症有关;例如,LINC00501通过介导miR-129-5p/HMGB1在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中抑制肺癌的发展和转移，并上调表达⁵¹．相反，LBX2-AS1在NSCLC中通过Notch信号促进细胞增殖和转移⁵²．此外，我们发现这两个基因有物理相互作用、共表达关系和共享的蛋白质结构域，如图所示。3.B.跨膜蛋白(TMEMs)是至少具有一种跨膜结构的膜蛋白;它们也被称为整体膜蛋白。TMEM176在不同的恶性肿瘤中发挥不同的作用。一系列的膜蛋白功能与恶性肿瘤的增殖、侵袭和转移密切相关^53，54．在人肝细胞癌中，表观遗传沉默TMEM176A促进ERK信号⁵⁵．

同样，高表达TMEM16A在胃肠道间质肿瘤中起作用⁵⁶．TMEM176A在胶质母细胞瘤中可以抑制Bcl2表达和引起细胞凋亡^57，58．增加TMEM176B蛋白质水平已发现在各种肿瘤，抑制TMEM176B增加CD8 + T细胞介导的肿瘤生长控制，提高癌症治疗效果⁵⁹．TMEM176B通过离子机制抑制三磷酸腺苷(ATP)和奈格菌素诱导的树突状细胞和巨噬细胞NLRP3炎症小体激活。针对TMEM176B可以强调抗肿瘤CD8⁺T细胞在直接杀死恶性细胞的同时，以炎症体依赖的方式作出反应^60，61．

磷脂酰肌醇聚糖锚生物合成C类和W类(PIGC而且PIGW)，是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚生物合成途径中的关键基因，编码一个内质网(ER)相关蛋白，对糖基磷脂酰肌醇(GPI)的生物合成非常重要。⁶²．这一过程发生在内质网中，是糖基磷脂酰肌醇(GPI)生物合成的一个步骤，将许多细胞表面蛋白质锚定在细胞膜上。的缺陷PIGW导致年龄依赖性癫痫性脑病West综合征和一种表现为低磷酸盐和认知障碍的综合征的基因(HPMRS5)⁶³．PIGC与肝癌(HCC)等癌细胞的转移酶活性相关⁶²．由于细胞粘附在转移过程中会发生改变，提示在SCLC脑转移过程中，GPI结合改变是由于高表达PIGC而且PIGW．

我们指出ABCA13，一种atp结合盒(ABC)转运蛋白，在肺癌患者中突变最多(9%)，如图S2所示，提示该基因的改变可以影响肺癌状态。

AMFR是一种编码泛素蛋白连接酶的基因。它还与lncrna相关，包括FGF10-AS1, LINC02115和LINC01716(表5)2)．gp78/AMFR在人类癌症中的过表达与肿瘤的低生存率和高分期有关^64，65．因此，它可以将AMFR在非BM SCLC中的狭窄表达归因于这种类型的癌症转移的生物标志物，尽管BM SCLC。板条箱编码了一种乙酰转移酶，并参与了极长链脂肪酸的β氧化、前酰辅酶a的β氧化和过氧化物酶体脂质代谢之间的特定途径(表S3)。需要CRAT将乙酰辅酶a从过氧化物酶体或线粒体运输到细胞质中，以激活钙/钙调蛋白依赖性激酶II (CaMKII)。CRAT蛋白水平的降低降低了细胞增殖和细胞迁移能力;它也是CaMKII激活所必需的⁶⁶．OCLN是DEGs结果中下调最多的基因，Log FC =−3.56(表1）;自然编码的跨膜蛋白在调节蛋白质紧密连接形成的细胞通透性障碍中起着重要作用，是血脑屏障(BBB)的重要组成部分。⁶⁷．

我们证明该基因的低表达可能影响脑转移，因为先前的研究表明CeRNA调节OCLN mRNA，该mRNA在血脑屏障中起着至关重要的作用。PIK3CG是PI3K-Akt信号通路的一个组成部分，控制细胞的基本功能，如细胞增殖、分化和代谢^68，69．OCLN也涉及到三个lncrna，如arggef2 - as1, NKX2-1-AS1和LINC01806(表2)．两个轮毂基因，包括猫而且应用程序,与不同的癌症有关;例如，CAT，专门定位于过氧化物酶体，分解H₂O₂是脂肪酸氧化的副产品，生成氧气和水。因此，CAT提供了相对于H₂O₂不产生中间不固定的自由基，随后的氧气被应用到不同的代谢过程⁷⁰．同样，过氧化氢酶在非小细胞肺癌等肿瘤组织中也比确切来源的正常组织中下调⁷¹．H₂O₂是几种生理过程的中介，包括细胞分化和增殖，细胞代谢，生存和免疫反应，通过ROS(活性氧)细胞内信号传导(图。1）⁷²．

淀粉样前体蛋白(APP)是一种在阿尔茨海默病的进展中起作用的蛋白质。它的细胞质区含有大量的磷酸化位点。APP也被认为是一种参与各种人类癌症(包括非小细胞肺癌)细胞增殖和侵袭的分子^73，74，75．我们的研究发现，这些基因在脑转移型SCLC中表达下调，并可能影响癌分期和生存率，如图所示。5．我们认为上述基因可能与SCLC的脑转移有关，可能作为新的治疗靶点和潜在的预后生物标志物。然而，考虑这些基因作为生物标志物需要深入和全面的研究和临床验证。由于我们只进行了生物信息分析，不足之处还需要进行临床实验和数据验证。此外，这些候选转移基因的功能和机制还有待进一步研究。

总之，脑转移型SCLC的基因表达与非bm型SCLC不同。我们演示了特定lncrna和mrna及其网络的上调和下调，以评估其预测价值。利用可靠的生物标志物预防癌症转移至关重要;然而，这些不同的lncrna的确切作用以及它们如何影响癌症转移还不清楚。